CN116144577A - 一种植物原生质体的分离与纯化方法 - Google Patents

一种植物原生质体的分离与纯化方法 Download PDF

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彭安琪
高婷
宋传奎
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Abstract

本发明涉及一种植物原生质体的分离与纯化方法，包括以下步骤：步骤一：解离材料的选择；步骤二：将植物组织切成碎片，迅速移至酶解液中；步骤三：将酶解液孵育，持续或间隔晃动；步骤四：孵育结束后，加入W5溶液终止消化，得到混合液，将混合液进行过滤，收集滤液，对滤液离心，去除上清液，缓慢加入W5溶液重悬原生质体，以获得高质量的原生质体细胞，酶解液成分包含蜗牛酶，W5溶液成分包含铝盐、钙盐、柠檬酸盐中的一种或多种。

Description

一种植物原生质体的分离与纯化方法
技术领域
本发明涉及一种植物原生质体的分离与纯化方法，更具体地说，涉及一种可用于不同植物的不同组织的原生质体分离与纯化方法。
背景技术
原生质体是去除细胞壁的植物细胞，可用于构建瞬时表达系统，用于蛋白亚细胞定位、蛋白相互作用、基因表达调控、亚细胞器制备以及悬浮细胞培养等研究方面得到了广泛应用；此外，近年来在动物细胞领域广泛应用的单细胞测序技术也开始应用于植物领域，该技术在植物领域应用的技术瓶颈之一就是原生质体的制备。受原生质体制备技术的限制，目前仅有少量模式植物可进行单细胞测序。由于细胞壁木质素含量高等原因，木本植物叶片原生质体分离难、完整性差。特别的，一些次生代谢物较多的物种，如茶树(Camelliasinensis L.)等，其富含多种特有天然化合物且缺少成熟的遗传转化体系，使其分子和细胞等基础研究无法在植物体内进行功能验证。因此，本发明提供的一种植物原生质体的分离与纯化方法对非模式植物的原生质体的制备的基础研究和生产应用都有重要意义。
现有报道的植物原生质体解离和纯化方法，往往受取材限制，特别在木本植物中，受到如花、种子苗和特殊品种限制。这难以满足研究人员的实验需求。特别在茶中，不同茶树品种的芽叶以及花都是重要的研究对象，然而茶树叶片蜡质厚、多酚含量高，原生质体难以分离，能够突破材料限制的原生质体制备方法有着巨大的应用前景。
发明内容
本发明针对现有的植物原生质体分离难、耗时长、完整性差及花瓣和种子苗原生质体提取具时效性等问题，旨在提供一种适于广泛解离对象的原生质体的快速分离和纯化方法，本方法能够适用于不同种类的植物，本方法特别是适用于解离难度高的木本植物，尤其是适用于茶、海桐(Pittosporum tobira)、栀子花(Gardenia jasminoides)、麦冬(Ophiopogon japonicus)等植物，本方法尤其是能够以植物的花、芽以及成熟叶为对象获得高质量的原生质体。
附图说明
图1为显微镜下本发明方法所制备的茶树叶的原生质体。
图2为显微镜下本发明方法所制备的茶树花的原生质体。
图3为显微镜下本发明方法所制备的麦冬叶的原生质体。
图4为显微镜下本发明方法所制备的海桐叶的原生质体。
图5为显微镜下本发明方法所制备的栀子花叶的原生质体。
具体实施方式
为实现上述目的，本发明的技术解决方案是：
一种植物原生质体的分离与纯化方法，所述方法包括以下步骤：
步骤一：解离材料的选择，所述解离材料为植物组织；步骤二：将所述植物组织切成碎片，优选切成2-10mm宽的长条，迅速移至酶解液中；步骤三：将所述酶解液孵育，持续或间隔晃动帮助细胞释放；步骤四：所述孵育结束后，加入W5溶液终止消化，得到混合液，将所述混合液进行过滤，收集滤液，对所述滤液离心，去除上清液，缓慢加入W5溶液重悬原生质体，以获得高质量的原生质体细胞。酶解液成分可以包含蜗牛酶。W5溶液成分可以包含铝盐。
酶解液包含甘露醇、氯化钙、氯化铝、2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(pH6.0)、氯化钾、蜗牛酶、纤维素酶R-10、离析酶R-10、牛血清蛋白、β-巯基乙醇，所述W5溶液成分为氯化钙、氯化铝、2-(N-吗啉代)乙烷磺酸、氯化钾、蔗糖中的一种或多种。所述甘露醇也可以用其他平衡剂替代，所述离析酶R-10可以用果胶酶替代。
所述步骤四还可以包含使用W5溶液漂洗组织块。
所述步骤四还可以包含将所述重悬原生质体过细胞筛，然后离心，去除上清，加入适量W5重悬。优选所述酶解液成分的配比为0.1-1.6M甘露醇，1-20mM氯化钙，20-160μM氯化铝，10-40mM2-(N-吗啉代)乙烷磺酸，1-40mM氯化钾，0.1-2.0％(w/v)蜗牛酶，0.5-3％(w/v)纤维素酶R-10，0.1-0.8％(w/v)离析酶R-10，0.01-0.2％(w/v)牛血清蛋白，1-1000mMβ-巯基乙醇，所述W5溶液的浓度配比为60-250mM氯化钙，20-160μM氯化铝，0.1‰-0.6‰(w/v)2-(N-吗啉代)乙烷磺酸，2-10mM氯化钾，2-10mM蔗糖。
更优选所述酶解液成分的配比为0.4-0.8M甘露醇，2-10mM氯化钙，40-80μM氯化铝，15-30mM2-(N-吗啉代)乙烷磺酸，15-30mM氯化钾，0.5-1.0％(w/v)蜗牛酶，1-1.5％(w/v)纤维素酶R-10，0.2-0.4％(w/v)离析酶R-10，0.05-0.15％(w/v)牛血清蛋白，5-500mM的β-巯基乙醇，所述W5溶液配比为60-125mM氯化钙，40-80μM氯化铝，0.2‰-0.4‰(w/v)的2-(N-吗啉代)乙烷磺酸，4-6mM氯化钾，4-6mM蔗糖。
所述植物组织可以为花或芽或根或叶片。优选植物的叶或花；叶片可以选择的全部芽叶，特别优选植物新生枝条的芽叶或者花瓣。
所述酶解液和所述W5溶液用尼龙滤膜过滤除菌，可以减少污染，提高原生质体得率。
上述方法可以用于制造一种分离与纯化植物原生质体的试剂盒。
实施例1
步骤一：解离材料的选择：选择木本植物茶树作为目标植物。选择茶树的花或者叶片作为解离材料。茶树可在温室条件下采取短日照模式使其进入花期，满足非花期的花的供给；叶片可以选择茶园新生枝条的全部芽叶，若温室培养，适当修剪后可促使3-5年生茶苗不停发新生枝条，以满足实验材料的全年获得。
步骤二：将叶片或花瓣切成碎片，优选切成2-3mm宽的长条，迅速移至酶解液中。每15mL酶解液优选约解离新鲜组织0.5-1.0g。
步骤三：将步骤二酶解液放于23-25℃培养箱的黑暗条件下孵育4-6h，每隔1h轻轻晃动帮助细胞释放。
步骤四：显微镜镜检细胞释放数量，细胞浑圆饱满，细胞类型多样，细胞碎片较少为佳。孵育结束，向酶解液加入等体积的W5溶液终止消化，将溶液通过细胞筛过滤(根据目标细胞大小选择合适孔径)，收集滤液于离心管，W5溶液漂洗组织块，用来洗脱组织块上的细胞原生质体，滤液与50-200g离心1min,去除上清液，贴壁缓慢加入W5溶液重悬原生质体，过40μm孔径的细胞筛。然后50g离心1min，去除上清，保证去除酶解液。适量W5重悬即可获得高质量的原生质体细胞。以用于原生质体转化，4℃冰箱可保存一周仍有活性。
酶解液浓度比为0.1-1.6M甘露醇，1-20mM氯化钙，20-160μM氯化铝，10-40mM 2-(N-吗啉代)乙烷磺酸，1-40mM氯化钾，0.1-2.0％(w/v)蜗牛酶，0.5-3％(w/v)纤维素酶R-10，0.1-0.8％(w/v)离析酶R-10，0.01-0.2％(w/v)牛血清蛋白，1-1000mMβ-巯基乙醇。优选0.4-0.8M甘露醇，10mM氯化钙，40-80μM氯化铝，20mM 2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(pH6.0)，20mM氯化钾，0.5-1.0％(w/v)蜗牛酶，1-1.5％(w/v)纤维素酶R-10，0.2-0.4％(w/v)离析酶R-10，0.1％(w/v)牛血清蛋白，5-500mM的β-巯基乙醇，0.45μm尼龙滤膜过滤除菌。
W5溶液浓度配比为60-250mM氯化钙，20-160μM氯化铝，0.1‰-0.6‰(w/v)2-(N-吗啉代)乙烷磺酸，2-10mM氯化钾，2-10mM蔗糖。优选125mM氯化钙，40-80μM氯化铝，0.3‰(w/v)的2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(pH6.0)，5mM氯化钾，5mM蔗糖，0.45μm尼龙滤膜过滤除菌。
加入蜗牛酶加速解离，使木本植物茶树的消化时间缩短至2-4h,同时能够适用不同茶树品种的叶片，茶树花瓣以及其他植物叶片。铝盐的加入提高了茶树叶片细胞的完整性和细胞活率，使得原生质体产量在0.3-2.4×107个/克鲜重以上，活力70-95％，并且细胞类型丰富，杂质和细胞碎片少，经简单过滤即可获得高质量的细胞悬液。能够满足包括原生质体培养、体细胞杂交、遗传转化、基因编辑、单细胞测序等后续各种研究的需要。
根据茶叶组织细胞的特性，制造针对茶叶分离与纯化植物原生质体的试剂盒。
实施例2
步骤一：解离材料的选择：选择草本植物麦冬作为目标植物。选择麦冬的花或者叶片作为解离材料。叶片可以选择麦冬的全部叶片，花选择花瓣。
步骤二：将叶片或花瓣切成碎片，优选切成2-3mm宽的长条，迅速移至酶解液中。每15mL酶解液优选约解离新鲜组织0.5-1.0g。
步骤三：将步骤二酶解液放于23-25℃培养箱的黑暗条件下孵育4-6h，每隔1h轻轻晃动帮助细胞释放。
步骤四：显微镜镜检细胞释放数量，细胞浑圆饱满，细胞类型多样，细胞碎片较少为佳。孵育结束，向酶解液加入等体积的W5溶液终止消化，将溶液通过单层神奇布过滤，收集滤液于离心管，W5溶液漂洗组织块，用来洗脱组织块上的细胞原生质体，滤液与50g离心1mi n,去除上清液，贴壁缓慢加入W5溶液重悬原生质体，过40μm孔径的细胞筛。然后50g离心1min，去除上清，保证去除酶解液。适量W5重悬即可获得高质量的原生质体细胞。以用于原生质体转化，4℃冰箱可保存一周仍有活性。
酶解液浓度比为0.1-1.6M甘露醇，1-20mM氯化钙，20-160μM氯化铝，10-40mM 2-(N-吗啉代)乙烷磺酸，1-40mM氯化钾，0.1-2.0％(w/v)蜗牛酶，0.5-3％(w/v)纤维素酶R-10，0.1-0.8％(w/v)离析酶R-10，0.01-0.2％(w/v)牛血清蛋白，1-1000mMβ-巯基乙醇。优选0.4-0.8M甘露醇，10mM氯化钙，40-80μM氯化铝，20mM 2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(pH6.0)，20mM氯化钾，0.5-1.0％(w/v)蜗牛酶，1-1.5％(w/v)纤维素酶R-10，0.2-0.4％(w/v)离析酶R-10，0.1％(w/v)牛血清蛋白，5-500mM的β-巯基乙醇，0.45μm尼龙滤膜过滤除菌。
W5溶液浓度配比为60-250mM氯化钙，20-160μM氯化铝，0.1‰-0.6‰(w/v)2-(N-吗啉代)乙烷磺酸，2-10mM氯化钾，2-10mM蔗糖。优选125mM氯化钙，40-80μM氯化铝，0.3‰(w/v)的2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(pH6.0)，5mM氯化钾，5mM蔗糖，0.45μm尼龙滤膜过滤除菌。
加入蜗牛酶加速解离，缩短消化时间。铝盐的加入提高了麦冬细胞的完整性和细胞活率，使得原生质体产量达到1-6.5×106个/克鲜重以上，活力70-95％，并且细胞类型丰富，杂质和细胞碎片少，经简单过滤即可获得高质量的细胞悬液。
根据麦冬组织细胞的特性，制造针对麦冬分离与纯化植物原生质体的试剂盒。
实施例3
步骤一：解离材料的选择：选择木本植物海桐作为目标植物。选择海桐的花或者叶片作为解离材料。叶片可以选择海桐新生枝条的全部芽叶。
步骤二：将叶片或花瓣切成2-10mm碎片，优选切成2-3mm宽的长条，迅速移至酶解液中。每15mL酶解液优选约解离新鲜组织0.5-1.0g。
步骤三：将步骤二酶解液放于23-25℃培养箱的黑暗条件下孵育4-6h，每隔1h轻轻晃动帮助细胞释放。
步骤四：显微镜镜检细胞释放数量，细胞浑圆饱满，细胞类型多样，细胞碎片较少为佳。孵育结束，向酶解液加入等体积的W5溶液终止消化，将溶液通过单层神奇布过滤，收集滤液于离心管，W5溶液漂洗组织块，用来洗脱组织块上的细胞原生质体，滤液与50g离心1mi n,去除上清液，贴壁缓慢加入W5溶液重悬原生质体，过40μm孔径的细胞筛。然后50g离心1min，去除上清，保证去除酶解液。适量W5重悬即可获得高质量的原生质体细胞。以用于原生质体转化，4℃冰箱可保存一周仍有活性。
酶解液浓度比为0.1-1.6M甘露醇，1-20mM氯化钙，20-160μM氯化铝，10-40mM2-(N-吗啉代)乙烷磺酸，1-40mM氯化钾，0.1-2.0％(w/v)蜗牛酶，0.5-3％(w/v)纤维素酶R-10，0.1-0.8％(w/v)离析酶R-10，0.01-0.2％(w/v)牛血清蛋白，1-1000mMβ-巯基乙醇。优选0.4-0.8M甘露醇，10mM氯化钙，40-80μM氯化铝，20mM 2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(pH6.0)，20mM氯化钾，0.5-1.0％(w/v)蜗牛酶，1-1.5％(w/v)纤维素酶R-10，0.2-0.4％(w/v)离析酶R-10，0.1％(w/v)牛血清蛋白，5-500mM的β-巯基乙醇，0.45μm尼龙滤膜过滤除菌。
W5溶液浓度配比为60-250mM氯化钙，20-160μM氯化铝，0.1‰-0.6‰(w/v)2-(N-吗啉代)乙烷磺酸，2-10mM氯化钾，2-10mM蔗糖。优选125mM氯化钙，40-80μM氯化铝，0.3‰(w/v)的2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(pH6.0)，5mM氯化钾，5mM蔗糖，0.45μm尼龙滤膜过滤除菌。
加入蜗牛酶加速解离。铝盐的加入提高了海桐叶片细胞的完整性和细胞活率，使得原生质体产量在1-6.5×106个/克鲜重以上，活力70-95％，并且细胞类型丰富，杂质和细胞碎片少，经简单过滤即可获得高质量的细胞悬液。使得实验材料能够满足包括原生质体培养、体细胞杂交、遗传转化、基因编辑、单细胞测序等后续各种研究的需要。
根据海桐组织细胞的特性，制造针对麦冬分离与纯化植物原生质体的试剂盒。
实施例4
步骤一：解离材料的选择：选择木本植物栀子花作为目标植物。选择栀子花的花或者叶片作为解离材料。叶片选择栀子花新生枝条的全部芽叶。
步骤二：将叶片或花瓣切成碎片，优选切成2-3mm宽的长条，迅速移至酶解液中。每15mL酶解液优选约解离新鲜组织0.5-1.0g。
步骤三：将步骤二酶解液放于23-25℃培养箱的黑暗条件下孵育4-6h，每隔1h轻轻晃动帮助细胞释放。
步骤四：显微镜镜检细胞释放数量，细胞浑圆饱满，细胞类型多样，细胞碎片较少为佳。孵育结束，向酶解液加入等体积的W5溶液终止消化，将溶液通过单层神奇布过滤，收集滤液于离心管，W5溶液漂洗组织块，用来洗脱组织块上的细胞原生质体，滤液与50g离心1mi n,去除上清液，贴壁缓慢加入W5溶液重悬原生质体，过40μm孔径的细胞筛。然后50g离心1min，去除上清，保证去除酶解液。适量W5重悬即可获得高质量的原生质体细胞。以用于原生质体转化，4℃冰箱可保存一周仍有活性。
酶解液浓度比为0.1-1.6M甘露醇，1-20mM氯化钙，20-160μM氯化铝，10-40mM 2-(N-吗啉代)乙烷磺酸，1-40mM氯化钾，0.1-2.0％(w/v)蜗牛酶，0.5-3％(w/v)纤维素酶R-10，0.1-0.8％(w/v)离析酶R-10，0.01-0.2％(w/v)牛血清蛋白，1-1000mMβ-巯基乙醇。优选0.4-0.8M甘露醇，10mM氯化钙，40-80μM氯化铝，20mM 2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(pH6.0)，20mM氯化钾，0.5-1.0％(w/v)蜗牛酶，1-1.5％(w/v)纤维素酶R-10，0.2-0.4％(w/v)离析酶R-10，0.1％(w/v)牛血清蛋白，5-500mM的β-巯基乙醇，0.45μm尼龙滤膜过滤除菌。
W5溶液浓度配比为60-250mM氯化钙，20-160μM氯化铝，0.1‰-0.6‰(w/v)2-(N-吗啉代)乙烷磺酸，2-10mM氯化钾，2-10mM蔗糖。优选125mM氯化钙，40-80μM氯化铝，0.3‰(w/v)的2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(pH6.0)，5mM氯化钾，5mM蔗糖，0.45μm尼龙滤膜过滤除菌。
加入蜗牛酶加速解离，使消化时间缩短，同时能够适用植物不同的组织，如叶片、花瓣等以及其他植物叶片。铝盐的加入提高了叶片细胞的完整性和细胞活率，使得原生质体产量在1-6.5×106个/克鲜重以上，活力70-95％，并且细胞类型丰富，杂质和细胞碎片少，经简单过滤即可获得高质量的细胞悬液，能够满足包括原生质体培养、体细胞杂交、遗传转化、基因编辑、单细胞测序等后续各种研究的需要。
根据栀子花组织细胞的特性，制造针对栀子花分离与纯化植物原生质体的试剂盒。
上面已经描述了本发明的示例性实施例。本领域普通技术人员将理解，可以在不脱离本发明的实质特征的情况下进行修改。因此，所公开的实施例应该被认为是描述性方面而不是限制性方面。本发明的范围由权利要求限定，而不是由以上描述限定，并且应当理解，其等同物内的所有差异都包括在本发明中。

Claims (10)

1.一种植物原生质体的分离与纯化方法，所述方法包括以下步骤：
步骤一：解离材料的选择，所述解离材料为植物组织；
步骤二：将所述植物组织切成碎片，迅速移至酶解液中；
步骤三：将所述酶解液孵育，持续或间隔晃动帮助细胞释放；
步骤四：所述孵育结束后，加入W5溶液终止消化，得到混合液，将所述混合液进行过滤，收集滤液，对所述滤液离心，去除上清液，缓慢加入W5溶液重悬原生质体，以获得高质量的原生质体细胞，
其特征在于，所述酶解液成分包含蜗牛酶。
2.根据权利要求1所述的一种植物原生质体的分离与纯化方法，其特征在于，所述W5溶液成分包含铝盐、钙盐、柠檬酸盐中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的一种植物原生质体的分离与纯化方法，其特征在于，所述酶解液包含甘露醇、氯化钙、氯化铝、2-(N-吗啉代)乙烷磺酸、氯化钾、蜗牛酶、纤维素酶R-10、离析酶R-10、牛血清蛋白、β-巯基乙醇，所述W5溶液成分为氯化钙、氯化铝、2-(N-吗啉代)乙烷磺酸、氯化钾、蔗糖中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的一种植物原生质体的分离与纯化方法，其特征在于，所述离析酶R-10替换为果胶酶。
5.根据权利要求2所述的一种植物原生质体的分离与纯化方法，其特征在于，所述步骤四还包含将所述重悬原生质体过细胞筛，然后离心，去除上清，加入适量W5重悬。
6.根据权利要求2所述的一种植物原生质体的分离与纯化方法，其特征在于，所述酶解液成分的配比为0.1-1.6M甘露醇，1-20mM氯化钙，20-160μM氯化铝，10-40mM2-(N-吗啉代)乙烷磺酸，1-40mM氯化钾，0.1-2.0％(w/v)蜗牛酶，0.5-3％(w/v)纤维素酶R-10，0.1-0.8％(w/v)离析酶R-10，0.01-0.2％(w/v)牛血清蛋白，1-1000mMβ-巯基乙醇，所述W5溶液的浓度配比为60-250mM氯化钙，20-160μM氯化铝，0.1‰-0.6‰(w/v)2-(N-吗啉代)乙烷磺酸，2-10mM氯化钾，2-10mM蔗糖。
7.根据权利要求2所述的一种植物原生质体的分离与纯化方法，其特征在于，所述酶解液成分的配比为0.4-0.8M甘露醇，2-10mM氯化钙，40-80μM氯化铝，15-30mM2-(N-吗啉代)乙烷磺酸，15-30mM氯化钾，0.5-1.0％(w/v)蜗牛酶，1-1.5％(w/v)纤维素酶R-10，0.2-0.4％(w/v)离析酶R-10，0.05-0.15％(w/v)牛血清蛋白，5-500mM的β-巯基乙醇，所述W5溶液配比为60-125mM氯化钙，40-80μM氯化铝，0.2‰-0.4‰(w/v)的2-(N-吗啉代)乙烷磺酸，4-6mM氯化钾，4-6mM蔗糖。
8.根据权利要求2所述的一种植物原生质体的分离与纯化方法，其特征在于，所述植物组织为花或芽或根或叶片。
9.根据权利要求2所述的一种植物原生质体的分离与纯化方法，其特征在于，所述酶解液和所述W5溶液用尼龙滤膜过滤除菌。
10.一种用于分离与纯化植物原生质体的试剂盒，其特征在于，使用权利要求1-9所述的一种植物原生质体的分离与纯化方法。
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