CN108611313A - 一种从芜菁柱头分离乳突细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及从芜菁柱头分离乳突细胞的方法，具体涉及植物组织酶解分离和获取完整具有活力的乳突细胞的方法，属于生物化学及细胞生物学领域。本发明主要采用了独创的酶解液首次分离出乳突细胞，步骤主要包括采集成熟柱头、柱头酶解液培养、涡旋震荡以及离心分离，获得完整的具有活力的乳突细胞，具有步骤简单、操作方便、耗时较短等优点，并且最终分离出的乳突细胞具有较高纯度，适合于乳突细胞的蛋白质组学和基因组学实验研究。

Description

一种从芜菁柱头分离乳突细胞的方法

技术领域

本发明涉及从芜菁柱头分离乳突细胞的方法，具体涉及植物组织酶解分离和获取完整具有活力的乳突细胞的方法，属于生物化学及细胞生物学领域。

背景技术

乳突细胞是柱头上的一层乳头状细胞，其形态结构变化和细胞信号转导与自交不育相关。目前对于乳突细胞的研究多集中在结构分析上，而对于细胞信号的转导以及相关基因的调控知之甚少。这主要是由于目前没有分离乳突细胞的配套方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种从芜菁柱头分离乳突细胞的方法，有效分离出结构完整、具有活力的柱头乳突细胞。该方法也可用于分离其它植物的乳突细胞，为其它植物柱头乳突细胞的分离提供参考。

为了深入研究乳突细胞在自交不育中的调控作用，申请人发明了一种酶解技术，并将该技术运用到芜菁柱头乳突细胞的分离上。在这一技术中，申请人用15~30个柱头，用酶解液在37℃、1000 rpm下培育3 ~5h，然后用涡旋仪震荡混匀3 min，在5000 rpm 4℃条件下离心3 min，收集离心产物，即得到乳突细胞，最后将其存放于0.35 M甘露醇中备用。

为了实现上述发明目的，本发明的技术方案为：一种从芜菁柱头分离乳突细胞的方法，其特征在于，将完整的柱头用酶解液处理，再通过涡旋、离心，收集得到结构完整且具有活力的乳突细胞；酶解液的制备步骤为：含有50 mM Hepes（4-羟乙基哌嗪乙磺酸），0.5 M蔗糖，5mM EDTA，0.05~ 0.15%BSA，5mM KH₂PO₄ ，1.5~4.5%纤维素酶，0.5~1.5%果胶酶，并用KOH调节pH值至7.5；所述百分比为质量百分比。

为了获得完整的柱头，需进行柱头的采集：在芜菁开花期采集当天开的花中的柱头15~30个，尽量去除花柱部位。

所述的纤维素酶为纤维素酶RS，还可以为其它纤维素酶；果胶酶为果胶酶Y，还可以为其它果胶酶。

将完整的柱头用酶解液处理的具体步骤为：将采集的柱头放入1.5 ml离心管中，并加入200 ~500μl新配制好的酶解液，并用锡箔纸包扎离心管且避光放入37℃摇床中3 ~5h。用锡箔纸包扎好的离心管放入摇床中的3 ~5 h，设置条件为：37℃、1000 rpm。

涡旋、离心的具体步骤为：取出离心管，用涡旋仪震荡混匀3 min，之后在4℃、5000rpm条件下冷冻离心3 min。收集的具体步骤为：在体视显微镜下挑选下层液中的乳突细胞；得到结构完整且具有活力的乳突细胞后，将其置于0.35 M甘露醇中-20℃低温保存。乳突细胞经过离心后位于离心管底部，下层液成分为柱头残留物，上层液为葡萄糖、半乳糖醛酸等成分。

相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：

1)首次从芸薹属植物芜菁柱头上分离出完整、具有活力的乳突细胞，可以用于乳突细胞蛋白质组学的研究，尤其是乳突细胞与自交不亲育相关的生理生化特性的基础性研究；

2)应用本发明的方法分离的完整、具有活力（经过贝克曼库尔特Vi-CELL XR系统检测细胞活力，检测到的细胞活力为99%）的乳突细胞，可进一步用于乳突细胞DNA提取，进行基因组研究，在分子层面上深入研究乳突细胞的功能；

3)本发明是基于对乳突细胞结构及代谢研究的工作基础，本方法具有坚实的理论依据，科学性强，方法较简便，易于操作和实际应用。

附图说明

图1 芜菁柱头乳突细胞分离流程图；

图2 显微镜下完整的柱头；

图3 显微镜下分离出的乳突细胞。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明。

分离植物乳突细胞，是研究乳突细胞的生理、生化特性及其功能的必要前提之一。我们应用本发明的方法，获取了完整的、具有活力的芜菁乳突细胞，为开展和深入研究乳突细胞蛋白质组学和基因组学奠定基础。众所周知，分离乳突细胞是开展乳突细胞蛋白质组学和基因组学实验研究的前提，而迄今，多数研究只是集中在乳突细胞的结构分析及简单代谢产物上，这主要是由于没有成熟的分离乳突细胞的方法。

参见图1，本发明采用以下技术方案：

1.在芜菁开花期采集当天开花中的柱头15~30个，尽量去除花柱部位，使酶解液与柱头乳突细胞充分接触。

2.将采集的柱头放入1.5 ml离心管中，并加入200 ~500μl新配备好的酶解液；酶解液中的BSA能够对纤维素酶和果胶酶起保护作用，防止酶的分解和非特异性吸附，能减轻有些酶的变性，能减轻有些不利环境因素如加热，表面张力及化学因素引起的变性；纤维素酶RS和果胶酶Y23能够破除植物细胞壁，使乳突细胞从柱头上分离开来；Hepes、蔗糖和EDTA等能够保持乳突细胞活力，减轻或去除其他因素对细胞的毒害作用。所述的纤维素酶为Cellulase RS，果胶酶为PectolyaseY-23，生产厂家或代理销售公司均为Solarbio公司。

3.用锡箔纸将离心管包扎进行避光处理；锡箔纸包扎避光防止培养液中的HEPES在可见光下暴露3h以上产生对细胞有毒性的过氧化氢以及酶失活。

4.将包扎好的离心管放入摇床中3 ~5h，并设置37℃、1000 rpm。

5.取出离心管，用涡旋仪震荡混匀3 min；本步骤充分振荡便于乳突细胞从柱头上散落下来。

6.将涡旋后的离心管在4℃、5000 rpm条件下冷冻离心3 min。

7.挑选出下层液中的乳突细胞，并用显微镜检验。

8.将乳突细胞放置于0.35 M甘露醇中并低温保存。

本实施例就以芜菁作为材料，采用本发明方法从15~30个柱头（图2）分离出完整的、具有活力的乳突细胞，并在显微镜下成功观察到分离出的乳突细胞（图3）。实验过程如下：

1.在芜菁开花期采集当天开花中的柱头15个，尽量去除花柱部位。

2.将采集的柱头放入1.5 ml离心管中，并加入300 μl新配备好的酶解液。酶解液组成：含有50 mM Hepes（4-羟乙基哌嗪乙磺酸），0.5 M蔗糖，5mM EDTA，0.10%BSA，5mMKH₂PO₄ ，1.5%纤维素酶，1.0%果胶酶，并用KOH调节pH值至7.5；

3.用锡箔纸将离心管包扎进行避光处理。

4.将包扎好的离心管放入摇床中4 h，并设置37℃、1000 rpm。

5.取出离心管，用涡旋仪震荡混匀3 min。

6.将涡旋后的离心管在4℃、5000 rpm条件下冷冻离心3 min。

7.挑选出下层液中的乳突细胞，并用显微镜检验。

8.将乳突细胞放置于0.35 M甘露醇中并低温保存。

本发明提供一种从芜菁柱头分离乳突细胞的方法，是应用酶解、分离等来获取乳突细胞的方法，其过程是将完整的柱头用酶解液处理，再通过涡旋、离心，最后得到结构完整具有活力的乳突细胞。从图2可知，申请人得到了完整、不破损的柱头。从图3中可知，分离出完整的、具有活力的乳突细胞。

本发明所述的实例是对本发明的说明而不能限制本发明，在与本发明相当的含义和范围内的任何改变和调整，都应认为是在本发明的范围内。

Claims (6)

1.一种从芜菁柱头分离乳突细胞的方法，其特征在于，将完整的柱头用酶解液处理，再通过涡旋、离心，收集得到结构完整且具有活力的乳突细胞；酶解液的制备步骤为：含有50mM Hepes（4-羟乙基哌嗪乙磺酸），0.5 M蔗糖，5mM EDTA，0.05~ 0.15%BSA，5mM KH₂PO₄ ，1.5~4.5%纤维素酶，0.5~1.5%果胶酶，并用KOH调节pH值至7.5；所述百分比为质量百分比。

2.根据权利要求1所述的一种从芜菁柱头分离乳突细胞的方法，其特征在于，为了获得完整的柱头，需进行柱头的采集：在芜菁开花期采集当天开的花中的柱头15~30个，尽量去除花柱部位。

3.根据权利要求2所述的一种从芜菁柱头分离乳突细胞的方法，其特征在于，将完整的柱头用酶解液处理的具体步骤为：将采集的柱头放入1.5 ml离心管中，并加入200 ~500μl新配制好的酶解液，并用锡箔纸包扎离心管且避光放入37℃摇床中3 ~5 h。

4.根据权利要求3所述的一种从芜菁柱头分离乳突细胞的方法，其特征在于，用锡箔纸包扎好的离心管放入摇床中的3 ~5 h，设置条件为：37℃、1000 rpm。

5.根据权利要求4所述的一种从芜菁柱头分离乳突细胞的方法，其特征在于，涡旋、离心的具体步骤为：取出离心管，用涡旋仪震荡混匀3 min，之后在4℃、5000 rpm条件下冷冻离心3 min。

6.根据权利要求4所述的一种从芜菁柱头分离乳突细胞的方法，其特征在于，收集的具体步骤为：在体视显微镜下挑选下层液中的乳突细胞；得到结构完整且具有活力的乳突细胞后，将其置于0.35 M甘露醇中-20℃低温保存。