CN103275174A - 一种通用型聚丙烯酰胺凝胶蛋白质快速分离和染色试剂盒 - Google Patents
一种通用型聚丙烯酰胺凝胶蛋白质快速分离和染色试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于蛋白质分子分离和染色领域，尤其涉及一种通用型聚丙烯酰胺凝胶蛋白质快速分离和染色试剂盒。所述试剂盒中共有7种试剂，实现了蛋白质分离和染色。本发明操作方便，试剂配制过程简单，简化了蛋白质分离和染色的步骤，制作的SDS-PAGE凝胶凝结均匀、电泳边缘效应不明显、染色效果卓著，适合科研人员后续试验进行。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质分子分离和染色领域，尤其涉及一种通用型聚丙烯酰胺凝胶蛋白质快速分离和染色试剂盒。
背景技术
随着蛋白质组学的发展，进行蛋白质分离、鉴定研究是生物科学领域重要的研究内容。目前进行蛋白质分离的方法有很多，采用SDS-PAGE不连续缓冲系统分离蛋白的方法在生命科学、医药卫生等领域被广范应用。但SDS-PAGE在使用过程中仍然存在较多的问题需要解决：
①电泳结果重复性较差：由于胶体混匀较难，聚合凝结时间较长，凝结不均匀，形成两边翘起中间凹下的“微笑”型带；
②电泳载体SDS-PAGE胶品质均一性差：1）浓缩胶未浓缩好，其原因在于TEMED、APS剂量不够或者失效；2）浓缩胶浓缩速度较快，其原因在于APS和TEMED用量过多，此时会造成胶体太硬易裂，电泳时易烧胶；
③制胶时间长。
由于原因①和②需要调控的因素较多，常常造成试验失败或试验结果不理想。这大大增加了实验成本、操作人员的实验风险（丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺均为神经性毒剂）和环境污染风险。
蛋白质在凝胶分离后，需要对分离的蛋白质进行染色分析。考马斯亮蓝染色法具有的安全、快速、良好的重复性、极低的染色背景、较高的灵敏度（30ng）和良好的质谱衔接性等优势，是首选的染色鉴定方法。但考马斯亮蓝染料配置方法较为繁琐、配置时间长、保存期短（1个月失效）、用量大、染色时间长、染色背景深等问题，不但增加了科研人员的工作量和试剂浪费现象，而且对环境形成污染，进一步增加了碳排放。
针对以上问题，尽管已经有多种对策应对，如针对凝胶制备的发明“生物大分子浓缩除盐方法及试剂盒（CN 102072836 A）”等解决了聚丙烯酰胺法浓缩或除盐、凝胶回收、化学试剂污染等问题，但聚丙烯酰胺凝结不均、TEMED、APS试剂现配现用、制胶时间长等问题仍然无法解决；而针对蛋白质染色的发明如“一种考马斯亮蓝染色法及其专用凝胶固定液（CN 1904578 A）”和“一种考马斯亮蓝G250染色方法及其专用液（CN 102288470 A）”解决了考马斯亮蓝染色法染色背景深、操作繁琐、灵敏度提高的问题，但考马斯亮蓝染液配置复杂、保存期短、染色耗费时间长等的问题仍然没有解决。而且从目前公布的发明中，蛋白质分离和染色分析过程是独立的，还没有能够将SDS-PAGE蛋白质分离、染色试验合为一体的试剂盒。
发明内容
为了克服现有技术不足，本发明提供了一种通用型聚丙烯酰胺凝胶蛋白质快速分离和染色试剂盒，本发明可以实现SDS-PAGE电泳法进行蛋白质分子一维快速分离和考马斯亮蓝快速染色、脱色鉴定，操作方便，试剂配制简单，且存放时间长，得到的试验结果清晰，精准度高。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种通用型聚丙烯酰胺凝胶蛋白质快速分离和染色试剂盒，包括7种试剂，其组分配比如下：
试剂1：分析纯甘油和水的体积份配比为1：5~8；
试剂2：甲叉丙烯酰胺和丙烯酰胺的质量份配比为1：15~40，TBE或TAE和水的体积份配比为1：2~4；
试剂3：SDS和水的质量份配比为1：10~15；
试剂4：硫酸铵和水的质量份配比为1：10~15；
试剂5：SDS和溴酚蓝的质量份配比为1:10~15，甘油、TBE、巯基乙醇和水的体积份配比为15~20：4~6：5~8：3~5；
试剂6：SDS、甘氨酸和TBE的质量份配比为2~5：25~30：6~10，水为200~220体积份；
试剂7：甲醇、冰醋酸和水的体积份配比为400~450：100~120：450~500，考马斯亮蓝为1质量份。
优选的，试剂3中SDS与水的质量份配比为1:10。
优选的，试剂4中硫酸铵与水的质量份配比为1:10。
优选的，试剂5中，SDS和溴酚蓝的质量份配比为1：10，甘油、TBE、巯基乙醇和水的体积份配比为15：5：5：4。
优选的，试剂6中，SDS、甘氨酸、TBE的质量份配比为2:29:6，水为200体积份。
优选的，试剂7中，甲醇、冰醋酸和水的体积份配比为450：100：450，考马斯亮蓝为1质量份。
优选的，所述的水为双蒸水、去离子水、超纯水或纯水中一种或多种组合。
优选的，将试剂1-7任一一种试剂通过加热、震荡或其它促进溶解的方法加速其中组分的溶解并混合均匀。
优选的，对试剂7使用后的溶液进行离心、过滤或采用其它纯化方法，制得的上清液、滤液或纯化物作为试剂7回用。
优选的，将试剂1-7放置于4℃或常温环境中保存。
采用本发明进行蛋白质快速分离和染色的方法如下：
一：蛋白质快速分离
1) 安装好电泳板；
2）按体积份配比为330：400：10：10:1取试剂1、试剂2、试剂3、试剂4和TEMED，混合制备聚丙烯酰胺分离胶；
3） 混匀，灌胶，并在凝胶液面上小心加水或用75%酒精覆盖，以使界面平滑，待分离胶凝固后，用移液枪将水或酒精吸出干净；
4）按体积份配比为680:170:10:10:1取试剂1、试剂2、试剂3、试剂4和TEMED，将上述物质搅拌混匀，灌胶，避免气泡产生或将胶液充溢混合后，插上梳子形成上加样孔，得浓缩胶；
5）取试剂3重悬蛋白样品沉淀物，混匀，加热，然后对其离心并吸取上清备用，向上清中加等体积的试剂5，混匀，沸水水浴加热，制得蛋白质样品；
6）在电泳槽加入适量试剂6，调节电流恒流电泳至样品进入分离胶，再调节电流恒流电泳至溴酚兰移动至凝胶下边界约3-5 cm时停止电泳；
7）从电泳装置上卸下玻璃板，除去浓缩胶部分，将分离胶小心地移入至少为分离胶体积5倍的固定液（固定液为甲醇和乙酸的混合物，甲醇:乙酸=3:l配置）中固定，直至染料由蓝绿色变为黄色，除去固定液，进行蛋白质染色脱色步骤。
二：蛋白质染色脱色
1） 取至少为上步骤所得分离胶体积5倍的试剂7浸泡分离胶，在室温下放在摇床上平缓摇动，染色2 h以上；
2） 取出分离胶并浸泡于适量脱色液中，平缓摇动2～3h，每隔0.5h更换脱色液1次，直到条带清晰、背景浅或没有背景，将试剂7滤除胶块等杂质回收重复使用；
3） 凝胶扫描成图像或拍照保存，观察结果；脱色后的SDS-PAGE凝胶可在试剂1中长期保存。
应用本发明制作的SDS-PAGE凝胶凝结均匀、电泳边缘效应不明显、染色效果卓著，适合科研人员后续试验进行。
本发明与现有技术相比，具有如下优点：
1）本发明操作方便，试剂配制过程简单，将SDS-PAGE电泳法进行蛋白质分子一维快速分离和考马斯亮蓝快速染色、脱色鉴定一体进行，简化了蛋白质分离和染色的步骤；
2）采用本发明技术方案制作的SDS-PAGE凝胶凝结均匀、电泳边缘效应不明显、染色效果卓著，适合科研人员后续试验进行。
附图说明
图1为现有技术中SDS-PAGE电泳图；
图2为采用本发明技术方案得到的SDS-PAGE电泳图。
具体实施方式
实施例1
按照下述配比配制试剂1-7
试剂1：按体积份配比1：5，取分析纯甘油和双蒸水，混合加热溶解后，混合均匀；
试剂2：按质量份配比1：15取甲叉丙烯酰胺、丙烯酰胺，按体积份配比1：2取TBE、双蒸水，将上述物质混合加热溶解后，混合均匀；
试剂3：按质量份配比1：10，取SDS、超纯水，混合加热溶解后，混合均匀；
试剂4：按质量份配比为1：10，取硫酸铵、超纯水，加热溶解后。混合均匀；
试剂5：按质量份配比为1：10取SDS、溴酚蓝，按体积份配比15：4：5：3取甘油、TBE、巯基乙醇、超纯水，将上述物质混合加热溶解后，混合均匀；
试剂6：按质量份配比为2：25：6取SDS、甘氨酸、TBE，并取200体积份超纯水，将上述物质混合加热溶解后，混合均匀；
试剂7：按体积份配比为400：100：450，取甲醇、冰醋酸和超纯水，取1质量份的考马斯亮蓝，将上述物质混合加热溶解后，混合均匀。
将试剂1-7放置于4℃或常温环境中保存。
使用时，将试剂6和试剂7从试剂盒中取出置于室温储存，用时分别振荡。将试剂盒中试剂5置于37℃水中水浴加热30min。
采用本发明进行蛋白质快速分离和染色的方法如下
一：蛋白质快速分离
聚丙烯酰胺凝胶制备
(1) 装好电泳板，可先用20 mL凝胶封住电泳板下部，防止漏液；
(2) 按下述的体积份配比配制聚丙烯酰胺分离胶；
| 试剂1 | 330 |
| 试剂2 | 400 |
| 试剂3 | 10 |
| 试剂4 | 10 |
| TEMED | 1 |
(3) 混匀，灌胶；
(4) 在凝胶液面上小心加水或用75%酒精覆盖，以使界面平滑；
(5) 等分离胶凝固后，用移液枪、吸水纸将水或酒精吸出干净，再按照下述的体积份配比配制浓缩胶；
| 试剂1 | 680 |
| 试剂2 | 170 |
| 试剂3 | 10 |
| 试剂4 | 10 |
| TEMED | 1 |
(6) 用玻璃棒搅拌混匀，并用玻棒引流灌胶，避免气泡产生或将胶液充溢；
(7) 插上梳子形成上加样孔。
加样电泳
(1) 取试剂3试剂10 μL重悬蛋白样品沉淀物，混匀，70℃ 10min；
(2) 12000 rpm离心1min，取上清作为样品备用；
(3) 取样品各50 μL，加等体积的试剂5，混匀，沸水浴5min；
(4) 12000 rpm离心2 min，取20 μL上清加样；
(5) 在电泳槽加入适量试剂6，调节电流恒流40 mA电泳至样品进入分离胶，再调至80 mA恒流电泳；
(6) 等溴酚兰移动至凝胶下边界约3-5 cm时即可停止电泳。
蛋白质固定
从电泳装置上卸下玻璃板，用自来水小水流冲激玻璃板，然后用工具小心撬开玻璃板，除去浓缩胶部分，将分离胶小心的移入至少为胶体积的5倍的固定液（按照甲醇:乙酸=3:l配置）中固定，直至染料由蓝绿色变为黄色，除去固定液，进入步骤5。
染色脱色分析
(1) 取至少为凝胶体积5倍的试剂7上清浸泡凝胶，在室温下放在摇床上平缓摇动，染色2 h以上；
(2) 取出凝胶并浸泡于适量脱色液中，平缓摇动2～3h，每隔0.5h更换脱色液1次，直到条带清晰、背景浅或没有背景，将试剂7过滤滤除胶块等杂质后，回收重复使用；
(3) 凝胶扫描成图像或拍照保存，观察结果；脱色后的SDS-PAGE凝胶可保存在试剂1中长期保存。
实施例2
按照下述配比配制试剂1-7
试剂1：按体积份配比1：8，取分析纯甘油和双蒸水，混合加热溶解后，混合均匀；
试剂2：按质量份配比1：40取甲叉丙烯酰胺、丙烯酰胺，按体积份配比1：4取TBE、双蒸水，将上述物质混合加热溶解后，混合均匀；
试剂3：按质量份配比1：15，取SDS、超纯水，混合加热溶解后，混合均匀；
试剂4：按质量份配比为1：15，取硫酸铵、超纯水，加热溶解后。混合均匀；
试剂5：按质量份配比为1：15取SDS、溴酚蓝，按体积份配比20：6：8：5取甘油、TBE、巯基乙醇、超纯水，将上述物质混合加热溶解后，混合均匀；
试剂6：按质量份配比为5：30：10取SDS、甘氨酸、TBE，并取220体积份超纯水，将上述物质混合加热溶解后，混合均匀；
试剂7：按体积份配比为450：120：500，取甲醇、冰醋酸和超纯水，取1质量份的考马斯亮蓝，将上述物质混合加热溶解后，混合均匀。
将试剂1-7放置于4℃或常温环境中保存。
使用时，将试剂6和试剂7从试剂盒中取出置于室温储存，用时分别振荡。将试剂盒中试剂5置于37℃水中水浴加热30min。
采用本发明进行蛋白质快速分离和染色的方法同实施例1。
实施例3
按照下述配比配制试剂1-7
试剂1：按体积份配比1：6，取分析纯甘油和双蒸水，混合加热溶解后，混合均匀；
试剂2：按质量份配比1：30取甲叉丙烯酰胺、丙烯酰胺，按体积份配比1：3取TBE、双蒸水，将上述物质混合加热溶解后，混合均匀；
试剂3：按质量份配比1：10，取SDS、超纯水，混合加热溶解后，混合均匀；
试剂4：按质量份配比为1：10，取硫酸铵、超纯水，加热溶解后。混合均匀；
试剂5：按质量份配比为1：10取SDS、溴酚蓝，按体积份配比15：5：5：4取甘油、TBE、巯基乙醇、超纯水，将上述物质混合加热溶解后，混合均匀；
试剂6：按质量份配比为2：29：6取SDS、甘氨酸、TBE，并取200体积份超纯水，将上述物质加热溶解后，混合均匀；
试剂7：按体积份配比为450：100：450，取甲醇、冰醋酸和双蒸水，取1质量份的考马斯亮蓝，将上述物质混合加热溶解后，混合均匀。
将试剂1-7放置于4℃或常温环境中保存。
使用时，将试剂6和试剂7从试剂盒中取出置于室温储存，用时分别振荡。将试剂盒中试剂5置于37℃水中水浴加热30min。
采用本发明进行蛋白质快速分离和染色的方法同实施例1。
本实施例最后所得的SDS-PAGE电泳图如图2所示。
Claims (10)
1. 一种通用型聚丙烯酰胺凝胶蛋白质快速分离和染色试剂盒，其特征在于，包括7种试剂，其组分配比如下：
试剂1：分析纯甘油和水的体积份配比为1：5~8；
试剂2：甲叉丙烯酰胺和丙烯酰胺的质量份配比为1：15~40，TBE或TAE和水的体积份配比为1：2~4；
试剂3：SDS和水的质量份配比为1：10~15；
试剂4：硫酸铵和水的质量份配比为1：10~15；
试剂5：SDS和溴酚蓝的质量份配比为1:10~15，甘油、TBE、巯基乙醇和水的体积份配比为15~20：4~6：5~8：3~5；
试剂6：SDS、甘氨酸和TBE的质量份配比为2~5：25~30：6~10，水为200~220体积份；
试剂7：甲醇、冰醋酸和水的体积份配比为400~450：100~120：450~500，考马斯亮蓝为1质量份。
2.如权利要求1所述的一种通用型聚丙烯酰胺凝胶蛋白质快速分离和染色试剂盒，其特征在于：试剂3中SDS与水的质量份配比为1:10。
3.如权利要求1所述的一种通用型聚丙烯酰胺凝胶蛋白质快速分离和染色试剂盒，其特征在于：试剂4中硫酸铵与水的质量份配比为1:10。
4.如权利要求1所述的一种通用型聚丙烯酰胺凝胶蛋白质快速分离和染色试剂盒，其特征在于：试剂5中，SDS和溴酚蓝的质量份配比为1：10，甘油、TBE、巯基乙醇和水的体积份配比为15：5：5：4。
5.如权利要求1所述的一种通用型聚丙烯酰胺凝胶蛋白质快速分离和染色试剂盒，其特征在于：试剂6中，SDS、甘氨酸、TBE的质量份配比为2:29:6，水为200体积份。
6.如权利要求1所述的一种通用型聚丙烯酰胺凝胶蛋白质快速分离和染色试剂盒，其特征在于：试剂7中，甲醇、冰醋酸和水的体积份配比为450：100：450，考马斯亮蓝为1质量份。
7.如权利要求1-6任一所述的一种通用型聚丙烯酰胺凝胶蛋白质快速分离和染色试剂盒，其特征在于：所述的水为双蒸水、去离子水、超纯水或纯水中一种或多种组合。
8.如权利要求1-6任一所述的一种通用型聚丙烯酰胺凝胶蛋白质快速分离和染色试剂盒，其特征在于：将试剂1-7任一一种试剂通过加热、震荡或其它促进溶解的方法加速其中组分的溶解并混合均匀。
9.如权利要求1所述的一种通用型聚丙烯酰胺凝胶蛋白质快速分离和染色试剂盒，其特征在于：对试剂7使用后的溶液进行离心、过滤或采用其它纯化方法，制得的上清液、滤液或纯化物作为试剂7回用。
10.如权利要求1-6任一所述的一种通用型聚丙烯酰胺凝胶蛋白质快速分离和染色试剂盒，其特征在于：将试剂1-7放置于4℃或常温环境中保存。
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