CN111610077B - 蛋白质电泳染色液、试剂盒及染色方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蛋白质电泳染色液，该染色液中包含有考马斯亮蓝、浓盐酸和水。本发明还公开了用该染色液进行蛋白质SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳条带染色的方法。本发明通过改进蛋白质电泳染色液的配方，提升了蛋白质电泳条带染色的效果，加快了染色、脱色速度，同时确保了染色液对人体的安全性，特别适合用于SDS‑PAGE或非变性PAGE等蛋白凝胶的无污染、快速、高灵敏染色，或Western转膜后PAGE胶上残余蛋白的检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域，特别是涉及蛋白质电泳，更具体地说，是涉及蛋白质电泳条带染色液的配方，及使用该染色液进行染色、脱色的方法。
背景技术
聚丙烯酰胺凝胶电泳技术是目前分析蛋白质组分和检测的最基本方法，可以分离蛋白并测定蛋白质的相对分子量和蛋白纯度，还可以用于蛋白的分离纯化。聚丙烯酰胺凝胶电泳的染色方法很多，常用到的有氨基黑染色、考马斯亮蓝染色、银染色和荧光染色等方法。
其中，考马斯亮蓝染色由于比氨基黑染色灵敏度更高，比银染色操作更简便，并且重复性高，具有非常好的质谱兼容性，是目前最为常用的蛋白凝胶电泳染色方法。其原理是考马斯亮蓝可与蛋白质形成较强的非共价复合物。考马斯亮蓝分子上的芳香苯环与蛋白质的疏水区结合，同时考马斯亮蓝分子上的亚硫酸基团与蛋白质的正电荷结合，在可见光下显蓝色。根据考马斯亮蓝的光谱特性还可进一步估算溶液中蛋白质的含量，在595 nm的最大吸收波长下测量溶液的光学吸光度，该方法具有高灵敏度，最高可辨别5μg的蛋白质。
考马斯亮蓝有G-250和R-250两种。考马斯亮蓝G-250由于与蛋白质的结合反应十分迅速，常用来作为蛋白质含量的测定。考马斯亮蓝R-250与蛋白质反应虽然比较缓慢，但是可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。根据科学出版社2001年出版的《蛋白质技术手册》，经典的R250考马斯亮蓝配方是：每升考马斯亮蓝染液含考马斯亮蓝R-2501.0g、甲醇450ml、蒸馏水450ml、冰醋酸100ml；每升脱色液含甲醇100ml、冰醋酸100ml、蒸馏水800ml。考马斯亮蓝染色的常规方法是：1)将胶移入一个小的盛有少量考马斯亮蓝的容器内，或将玻璃板连同凝胶浸在染料中轻轻振荡直至凝胶脱落；2)对于0.75mm的凝胶，可在据床上缓慢震荡5-10min；对于1.5mm的凝胶，则为10-20min；3)弃去染液，将凝胶在水中漂洗数次；4)加入考马斯亮蓝脱色液(约50ml)，清晰的条带很快会显现出来，大部分凝胶脱色需要1 h，使用过的脱色液则可用水冲洗掉。为了脱色完全，需数次更换脱色液并震荡过夜。该方法的缺点是灵敏度不高，检测下限仅为200-500ng，背景较高，而且染色液中含有对人体有害的甲醇、冰醋酸等。
目前市售的考马斯亮蓝染色液存在的主要问题是染色和脱色时间长、灵敏度低（检测下限仅为200-500ng），且含有剧毒的甲醇及强刺激性的乙酸。
目前也有针对经典考马斯亮蓝配方进行的改进，如中国发明专利CN104004382B，采用了加入可溶性淀粉的方案，可以在20 min内完成染色，然而淀粉在溶液中保质期短，并且该可溶性淀粉的制作最长需要7天，步骤繁琐，因此限制了这一技术的使用。
因此，蛋白染色领域中需要一种成本低、制备简便、环保无毒害、储存时间长、重复性高且具有非常好的质谱兼容性的染色配方。除此之外，还需要解决染色、脱色时间过长的问题，现行的配方染色时间通常要达到30min以上才能达到较好的实验结果。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供一种蛋白质电泳染色液，它配方简单，染色效果好，染、脱色速度快，且无毒无害，成本低。
为解决上述技术问题，本发明的蛋白质电泳染色液，配方中包含有考马斯亮蓝、浓盐酸和水。
所述考马斯亮蓝可以使用考马斯亮蓝G-250、考马斯亮蓝R-250中的一种或两种。每升该蛋白质电泳染色液中，所述考马斯亮蓝G-250的用量优选为30～500 mg/L，进一步优选为250 mg/L；所述考马斯亮蓝R-250的用量优选为200～500 mg/L，进一步优选为300 mg/L；所述浓盐酸的用量优选为3～20 ml/L，进一步优选为15 ml/L。
较佳的，所述染色液的配方中还可以进一步添加甘油、香精、海藻糖、吐温20中的一种或多种。甘油无色、透明、无臭、粘稠液体，具有吸湿性，在高浓度下能有效降低凝胶在加热过程中发生膨胀、蜷曲，增强染色效果，降低所需染色时间。香精能改善染色液的气味。海藻糖具有极强的耐热性和强大的保湿能力，能防止过热引起的凝胶溶解、蛋白条带扩散，同时能大大延长染色后凝胶的保存时间。吐温20能增大染液极性，使染液能更好地进入凝胶内部，从而有效减少染色时间。
每升该蛋白质电泳染色液中，所述甘油的用量优选为80～120 ml/L，进一步优选为100 ml/L；所述香精的用量优选为1 ml/L；所述海藻糖的用量优选为10～30 g/L，进一步优选为20 g/L；所述吐温20的用量优选为0.1～3 g/L，进一步优选为1 g/L。
上述蛋白质电泳染色液的酸度可以是4.5～16，优选为14。
本发明要解决的技术问题之二是提供用上述染色液进行蛋白质SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳条带染色的方法，该方法包括以下步骤：
1）用水振荡清洗蛋白质SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结束后所得到的凝胶；
2）用热水振荡清洗步骤1）所得凝胶；
3）用水清洗步骤2）所得凝胶；
4）向步骤3）所得凝胶中加入所述染色液，加热，但不煮沸，进行振荡染色；
5）倒掉染色液，加水，振荡脱色。
上述步骤1）和步骤3）中的清洗步骤，优选用去离子水（用量一般为50～100ml）振荡清洗凝胶1～2min，倒掉清洗的水，重复两次。
上述步骤2)中，热水振荡清洗的目的在于溶解凝胶中的SDS，降低其对蛋白条带染色的影响。可以将凝胶和去离子水（用量一般为50～100ml）一起用微波炉加热至接近沸腾，但避免煮沸，然后在摇床上振荡清洗2～5 min。
上述步骤4)中，优选为将清洗的凝胶浸没在本发明的蛋白质电泳染色液（用量一般为30～50ml）中，加热所述染色液1～2min至接近沸腾（但避免煮沸），然后在摇床上振荡染色5～15min。高温可以加速蛋白条带的着色，使凝胶染色在较短的时间内完成。加热方式优选为微波炉加热，微波炉腔内能够产生2.4GHZ的高频电磁场，带动水分子及相邻分子剧烈运动，从而加速考马斯亮蓝分子穿透凝胶，与凝胶中的蛋白快速结合。同时微波炉能够穿透水溶液5cm以上，不会因为受热不均匀产生凝胶膨胀或卷缩的现象。
上述步骤5）中，优选为加入去离子水（用量一般为50～100ml），在摇床上振荡脱色5～10min，倒掉脱色液，重复3次。
本发明要解决的技术问题之三是提供包含有上述染色液的蛋白质电泳染色试剂盒。
本发明要解决的技术问题之四是提供上述染色液的用途。该蛋白质电泳染色液可以应用于SDS-PAGE或非变性PAGE蛋白凝胶的染色，或Western转膜后PAGE胶上残余蛋白的检测。
与传统的蛋白质电泳染色液相比，本发明的蛋白质电泳染色液及染色方法，具有以下优点和有益效果：
1.环保。传统染色液染色、脱色时间长，长时间泡水会导致凝胶中蛋白扩散，需要使用乙酸、甲醇来固定蛋白；本发明的染色液染色速度快，蛋白扩散不明显，不需要使用乙酸、甲醇来固定蛋白。另外，使用传统染色液，由于染料用量大，在脱色时，需要使用乙酸、甲醇或乙醇等有毒有害溶剂帮助溶解染料来加快脱色；而使用本发明的染色液，由于染料用量少，背景染色低，在脱色时，不需要乙酸、甲醇或乙醇促进染料溶解，用少量盐酸即可代替乙酸提供酸性，只需用水即可快速脱色，因此对人体健康和环境无害。
2.染色、脱色速度快，灵敏度高。
本发明的染色液特异性强，染料可以选择性与蛋白结合，最快可以在10min内看到染色的条带，而传统的染色方法最快需要2h以上，甚至有些时候需要染色过夜。因此本发明的染色液可以进行快速染色，大大缩短染色时间。
使用本发明的染色液进行染色，因为染料用量低，背景色浅，无需脱色即可进行初步观察，最快可以在15-20min内脱去背景色，而使用传统配方染色液进行染色，脱色过程一般需要5-8h，经常需要脱色过夜。因此使用本发明的染色液可以极大缩短脱色时间，为科研或生产人员节约时间成本。
另外，本发明的染色液配方中添加的甘油、海藻糖和吐温20，也有助于增强染色效果，减少染色时间。
经试验，使用本发明的染色液染色10min即可检测到20ng条带，约20min可检测到10ng条带，约30min可检测到5ng条带，约70min即可按照最大灵敏度完成整个染、脱色过程，获得清晰无背景的蛋白条带；不要求最大灵敏度时只需10min即可完成染色，而且无需脱色，只要用水冲洗去掉浮色即可观察，总时间可控制在12min内，灵敏度在20ng左右。
3.制备简便，成本低。本发明的配方不含有乙酸、甲醇或乙醇等溶剂，而且考马斯亮蓝G250和R250的含量也比传统的配方要低很多，因此可以大大节约成本。
4.染色后凝胶的保存时间长。本发明的配方中含有海藻糖，可以延长染色后凝胶的保存时间。
附图说明
图1是不同质量的牛血清白蛋白BSA用实施例1的染色液进行染色的结果图。其中，M为蛋白标准品Markers；a图为染色10min效果图；b图为染色30min效果图；d图为脱色10min效果图；e图为脱色30min效果图。
图2是不同质量的牛血清白蛋白BSA用实施例2的染色液进行染色的结果图。其中，M为蛋白标准品Markers；a图为染色10min效果图；b图为染色30min效果图；d图为脱色10min效果图；e图为脱色30min效果图。
图3是不同质量的牛血清白蛋白BSA用实施例3的染色液进行染色的结果图。其中，M为蛋白标准品Markers；a图为染色10min效果图；b图为染色30min效果图；d图为脱色10min效果图；e图为脱色30min效果图。
图4是不同质量的牛血清白蛋白BSA用实施例4的染色液进行染色的结果图。其中，M为蛋白标准品Markers；a图为染色10min效果图；b图为染色30min效果图；d图为脱色10min效果图；e图为脱色30min效果图；f为脱色50min效果图。
图5是不同质量的牛血清白蛋白BSA用对照实施例1的市售染色液进行染色的结果图。其中，M为蛋白标准品Markers；a图为染色10min效果图；b图为染色30min效果图；c图为染色60min效果图。
图6是不同质量的牛血清白蛋白BSA用对照实施例2的传统染色液进行染色的结果图。其中，M为蛋白标准品Markers；b图为染色30min效果图；c图为染色60min效果图；g图为脱色过夜（10h）效果图；h图为进一步脱色（16h）效果图。
具体实施方式
为对本发明的技术内容、特点与功效有更具体的了解，现结合附图及具体实施例，对本发明的技术方案，详述如下：
以下各实施例所用凝胶如未作特殊说明，均为GenScript购买的预制胶，产品编号M00657。
所用牛血清白蛋白BSA如未作特殊说明，均购买自生工生物，产品编号B600036-0250，批号F304DA0001。
所用蛋白标准品Markers如未作特殊说明，均购买自赛默飞世尔，产品编号26616。
所用考马斯亮蓝染料G250、R250、甘油、香精、海藻糖、吐温20购买自生工生物。
所用甲醇和乙酸分别购自江苏彤晟化学试剂有限公司和江苏强盛功能化学股份有限公司。
实施例1
1.染色液的制备
分别称取250mg考马斯亮蓝G-250（CBB G-250）、300 mg考马斯亮蓝R-250（CBB R-250）、100 ml甘油、1 ml香精，20 g海藻糖，1 g吐温20，加入去离子水定容至985ml，搅拌2～4h，待考马斯亮蓝充分溶解后，加入15ml浓度为38%的浓盐酸，混合均匀后，溶液最终酸度为14。最后用不透光的瓶子分装保存。
2.SDS-PAGE电泳条带染色和脱色
1）蛋白凝胶电泳结束后，在一个塑料容器里，用100ml去离子水在摇床上振荡清洗凝胶1 min，倒掉清洗的水，重复两次。
2）加入100ml去离子水，用微波炉加热至近沸，但避免煮沸，然后在摇床上振荡清洗5 min。对于1.5mm厚度的凝胶需要延长振荡清洗的时间。
3）用100ml去离子水振荡清洗凝胶1min，倒掉清洗的水，重复两次。
4）加入50ml上述考马斯亮蓝复合配方染色液，用微波炉加热至近沸，但避免煮沸，然后在摇床上振荡染色10min，重复3次
5）倒掉染色液，用100ml去离子水振荡清洗凝胶，倒掉清洗的水，重复两次。
6）加入100ml去离子水，用微波炉加热至近沸，在摇床上振荡脱色10min，倒掉脱色后的溶液，重复3次。
3.染色结果
染色结果如图1所示，不同质量的牛血清白蛋白BSA，用本实施例的染色液，染色10min可见20ng条带，染色30min可见10ng条带，脱色10 min即可脱去大部分背景色，同时清晰看到5ng条带，甚至可以隐约看到2.5ng条带。脱色30min可以完全洗脱背景色，5ng条带清晰可见。
实施例2
1.染色液的制备
称取250mg考马斯亮蓝G-250（CBB G-250）、100 ml甘油、1 ml香精，20 g海藻糖，1g吐温20，加入去离子水定容至985ml，搅拌2～4小时，待考马斯亮蓝充分溶解后，加入15ml浓度为38%的浓盐酸，混合均匀后，溶液最终酸度为14。最后用不透光的瓶子分装保存。
2.SDS-PAGE电泳条带染色和脱色
1）蛋白凝胶电泳结束后，在一个塑料容器里，用100ml去离子水在摇床上振荡清洗凝胶1 min，倒掉清洗的水，重复两次。
2）加入100ml去离子水，用微波炉加热至近沸，但避免煮沸，然后在摇床上振荡清洗5 min。对于1.5mm厚度的凝胶需要延长振荡清洗的时间。
3）用100ml去离子水振荡清洗凝胶，倒掉清洗的水，重复两次。
4）加入50 ml上述考马斯亮蓝复合配方染色液，用微波炉加热至近沸，但避免煮沸，然后在摇床上振荡染色10min，重复3次。
5）倒掉染色液，用100ml去离子水振荡清洗凝胶，倒掉清洗的水，重复两次。
6）加入100 ml去离子水，用微波炉加热至近沸，在摇床上振荡脱色10min，倒掉脱色液，重复3次。
3.染色结果
染色结果如图2所示。与实施例1相比，实施例2的染色灵敏度相同，同样可达5ng，但是条带颜色偏绿，相比实施例1浅，清晰度相对低一些。
实施例3
1.染色液的制备
称取300 mg考马斯亮蓝R-250（CBB R-250）、100 ml甘油、1 ml香精，20 g海藻糖，1g吐温20，加入去离子水定容至985ml，搅拌2～4 h，待考马斯亮蓝充分溶解后，加入15ml浓度为38%的浓盐酸，混合均匀后，溶液最终酸度为14。最后用不透光的瓶子分装保存。
2.SDS-PAGE电泳条带染色和脱色
1）蛋白凝胶电泳结束后，在一个塑料容器里，用100ml去离子水在摇床上振荡清洗凝胶1 min，倒掉清洗的水，重复两次。
2）加入100 ml去离子水，用微波炉加热至近沸，但避免煮沸，然后在摇床上振荡清洗5 min。对于1.5mm厚度的凝胶需要延长振荡清洗的时间。
3）用100ml去离子水振荡清洗凝胶，倒掉清洗的水，重复两次。
4）加入50 ml上述考马斯亮蓝复合配方染色液，用微波炉加热至近沸，但避免煮沸，然后在摇床上振荡染色10min，重复3次。
5）倒掉染色液，用100ml去离子水振荡清洗凝胶，倒掉清洗的水，重复两次。
6）加入100 ml去离子水，微波炉加热至近沸，在摇床上振荡脱色10 min，倒掉脱色液，重复3次。
3.染色结果
染色结果如图3所示。染色10min可见39ng条带，而且几乎没有背景染色，染色30min可达5ng条带，与实施例1相同，但是在脱色30 min后，低浓度的蛋白条带被洗去颜色，只能看到10ng条带。
实施例4
1.染色液的制备
分别称取250mg考马斯亮蓝G-250（CBB G-250）、300mg考马斯亮蓝R-250（CBB R-250）、100 ml甘油、1 ml香精，20 g海藻糖，1g吐温20，加入去离子水定容至980ml，搅拌2～4h，待考马斯亮蓝充分溶解后，加入20ml浓度为38%的浓盐酸，混合均匀后，溶液最终酸度为16。最后用不透光的瓶子分装保存。
2.SDS-PAGE电泳条带染色和脱色
1）蛋白凝胶电泳结束后，在一个塑料容器里，用100ml去离子水在摇床上振荡清洗凝胶1 min，倒掉清洗的水，重复两次。
2）加入100ml去离子水，用微波炉加热至近沸，但避免煮沸，然后在摇床上振荡清洗5 min。对于1.5mm厚度的凝胶需要延长振荡清洗的时间。
3）用100ml去离子水振荡清洗凝胶，倒掉清洗的水，重复两次。
4）加入50ml上述考马斯亮蓝复合配方染色液，用微波炉加热至近沸，但避免煮沸，然后在摇床上振荡染色10min，重复3次
5）倒掉染色液，用100ml去离子水振荡清洗凝胶，倒掉清洗的水，重复两次。
6）加入100ml去离子水，用微波炉加热至近沸，在摇床上振荡脱色10min，倒掉脱色液，重复3次。
3.染色结果
染色结果如图4所示。本实施例增加了盐酸用量，但是灵敏度反而降低，只有20ng。染色背景相比实施例1-3都要深，需要50min才能完全脱去背景色。
对照实施例1
1.染色液
使用市售Biofuraw牌考马斯亮蓝复合配方染色液（产品编号180-7001）。
2.SDS-PAGE电泳条带染色（染色操作方法参照该市售染色液的产品说明书）
1）蛋白凝胶电泳结束后，在一个塑料容器里，用100ml去离子水在摇床上振荡清洗凝胶1 min，倒掉清洗的水，重复两次。
2）加入100ml去离子水，用微波炉加热至近沸，但避免煮沸，然后在摇床上振荡清洗5 min。对于1.5mm厚度的凝胶需要延长振荡清洗的时间。
3）用100ml去离子水振荡清洗凝胶，倒掉清洗的水，重复两次。
4）加入50ml上述市售考马斯亮蓝复合配方染色液，然后在摇床上振荡染色10min，此时可以观察蛋白条带的染色情况，继续染色至1h。
5）倒掉染色液，用100ml去离子水振荡清洗凝胶，倒掉清洗的水，重复两次。
3.染色结果
染色结果如图5所示，染色灵敏度仅为39ng，染色30min只能看见39ng条带，染色1h只能看见78ng条带。
对照实施例2
1. 经典配方染色液的制备
分别量取450ml甲醇和100ml乙酸混匀，用双蒸水补足至1L，加入1.0 g考马斯亮蓝R-250（CBB R-250），充分搅拌2～4 h，待考马斯亮蓝充分溶解。最后用不透光的瓶子分装保存。
2.脱色液的制备
分别量取100ml甲醇和100ml乙酸混匀，用双蒸水补足至1L。
3.SDS-PAGE电泳条带染色和脱色
1）蛋白凝胶电泳结束后，在一个塑料容器里，用100ml去离子水在摇床上振荡清洗凝胶1 min，倒掉清洗的水，重复两次。
2）加入100ml去离子水，用微波炉加热至近沸，但避免煮沸，然后在摇床上振荡清洗5 min。对于1.5mm厚度的凝胶需要延长振荡清洗的时间。
3）用100ml去离子水振荡清洗凝胶，倒掉清洗的水，重复两次。
4）加入50ml上述考马斯亮蓝经典配方染色液，用微波炉加热至近沸，但避免煮沸，然后在摇床上振荡染色1h。
5）倒掉染色液，用100ml去离子水振荡清洗凝胶，倒掉清洗的水，重复两次。
6）加入100ml脱色液，在摇床上振荡脱色30min，倒掉脱色液，重复3次。然后加入100 ml脱色液在摇床上脱色过夜。
3.染色结果
对照实施例2采用传统染色液配方，染色结果如图6所示，使用该传统染色液染BSA蛋白条带时，清楚的条带仅78ng，39ng的条带已经非常模糊，而且染、脱色时间长，脱色需要过夜才能看到清楚的条带，甚至脱色过夜背景染色依然存在。此外，试剂耗费量大，胶体膨胀易碎。
表1 各实施例染色液配方和BSA蛋白染色灵敏度对比
。
Claims (8)
1.蛋白质电泳染色液，其特征在于，所述染色液中包含有考马斯亮蓝G-250、考马斯亮蓝R-250、浓盐酸和水；所述染色液的染色温度为使该染色液接近沸腾但不沸腾的温度；
所述染色液中，所述考马斯亮蓝G-250的含量为30～500mg/L，所述考马斯亮蓝R-250的含量为200～500mg/L，所述浓盐酸的含量为3～20ml/L；
所述染色液中，甘油的含量为80～120ml/L，海藻糖的含量为10～30g/L，吐温20的含量为0.1～3g/L；
所述染色液的酸度为4.5～16。
2.根据权利要求1所述的染色液，其特征在于，所述考马斯亮蓝G-250的含量为250mg/L，所述考马斯亮蓝R-250的含量为300mg/L，所述浓盐酸的含量为15ml/L。
3.根据权利要求1所述的染色液，其特征在于，所述甘油的含量为100ml/L，所述海藻糖的含量为20g/L，所述吐温20的含量为1g/L。
4.根据权利要求1所述的染色液，其特征在于，所述染色液的酸度为14。
5.用权利要求1～4任一项所述染色液进行蛋白质SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳条带染色的方法，其特征在于，步骤包括：
1)用水振荡清洗蛋白质SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结束后所得到的凝胶；
2)用热水振荡清洗步骤1)所得凝胶；
3)用水清洗步骤2)所得凝胶；
4)向步骤3)所得凝胶中加入所述染色液，加热，但不煮沸，进行振荡染色；
5)倒掉染色液，加水，振荡脱色。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤1)和步骤3)，用50～100ml去离子水振荡清洗凝胶1～2min，倒掉清洗的水，重复两次；所述步骤2)，加入50～100ml去离子水，用微波炉加热至接近沸腾，但避免煮沸，然后在摇床上振荡清洗2～5min；所述步骤4)，加入30～50ml所述染色液，用微波炉加热至接近沸腾，但避免煮沸，然后在摇床上振荡染色5～15min；所述步骤5)，加入50～100ml去离子水，在摇床上振荡脱色5～10min，倒掉脱色液，重复3次。
7.蛋白质电泳染色试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含有权利要求1～4任一项所述的染色液。
8.权利要求1～4任一项所述染色液的用途，其特征在于，用于SDS-PAGE或非变性PAGE蛋白凝胶的染色，或Western转膜后PAGE胶上残余蛋白的检测。
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