TWI579551B - 收集元件與具有該元件之樣本處理套組 - Google Patents

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TWI579551B
TWI579551B TW104121502A TW104121502A TWI579551B TW I579551 B TWI579551 B TW I579551B TW 104121502 A TW104121502 A TW 104121502A TW 104121502 A TW104121502 A TW 104121502A TW I579551 B TWI579551 B TW I579551B
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文聰 胡
陳貞伶
楊正偉
徐韋凡
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Description

收集元件與具有該元件之樣本處理套組
本發明是有關於一種樣本分離與收集套組，且特別是有關於一種可拆式收集元件與具有該元件之樣本處理套組。
微流體技術被廣泛應用於生物、醫藥以及生化領域之中，而離心微流體平台已普遍被用作研究工具。在離心微流體平台中，由於樣本非連續流體輸入的設計，使得離心微流體裝置不適於處理大容量的樣本，且無法作為商業銷售或使用的測試平台或套組。此外，利用離心微流體平台所處理分離之樣本常需要進一步抽取或收集以供後續其他檢驗或測試，亦需要有更佳收集樣本的方法。
本發明提供一種樣本處理套組，包括至少一離心微流碟片以及至少一收集元件。收集元件以可拆卸的方式嵌入離心微流 碟片。藉由使用此樣本處理套組，目標分子或細胞可利用密度梯度分離於離心微流碟片中分離開來且收集至收集元件中。而且，本發明之樣本處理套組可應用於注入連續流體的自動工作站，因此可輕易處理大量樣本。
本發明涉及一種樣本處理套組，包括至少一離心微流元件以及至少一收集元件。離心微流元件包括用以載入生物樣本的樣本入口、分離槽、沉降槽以及用以緊密嵌入收集元件的嵌合部位。樣本入口以同心圓或偏心圓的方式配置，並且在旋轉期間，可連續或間續地用以載入生物樣本至離心微流元件中。收集元件是以可拆卸的方式嵌入嵌合部位。分離槽連接樣本入口以及沉降槽連接分離槽，其中在沉降槽以及分離槽中包含密度梯度溶液。在離心的過程中，生物樣本經處理後分離成待收集的部分以及剩餘的部分，待收集的部分會進入分離槽，剩餘的部分則會進入沉降槽。收集元件包括晶片主體。晶片主體其上具有進入口且其內部具有收集槽。具有進入口的收集槽與用以接收生物樣本的離心微流碟片的分離槽相連接。
在本發明亦提供一種收集元件，可應用於樣本處理套組的離心微流碟片。收集元件包括晶片主體。晶片主體其上具有進入口且其內部具有收集槽。具有進入口的收集槽與離心微流碟片的分離槽經流道相連接。生物樣本自離心微流碟片的樣本入口注入並且經過離心微流碟片的分離槽後分離，會收集於收集元件的收集槽。
為讓本發明的上述特徵和優點能更明顯易懂，下文特舉實施例，並配合所附圖式作詳細說明如下。
10、20、30‧‧‧樣本處理套組
100、500、600‧‧‧碟片
102、502A、502B、502C、602A、602B、602C‧‧‧樣本入口
103、503A、503B、503C、603A、603B、603C‧‧‧連結通道
104、504A、504B、504C、604A、604B、604C‧‧‧分離槽
104b‧‧‧分離槽的一端
105‧‧‧密度梯度溶液
106、506A、506B、506C、606A、606B、606C‧‧‧沉降槽
110、510A、510B、510C、610A、610B、610C‧‧‧傳送通道
120、620A、620B、620C‧‧‧試劑入口
122、522A、522B、522C、622A、622B、622C‧‧‧匯流點
124、624A、624B、624C‧‧‧連通通道
130‧‧‧軸孔
150、150A、550A、550B、550C、650A、650B、650C‧‧‧凹槽
200、200A‧‧‧收集元件
202、202’‧‧‧晶片主體
203‧‧‧支臂部分
202a‧‧‧上表面
204‧‧‧進入口
206‧‧‧收集槽
206a‧‧‧壁狀結構
206b‧‧‧部分
208‧‧‧廢料出口
400‧‧‧自動工作站
410‧‧‧泵
420‧‧‧旋轉平台
621A、621B、621C‧‧‧儲存槽
623A、623B、623C‧‧‧清洗通道
625‧‧‧清洗入口
625A、625B、625C‧‧‧端部
626A、626B、626C‧‧‧接點
A、B、C‧‧‧處理部分
HC‧‧‧重細胞
LC、LC’‧‧‧輕細胞
R‧‧‧試劑
V1、V2、V3、V4、V5、V6‧‧‧夾緊閥
X、Y‧‧‧厚度方向
為了更理解本發明，所附圖式併入並構成本說明書的一部分。圖式參酌實施方式說明本發明的實施例，並且用以理解本發明的原理。
圖1A是根據本發明實施例的樣本處理套組的立體示意圖。
圖1B是根據圖1A所示樣本處理套組的收集元件的上視圖。
圖1C是根據圖1A所示樣本處理套組的收集元件的剖面示意圖。
圖1D是根據本發明另一實施例的樣本處理套組的收集元件的上視圖。
圖1E是根據本發明另一實施例的樣本處理套組的收集元件的剖面示意圖。
圖2是根據本發明另一實施例的樣本處理套組的立體示意圖。
圖3A是根據本發明另一實施例的樣本處理套組的立體示意圖。
圖3B是根據圖3A所示樣本處理套組的收集元件的上視圖。
圖3C是根據圖3A所示樣本處理套組的收集元件的剖面示意圖。
圖4A是根據本發明一實施例沿著位於樣本處理套組中的離心微流碟片一部分的厚度方向剖面示意圖。
圖4B是根據本發明一實施例沿著位於樣本處理套組中的收集元件一部分的厚度方向剖面示意圖。
圖5A是根據本發明一實施例的離心微流碟片的立體示意圖。
圖5B至圖5E是根據圖5A所示離心微流碟片的各種剖面示意圖。
圖6A是根據本發明另一實施例的離心微流碟片的立體示意圖。
圖6B至圖6G是根據圖6A所示離心微流碟片的不同剖面示意圖。
圖7是根據本發明實施例的自動工作站示意圖。
圖8是根據本發明實施例之樣本處理套組的流速與細胞株MCF7的回收率之關係圖。
圖9繪示不同種類的細胞株的回收率。
所有圖式和詳細實施方式使用相同的參考數字以指示相同的元件。本發明將透過結合所附圖式及下列的詳細實施方式而更加淺顯易懂。
本發明涉及一種可拆式收集元件以及一種樣本處理套組。可拆式收集元件以可拆卸的方式嵌入離心微流碟片。樣本處 理套組包括可拆式收集元件以及離心微流碟片。樣本處理套組可利用密度梯度來處理(即分離、收集及/或標記)載入離心微流碟片內的細胞或目標分子。此外，本發明的樣本處理套組可經由一種自動工作站來操作離心微流碟片以及執行生物樣本的處理。
本發明所揭露的樣本處理套組可應用於處理不同種類的樣本，包括所有的血液樣本、血漿流體、尿液或者其他體液或生物流體。
圖1A是根據本發明實施例的樣本處理套組的立體示意圖。圖1B是圖1A所示樣本處理套組的收集元件的上視圖，而圖1C是圖1A所示樣本處理套組的收集元件的剖面示意圖。圖1C的剖面是橫切於圖1A的收集元件的厚度方向。
請參照圖1A，樣本處理套組10至少包括離心微流碟片100以及收集元件200。收集元件200是可移動的及可拆卸的，並且能夠嵌入或垂直插入離心微流碟片100的凹槽150中。已嵌入的收集元件200直立於微流碟片100。也就是說，在收集元件200嵌入碟片後，收集元件200的厚度方向X會實質上垂直於微流碟片100的厚度方向Y。離心微流碟片100可以是圓形或橢圓形碟片，且微流碟片100可以是由數個薄切片組裝或彼此堆疊後製造而得。微流碟片100的材質可以是塑膠材料，例如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或其他熱塑性塑料。微流碟片100的直徑可以是在6與18公分之間，舉例而言，微流碟片100的直徑以12至14公分為較佳。微流碟片100包括多於一個的軸孔130，用以容納旋 轉軸。儘管離心微流碟片稱為「碟片」，但其事實上是離心微流處理元件，且用詞「碟片」並非用以限制元件的形狀或外形設計。
請參照圖1A，微流碟片100至少包括樣本入口102、分離槽104以及沉降槽106。樣本入口102位於碟片100的中央部位，且樣本可藉由樣本入口102載入至碟片100。分離槽104藉由連結通道103與樣本入口102連接。連結通道103與分離槽104共同設計成自中央的樣本入口102向外盤旋的螺旋形。分離槽104具有弧形以及分離槽104的弧形部(弧形部實質上沿著碟片的圓周邊緣)所具有的長約為2至20公分及寬約為0.1至2公分。
連結通道103(其連接樣本入口至圓周部分)之長度尺寸大約為0.1至1公分。
沉降槽106配置環繞分離槽104，但與分離槽104兩者之間存在間距且相互分離。沉降槽106藉由位於彼此之間的連接部107與分離槽104連接，以致導入流體可於分離槽104與沉降槽106之間流動。連結通道103的一端物理連接樣本入口102，而分離槽104的一端104b物理連接匯流點122。微流碟片100還包括位於微流碟片100周圍部分的凹槽150。凹槽150配置用以容納可拆式收集元件200。也就是說，凹槽150的形狀應設計成與收集元件200緊密嵌合。
原則上，凹槽可被視為嵌合部位，且收集元件藉由緊密嵌合的機制而嵌入嵌合部位。
如圖1A所示，碟片100又包括化學物入口或試劑入口 120，位於碟片100的中央位置，而反應試劑可以藉由試劑入口120載入至碟片100。試劑入口120與樣本入口102皆為圓形開口，但試劑入口120與樣本入口102為不同尺寸，並以同心圓(concentric)或偏心圓的方式配置於不同層。位於上層的試劑入口120具有大於位於下層的樣本入口102的尺寸。試劑入口120藉由連通通道124連接匯流點122。分離的樣本或試劑流經匯流點122後，更進一步藉由傳送通道110流入嵌入凹槽150的收集元件200。傳送通道110的端點其功能是作為分離的樣本或試劑的出口。匯流點122垂直延伸而與位於上層的傳送通道110及位於下層的分離槽104相通。分離的樣本可藉由匯流點122與傳送通道110自分離槽104的一端104b流入嵌入凹槽150的收集元件200內。由試劑(化學物)入口120載入的試劑之流徑與由樣本入口載入的樣本之流徑位於不同層且所流經的路線也不相同。收集元件200可於後續步驟中自碟片移除。
參照圖1B至圖1C，收集元件200包括晶片主體202，晶片主體202其上表面202a具有進入口204。進入口204通向位於晶片主體202內部的收集槽206。如圖1C所示，收集槽206連接至少一個廢料出口208(此處例示為2個)，以使額外或不必要的流體或者操作緩衝溶液(running buffer)自廢料出口208排出。進入口204其功能事實上是作為入口，用以接收來自分離槽104並經由匯流點122及傳送通道110的樣本流體。如圖1A所示，當收集元件200插入微流碟片100時，得以接收分離的樣本或其他 流體。
在另一實施例中的收集元件，如圖1D至圖1E所示，收集元件200，包括晶片主體202，晶片主體202其上表面202a具有進入口204。此外，晶片主體202可進一步包括一或多個位於兩側的支臂部分203，以使晶片主體202易於嵌入凹槽150。然而，此部分設計是可選擇的。在圖1E中，收集槽206連接至少一個廢料出口208(此處例示為2個)。
收集元件200/200’的尺寸可以為例如：長度或寬度為0.3至5公分且厚度為0.1至5公分。收集槽206裝載的體積可例如為10微升至5毫升。收集元件200/200’可以是由數個薄切片組裝或彼此堆疊後製造而得。收集元件200/200’的材質可以是塑膠材料，例如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或其他熱塑性塑料。較佳地，收集元件200/200’可以是由2至4個切片彼此藉由防水黏著材料(water-proof adhesive materials)(例如PDMS)或者藉由超音波焊接(ultrasonic welding)或點膠(dispensing)或雙面膠(double tape)固定後製造而得。收集元件200/200’可藉由移除一或多個收集元件的上層切片來開啟而暴露出收集槽206以易於抽取樣本。經由上述方式，當所需樣本被收集至收集元件200/200’的收集槽206內時，其他切片會被移除且只有保留有樣本的晶片主體(即包含收集槽的切片)會被保存下來進一步實驗。
圖2是根據本發明另一實施例的樣本處理套組的立體示意圖。樣本處理套組20至少包括離心微流碟片100以及收集元件 200A。微流碟片100的凹槽150A位於微流碟片100的邊緣部分且凹槽150A側向開放並直接朝向外部環境。凹槽150A同樣配置用以容納可拆式收集元件200A。也就是說，凹槽150A的形狀應設計成與收集元件200A緊密嵌合。收集元件200A是可移動的及可拆卸的，並且能夠側向插入離心微流碟片100的凹槽150A中。在收集元件200A嵌入碟片後，收集元件200A的厚度方向X會實質上垂直於微流碟片100的厚度方向Y。在本實施例中的離心微流碟片100和收集元件200A與在先前實施例中的離心微流碟片100和收集元件200相似，差別在於凹槽的位置和嵌入的方式不同。因此，微流碟片和收集元件的細節在此可省略不再贅述。
圖3A是根據本發明另一實施例的樣本處理套組的立體示意圖。樣本處理套組30至少包括離心微流碟片100以及收集元件200B。與圖1A中的離心微流碟片100的差異在於，圖3A中的離心微流碟片100僅包括一個軸孔130，其位於樣本入口102的中心用以容納旋轉軸。
如圖3A所示，微流碟片100的凹槽150A位於微流碟片100的邊緣部分且凹槽150A側向開放並直接朝向外部環境。凹槽150A同樣配置用以容納可拆式收集元件200B。也就是說，凹槽150A的形狀應設計成與收集元件200B緊密嵌合。收集元件200B是可移動的及可拆卸的，並且能夠側向插入離心微流碟片100的凹槽150A中。在收集元件200B嵌入碟片後，收集元件200B的厚度方向X會實質上垂直於微流碟片100的厚度方向Y。與先前 的實施例相比，在本實施例中離心微流碟片100和收集元件200B的相似的部分或結構在此可省略不再贅述。圖3B是圖3A所示樣本處理套組的收集元件的上視圖，而圖3C是圖3A所示樣本處理套組的收集元件的剖面示意圖。圖3C的剖面是橫切於圖3A的收集元件的厚度方向。
參照圖3A至圖3C，收集元件200B包括晶片主體202，晶片主體202其上表面202a具有進入口204。進入口204通向位於晶片主體202內部的收集槽206。如圖3A及3C所示，收集槽206經由多個壁狀結構206a被分成數個半連接的部分206b。收集槽206連接至少一個廢料出口208(此處例示為1個)，以使額外或不必要的流體或者運轉溶液自廢料出口208排出。進入口204其功能事實上是作為入口，用以接收來自分離槽104的樣本流體或是經由匯流點122及傳送通道110的試劑。如圖3A至3B所示，進入口204位於上表面202a的周圍部分，而不是位在如圖1B中所示的中央位置。當收集元件200B插入微流碟片100時，進入口204面向凹槽150A的一側以接收流體。
於腫瘤(tumor)轉移的過程中，在初步位置的侵入性腫瘤細胞傾向於使細胞流瀉至血流，轉移至其他器官而生長成新腫瘤。然而，血流中的這些轉移細胞(metastasized cells)是難以定位的，因為這些轉移細胞與血液細胞(hernatologic cells)相比是非常稀少的(大約每一億個細胞中僅有一個腫瘤細胞)。值得注意的是，在血液內循環的這些轉移細胞例如循環性癌細胞(CTCs)， 可有助於提供腫瘤轉移及/或特殊療法的療效所相關的潛在預測資訊。為實驗所需，這些稀罕細胞(rare cells)例如循環性癌細胞，可自血液樣本分離或收集。
在以下實施例中，所有血液作為生物樣本的範例，而自所有血液分離與收集的稀罕細胞可用於描述樣本處理套組以及相關的自動工作站的運作。
圖4A是根據本發明一實施例沿著位於樣本處理套組中的離心微流碟片一部分的厚度方向剖面示意圖。為了說明細胞或分子分離的原理，圖4A著重於分離槽和沉降槽的部分。密度梯度溶液105在樣本載入前，首先被載入至分離槽104以及沉降槽106。密度梯度溶液105例如是Ficoll-Paque溶液(Ficoll-paqueTM plus GE Healthcare,No.17-1440-02)。於碟片100旋轉的期間，離心力驅動流體(流體樣本以及緩衝液)自中央的樣本入口102徑向地向外流動，向外沿著連結通道103與分離槽104的螺旋形，接著朝向配置靠近於碟片100的圓周邊緣且環繞分離槽104的沉降槽106向外流動。意即，流體樣本例如血液樣本，其包含了輕細胞(light cells)LC以及重細胞(heavy cell)HC，自樣本入口載入並且流動至分離槽104(流向如箭頭所示)。藉由離心力的作用以及密度梯度溶液105的篩選，輕細胞LC或小分子懸浮在分離槽104中，並自分離槽104進一步流動至收集槽(流向如箭頭所示)，而重細胞HC或大分子沉降並沖刷至沉降槽106。樣本的流徑起始於樣本入口102，沿著連結通道103、分離槽104及沉降槽 106，並且部分的樣本(輕細胞LC或小分子)經由匯流點122和傳送通道110流到嵌入至凹槽150的收集元件200內。
藉由調整流動條件及/或密度梯度溶液105的密度，目標細胞或分子可輕易地自生物樣本分離開來，而被收集元件200收集。
當目標細胞或分子被收集在收集元件200內，可執行進一步的處理以加工目標細胞或分子。舉例而言，在目標細胞移出收集元件200之前，目標細胞可在收集元件200內被進一步標記。在這種情況下，標記試劑可自試劑入口120而非樣本入口102載入，並通過連通通道124、匯流點122、傳送通道110而流入收集元件200(如圖1A所示)。化學物或標記試劑的流徑起始於試劑入口120(化學物入口)，經由連通通道124、匯流點122、傳送通道110而終止於收集元件200的收集槽206，並沒有進入到分離槽或沉降槽內。化學物可包括選自一或多種的螢光染料(fluorescent dye)、抗體(antibodies)、免疫標示物(immuno-marker)、量子點(quantum dots)、磁珠(magnetic bead)、標記材料或樣本製備材料。
圖4B是根據本發明一實施例沿著位於樣本處理套組中的收集元件一部分的厚度方向剖面示意圖。為了說明細胞標記(cell labeling)的原理，圖4B著重於收集槽的部分。如圖4B的上半部所示，輕細胞LC被收集至收集元件200的收集槽206內(流向如箭頭所示)。之後，試劑R(即化學物，例如螢光染料、抗體、 免疫標示物、量子點、磁珠或其它標記或樣本製備材料)被載入至收集元件200的收集槽206並與輕細胞LC(圖4B的中段部所示)培養，接著在培養之後可得到標記的輕細胞LC’(圖4B的下半部所示)。最後，注入清洗緩衝液(washing buffer)以沖洗出未反應的標記試劑。標記過程可以是任何有效的標記過程，例如免疫標記(immuno-labeling)、螢光標記(fluorescence labeling)或磁珠標記(magnetic bead labeling)。
在本實施例中，標記過程僅僅執行一次，但如有需要，收集於收集槽內的目標物可被執行數次標記〔即複數標記(multiple labeling)或複合標示標記(multi-marker labeling)〕。
圖5A是根據本發明一實施例的離心微流碟片的立體示意圖。圖5B至圖5E是圖5A所示離心微流碟片的各種剖面說明示意圖。圖5B至圖5E所示是圖5A中的碟片由下層依序至上層的剖面。圖5B至圖5E的剖面是橫切於圖5A中的碟片的厚度方向。離心微流碟片500可以是圓形或橢圓形碟片，且圖5A中的微流碟片500可以是由數個切片組裝或彼此堆疊後製造而得。在圖5A中，碟片500的堆疊切片顯示為兩個分離的部分(一為下方且較大的部分，另一為上方且較小的部分)以達到說明目的。微流碟片500的材質可以是塑膠材料，例如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或其他熱塑性塑料。微流碟片500的直徑可以是在6與18公分之間，舉例而言，以12至14公分為較佳。
圖5A中的離心微流碟片500事實上包括三個獨立處理部 分，處理部分A、處理部分B以及處理部分C，且每個處理部分可被當作離心微流元件，其功能類似於前述的微流碟片100。原則上，離心微流碟片500是將至少三個獨立作用的微流元件整合成一個微流碟片。連同如上所述的三個分離的收集元件，三個獨立的樣本處理套組被整合成一個樣本處理套組，以使這三個獨立的樣本處理套組(分別處理相同或不同的樣本)的處理流程可以藉由一個單一的離心過程同時執行。這樣的設計非常符合經濟成本，並提供高效率和高收益。
如圖5A至圖5E中所示，離心微流碟片500的每個處理部分A/B/C包括樣本入口502A/502B/502C、連結通道503A/503B/503C、分離槽504A/504B/504C以及沉降槽506A/506B/506C。樣本入口502A/502B/502C位於碟片500的中央部位，且相同的樣本或是不同的樣本可藉由樣本入口502A/502B/502C載入至碟片500的不同處理部分。分離槽504A/504B/504C藉由對應的連結通道503A/503B/503C與樣本入口502A/502B/502C連接。樣本入口502A/502B/502C為不同尺寸，並以同心的方式配置於不同層。沉降槽506A/506B/506C與分離槽504A/504B/504C連接，並且在離心過程中，在入射流體樣本中待收集的目標物或細胞可流入分離槽504A/504B/504C，而流體樣本中不收集的部分會流入沉降槽506A/506B/506C。藉由調整流動條件及/或密度梯度溶液的密度，目標物或細胞可輕易地自生物流體樣本脫離，且流入收集元件。
分離槽504A/504B/504C的一端物理連接匯流點522A/522B/522C。待收集的目標物或細胞流經分離槽504A/504B/504C，經由匯流點522A/522B/522C，進一步流入與凹槽550A/550B/550C相連接的傳送通道510A/510B/510C。匯流點522A/522B/522C垂直延伸(跨越兩層)而與位於下層的分離槽504A/504B/504C及位於上層的傳送通道510A/510B/510C相通。意即，自分離槽504A/504B/504C的一端分離的樣本可藉由匯流點522A/522B/522C與傳送通道510A/510B/510C接著流入橫截的凹槽550A/550B/550C內(即由嵌入其中的收集元件來收集)。如前所述，收集元件200(如圖1A所示)可在分離的樣本於後續步驟收集完畢後自碟片的凹槽移除。
圖6A是根據本發明另一實施例的離心微流碟片的立體示意圖。圖6B至圖6G是圖6A所示離心微流碟片的各種剖面說明示意圖。圖6B至圖6G所示是圖6A中的碟片由下層依序至上層的剖面。圖6B至圖6G的剖面是橫切於圖6A中的碟片的厚度方向。離心微流碟片600可以是圓形或橢圓形碟片，且微流碟片600可以是由數個切片組裝或彼此堆疊後製造而得。在圖6A中，碟片600的堆疊切片顯示為兩個分離的部分(一為下方且較大的部分，另一為上方且較小的部分)以達到說明目的。
圖6A中的離心微流碟片600事實上被分為三個獨立處理部分，處理部分A、處理部分B以及處理部分C，且每個處理部分的功能類似於前述的微流碟片100。相似而言，離心微流碟片 600的設計是將至少三個獨立作用的微流碟片整合成一個微流碟片，並且如上所述的三個收集元件可嵌入微流碟片600，以作為在單一的離心過程中三個獨立的樣本處理套組。離心微流碟片600的設計類似於離心微流碟片500的設計，除了用以載入試劑或染料的額外流徑設計。
如圖6A至圖6G中所示，離心微流碟片600的每個處理部分A/B/C包括樣本入口602A/602B/602C、連結通道603A/603B/603C、分離槽604A/604B/604C以及沉降槽606A/606B/606C。樣本入口602A/602B/602C位於碟片600的中央部位，且相同的樣本或是不同的樣本可藉由樣本入口602A/602B/602C載入至碟片600的不同處理部分。分離槽604A/604B/604C藉由對應的連結通道603A/603B/603C與樣本入口602A/602B/602C連接。樣本入口602A/602B/602C為不同尺寸，並以同心的方式配置於不同層。在圖6B中，儲存槽621A/621B/621C配置在各處理部分的連結通道603A/603B/603C的旁邊，且試劑入口620A/620B/620C連接至儲存槽621A/621B/621C。沉降槽606A/606B/606C與分離槽604A/604B/604C連接，並且在離心過程中，在入射流體樣本中待收集的目標物或細胞可流入分離槽604A/604B/604C，而流體樣本中不收集的部分會流入沉降槽604A/604B/604C。分離槽604A/604B/604C的一端物理連接匯流點622A/622B/622C。待收集的目標物或細胞流經分離槽604A/604B/604C，經由匯流點 622A/622B/622C，進一步流入與凹槽650A/650B/650C相連接的傳送通道610A/610B/610C。匯流點622A/622B/622C垂直延伸(跨越兩層)而與位於下層的分離槽604A/604B/604C及位於上層的傳送通道610A/610B/610C相通。意即，自分離槽604A/604B/604C的一端分離的樣本可藉由匯流點622A/622B/622C與傳送通道610A/610B/610C接著流入橫截的凹槽650A/650B/650C內(即由嵌入其中的收集元件來收集)。如前所述，收集元件200(如圖1A所示)可在分離的樣本於後續步驟收集完畢後自碟片的凹槽移除。
在圖6A和圖6C中，除了試劑入口620A/620B/620C和與試劑入口620A/620B/620C相連的儲存槽621A/621B/621C，碟片600的各個處理部分A/B/C還包括與儲存槽621A/621B/621C和匯流點622A/622B/622C相連接的連通通道624A/624B/624C，且清洗通道623A/623B/623C連接到匯流點622A/622B/622C。清洗緩衝液從清洗入口625(位於上層)載入，經由清洗通道623A/623B/623C流入傳送通道610A/610B/610C(經過匯流點622A/622B/622C)以稀釋樣本或洗去殘留物。在圖6F中，清洗入口625實質上是三角形的開口(具有三個端部625A/625B/625C)，位於碟片600的第二最上層且藉由位在碟片600最上層的中央開口朝向外部環境而暴露出一部分(如圖6G所示)。清洗入口625的端部625A/625B/625C藉由穿過不同層的接點626A/626B/626C而分別與位在較下層的清洗通道623A/623B/623C相連接。清洗入口625和樣本入口602A/602B/602C是位在不同層且具有、不同尺寸 的開口，但其是以同心或偏心的方式配置。
相同的反應試劑或是不同的反應試劑可藉由試劑入口620A/620B/620C分別載入至碟片600的儲存槽621A/621B/621C，且儲存槽621A/621B/621C延伸跨越兩層(如圖6B至圖6C中所示)以保留載入至其內的試劑。試劑入口620A/620B/620C延伸通過所有的上方層且開口朝向外部環境，使得試劑能夠從碟片600的最上層載入。
樣本的流徑起始於樣本入口602A/602B/602C，沿著連結通道603A/603B/603C、分離槽604A/604B/604C，並且部分的樣本(待收集的目標物或細胞)終止於嵌入至凹槽650A/650B/650C的收集元件200的收集槽206。當目標物或細胞被收集在收集元件的收集槽206內，可藉由注入試劑至碟片600執行進一步的處理以加工目標物或細胞。舉例而言，藉由自試劑入口620A/620B/620C載入標記試劑，通過連通通道624A/624B/624C、匯流點622A/622B/622C、傳送通道610A/610B/610C而流入收集元件的收集槽，目標細胞可在收集槽內被進一步標記。試劑的流徑起始於試劑入口620A/620B/620C，經由連通通道624A/624B/624C、匯流點622A/622B/622C、傳送通道610A/610B/610C而終止於嵌入至凹槽650A/650B/650C的收集元件的收集槽，並無進入到分離槽內。
根據本發明實施例的樣本處理套組可藉由將上述的微流碟片100、微流碟片500或微流碟片600與上述的收集元件200、 收集元件200A或收集元件200B隨意地組裝而製得。根據本發明實施例的樣本處理套組可使用自動工作站共同操作。圖7是根據本發明實施例的自動工作站說明示意圖。自動工作站400包括至少一個蠕動泵(peristaltic pump)410、旋轉平台(rotation platform)420以及夾緊閥(pinch valve)V1至V6。外部的蠕動泵410可驅動流體或緩衝溶液，以提供血液樣本穩定的流率。夾緊閥V1至V6允許快速的流體輸送及關斷(shut-off)，以致整個工作站可以輕易地程式化。旋轉平台420可由馬達提供動力，以使樣本處理套組(微流碟片以及收集元件)於高速下旋轉而得到高生產率支配(throughput handing)。自動工作站400接受連續的流體輸入，藉由蠕動泵持續推送流體樣本(例如血液樣本)與緩衝液，並在碟片運轉期間持續注入血液樣本。自動工作站400的流動機制(flow mechanism)如圖7所示，而流向是由箭頭所標記。舉例而言，夾緊閥V1至V4分別控制了血液樣本、第一緩衝液、試劑溶液以及第二緩衝液的載入。藉由泵410的驅動，夾緊閥V2和夾緊閥V5鬆開(unlocking)而使血液樣本注入至內部的樣本入口。又藉由泵410的驅動，夾緊閥V4和夾緊閥V6鬆開而使試劑溶液注入至外部的試劑入口。試劑溶液可包括一或多種螢光染料、抗體、免疫標示物或甚至標記磁珠(labeled magnetic beads)。
根據本實施例所揭露的自動離心系統，連續流動(continuous-flow)微流的運作可提供顯著的優點，包括大量樣本體積(上至20毫升)、簡易施作以及降低污染。如先前所述，樣 本入口與試劑入口的相對位置可以同心或偏心(eccentric)的方式配置，而離心碟片可藉由位於碟片的中心部的旋轉軸或不具有旋轉主軸而旋轉。
自動工作站的流體樣本(例如包含輕細胞與重細胞的血液樣本)的處理步驟可概括如下：引進血液樣本至自動工作站內的微流碟片；藉由旋轉平台旋轉樣本處理套組(微流碟片以及收集元件)，以驅動血液樣本徑向地向外流動至分離槽，其中血液樣本的輕細胞流動至收集元件的收集槽，而重細胞沉澱至微流碟片的沉降槽；以及藉由自微流碟片移除收集元件以進一步實驗或觀察，而由收集槽收集輕細胞。運作細節可如以下步驟舉例說明：
(a)將血液樣本、Ficoll-paqueTM plus溶液、緩衝液以及試劑溶液填入至貯藏管。
(b)樣本處理套組(微流碟片100、微流碟片500或微流碟片600以及收集元件200、收集元件200’、收集元件200A、收集元件200B)於每分鐘轉速2000至4000轉下旋轉。
(c)旋轉期間，以每分鐘流速50至5000微升(μl)自樣本入口載入並推送Ficoll-paqueTM plus溶液至碟片。
(d)以每分鐘流速50至5000微升自清洗入口載入並推送PBS/緩衝液至碟片。
(e)以每分鐘流速50至2000微升載入並推送血液樣本(混合緩衝液)至碟片。
(f)以每分鐘流速50至5000微升自清洗入口載入並推 送推送PBS/緩衝液至碟片。
(g)自試劑入口，以每分鐘流速50至3000微升載入並推送20至1000微升的試劑溶液至碟片。
(h)樣本處理套組(微流碟片以及收集元件)於每分鐘轉速0至500轉下旋轉10至60分鐘，用於培養。
(i)樣本處理套組(微流碟片以及收集元件)於每分鐘轉速1000至5000轉下旋轉。
(j)以每分鐘流速50至5000微升自清洗入口載入並推送PBS/緩衝液至碟片。
(k)停止旋轉並自微流碟片取出收集元件以觀察或進一步實驗。收集槽內收集到的細胞可直接觀察或是取出以進行其他測試或分析。
為具體描繪碟片平台(disk platform)的效能，在實驗中使用少量的特定癌細胞株來代表目標細胞。所使用細胞株為乳癌細胞株MCF7與MDA-MB-231、攝護腺癌細胞株PC3、肝癌細胞株(hepatoma cell lines)HEP3B與PLC5以及結腸直腸癌細胞株(colorectal cancer cell line)Colo205。血液樣本是從健康人體的自願者所收集，大約100至200個癌細胞被混合至2毫升的血液中以模擬人體環境中稀罕細胞的存在情況。
為決定碟片平台的理想流速，以抗體anti-EpCAM-PE所標記的細胞株MCF7與1毫升的血液摻雜混合的樣本來進行實驗。圖8繪示在碟片平台使用微流碟片100來分離回收細胞株 MCF7時，樣本處理套組中微流碟片100的流速與細胞株MCF7的回收率(recovery ratio)之間的關係。結果指出本實驗樣本處理套組中微流碟片的理想流速為每分鐘500微升，且細胞回收率(即收穫量)大約為0.9(90%)。利用每分鐘500微升之流速來進行進一步的實驗，以針對了不同種類的癌細胞株進行測試。圖9繪示不同種類的細胞株的回收率。在碟片平台使用微流碟片100針對不同種類的癌細胞株的細胞回收率在60%至90%之間，通常是高於70%。在碟片平台使用微流碟片500或微流碟片600所觀察到的比較結果中，對於細胞株MCF7的分離回收率約為70%。這些結果說明了本發明之樣本處理套組(微流碟片以及收集元件)可自該些血液樣本中有效地分離以及收集非常少量的細胞(亦即稀罕細胞)。具體而言，利用樣本處理套組對於不同細胞株的細胞回收率分別是：對於攝護腺癌細胞株PC3達90%以上、對於肝癌細胞株HEP3B與PLC5約為80%、對於乳癌細胞株MCF7和結腸直腸癌細胞株Colo205約為70-80%以及對於乳癌細胞株MDA-MB-231約達60-70%。
此外，將標記試劑注入收集元件用以標記所收集到的細胞的標記效果也經過測試，發現使用微流碟片100、微流碟片500和微流碟片600所觀察到的細胞株的標記效果均令人滿意。
與先前可透過免疫親合(immuno-affinity)分離法從血液中分離出特定細胞的微流裝置相比，本發明之樣本處理套組可有效的捕捉具有相對低的抗原表現(antigen expression)水準的細胞 株(例如MDA-MB-231)。此表示在前面實施例中所揭露的使用密度梯度分離的樣本處理套組，可有效地單獨分離具有腫瘤細胞標記表現量(expression level)的目標細胞。
由於本發明之樣本處理套組所包括的收集元件可在離心期間於原位(in situ)收集樣本，並且可將收集到的樣本保留在收集元件內部，而不需要從收集元件中取出或者移出作進一步處理，因此不必擔心收集樣本受到汙染或是損耗。此可顯著提升稀罕樣本或是極少量樣本的可加工性。
本發明之先進的樣本處理套組可應用於生物實驗、生化測試及醫藥檢驗的領域。本發明之樣本處理套組與全自動樣本製備相容，而且其可容納的樣本體積可視需求調整改變(範圍變動彈性在0.1至20毫升之間)。本發明之樣本處理套組可達到上至60%至90%稀少樣本(scarce samples)的高回收率。進一步來說，本發明利用微流離心碟片的樣本處理套組利用了連續密度梯度分離與複合標示標記之技術。
雖然本發明已以實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作些許的更動與潤飾，故本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。圖式不必然依比例繪示。由於製造的過程與公差，在本揭露中美術的重現與實際裝置之間是有所區別的。本發明的其他實施例可能未被具體繪示。因此，本說明書與附圖應視為例示，而非用以限制本發明。可適應 於本發明的標的、精神及範圍的特定情況、材料、物質的組成、方法或過程進行修改。所有的修改都意圖限定於所附的權利要求範圍之內。雖然在此所公開的方法已參照在特定的順序下執行特定的操作，將被理解的是，這些操作也可以組合、細分或重新排序，以在不脫離本發明的教示下形成等效的方法。
10‧‧‧樣本處理套組
100‧‧‧碟片
102‧‧‧樣本入口
103‧‧‧連結通道
104‧‧‧分離槽
104b‧‧‧分離槽的一端
106‧‧‧沉降槽
107‧‧‧連接部
110‧‧‧傳送通道
120‧‧‧試劑入口
122‧‧‧匯流點
124‧‧‧連通通道
130‧‧‧軸孔
150‧‧‧凹槽
200‧‧‧收集元件
202‧‧‧晶片主體
204‧‧‧進入口
206‧‧‧收集槽
X、Y‧‧‧厚度方向

Claims (19)

  1. 一種樣本處理套組，包括至少一離心微流元件以及至少一收集元件，其中所述至少一離心微流元件包括：樣本入口，以同心圓或偏心圓的方式配置，並且在旋轉期間，可連續或間續地用以載入生物樣本至所述離心微流元件中；分離槽，連接所述樣本入口；沉降槽，連接所述分離槽，其中在所述沉降槽以及所述分離槽中包含密度梯度溶液；以及嵌合部位，用以容納所述至少一收集元件，其中當所述至少一收集元件以可拆卸的方式嵌入所述嵌合部位時，所述至少一收集元件與所述分離槽相連接，所述至少一收集元件其上具有進入口，用以接收經由所述至少一離心微流元件處理過的所述生物樣本，並且在接收處理過的所述生物樣本後，所述至少一收集元件會與所述至少一離心微流元件的所述嵌合部位分開，其中所述至少一離心微流元件更包括清洗入口用以載入緩衝液，所述清洗入口以同心圓或偏心圓的方式配置，且所述清洗入口經由清洗通道連接至所述至少一收集元件，且所述清洗入口和所述樣本入口位於所述至少一離心微流元件的不同層。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的樣本處理套組，其中所述收集元件包括晶片主體，所述晶片主體其上具有所述進入口且其內部具有收集槽，所述收集槽與所述分離槽經流道相連接，且所 述進入口通向所述收集槽，以使得經由所述至少一離心微流元件處理過的所述生物樣本流入所述收集槽中。
  3. 如申請專利範圍第2項所述的樣本處理套組，其中所述生物樣本的流徑起始於所述樣本入口，實質上流經所述分離槽並且終止於所述至少一收集元件的所述收集槽中。
  4. 如申請專利範圍第1項所述的樣本處理套組，其中所述至少一離心微流元件更包括試劑入口用以載入試劑，且所述試劑入口經由連結通道連接至所述至少一收集元件。
  5. 如申請專利範圍第4項所述的樣本處理套組，其中所述試劑的流徑起始於所述試劑入口，經由所述連結通道並且終止於所述至少一收集元件的所述收集槽中。
  6. 如申請專利範圍第1項所述的樣本處理套組，其中所述樣本處理套組包括多個離心微流元件以及多個收集元件分別嵌入所述離心微流元件的所述嵌合部位。
  7. 如申請專利範圍第6項所述的樣本處理套組，其中所述至少一離心微流元件更包括試劑入口用以載入試劑；儲存槽，用以接收來自所述試劑入口的所述試劑；以及連結通道，將所述儲存槽連接至所述至少一收集元件。
  8. 如申請專利範圍第7項所述的樣本處理套組，其中所述試劑的流徑起始於所述試劑入口，經由所述儲存槽和所述連結通道並且終止於所述至少一收集元件的所述收集槽中。
  9. 如申請專利範圍第1項所述的樣本處理套組，其中所述嵌合部位位於自所述樣本入口徑向地向外且所述至少一離心微流元件的周圍部分，並且所述至少一收集元件嵌入所述嵌合部位。
  10. 如申請專利範圍第9項所述的樣本處理套組，其中嵌入所述嵌合部位的所述至少一收集元件的厚度方向實質上垂直於所述至少一離心微流元件的厚度方向。
  11. 如申請專利範圍第1項所述的樣本處理套組，其中所述嵌合部位位於自所述樣本入口徑向地向外且所述至少一離心微流元件的邊緣部分，並且所述至少一收集元件嵌入所述嵌合部位。
  12. 如申請專利範圍第11項所述的樣本處理套組，其中嵌入所述嵌合部位的所述至少一收集元件的厚度方向實質上垂直於所述至少一離心微流元件的厚度方向。
  13. 如申請專利範圍第1項所述的樣本處理套組，其中所述生物樣本是生物流體，並且所述樣本處理套組利用密度梯度分離以收集來自所述生物流體的細胞。
  14. 一種收集元件，可應用於樣本處理套組的離心微流元件，所述離心微流元件包括樣本入口，所述樣本入口以同心圓或偏心圓的方式配置，並且在旋轉期間，可連續或間續地用以載入生物樣本至所述離心微流元件中，所述收集元件包括晶片主體，所述晶片主體其上具有進入口且其內部具有收集槽，其中所述收集槽具有所述進入口以接收經由所述離心微流元件處理過的生物樣本，所述收集元件以可拆卸的方式嵌入所述離心微流元件的嵌 合部位，並且經由所述離心微流元件的分離槽處理過的所述生物樣本會由所述收集元件的所述收集槽收集，其中所述離心微流元件更包括清洗入口用以載入緩衝液，所述清洗入口以同心圓或偏心圓的方式配置，且所述清洗入口經由清洗通道連接至所述收集元件，且所述清洗入口和所述樣本入口位於所述離心微流元件的不同層。
  15. 如申請專利範圍第14項所述的收集元件，其中所述離心微流元件接收化學物載入至所述收集槽，且所述化學物會與位於所述收集元件的所述收集槽中的經處理過的所述生物樣本進行反應，且所述化學物包括選自一或多種的螢光染料、抗體、免疫標示物、量子點、磁珠、標記材料或樣本製備材料。
  16. 如申請專利範圍第14項所述的收集元件，其中所述生物樣本是生物流體，並且所述樣本處理套組利用密度梯度分離以收集來自所述生物流體的細胞。
  17. 如申請專利範圍第14項所述的收集元件，其中所述晶片主體被開啟而暴露所述收集槽以抽取樣本。
  18. 如申請專利範圍第14項所述的收集元件，其中所述收集元件更包括至少一廢料出口，且所述收集槽連接所述至少一廢料出口以排放流體。
  19. 一種用於處理生物樣本的樣本處理套組，其中所述樣本處理套組利用離心及密度梯度溶液將一或多種包含於血液樣本中的生物成分分離，且所述血液樣本會持續沿著流徑流動，且所 述樣本處理套組的幾何形狀並非長圓柱管類的幾何形狀，而是實質上平面的幾何形狀，所述樣本處理套組沿其平面並穿越其離心中心之最長長度實質上大於所述樣本處理套組的厚度，且所述樣本處理套組包括至少一離心微流元件和至少一樣本收集元件，其中所述至少一離心微流元件包括至少一樣本入口以及清洗入口，所述清洗入口用以載入緩衝液且以同心圓或偏心圓的方式配置，所述清洗入口經由清洗通道連接至所述至少一樣本收集元件，且所述清洗入口和所述至少一樣本入口位於所述至少一離心微流元件的不同層，且所述至少一樣本收集元件可物理性地拆卸並嵌入至所述至少一離心微流元件，且所述樣本處理套組可在不使用閥門的情況下於操作期間控制流速。
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