CN114807320A - 基于微流控的恒温扩增检测装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于微流控的恒温扩增检测装置及方法，该装置包括：微流控芯片，其包括芯片主体以及沿所述芯片主体的圆周方向均匀间隔设置在所述芯片主体上的若干检测单元，所述检测单元包括核酸提取单元以及与所述核酸提取单元连通的核酸扩增单元；离心机构，其用于实现所述微流控芯片的旋转运动；加热装置；以及光学检测机构，其设置在所述芯片主体的下方，用于对核酸扩增单元中完成恒温扩增后的产物进行光学检测。发明提供了一种基于微流控的核酸检测方案，其集核酸提取、扩增及检测于一体，能够实现核酸的快速检测，且检测通量高、样本需求量小、步骤简单易于操作，具有很好的应用前景。

Description

基于微流控的恒温扩增检测装置及方法

技术领域

本发明涉及核酸检测领域，特别涉及一种基于微流控的恒温扩增检测装置及方法。

背景技术

核酸扩增检测技术被广泛应用于如分子生物学、医学、法学等生命科学的各个领域，由于PCR需要不断变化温度来实现核酸的扩增，始终无法摆脱操作较繁琐、依赖精良仪器设备等缺陷，多种机制的核酸等温扩增技术应运而生，也得到了迅猛的发展。其中，环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法自开发出来后，因其快速(1小时内)、简易(只需65℃温控设备)、灵敏、特异等特点，近年来被广泛用于病毒、细菌等微生物的检测。且借助微流控所具备的样本需求量少、效率高等优点，当前还开发了借助微流控进行等温扩增的方案，例如，专利CN201110161010.X公开的一种用于核酸等温扩增反应的微芯片、制造其的方法和核酸等温扩增反应方法。

核酸等温扩增检测的主要步骤为：核酸提取与纯化、等温扩增以及光学检测，其中，核酸提取与纯化步骤较为繁琐，占用了整个检测过程的大量时间和工作量。磁珠法提取核酸有广泛的应用，传统的磁珠法提取核酸主要步骤为：1、在样品中加入裂解液裂解；2、加入磁珠吸附核酸；3、加入洗涤液洗涤；4、加入洗脱液使核酸和磁珠分离，得到纯化的核酸。例如专利CN105087353A公开的一种离心式核酸提取纯化装置及其制作方法等，这类传统核酸提取方案，普遍存在操作繁琐、效率低的缺陷。专利CN110016435B公开了一种用于游离核酸提取的离心微流控芯片及其在提取游离核酸的方法，其提供了一种核酸提取的新思路，通过设计非混溶相作为阀门阻隔核酸提取样品腔和洗脱腔之间的液体交换，但同时又允许磁珠通过该阀门，利用转移磁珠的方式，可简化步骤。然后其还存在如下不足：1、非混溶相结构中，拱形毛细管微通道的设计要求较苛刻，芯片允许的转速受到拱形毛细管微通道结构参数等较多条件的限制(角加速度太大时，不混溶相界面两侧之间的压力差超过表面张力的适应性，并且不混溶相的界面将被破坏，然后水桥在相邻的腔室中引起流体混合不能实现分离纯化的目的，即角速度不能太大)，非混溶相结构的稳定性不够，转速较大时容易出现不混溶相的界面被破坏的情况，所以其通用性较差、操作要求高；2、其仅具备核酸提取功能，需要另外配置温控机构和检测机构才能实现光学检测。

所以，现在有必要对现有技术进行改进，以提供更可靠的方案。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种基于微流控的恒温扩增检测装置及方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种基于微流控的恒温扩增检测装置，包括：

微流控芯片，其包括芯片主体以及沿所述芯片主体的圆周方向均匀间隔设置在所述芯片主体上的若干检测单元，所述检测单元包括核酸提取单元以及与所述核酸提取单元连通的核酸扩增单元；

离心机构，其用于实现所述微流控芯片的旋转运动；

加热装置，其数量和设置位置与所述检测单元匹配，以使得每个检测单元均配置有一个加热装置来提供核酸进行恒温扩增过程中的加热功能；所述加热装置包括设置在所述芯片主体的外周边沿的侧部的加热套以及用于驱动所述加热套沿所述芯片主体的径向往复移动的第一驱动机构，所述加热套上具有可供所述芯片主体的外周边沿部分插入的加热槽，以使得所述加热套可上下包覆所述芯片主体上的核酸扩增单元；

以及光学检测机构，其设置在所述芯片主体的下方，用于对核酸扩增单元中完成恒温扩增后的产物进行光学检测。

优选的是，所述离心机构包括离心电机以及与所述离心电机的输出轴驱动连接的离心转盘，所述微流控芯片设置在所述离心转盘上。

优选的是，所述光学检测机构包括安装平台、设置在所述安装平台上的若干光学检测装置本体以及用于驱动所述安装平台上下移动的升降机构。

优选的是，所述核酸提取单元包括：

清洗装置，其包括用于加入和存放清洗液的清洗腔以及设置在所述清洗腔上的清洗液加样口；

裂解装置，其包括与所述清洗腔连通的裂解腔、设置在所述裂解腔上的裂解液加样口以及连通在所述裂解腔的出口端上的S型流道；

核酸吸附装置，其包括与所述S型流道连通的吸附腔以及设置在所述吸附腔上的吸附液加样口，所述吸附腔内用于加入和存放含有磁珠的核酸吸附液；

洗脱装置，其包括洗脱腔以及设置在所述洗脱腔上洗脱液加样口，所述洗脱腔内用于加入和存放洗脱液；

以及可控阻隔装置，其设置在所述核酸吸附装置和洗脱装置之间，所述可控阻隔装置包括连通所述吸附腔和洗脱腔的可控通道、设置在所述可控通道中的囊体以及设置在所述囊体中间形成的囊道内的磁性密封芯；

在施加外部磁场使所述吸附腔内吸附有核酸的磁珠转移至所述洗脱腔内时，磁场的作用可使得所述磁性密封芯脱离所述囊道并同磁珠一起进入所述洗脱腔。

优选的是，所述核酸扩增单元包括通过扩增流道与所述洗脱腔连通的分配腔、连通设置在所述分配腔上的若干扩增元件以及连通设置在所述分配腔上的废液腔；

所述扩增流道与所述废液腔分别与所述分配腔在长度方向上相对的两侧连通；

所述扩增元件包括与所述分配腔连通的定量腔以及与所述定量腔通过定量流道连通的扩增反应腔。

优选的是，所述分配腔在长度方向上呈弧形状且沿所述芯片主体的圆周方向布置，若干扩增元件沿所述芯片主体的圆周方向均匀间隔布置，所述分配腔内设置有数量与所述扩增元件相同的若干倒三角状的分配块，且若干分配块沿所述芯片主体的圆周方向布置，每个分配块对应一个定量腔；

所述分配块具有一导流平面和一导流尖端，所述导流平面处于靠近所述芯片主体的圆心的一侧，所述导流尖端处于远离所述芯片主体的圆心的一侧，且每个所述分配块的导流尖端正对一个定量腔的入口。

优选的是，所述裂解腔通过一个主清洗液流道和两个支清洗液流道与清洗腔连通，所述裂解腔内设置有过滤元件；进一步优选的，过滤元件为过滤膜；

所述支清洗液流道的末端通过一扩口段部与所述裂解腔连通，所述扩口段部倾斜设置在所述过滤元件的上方。

优选的是，所述支清洗液流道上还设置有自吸气组件，所述自吸气组件包括与所述支清洗液流道倾斜连通的倾斜吸气流道段、与所述倾斜吸气流道段连通的径向吸气流道段、以及设置在所述径向吸气流道段末端的自吸气孔；

由所述芯片主体的圆心朝外周的方向，所述倾斜吸气流道段与支清洗液流道之间的夹角为锐角，所述径向吸气流道段与所述支清洗液流道平行，所述自吸气孔比所述倾斜吸气流道段更靠近所述芯片主体的圆心。

优选的是，所述可控通道包括与所述吸附腔连通的第一通道以及一端与所述第一通道的末端连通且另一端与所述洗脱腔连通的第二通道；

所述第一通道呈喇叭状，且由所述吸附腔朝所述第二通道的方向，所述第一通道的宽度逐渐减小，所述第一通道的末端的宽度小于所述磁性密封芯的直径；

所述第二通道呈矩形状，所述囊体的外壁与所述第二通道的内壁固定连接，所述囊体的靠近所述洗脱腔的末端的内壁向内突出形成两个相互匹配的半圆形内凸部以使得所述磁性密封芯被限制于所述第二通道内，半圆形内凸部与囊体的内壁通过弧形面过渡连接；当磁性密封芯在移动的磁场作用下从所述囊体的囊道内脱离时，两个半圆形内凸部能相互挤压接触从而密封所述囊道；

所述囊体内填充有压缩气体或液体。

本发明还提供该基于微流控的恒温扩增检测装置的检测方法，包括以下步骤：

1)通过所述离心机构和微流控芯片的配合以及施加外部磁场的作用下，对样品进行核酸提取，并使提取得到的核酸进入核酸扩增单元的扩增反应腔中；

2)控制所述第一驱动机构驱动加热套朝向芯片主体的圆心方向移动，使得加热套上下包覆所述芯片主体上的核酸扩增单元中的扩增反应腔，所述加热套工作，提供恒温环境，使扩增反应腔中的核酸进行恒温扩增；

3)完成恒温扩增后，控制所述第一驱动机构驱动加热套从扩增反应腔上撤离，控制所述升降机构驱动所述安装平台向上移动，通过安装平台上的若干光学检测装置本体对扩增反应腔中完成恒温扩增后的产物进行光学检测；

其中，一台光学检测机构中的光学检测装置本体的数量和位置与一个检测单元中的扩增反应腔的数量和位置匹配，以使得通过一台光学检测机构能够同时对一个检测单元中所有的扩增反应腔同时进行光学检测。

优选的是，所述裂解腔和洗脱腔的腔体内均设置有若干扰流件，所述扰流件包括与腔体的底面连接的固定件以及与所述固定件连接的活动块，所述芯片主体旋转时，所述活动块会相对所述固定件往复移动；

所述固定件为连接在腔体底面上的固定柱，所述活动块为可偏心旋转连接在所述固定柱上的偏心旋转块。

优选的是，所述吸附腔内沿所述芯片主体的径向间隔设置有若干导流槽，所述导流槽在长度方向上呈弧形状；

所述导流槽的底面呈上下起伏的波浪面状。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种基于微流控的核酸检测装置，其集核酸提取、扩增及检测于一体，能够实现核酸的快速检测，且检测通量高、样本需求量小、步骤简单易于操作，具有很好的应用前景；

本发明通过可控阻隔装置的设置能够实现吸附腔和洗脱腔的阻隔但又能允许磁珠在两个腔体之间的转移，从而能够简化核酸提取步骤，同时可控阻隔装置结构的设计使其具有较高的稳定性，在微流控芯片以较大转速离心时，可控阻隔装置仍能保证其阻隔功能的实现；

本发明中通过支清洗液流道以及自吸气组件的设置，能够对过滤膜进行冲刷，提高清洗效果，能有效防止过滤膜被堵塞，提高过滤效率，最终提高核酸回收率；

本发明通过分配腔、分配块的设置，能够便于实现各定量腔内核酸样品的快速、均匀分配。

附图说明

图1为本发明的实施例中的基于微流控的恒温扩增检测装置的俯视方向的结构示意图；

图2为本发明的实施例中的基于微流控的恒温扩增检测装置的主视方向的结构示意图；

图3为本发明的实施例中的光学检测机构的结构示意图；

图4为本发明的实施例中的检测单元的结构示意图；

图5为本发明的实施例中的清洗装置和裂解装置的结构示意图；

图6为本发明的实施例中的核酸吸附装置、洗脱装置、可控阻隔装置及核酸扩增单元配合的结构示意图；

图7为本发明的实施例中的可控阻隔装置的结构示意图；

图8为本发明的实施例中的可控阻隔装置的另一种状态的结构示意图；

图9-11为本发明的实施例中施加外部移动的磁场转移磁珠的过程示意图；

图12为本发明的另一种实施例中的裂解装置的结构示意图；

图13为本发明的另一种实施例中的检测单元的结构示意图；

图14为本发明的一种实施例中的扰流件的结构示意图；

图15为本发明的一种实施例中的吸附腔沿厚度方向的截面的结构示意图。

附图标记说明：

1—微流控芯片；2—芯片主体；20—扰流件；21—腔体底面；22—固定柱；23—偏心旋转块；3—检测单元；4—核酸提取单元；

40—清洗装置；400—清洗腔；401—清洗液加样口；

41—裂解装置；410—裂解腔；411—主清洗液流道；412—支清洗液流道；413—过滤元件；414—扩口段部；415—S型流道；416—自吸气组件；417—裂解液加样口；4160—倾斜吸气流道段；4161—径向吸气流道段；4162—自吸气孔；

42—核酸吸附装置；420—吸附腔；421—导流槽；422—导流槽的底面；423—吸附液加样口；

43—洗脱装置；430—洗脱腔；431—洗脱液加样口；

44—可控阻隔装置；440—可控通道；441—囊体；442—磁性密封芯；443—第一通道；444—第二通道；445—半圆形内凸部；446—囊道；447—弧形面；

450—第一排气流道；451—第一排气孔；452—第二排气流道；453—第二排气孔；454—第三排气流道；455—第三排气孔；456—微流阀；

5—核酸扩增单元；50—扩增流道；51—分配腔；52—扩增元件；53—废液腔；54—定量腔；55—定量流道；56—扩增反应腔；57—分配块；570—导流平面；571—导流尖端；540—入口；

6—离心机构；60—离心电机；61—离心转盘；

7—加热装置；70—加热套；71—第一驱动机构；72—加热槽；

8—光学检测机构；80—安装平台；81—光学检测装置本体；82—升降机构；9—磁场。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

实施例1

参照图1-11，本实施例提供一种基于微流控的恒温扩增检测装置，包括：

微流控芯片1，其包括芯片主体2以及沿芯片主体2的圆周方向均匀间隔设置在芯片主体2上的若干检测单元3，检测单元3包括核酸提取单元4以及与核酸提取单元4连通的核酸扩增单元5；

离心机构6，其用于实现微流控芯片1的旋转运动；

加热装置7，其数量和设置位置与检测单元3匹配，以使得每个检测单元3均配置有一个加热装置7来提供核酸进行恒温扩增过程中的加热功能；加热装置7包括设置在芯片主体2的外周边沿的侧部的加热套70以及用于驱动加热套70沿芯片主体2的径向往复移动的第一驱动机构71(如电动推杆)，加热套70上具有可供芯片主体2的外周边沿部分插入的加热槽72，以使得加热套70可上下包覆芯片主体2上的核酸扩增单元5；

以及光学检测机构8，其设置在芯片主体2的下方，用于对核酸扩增单元5中完成恒温扩增后的产物进行光学检测。

其中，加热套70用于提供加热功能，其内设置有加热元件(如电热丝等)，可采用蓄电池供电或外部电源供电。

在优选的实施例中，离心机构6包括离心电机60以及与离心电机60的输出轴驱动连接的离心转盘61，微流控芯片1设置在离心转盘61上。

在优选的实施例中，光学检测机构8包括安装平台80、设置在安装平台80上的若干光学检测装置本体81以及用于驱动安装平台80上下移动的升降机构82(如电动推杆)。其中，光学检测装置本体81根据需要采用常规的光学检测仪器即可，例如，在一种实施例中，完成恒温扩增后，通过检测产物的荧光强度进行目标核酸的定量/定性分析，光学检测装置本体81选择常规的荧光检测仪器即可，其包括激发光源、探测器等，激发光源发出激发光透过芯片主体2照射到扩增产物上，产生的荧光则通过探测器采集，从而根据荧光强度实现目标核酸的定量/定性检测。

本实施例中，核酸提取单元4包括：

清洗装置40，其包括用于加入和存放清洗液的清洗腔400以及设置在清洗腔400上的清洗液加样口401；

裂解装置41，其包括与清洗腔400连通的裂解腔410、设置在裂解腔410上的裂解液加样口417以及连通在裂解腔410的出口端上的S型流道415；

核酸吸附装置42，其包括与S型流道415连通的吸附腔420以及设置在吸附腔420上的吸附液加样口423，吸附腔420内用于加入和存放含有磁珠(优选为可吸附核酸的纳米磁珠)的核酸吸附液；

洗脱装置43，其包括洗脱腔430以及设置在洗脱腔430上洗脱液加样口431，洗脱腔430内用于加入和存放洗脱液；

以及可控阻隔装置44，其设置在核酸吸附装置42和洗脱装置43之间，可控阻隔装置44包括连通吸附腔420和洗脱腔430的可控通道440、设置在可控通道440中的囊体441以及设置在囊体441中间形成的囊道446内的磁性密封芯442；

在施加外部磁场9使吸附腔420内吸附有核酸的磁珠转移至洗脱腔430内时，磁场9的作用可使得磁性密封芯442脱离囊道446并同磁珠一起进入洗脱腔430。

其中，清洗腔400、裂解腔410、吸附腔420沿芯片主体2的圆心朝外周的方向依次设置，洗脱腔430设置在吸附腔420的侧部，可控阻隔装置44设置在吸附腔420和洗脱腔430之间。

其中，连通清洗腔400和裂解腔410的流道上设置有微流阀456，微流阀456用于提供一定的阻力作用，只有当离心转速达到一定数值时，清洗液才能突破微流阀456的阻力进入到裂解腔410中。在优选的实施例中，为流道本体的内壁向内凹陷形成的缩口状流道腔，微流阀456提供的阻力大小主要取决于缩口状流道腔的长度和宽度，长度越长、宽度越窄，阻力越大，需突破该阻力的离心转速越大。

其中，裂解腔410内设置有过滤元件413，在优选的实施例中，过滤元件413为过滤膜。过滤膜用于过滤样品裂解产生的残渣，使这些残渣停留在裂解腔410内，而核酸则可在离心作用下通过过滤膜。过滤膜具有一定的阻力，只有达到一定离心转速时，裂解腔410内的液体才能通过滤膜。

其中，S型流道415提供一定的阻力作用，只有当离心转速达到一定数值时，才能使裂解液突破第一流道进入吸附腔420，其提供的阻力大小可通过第一流道的长度与宽度的设置来满足需求，长度越长、宽度越窄，阻力越大，需突破该阻力的离心转速越大。

本实施例中，核酸扩增单元5包括通过扩增流道50与洗脱腔430连通的分配腔51、连通设置在分配腔51上的若干扩增元件52以及连通设置在分配腔51上的废液腔53；扩增流道50与废液腔53分别与分配腔51在长度方向上相对的两侧连通；

扩增元件52包括与分配腔51连通的定量腔54以及与定量腔54通过定量流道55连通的扩增反应腔56。

其中，分配腔51在长度方向上呈弧形状且沿芯片主体2的圆周方向布置，若干扩增元件52沿芯片主体2的圆周方向均匀间隔布置，分配腔51内设置有数量与扩增元件52相同的若干倒三角状的分配块57，且若干分配块57沿芯片主体2的圆周方向布置，每个分配块57对应一个定量腔54；

分配块57具有一导流平面570和一导流尖端571，导流平面570处于靠近芯片主体2的圆心的一侧，导流尖端571处于远离芯片主体2的圆心的一侧，且每个分配块57的导流尖端571正对一个定量腔54的入口540。

其中，扩增流道50和定量流道55均为具有一定阻力的微细流道，只有当离心转速达到一定程度，使离心力大于流道阻力时，液体才可突破流道的阻力而顺利通过。

其中，相邻分配块57之间的间隙形成供核酸样品流过的分配通道，核酸样品进入分配腔51后会与分配块57接触，在分配块57的导流平面570的导流作用下，能够使得大量核酸样品快速沿着相邻的导流平面570向右侧流动，与每个分配块57接触的部分核酸样品又在导流尖端571的引导下，藉由离心作用，顺着导流尖端571朝向远离圆心的一侧滴落，正好进入到各个定量腔54内；分配块57的导流作用使得分配腔51内形成两股液流方向：第一股是沿圆周方向的、藉由导流平面570的导流作用形成的用于将核酸样品快速分配至沿圆周布置的各定量腔54位置处的分配流，第二股是沿径向的、藉由导流尖端571与离心作用形成的用于将分配流中的核酸样品快速引入定量腔54内的定量流。通过上述分配腔51、分配块57的结构设计，能够便于实现各定量腔54内核酸样品的快速、均匀分配。

在一定的转速下，洗脱腔430中提取的核酸样品可突破扩增流道50的阻力，进入分配腔51，通过分配腔51及其内部分配块57的结构设置，能快速、较均匀分配至每个定量腔54(当前转速下流体无法突破定量流道55的阻力而进入扩增反应腔56)，当所有定量腔54都装满核酸样品后，多余的核酸样品溶液进入废液腔53收集；然后再提高转速，使得核酸样品突破定量流道55的阻力进入扩增反应腔56，以进行后续的恒温扩增反应。

其中，清洗液、裂解液、核酸吸附液、洗脱液等试剂均采用常规试剂即可。

其中，扩增反应腔56中预封有冻干的用于恒温扩增所需的试剂(如恒温PCR试剂、引物、探针等)。定量腔54用于实现样品的定量，使得每个扩增反应腔56中加入基本等量的样品，且样品的体积能与扩增反应腔56中预封的恒温扩增试剂量相匹配，以保证顺利进行恒温扩增。

以下结合具体步骤，对该基于微流控的恒温扩增检测装置进行核酸提取的原理进行说明：

(1)向清洗腔400、裂解腔410、吸附腔420和洗脱腔430内先分别注入清洗液、裂解液、核酸吸附液和洗脱液，扩增反应腔56中预封有冻干的用于恒温扩增所需的试剂，将样品(如细菌样品)加入裂解腔410中，然后将微流控芯片1装在离心机构6的离心转盘61上；

(2)使微流控芯片1先以第一转速R1正反往复旋转进行震荡，以通过震荡使样品与裂解液充分混匀，实现对样品的裂解，以释放核酸；由于微流阀456的阻力作用，在第一转速下清洗液无法进入裂解腔410，由于过滤膜的阻力作用，第一转速下，裂解液也无法突破过滤膜，从而能够提供样品与裂解液充分混匀的环境；

(3)充分裂解后，微流控芯片1以第二转速R2反转(逆时针旋转)，在离心力的作用下，裂解腔410内的部分物质(核酸、裂解液等)通过过滤膜，并通过S型流道415进入吸附腔420，而裂解残渣则被过滤膜过滤阻挡，留在裂解腔410内；此转速下，清洗液仍然无法突破微流阀456的阻力进入裂解腔410；

(4)提高转速使微流控芯片1以第三转速R3反转，在第三转速下，清洗液突破微流阀456的阻力，进入裂解腔410，对裂解腔410进行清洗，使得附着在其内的剩余核酸能最大限度被冲洗，与清洗液一同进入吸附腔420，从而可大大提高核酸回收率；

(5)使微流控芯片1以第四转速R4正反往复旋转进行震荡，以通过震荡使磁珠充分与核酸结合吸附；

(6)在吸附腔420下方施加移动的磁场9(如手持或通过机械设备驱动永磁体或电磁铁进行移动)，磁场9移动方向由吸附腔420最右端向洗脱腔430移动，且磁场9在径向能够覆盖吸附腔420沿径向的宽度，以保证磁场9能够充分吸附吸附腔420内的磁珠；通过磁场9使磁珠转移至洗脱腔430中；在通过可控阻隔装置44时，磁性的磁性密封芯442能够吸附住进入可控通道440内的磁珠，通过磁性密封芯442负载磁珠，最终在磁场9的作用下一同转移至洗脱腔430中；

(7)先撤去磁场9，微流控芯片1以第五转速R5正反往复旋转进行震荡(此时可控通道440封闭，洗脱腔430内的液体不会外溢)，以使洗脱液与磁珠充分混匀接触，在洗脱液的作用下，核酸脱离磁珠，游离进入液体内；

(8)重新加上磁场9，吸附住磁珠和磁性密封芯442，微流控芯片1以第六转速R6反转(逆时针)，在离心力的作用下，洗脱腔430中的溶液突破扩增流道50的阻力进入分配腔51，然后在分配块57与离心力作用下快速、均匀分配至各个定量腔54；多余溶液进入废液腔53；

(9)提高转速使微流控芯片1以第七转速R7反转，在离心力的作用下，定量腔54中的溶液突破定量流道55的阻力进入扩增反应腔56，与内部的恒温扩增试剂混合；

(10)微流控芯片1以第八转速R8正反往复旋转进行震荡，以使核酸样品与扩增反应腔56内部的恒温扩增试剂充分混合，然后即可在加热装置7的配合下进行恒温扩增反应，最后通过光学检测机构8对扩增产物进行最终检测，完成整个核酸提取、恒温扩增及检测过程。

其中，第一转速R1、第四转速R4、第五转速R5及第八转速R8均用于提供震荡功能以促进混匀，不需要提供突破阻力使液体进行转移的功能，所以均在较小的离心转速下即可实现，例如可均选择100-800r/min。

其中，第二转速R2、第三转速R3、第六转速R6、第七转速R7需要提供依次逐渐增大的离心力以使液体在各个腔体中要需要的路径依次转移，所以需要满足第二转速R2＜第三转速R3＜第六转速R6＜第七转速R7，例如，在一种实施例中，R2为1000-2000r/min，R3为2200-3500r/min，R6为3600-4500r/min，R6为4600-8000r/min。

本实施例中，可控阻隔装置44的作用在于阻隔吸附腔420和洗脱腔430之间的液体互流，但又允许磁珠在磁场9的作用下能由吸附腔420转移至洗脱腔430。以下对可控阻隔装置44进行进一步说明。

可控通道440包括与吸附腔420连通的第一通道443以及一端与第一通道443的末端连通且另一端与洗脱腔430连通的第二通道444；

第一通道443呈喇叭状，且由吸附腔420朝第二通道444的方向(如图6或7中从右至左的方向)，第一通道443的宽度逐渐减小，第一通道443的末端的宽度小于磁性密封芯442的直径，使得磁性密封芯442无法从第二通道444进入第一通道443；特别是在微流控芯片1逆时针转动时，磁性密封芯442还能紧贴第一通道443的右端出口，实现更好的密封效果；

第二通道444呈矩形状，囊体441的外壁与第二通道444的内壁固定连接，囊体441的靠近洗脱腔430的末端的内壁向内突出形成两个相互匹配的半圆形内凸部445以使得磁性密封芯442被限制于第二通道444内，半圆形内凸部445与囊体441的内壁通过弧形面447过渡连接；当磁性密封芯442在移动的磁场9作用下从囊体441的囊道446内脱离时，两个半圆形内凸部445能相互挤压接触从而密封囊道446；囊体441内填充有压缩气体或液体。囊体441优选采用防腐蚀的具有一定弹性的薄壁塑料材质，如聚四氟乙烯、PFA塑料等常见产品。

参照图6和图7，无外加磁场9时，囊体441内具有一定的压力作用，囊道446的内壁会与磁性密封芯442紧密接触，从而能够通过磁性密封芯442实现密封；而囊体441右侧的两个半圆形内凸部445则能够使得磁性密封芯442被限制在第二通道444内，即使在微流控芯片1进行离心转动时，磁性密封芯442也无法突破两个半圆形内凸部445的限制。并且，在较大速度的离心转动：第二转速R2、第三转速R3、第六转速R6、第七转速R7时，均为逆时针方向旋转，此时磁性密封芯442会紧贴第一通道443的右端出口，而基本不会对半圆形内凸部445产生挤压力，只有在较小的速度(R1、R4、R5、R8)震荡过程中逆时针旋转时，磁性密封芯442才会对半圆形内凸部445产生挤压力，而此压力是较小的，无法使半圆形内凸部445变形而打开，如此，为满足磁性密封芯442无法突破两个半圆形内凸部445的限制所需的半圆形内凸部445的结构也更加容易实现。

在一种优选的实施例中，磁性密封芯442至少包括2个，且2个磁性密封芯442之间通过柔性件(如弹簧或细绳等)连接。进一步优选的磁性密封芯442包括2个，2个磁性密封芯442之间通过弹簧(图中未示意)连接，一方面能够提供更好的密封效果，另一方面还能便于转移磁珠。原理为：磁场9作用使磁珠进入第一通道443后，磁性密封芯442的磁性使得磁珠能够大量吸附在右侧的磁性密封芯442上，随着磁场9继续向左移动，左侧的磁性密封芯442撑开囊道446并进入洗脱腔430，右侧的磁性密封芯442紧接着进入洗脱腔430，左侧磁性密封芯442主要起到开启囊道446的作用，而右侧的磁性密封芯442主要起吸附磁珠的作用，从而能够减少磁性密封芯442开启囊道446的过程中磁珠在磁性密封芯442上的脱离。另外，可控阻隔装置44中是通过磁性密封芯442与囊道446内壁的接触实现密封的，通过两个磁性密封芯442，一方面起到了双层密封的效果，另一方面，弹簧的作用使得两个磁性密封芯442具有相互远离的作用趋势，使右侧的磁性密封芯442与第一通道443的左端紧密接触，而左侧的磁性密封芯442则与第二通道444右端的两个半圆形内凸部445的内壁紧密接触，从而实现更好的密封。参照图11，当磁性密封芯442脱离囊道446后，两个半圆形内凸部445在内部压力作用下相互紧贴接触，实现封闭。

磁珠转移过程如下：

参照图9，磁场9先从吸附腔420最右端开始缓慢移动(移动速度控制在0.5-30mm/s)；当磁场9到达覆盖可控阻隔装置44的位置时，如图10，磁珠吸附在左侧的磁性密封芯442上，左侧的磁性密封芯442则在磁场9的作用下撑开囊道446；随着磁场9继续移动，磁珠随两个磁性密封芯442一同进入洗脱腔430，参照图8和图11，在洗脱液的作用下，核酸与磁珠分离，然后便可吸取核酸。

在优选的实施例中，该核酸提取微流控芯片1还包括与清洗腔400、吸附腔420、废液腔53均连通的第一排气流道450、设置在第一排气流道450上的第一排气孔451、与裂解腔410连通的第二排气流道452、设置在第二排气流道452上的第二排气孔453、与洗脱腔430连通的第三排气流道454、以及设置在第三排气流道454上的第三排气孔455。

实施例2

参照图12，作为实施例1的基础上的进一步改进，本实施例中，裂解腔410通过一个主清洗液流道411和两个支清洗液流道412与清洗腔400连通，裂解腔410内设置有过滤膜；支清洗液流道412的末端通过一扩口段部414与裂解腔410连通，扩口段部414倾斜设置在过滤膜的上方。

其中，部分清洗液从主清洗液流道411进入裂解腔410，对裂解腔410内部进行冲洗，另外一部分清洗液则从支清洗液流道412直接进入到过滤膜上方，沿倾斜方向喷射在过滤膜，能够对过滤膜上的大尺寸杂质进行冲刷，提高清洗效果，又能有效防止过滤膜被堵塞，提高清洗效率。

进一步优选的实施例中，支清洗液流道412上还设置有自吸气组件416，自吸气组件416包括与支清洗液流道412倾斜连通的倾斜吸气流道段4160、与倾斜吸气流道段4160连通的径向吸气流道段4161、以及设置在径向吸气流道段4161末端的自吸气孔4162；由芯片主体2的圆心朝外周的方向，倾斜吸气流道段4160与支清洗液流道412之间的夹角为锐角，径向吸气流道段4161与支清洗液流道412平行，自吸气孔4162比倾斜吸气流道段4160更靠近芯片主体2的圆心。

在优选的实施例中，倾斜吸气流道段4160、径向吸气流道段4161的内壁均为疏水表面，可阻止液体进入该流道；且径向吸气流道段4161的流道本体上也设置有微流阀456，进一步防止液体倒流进入径向吸气流道段4161并从自吸气孔4162溢出。当清洗液以一定的流速流经支清洗液流道412时，能够在与支清洗液流道412连通的倾斜吸气流道段4160内产生一定的负压，形成自吸作用，通过径向吸气流道段4161吸入一定量的外部空气，并混入清洗液液形成微泡一同倾斜喷射到过滤膜上，混入清洗液中的微泡能够对过滤膜起到较强的冲洗作用，使得尺寸较小的核酸能够顺利通过过滤膜进入吸附腔420，对过滤膜起到疏通作用，避免堵塞，从而能够提高过滤效率，最终提高核酸回收率。进入吸附腔420内后，微泡能随第一排气流道450排出。

实施例3

参照图13和图14，作为实施例2的基础上的进一步改进，本实施例中，裂解腔410和洗脱腔430的腔体内均设置有若干扰流件20，扰流件20包括与腔体的底面连接的固定件以及与固定件连接的活动块，芯片主体2旋转时，活动块会相对固定件往复移动；

固定件为连接在腔体底面21上的固定柱22，活动块为可偏心旋转连接在固定柱22上的偏心旋转块23。偏心旋转块23上偏心设置有连接孔，固定柱22上端可旋转连接在连接孔内。微流控芯片1以正反往复旋转进行震荡时，偏心旋转块23会在固定柱22上进行偏心旋转，从而能够对腔体内的液体起到扰流作用，配合震荡作用，能增强液体的混匀，促进更充分的裂解或洗脱。

在优选的实施例中，微流控芯片1整体可采用亚克力材质，其中的、磁性密封芯442、扰流件20等与液体接触的组件选用耐腐蚀材质。

实施例4

参照图13和图15，作为实施例2或3上的基础上的进一步改进，本实施例中，吸附腔420内沿芯片主体2的径向间隔设置有若干导流槽421，导流槽421在长度方向上呈弧形状；导流槽的底面422呈上下起伏的波浪面状。导流槽421能够在微流控芯片1以第四转速R4正反往复旋转进行震荡的过程中为吸附腔420内的磁珠提供一定的引导作用，使大量磁珠能够在导流槽421内或附近沿导流槽421的轨迹方向往复运动，从而与吸附腔420内的核酸充分接触，并减少磁珠的团聚吸附，从而能够利于磁珠与核酸的结合。另外，从厚度方向看，导流槽的底面422呈上下起伏的波浪面状，固磁珠在导流槽421内的运动也是呈上下起伏的波浪状，从而在厚度方向也能够利于磁珠与核酸的充分结合。

实施例5

本实施例提供一种基于微流控的恒温扩增检测方法，其采用实施例1-4中的任意一种装置来实现，本实施例中，微流控芯片1上设置有3个检测单元3，配置3组加热装置7，1组光学检测机构8。具体的，该方法包括以下步骤：

一、核酸提取

(1)向微流控芯片1清洗腔400、裂解腔410、吸附腔420和洗脱腔430内先分别注入清洗液、裂解液、核酸吸附液和洗脱液，扩增反应腔56中预封有冻干的用于恒温扩增所需的试剂，将样品(如细菌样品)加入裂解腔410中，然后将微流控芯片1装在离心机构6的离心转盘61上；

(2)使微流控芯片1先以第一转速R1＝130r/min正反往复旋转震荡5min，实现对样品的裂解，以释放核酸；第一转速下，裂解液也无法突破过滤膜；

(3)充分裂解后，微流控芯片1以第二转速R2＝1600r/min反转(逆时针旋转)40s，在离心力的作用下，裂解腔410内的部分物质(核酸、裂解液等)通过过滤膜，并通过S型流道415进入吸附腔420，而裂解残渣则被过滤膜过滤阻挡，留在裂解腔410内；此转速下，清洗液仍然无法突破微流阀456的阻力进入裂解腔410；

(4)提高转速使微流控芯片1以第三转速R3＝2400r/min反转30s，在第三转速下，清洗液突破微流阀456的阻力，进入裂解腔410，对裂解腔410进行清洗，使得附着在其内的剩余核酸能最大限度被冲洗，与清洗液一同进入吸附腔420，从而可大大提高核酸回收率；

(5)使微流控芯片1以第四转速R4＝180r/min正反往复旋转震荡90s，以通过震荡使磁珠充分与核酸结合吸附；

(6)在吸附腔420下方施加移动的磁场9(手持永磁体进行移动,移动速度控制在5mm/s)，磁场9移动方向由吸附腔420最右端向洗脱腔430移动，且磁场9在径向能够覆盖吸附腔420沿径向的宽度，以保证磁场9能够充分吸附吸附腔420内的磁珠；通过磁场9使磁珠转移至洗脱腔430中；在通过可控阻隔装置44时，磁性的磁性密封芯442能够吸附住进入可控通道440内的磁珠，通过磁性密封芯442负载磁珠，最终在磁场9的作用下一同转移至洗脱腔430中；

(7)先撤去磁场9，微流控芯片1以第五转速R5＝180r/min正反往复旋转进震荡90s，以使洗脱液与磁珠充分混匀接触，在洗脱液的作用下，核酸脱离磁珠，游离进入液体内；

(8)重新加上磁场9，吸附住磁珠和磁性密封芯442，微流控芯片1以第六转速R6＝3800r/min反转逆时针)1.5min(，在离心力的作用下，洗脱腔430中的溶液突破扩增流道50的阻力进入分配腔51，然后在分配块57与离心力作用下快速、均匀分配至各个定量腔54；多余溶液进入废液腔53；

(9)提高转速使微流控芯片1以第七转速R7＝5000r/min反转1min，在离心力的作用下，定量腔54中的溶液突破定量流道55的阻力进入扩增反应腔56，与内部的恒温扩增试剂混合,完成核酸提取与分配；

二、恒温扩增

(10)微流控芯片1以第八转速R8＝150r/min正反往复旋转震荡5min，以使核酸样品与扩增反应腔56内部的恒温扩增试剂充分混合；之后微流控芯片1回到初始位置，此时3组加热装置7分别处于3个检测单元3的外侧；

(11)控制第一驱动机构71驱动加热套70朝向芯片主体2的圆心方向移动，使得加热套70上下包覆芯片主体2上的核酸扩增单元5中的扩增反应腔56，加热套70工作，提供恒温环境，使扩增反应腔56中的核酸进行恒温扩增，控制温度为62℃，加热时间45min；之后升温至100℃，处理3min，进行酶灭活处理，终止反应；

三、光学检测

完成恒温扩增后，控制第一驱动机构71驱动加热套70从扩增反应腔56上撤离，控制升降机构82驱动安装平台80向上移动，通过安装平台80上的若干光学检测装置本体81对扩增反应腔56中完成恒温扩增后的产物进行光学检测；

其中，一台光学检测机构8中的光学检测装置本体81的数量和位置与一个检测单元3中的扩增反应腔56的数量和位置匹配，以使得通过一台光学检测机构8能够同时对一个检测单元3中所有的扩增反应腔56同时进行光学检测。完成一个检测单元3的检测后，控制微流控芯片1旋转一定角度，使另一个检测单元3移动到光学检测机构8上方，以进行光学检测，直至完成3个检测单元3的检测。当然，在另外一些实施例中，也可以配置3台光学检测机构8，完成恒温扩增后通过3台光学检测机构8同时对3个检测单元3进行检测，从而提高效率，但会带来成本的增加。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (10)

1.一种基于微流控的恒温扩增检测装置，其特征在于，包括：

微流控芯片，其包括芯片主体以及沿所述芯片主体的圆周方向均匀间隔设置在所述芯片主体上的若干检测单元，所述检测单元包括核酸提取单元以及与所述核酸提取单元连通的核酸扩增单元；

离心机构，其用于实现所述微流控芯片的旋转运动；

加热装置，其数量和设置位置与所述检测单元匹配，以使得每个检测单元均配置有一个加热装置来提供核酸进行恒温扩增过程中的加热功能；所述加热装置包括设置在所述芯片主体的外周边沿的侧部的加热套以及用于驱动所述加热套沿所述芯片主体的径向往复移动的第一驱动机构，所述加热套上具有可供所述芯片主体的外周边沿部分插入的加热槽，以使得所述加热套可上下包覆所述芯片主体上的核酸扩增单元；

以及光学检测机构，其设置在所述芯片主体的下方，用于对核酸扩增单元中完成恒温扩增后的产物进行光学检测。

2.根据权利要求1所述的基于微流控的恒温扩增检测装置，其特征在于，所述离心机构包括离心电机以及与所述离心电机的输出轴驱动连接的离心转盘，所述微流控芯片设置在所述离心转盘上。

3.根据权利要求2所述的基于微流控的恒温扩增检测装置，其特征在于，所述光学检测机构包括安装平台、设置在所述安装平台上的若干光学检测装置本体以及用于驱动所述安装平台上下移动的升降机构。

4.根据权利要求1所述的基于微流控的恒温扩增检测装置，其特征在于，所述核酸提取单元包括：

清洗装置，其包括用于加入和存放清洗液的清洗腔以及设置在所述清洗腔上的清洗液加样口；

裂解装置，其包括与所述清洗腔连通的裂解腔、设置在所述裂解腔上的裂解液加样口以及连通在所述裂解腔的出口端上的S型流道；

核酸吸附装置，其包括与所述S型流道连通的吸附腔以及设置在所述吸附腔上的吸附液加样口，所述吸附腔内用于加入和存放含有磁珠的核酸吸附液；

洗脱装置，其包括洗脱腔以及设置在所述洗脱腔上洗脱液加样口，所述洗脱腔内用于加入和存放洗脱液；

以及可控阻隔装置，其设置在所述核酸吸附装置和洗脱装置之间，所述可控阻隔装置包括连通所述吸附腔和洗脱腔的可控通道、设置在所述可控通道中的囊体以及设置在所述囊体中间形成的囊道内的磁性密封芯；

在施加外部磁场使所述吸附腔内吸附有核酸的磁珠转移至所述洗脱腔内时，磁场的作用可使得所述磁性密封芯脱离所述囊道并同磁珠一起进入所述洗脱腔。

5.根据权利要求4所述的基于微流控的恒温扩增检测装置，其特征在于，所述核酸扩增单元包括通过扩增流道与所述洗脱腔连通的分配腔、连通设置在所述分配腔上的若干扩增元件以及连通设置在所述分配腔上的废液腔；

所述扩增流道与所述废液腔分别与所述分配腔在长度方向上相对的两侧连通；

所述扩增元件包括与所述分配腔连通的定量腔以及与所述定量腔通过定量流道连通的扩增反应腔。

6.根据权利要求5所述的基于微流控的恒温扩增检测装置，其特征在于，所述分配腔在长度方向上呈弧形状且沿所述芯片主体的圆周方向布置，若干扩增元件沿所述芯片主体的圆周方向均匀间隔布置，所述分配腔内设置有数量与所述扩增元件相同的若干倒三角状的分配块，且若干分配块沿所述芯片主体的圆周方向布置，每个分配块对应一个定量腔；

所述分配块具有一导流平面和一导流尖端，所述导流平面处于靠近所述芯片主体的圆心的一侧，所述导流尖端处于远离所述芯片主体的圆心的一侧，且每个所述分配块的导流尖端正对一个定量腔的入口。

7.根据权利要求4所述的基于微流控的恒温扩增检测装置，其特征在于，所述裂解腔通过一个主清洗液流道和两个支清洗液流道与清洗腔连通，所述裂解腔内设置有过滤元件；

所述支清洗液流道的末端通过一扩口段部与所述裂解腔连通，所述扩口段部倾斜设置在所述过滤元件的上方。

8.根据权利要求7所述的基于微流控的恒温扩增检测装置，其特征在于，所述支清洗液流道上还设置有自吸气组件，所述自吸气组件包括与所述支清洗液流道倾斜连通的倾斜吸气流道段、与所述倾斜吸气流道段连通的径向吸气流道段、以及设置在所述径向吸气流道段末端的自吸气孔；

由所述芯片主体的圆心朝外周的方向，所述倾斜吸气流道段与支清洗液流道之间的夹角为锐角，所述径向吸气流道段与所述支清洗液流道平行，所述自吸气孔比所述倾斜吸气流道段更靠近所述芯片主体的圆心。

9.根据权利要求4所述的基于微流控的恒温扩增检测装置，其特征在于，所述可控通道包括与所述吸附腔连通的第一通道以及一端与所述第一通道的末端连通且另一端与所述洗脱腔连通的第二通道；

所述第一通道呈喇叭状，且由所述吸附腔朝所述第二通道的方向，所述第一通道的宽度逐渐减小，所述第一通道的末端的宽度小于所述磁性密封芯的直径；

所述第二通道呈矩形状，所述囊体的外壁与所述第二通道的内壁固定连接，所述囊体的靠近所述洗脱腔的末端的内壁向内突出形成两个相互匹配的半圆形内凸部以使得所述磁性密封芯被限制于所述第二通道内，半圆形内凸部与囊体的内壁通过弧形面过渡连接；当磁性密封芯在移动的磁场作用下从所述囊体的囊道内脱离时，两个半圆形内凸部能相互挤压接触从而密封所述囊道；

所述囊体内填充有压缩气体或液体。

10.根据权利要求4-9中任意一项所述的基于微流控的恒温扩增检测装置的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)通过所述离心机构和微流控芯片的配合以及施加外部磁场的作用下，对样品进行核酸提取，并使提取得到的核酸进入核酸扩增单元的扩增反应腔中；

2)控制所述第一驱动机构驱动加热套朝向芯片主体的圆心方向移动，使得加热套上下包覆所述芯片主体上的核酸扩增单元中的扩增反应腔，所述加热套工作，提供恒温环境，使扩增反应腔中的核酸进行恒温扩增；

3)完成恒温扩增后，控制所述第一驱动机构驱动加热套从扩增反应腔上撤离，控制所述升降机构驱动所述安装平台向上移动，通过安装平台上的若干光学检测装置本体对扩增反应腔中完成恒温扩增后的产物进行光学检测；

其中，一台光学检测机构中的光学检测装置本体的数量和位置与一个检测单元中的扩增反应腔的数量和位置匹配，以使得通过一台光学检测机构能够同时对一个检测单元中所有的扩增反应腔同时进行光学检测。

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