CN100500693C - 分子印迹树脂和制备方法及其分离提纯蛋白质的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子印迹树脂和制备方法及其分离提纯蛋白质的应用。孔径为2～3μm，以丙烯酰胺为单体，以低分子量聚乙醇的接枝物为辅助识别链，用牛血清白蛋白作模板，N，N-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，在由磷酸盐缓冲体系中以丙烯酸酯大孔树脂球作载体，使用过二硫酸铵-亚硫酸钠氧化还原体系为引发剂，在4～10℃交联聚合4～6h制备。该分子印迹树脂可用于混合蛋白体系中目标蛋白质的分离提纯。本发明成球在有机相中进行，印迹在水相中进行，避免了对模板蛋白质的破坏，实用性强。使用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测吸附蛋白及其洗涤过程，与通常使用紫外分光光度计检测蛋白质含量方法相比，这种检测方法定量容易，直观准确，可视性强。
Description
技术领域
本发明涉及印迹树脂的合成及其应用，特别是一种分子印迹树脂和制备方法及其分离提纯蛋白质的应用，用辅助识别的限长聚合物链合成蛋白质印迹聚合物，具体地用于蛋白质的分离提纯。
背景技术
分子印迹技术是聚合物通过“记忆”印迹分子的立体空间而具有的分子水平上的专一性识别能力。由于蛋白质结构的特殊性及生物活性的要求，近年来印迹蛋白质成为分子印迹领域研究热点。利用非共价作用是印迹蛋白质最简单方法。常用的弱分子间作用力有：氢键、静电力、电荷转移、疏水作用以及范德华力等。
印迹蛋白质的方法主要有包埋法、表面印迹法、抗原决定基的方法。
早期采用最多的聚合方法是包埋法，印迹的蛋白质通过蛋白酶的降解去除，印迹聚合物可以重新吸附印迹分子。Hjérten等(Hjérten J，Liao J L，Nakazato Ketal.，Chromatography，1997，44：227-234)采用该法，以丙烯酰胺为单体合成了低交联度的凝胶，对血红蛋白、生长激素、红细胞色素、肌红蛋白和核糖核酸酶等进行了印迹。洗脱印迹分子后得到了具有良好选择性的分子印迹聚合物，不同的印迹分子能被相应的凝胶所吸附。
表面印迹法制得的介质使印迹识别位点处在颗粒的表面(或表层)，克服了包埋法印迹分子利用率低、印迹分子洗脱困难、介质内部扩散阻力大、介质形态不规则等缺点。从蛋白质的结构和特性来看，表面印迹法更适合印迹蛋白质分子。其优点是可利用粒子的机械稳定性及调节粒子本身性能的适应不同的印迹需要。表面印迹法印迹蛋白质的载体有硅胶粒子、云母、聚合物微球等。硅胶作载体的优点是在聚合过程中硅胶表面的修饰基团通过价键距离控制，只有相应底物有强烈识别作用，可大大降低非特异吸附对选择性的影响。但用聚合方法制备的微球作载体(Ye L，Cormack PAG，Mosbach K.AnalChim Acta.2001，435：187～196)可通过对初始聚合阶段工艺条件的控制，得到尺寸均一，有良好机械性能的聚合物颗粒，不用粉碎和筛分，能保证得到的印迹聚合物的物理和化学性能。表面印迹法一般是在微球上进行印迹或涂层印迹聚合物，或是将蛋白质首先吸附到云母上(Shi H，Tsai W B，Ferrari S，Ratner B D.，Nature，1999，398：593-597)，然后将一薄层的二糖分子包被在吸附的蛋白质上，糖层与蛋白质通过氢键结合。接着在糖分子表面聚合上一层光滑的荧光聚合物薄层。最后除去云母并溶解掉印迹蛋白质，即生成了具有蛋白质形状空穴的聚二糖表面印迹聚合物。Sergey等(Bossi A，Piletsky S A，PiletskaE V，et al.Anal.Chem.，2001，73：5281～5286)提出表面接枝印迹方法是在聚苯乙烯树脂表面涂一薄层稳定的可键合的物质，该物质在蛋白质分子存在下可聚合。
抗原决定基的方法根据抗原和抗体仅仅是通过一小部分即抗原决定基来相互作用的原理而建立的一种方法，所谓的抗原决定基是由三到六个氨基酸残基组成的表面区域(Rachkov A，Minoura N.Biochi et Biophy Acta，2001，1544：255～266)。如果使用代表蛋白质或多肽结构的小部分裸露片段的短肽作为模板，就会产生与该短肽相匹配的空间大孔，从而分子印迹聚合物就会识别含有该短肽部分的整个蛋白质分子。抗原决定基方法的缺点是不仅可以识别模板分子，还可以识别其他的具有与模板分子相同序列的氨基酸和蛋白质。
从上述情况来看，目前印迹蛋白质方法单一，单体聚合发生在有机溶剂中，与蛋白质作用的官能团种类少，这限制了印迹蛋白质的应用。因此开发印迹蛋白质的新方法，增加官能团与蛋白质之间作用力是迫切需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提出一种分子印迹树脂和制备方法及其分离提纯蛋白质的应用，以克服传统的包埋法印迹蛋白质时难去除模板的不足及表面印迹蛋白质方法印迹效果差的缺点，即它是将一段带有随机分布功能基团的亲水性辅助识别链引入识别体系，该辅助识别链与模板蛋白质先进行自组装，然后组装体与自由单体丙烯酰胺共同以聚丙烯酸酯大孔树脂为载体在水相中进行交联聚合。本发明成球在有机相中进行，印迹在水相中进行，避免了对模板蛋白质的破坏，实用性强。使用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测吸附蛋白及其洗涤过程，与通常使用紫外分光光度计检测蛋白质含量方法相比，这种检测方法定量容易，直观准确，可视性强。
本发明提供的分子印迹树脂是先通过自由基溶液聚合制得低分子量(聚合度在40～100之间)的聚乙烯醇，然后在聚乙烯醇上进行接枝聚合，得到聚乙烯醇接枝产物。该产物作为辅助识别链先与牛血清白蛋白进行自组装，然后组装体与丙烯酰胺以丙烯酸酯大孔树脂球作载体进行交联聚合。除去模板蛋白后得到分子印迹树脂。最后使用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测吸附蛋白及其洗涤过程。
本发明的分子印迹树脂，它的孔径为2～3μm，按以下步骤制备：
1)以丙烯酰胺为单体，低分子量聚乙醇(聚合度在40～100)的接枝物为辅助识别链，在模板蛋白质存在下(本发明是用牛血清白蛋白作模板)，N，N-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，在由磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成的缓冲体系中以丙烯酸酯大孔树脂球作载体，使用过二硫酸铵-亚硫酸钠氧化还原体系为引发剂，在4～10℃交联聚合4～6h，体系pH在6.8～7.3之间。所述的分子印迹树脂的吸附量为50～100μg/g。
所述的分子印迹树脂的制备方法包括以下步骤：
1)在60～70℃，偶氮二异丁腈为引发剂，甲醇为溶剂，乙酸乙烯酯聚合反应4～10h，然后30℃醇解3h，离心分离后室温下真空干燥24hr，制得聚乙烯醇(聚合度在40～100之间)；所述的甲醇重量:乙酸乙烯酯的重量比＝5～15:1，偶氮二异丁腈与醋酸乙烯酯的重量比＝0.01～0.04:1。
2)25～45℃下，以水与二甲基甲酰胺为混合溶剂，硝酸铈铵为催化剂，5％～20％的聚乙烯醇与接枝单体丙烯酰胺和4-乙烯基吡啶反应，反应时间为6～48h，氮气保护，沉淀、分离，真空烘箱中烘24h，得到聚乙烯醇接枝丙烯酰胺、4-乙烯基吡啶的共聚物PVAVP；所述的接枝单体摩尔比为丙烯酰胺:4-乙烯基吡啶＝0.5～2.5:1，水与二甲基甲酰胺混合溶剂体系中水的体积比为60～100％，硝酸铈铵与丙烯酰胺摩尔比为0.006～0.01:1。
3)在20～40℃下，二甲基亚砜和吡啶为溶剂，5％～10％的聚乙烯醇接枝丙烯酰胺、4-乙烯基吡啶的共聚物PVAVP与丙烯酰氯反应二次接枝，反应时间为4～6h，沉淀、分离，洗涤，真空干燥24h，得到识别分子PVPAC；所述的丙烯酰氯与聚乙烯醇接枝丙烯酰胺、4-乙烯基吡啶的共聚物PVAVP的摩尔比0.2～0.5:1。
4)将识别分子PVPAC溶解于由磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成的缓冲溶液中，辅助识别链浓度为1～10％，与浓度0.1～0.5％牛血清白蛋白(BSA)先于4℃～10℃进行自组装0.5h～2h。加入丙烯酸酯树脂载体，丙烯酰胺、N，N-亚甲基双丙烯酰胺、过二硫酸铵，4～10℃通氮除氧1h，然后加入亚硫酸钠溶液，使体系总体积在30mL，交联聚合反应4～6h，反应体系pH在6.8～7.3之间；用2mol.L-1KCl溶液洗涤树脂球至电泳检测无BSA条带，得到浅黄色的分子印迹树脂。所述的丙烯酸酯树脂与丙烯酰胺的重量比＝0.15～0.5:1，辅助识别链重量为丙烯酰胺重量的25～100％，牛血清白蛋白重量为辅助识别链的4～15％，N，N亚甲基双丙烯酰胺重量为丙烯酰胺重量的5～15％。
上述的分子印迹树脂应用于蛋白质分离的方法包括下述步骤：
1)4℃下，将计量的分子印迹树脂直接放入pH＝7.3的磷酸盐缓冲液的蛋白质混合体系中，吸附15h；
2)吸附蛋白后的树脂依次用依次用1mL 0.01M磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成的缓冲液、1mL 0.15M氯化钾溶液、1mL 0.5M氯化钾溶液、1mL 2.0M氯化钾溶液各洗涤三次，进行梯度洗涤；
3)将各洗涤液分别用三氯乙酸/脱氧胆酸纳(TCA/DOC)方法沉淀蛋白，蛋白液制样后恒流走十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，用电泳检测吸附蛋白，从电泳结果读出蛋白浓度。
本发明可作成试剂盒，即包括：辅助识别链、丙烯酰胺单体和丙烯酸酯大孔树脂。
本发明得到的分子印迹树脂在在含有目标蛋白质和其他蛋白质混合体系中，能够分离出目标蛋白质(本发明使用牛血清白蛋白和血红蛋白混合体系中，能够分离出牛血清白蛋白)，吸附量为50～100μg/g。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测吸附蛋白及其洗涤过程。
本发明不同于其他印迹蛋白质的方法是加入了辅助识别链，本发明中的辅助识别链是具有多识别位点的，且这些识别位点是随机分布的，这种方法克服了通常由单纯的单体制备的识别体系识别位点单一、结构紧密蛋白质不易洗脱的弊端。通常的以树脂球作载体的印迹都是印迹过程与成球过程同步进行，本发明则是将成球与印迹分步进行，成球在有机相中进行，印迹在水相中进行，避免了对模板蛋白质的破坏，实用性强。本发明使用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测吸附蛋白及其洗涤过程，与通常使用紫外分光光度计检测蛋白质含量方法相比，这种检测方法定量容易，直观准确，可视性强。
附图说明
图1：大孔分子印迹树脂的扫描电镜照片(SEM)。
图2：树脂吸附混合蛋白质电泳图。
图3：分子印迹树脂吸附混合蛋白质电泳图。
具体实施方式
实施例1.
乙酸乙烯酯53mL、甲醇490mL、偶氮二异丁腈0.5g加入反应瓶中，通氮、除氧，70℃反应4h。向上述制得的10％聚醋酸乙烯酯的甲醇溶液中加入40％氢氧化钠溶液4.3g，30℃醇解3h。离心分离后室温下真空干燥24hr，制得聚乙烯醇(PVA)。
聚乙烯醇2g，溶于18mL水中，加入2mL二甲基甲酰胺，40℃通N250min，加入硝酸铈铵的硝酸溶液0.9mL，15min后加入丙烯酰胺1.94g，15min后加入4-乙烯基吡啶1.43g，45℃下氮气保护反应10h。沉淀、分离，真空烘箱中烘24h，得聚乙烯醇接枝丙烯酰胺、4-乙烯基吡啶的共聚物PVAVP。
取1gPVAVP用20m1二甲基亚砜溶解，加1.0mL吡啶，20℃滴加丙烯酰氯1.11mL，30℃反应4h。沉淀、分离，洗涤，真空干燥24h，得到识别分子PVPAC。
牛血清白蛋白(BSA)0.15g溶解于20mL 10％的PVPAC的磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成的缓冲溶液中，于4℃在离心管中旋转0.5h。丙烯酸甲酯树脂1g移入上述溶液体系，加丙烯酰胺2.00g，N，N亚甲基双丙烯酰胺0.22g，过二硫酸铵0.08g，在搅拌情况下于4℃通氮除氧1h，然后加入亚硫酸钠溶液3.51mL，反应3h。将产物放入抽提袋中，挤掉树脂球表面的凝胶。2mol.L-1KCl溶液洗涤树脂球至电泳检测无BSA条带，得到浅黄色的分子印迹树脂(MIPR1)。
称取湿MIPR1树脂0.5g加入含有0.77‰牛血清白蛋白(BSA-V，联星公司)和牛血红蛋白(BBI，上海申工)的10mL磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成的缓冲液，体系pH＝7.3，4℃吸附15h。吸附蛋白后的树脂球依次用1mL0.01M磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成的缓冲溶液、1mL 0.150mol.L-1KCl溶液、1mL 0.50mol.L-1KCl溶液、1mL2.0mol.L-1KCl溶液各洗涤三次。
将各洗涤液分别按下述步骤用三氯乙酸/脱氧胆酸纳(TCA/DOC)方法沉淀蛋白。蛋白液制样后按照下述步骤恒流走十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
三氯乙酸/脱氧胆酸纳(TCA/DOC)沉淀蛋白质方法
材料：1.5％脱氧胆酸钠溶液
2.30％三氯乙酸溶液
3.2M氢氧化钠溶液
4.十二烷基磺酸钠(1×SDS)样品缓冲液组成：
Tris·Cl(pH 6.8) 50mM
DTT(二硫苏糖醇) 100mM
SDS 2％
溴酚蓝 0.1％
甘油 10％
步骤：1.向1mL上述各蛋白液中加入10μL 5％脱氧胆酸钠溶液后混匀，然后加480μL 30％三氯乙酸，混匀后于4℃放置2h或冰浴中放置30min。
2.4℃、10,000rpm离心25min，去上清。
3.10,000rpm离心25min，去尽残留液体。
4.沉积物中加入50μL一倍样品液重悬，如果呈黄色或有沉淀，则加1～2μL 2N氢氧化钠溶液将颜色调至蓝色并使之完全溶解。
5.99℃煮沸5min，3000rpm离心10s后即可直接上样走电泳。
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
材料：1.30％丙烯酰胺溶液
2.1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：
1000mL溶液中含有：3.1g Tris碱、18.8g甘氨酸(Gly)、10mL 10％ SDS。
3.考马斯亮蓝染色液：
100mL溶液中含有45mL甲醇、10mL乙酸、0.25g考马斯亮蓝(R250)。
4.脱色液组成：
100mL溶液中含有45mL甲醇、10mL乙酸。
5.15％电泳胶板按照下述组份的量配制：
| 贮存液 | 分离胶(mL) | 积层胶(mL) |
| 水 | 1.84 | 2.72 |
| 30％丙烯酰胺 | 4.0 | 0.664 |
| 1.5M Tris pH 8.8 | 2.0 | — |
| 1.0M Tris pH 6.8 | — | 0.504 |
| 10％ SDS | 0.08 | 0.04 |
| 10％过硫酸铵 | 0.08 | 0.04 |
| TEMED | 0.003 | 0.004 |
步骤：
取上述处理好的待测蛋白样品各10μL上样，然后恒流走电泳(单块胶板18mA，双块胶板36mA)，待蓝色前沿走到理想位置时停止电泳，将胶取下于染色液中浸泡2h左右，然后脱色2—3遍，看电泳结果。
从电泳结果读出蛋白浓度，吸附量为100μg/g，特异性好，测定结果见图1、2。
图1：大孔分子印迹树脂的扫描电镜照片(SEM)(×10000倍，孔径为2～3μm)。
图2：树脂吸附混合蛋白质电泳图：I是分子印迹树脂(MIPR1)吸附混合蛋白质前后溶液蛋白浓度，II是无识别分子的丙烯酰胺树脂(PAMR1)吸附混合蛋白质前后溶液蛋白浓度。
作对照实验的丙烯酰胺树脂参照上述过程制备，只是不加入辅助识别分子。具体制备步骤如下：
牛血清白蛋白(BSA)0.15g溶解于20mL磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成的缓冲溶液中，称量1g丙烯酸甲酯树脂移入上述溶液体系，加丙烯酰胺2.00g，N，N亚甲基双丙烯酰胺0.22g，过二硫酸铵0.08g，在搅拌情况下于4℃通氮除氧1h，然后加入亚硫酸钠溶液3.51mL，反应3h。将产物放入抽提袋中，挤掉树脂球表面的凝胶。2mol.L-1氯化钾KCl溶液洗涤树脂球至电泳检测无BSA条带，得到白色的分子印迹树脂(PAMR1)。
称取湿PAMR1树脂0.5g加入含有0.77‰牛血清白蛋白(BSA-V，联星公司)和牛血红蛋白(BBI，上海申工)的10mL磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成的磷酸盐缓冲液，体系pH＝7.3，4℃吸附15h。吸附蛋白后的树脂球依次用1mL0.01M磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成的缓冲溶液、1mL 0.150mol.L-1KCl溶液、1mL 0.50mol.L-1KCl溶液、1mL2.0mol.L-1KCl溶液各洗涤三次。
将各洗涤液分别用三氯乙酸/脱氧胆酸纳(TCA/DOC)方法沉淀蛋白。蛋白液制样后恒流走十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。测定结果见图2，看出特异性吸附较差。
实施例2.
乙酸乙烯酯16mL、甲醇264mL、偶氮二异丁腈0.15g加入反应瓶中，通氮、除氧，65℃反应6h。向上述制得的13％聚醋酸乙烯酯的甲醇溶液中加入40％氢氧化钠溶液5.73g，35℃醇解3h。离心分离后室温下真空干燥24hr，制得聚乙烯醇(PVA)。
聚乙烯醇(PVA)1g，溶于20ml水中，35℃通N250min，加入硝酸铈铵的硝酸溶液0.45mL，15min后加入丙烯酰胺1.04g，15min后加入4-乙烯基吡啶0.843g，40℃下氮气保护反应24h。沉淀、分离，真空烘箱中烘24h，得聚乙烯醇接枝丙烯酰胺、4-乙烯基吡啶共聚物PVAVP。
取0.8gPVAVP用15mL二甲基亚砜溶解，加0.8mL吡啶，20℃滴加丙烯酰氯0.85mL，35℃反应6h。沉淀、分离，洗涤，真空干燥24h，得到识别分子PVPAC。
牛血清白蛋白(BSA)0.10g溶解于15mL 5％的PVPAC的缓冲溶液中，于4℃在离心管中旋转0.5h。丙烯酸甲酯树脂0.5g移入上述溶液体系，加丙烯酰胺1.50g，N，N亚甲基双丙烯酰胺0.12g，过二硫酸铵0.08g，在搅拌情况下于4℃通氮除氧0.5h，然后加入亚硫酸钠溶液3.51mL，反应2h。将产物放入抽提袋中，挤掉树脂球表面的凝胶。2mol.L-1氯化钾(KCl)溶液洗涤树脂球至电泳检测无BSA条带，得到浅黄色的分子印迹树脂(MIPR2)。
称取湿MIPR2树脂0.75g加入含有0.5‰牛血清白蛋白和牛血红蛋白的10mL磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成的磷酸盐缓冲液，体系pH＝7.0，4℃吸附15h。吸附蛋白后的树脂球依次用1mL0.1M磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成的磷酸盐缓冲溶液、1mL0.150mol.L-1KCl溶液、1mL 0.50mol.L-1KCl溶液、1mL 2.0mol.L-1KCl溶液各洗涤三次。
将各洗涤液分别用三氯乙酸/脱氧胆酸纳(TCA/DOC)方法沉淀蛋白。恒流走十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，吸附量为65μg/g。
作对照实验的丙烯酰胺树脂参照上述过程制备，只是不加入辅助识别分子，具体步骤如下：
牛血清白蛋白(BSA)0.10g溶解于15mL磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成的磷酸盐缓冲溶液中，加丙烯酸甲酯树脂0.5g，AM1.50g，N，N亚甲基双丙烯酰胺0.12g，过二硫酸铵0.08g，在搅拌情况下于4℃通氮除氧0.5h，然后加入亚硫酸钠溶液3.51mL，反应2h。将产物放入抽提袋中，挤掉树脂球表面的凝胶。2mol.L-1KCl溶液洗涤树脂球至电泳检测无BSA条带，得到白色的分子印迹树脂(PAMR2)。
称取湿PAMR2树脂0.75g加入含有0.5‰牛血清白蛋白和牛血红蛋白的10mL磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成的磷酸盐缓冲液，体系pH＝7.0，4℃吸附15h。吸附蛋白后的树脂球依次用1mL0.1M磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成的磷酸盐缓冲溶液、1mL0.150mol.L-1KCl溶液、1mL 0.50mol.L-1KCl溶液、1mL 2.0mol.L-1KCl溶液各洗涤三次。
将各洗涤液分别用三氯乙酸/脱氧胆酸纳(TCA/DOC)方法沉淀蛋白。恒流走十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。测定结果见图3(I)，看出特异性吸附较差。
图3：分子印迹树脂吸附混合蛋白质电泳图：Ia-实施例2丙烯酰胺树脂球(PAMR2)吸附混合蛋白质浓度，Ib-实施例2分子印迹树脂(MIPR2)吸附混合蛋白质浓度；IIa-实施例3丙烯酰胺树脂球(PAMR3)吸附混合蛋白质浓度，IIb-实施例3分子印迹树脂(MIPR3)吸附混合蛋白质浓度。
实施例3.
乙酸乙烯酯53mL、甲醇574mL、偶氮二异丁腈0.65g加入反应瓶中，通氮、除氧，60℃反应10h。向上述制得的8％的聚醋酸乙烯酯的甲醇溶液中加入40％氢氧化钠溶液4.78g，30℃醇解2h。离心分离后室温下真空干燥24hr，得到聚乙烯醇(PVA)。
聚乙烯醇(PVA)4g，溶于20ml水中，加入5mL二甲基甲酰胺，35℃通N250min，加入硝酸铈铵的硝酸溶液1.10mL，15min后加入丙烯酰胺3.92g，15min后加入4-乙烯基吡啶2.89g，35℃下氮气保护反应36h。沉淀、分离，真空烘箱中烘24h，得聚乙烯醇接枝丙烯酰胺、4-乙烯基吡啶共聚物PVAVP。
取2gPVAVP用30mL二甲基亚砜溶解，加1.51mL吡啶，20℃滴加丙烯酰氯2.35mL，25℃反应6h。沉淀、分离，洗涤，真空干燥24h，得到识别分子PVPAC。
牛血清白蛋白BSA0.10g溶解于20mL5％的PVPAC的磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成的缓冲溶液中，于4℃在离心管中旋转20min。丙烯酸甲酯树脂2.0g移入上述溶液体系，加AM1.00g，N，N亚甲基双丙烯酰胺0.30g，过二硫酸铵0.35g，在搅拌情况下于4℃通氮除氧1h，然后加入亚硫酸钠溶液6.47mL，反应4h。将产物放入抽提袋中，挤掉树脂球表面的凝胶。2mol.L-1KCl溶液洗涤树脂球至电泳检测无BSA条带，得到浅黄色的分子印迹树脂(MIPR3)。
称取湿MIPR3树脂1.0g加入含有0.4‰牛血清白蛋白和血红蛋白的10mL磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成的磷酸盐缓冲溶液中，4℃吸附18h。吸附蛋白后的树脂球依次用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成的1mL 0.150mol.L-1KCl溶液、1mL 0.50mol.L-1KCl溶液、1mL 2.0mol.L-1KCl溶液洗涤三次。
将各洗涤液分别用三氯乙酸/脱氧胆酸纳(TCA/DOC)方法沉淀蛋白。恒流走十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，从电泳结果读出蛋白浓度，吸附量为50μg/g。
作对照实验的丙烯酰胺树脂参照上述过程制备，只是不加入辅助识别分子。制备过程如下：
牛血清白蛋白BSA0.10g溶解于20mL磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成的磷酸盐缓冲溶液中，加丙烯酸甲酯树脂2.0g，AM1.00g，N，N亚甲基双丙烯酰胺0.30g，过二硫酸铵0.35g，在搅拌情况下于4℃通氮除氧1h，然后加入亚硫酸钠溶液6.47mL，反应4h。将产物放入抽提袋中，挤掉树脂球表面的凝胶。2mol.L-1KCl溶液洗涤树脂球至电泳检测无BSA条带，得到白色的分子印迹树脂(PAMR3)。
称取湿树脂PAMR3 1.0g加入含有0.4‰牛血清白蛋白和血红蛋白的10mL磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成的磷酸盐缓冲溶液中，4℃吸附18h。吸附蛋白后的树脂球依次用1mL0.1M磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成的缓冲溶液、1mL 0.150mol.L-1KCl溶液、1mL0.50mol.L-1KCl溶液、1mL 2.0mol.L-1KCl溶液洗涤三次。
将各洗涤液分别用三氯乙酸/脱氧胆酸纳(TCA/DOC)方法沉淀蛋白。恒流走十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。测定结果见图3(II)，看出特异性吸附较差。
Claims (3)
1、一种分子印迹树脂的制备方法，该分子印迹树脂的孔径为2～3μm，吸附量为50～100μg/g，其特征在于它包括以下步骤：
1)在60～70℃，偶氮二异丁腈为引发剂，甲醇为溶剂，乙酸乙烯酯聚合反应4～10小时，然后30℃醇解3小时，离心分离后室温下真空干燥24小时，制得聚乙烯醇，聚合度在40～100之间；
2)25～45℃下，以水与二甲基甲酰胺为混合溶剂，混合溶剂体系中水的体积百分比为60～100％，硝酸铈铵为催化剂，5％～20％的聚乙烯醇与接枝单体丙烯酰胺和4-乙烯基吡啶反应，反应时间为6～48小时，反应体系用氮气保护，反应所得产品经沉淀、分离、真空烘箱中烘24小时，得到聚乙烯醇接枝丙烯酰胺、4-乙烯基吡啶的共聚物；所述的接枝单体摩尔比为丙烯酰胺：4-乙烯基吡啶＝0.5～2.5:1，硝酸铈铵与丙烯酰胺摩尔比为0.006～0.01:1；
3)在20～40℃下，二甲基亚砜和吡啶为溶剂，5％～10％的聚乙烯醇接枝产物PVAVP与丙烯酰氯反应二次接枝，反应时间为4～6小时，反应所得产品经沉淀、分离、洗涤、真空干燥24小时，得到识别分子即聚乙烯醇接枝丙烯酰胺、4-乙烯基吡啶与丙烯酰氯的共聚物PVPAC；所述的丙烯酰氯与聚乙烯醇接枝丙烯酰胺、4-乙烯基吡啶的共聚物的摩尔比0.2～0.5:1；
4)将第3)步得到的共聚物PVPAC作为辅助识别链，溶解于由磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成的缓冲水溶液中，辅助识别链浓度为1～10％，与浓度0.1～0.5％牛血清白蛋白先于4℃～10℃进行自组装0.5小时～2小时；然后向上述水溶液中加入丙烯酸酯树脂载体，丙烯酰胺、N，N-亚甲基双丙烯酰胺、过二硫酸铵，4～10℃通氮除氧1小时，然后加入亚硫酸钠溶液，交联聚合反应4～6小时，反应体系pH在6.8～7.3之间；用2mol.L-1氯化钾溶液洗涤丙烯酸酯树脂载体至电泳检测无牛血清白蛋白条带，得到分子印迹树脂；所述的丙烯酸酯树脂与丙烯酰胺的重量比为＝0.15～0.5:1，辅助识别链重量为丙烯酰胺重量的25～100％，牛血清白蛋白重量为辅助识别链的4～15％，N，N亚甲基双丙烯酰胺重量为丙烯酰胺重量的5～15％。
2、根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤1)所述的甲醇重量：乙酸乙烯酯的重量比＝5～15:1，偶氮二异丁腈与乙酸乙烯酯重量比＝0.01～0.04:1。
3、一种权利要求1所制备的分子印迹树脂应用于蛋白质分离的方法，其特征在于包括下述步骤：
1)4℃下，将计量的分子印迹树脂直接放入pH＝7.3的磷酸二氢钠和磷酸氢二钠缓冲液的蛋白质混合体系中，吸附15小时；
2)吸附蛋白后的树脂依次用1mL 0.01M磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成的缓冲液、1mL0.15M氯化钾溶液、1mL 0.5M氯化钾溶液、1mL 2.0M氯化钾溶液各洗涤三次，进行梯度洗涤；
3)将各洗涤液分别用三氯乙酸/脱氧胆酸纳方法沉淀蛋白，蛋白液制样后恒流走十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，用电泳检测吸附蛋白，从电泳结果读出蛋白浓度。
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