CN100400557C - 蛋白质印迹大孔高分子化合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明是设计合成了一种蛋白质印迹的大孔聚合物，它是将牛血清白蛋白分散于含有碳酸钙超微粉体的丙烯酰胺单体中。单体聚合后，蛋白质和超微粉体被包埋在聚丙烯酰胺高分子网络中。随着超微粉体的溶解和洗出形成了大孔聚合物，部分蛋白质也会随之脱出，从而得到了含有蛋白质印迹孔洞的聚合物。这为生物大分子印迹聚合物提供了一种方法。

Description

蛋白质印迹大孔高分子化合物及其制备方法
(一)技术领域：
本发明属于分子印迹技术领域，特别是涉及一种将生物大分子蛋白质为模板对聚合物的印迹，最终得到在色谱固定相中可选择性识别蛋白质的高分子材料。
(二)背景技术：
蛋白质印迹聚合物的制备可获得能够特异性地识别蛋白质材料，是实现蛋白质芯片和高通量药物搜寻的基础之一。该方法主要借鉴了小分子的印迹技术(MIT)，而MIT已经广泛地应用到高分子催化剂、传感器设计、人工受体/抗体及手性分离的HPLC固定相。
但与小分子的印迹不同，蛋白质的印迹却遇到了技术上的困难。原因是蛋白质的尺度远大于包裹它们的聚合物网格而难以从聚合物中扩散出来。模板蛋白质被淤塞在聚合物中不能形成纳米空穴。解决这种问题的一种可行的方法是蛋白质对聚合物表面的印迹(参见Shi，H.Tsai，W.B.Garrison，M.D.Ferrari，S.& Ratner，B.D.Template-imprinted nanostructured surfaces for protein recognition.Nature，1999，398(6728)：593-597)，该方法所得到的聚合物对蛋白质的识别能力可提高约20倍，但由于聚合物的表面积所限，此项技术只能用于蛋白质的识别检测，还不能对大量蛋白质进行识别分离。要进一步扩大可识别的表面，就需要对聚合物本体内部进行印迹。
(三)发明内容：
本发明的目的在于提供一种蛋白质印迹大孔高分子化合物及其制备方法，它解决了制备蛋白质印迹三维聚合物是将蛋白质模板从聚合物内部的洗涤脱出的关键问题，它拟以超细粉体作为聚合物的致孔剂，通过溶洗出这些粉体，使聚合物内部形成大量微小的孔道，这些孔道具有很高的比表面，内表面上印迹的蛋白质易于从孔道中洗脱，这样，就可得到较大容量的蛋白质印迹聚合物，从而实现在色谱固定相上的蛋白质的识别。
本发明的技术方案：一种蛋白质印迹大孔高分子化合物，其特征在于：该高分子化合物是由交联型聚丙烯酰胺所构成；该高分子化合物结构中含有牛血清白蛋白印迹的空洞；该高分子化合物在液相色谱中可识别牛血清白蛋白。
上述所说的蛋白质印迹大孔高分子化合物不溶于任何溶剂。
一种蛋白质印迹大孔高分子化合物的制备方法，其特征在于它是由以下步骤所构成：
(1)BSA印迹聚合物的制备：
在5℃下，在0.15～0.3g的牛血清白蛋白和0.3～0.6g的2,500目的碳酸钙粉末的20～40mL磷酸钾缓冲液(pH 7.5，0.01M)所形成的悬浮液中，加入5～10g的丙烯酰胺和2～4g的N，N′-亚甲基双丙烯酰胺，加入0.3～0.5g的过硫酸钾-亚硫酸氢钠引发剂；在氮气保护下，强烈搅拌下直至反应体系固化；将固体碾碎并挤压过200目的筛网；所得到的聚合物用250mL 0.1M的盐酸洗涤3～5次以除去碳酸钙；将颗粒用2～4mg的链霉蛋白酶(XXI型)的5～10mL磷酸钾缓冲液(pH 8.0，0.1M)处理48～72h以除去部分蛋白质；产物真空干燥；
(2)非印迹聚合物的制备：
在5℃下，在0.3～0.6g的2,500目的碳酸钙粉末的20～40mL磷酸钾缓冲液(0.01M，pH 7.5)所形成的悬浮液中，加入5～10g的丙烯酰胺和2～4g的N，N′-亚甲基双丙烯酰胺；加入0.3～0.5g的过硫酸钾-亚硫酸氢钠引发剂；反应条件与BSA印迹聚合物的制备方法相同；
(3)高性能液相色谱：
蛋白质印迹聚合物在氯仿-丙酮(15∶3体积比)中匀浆，利用气动流体泵，在300巴的压强下，以丙酮为溶剂装载到不锈钢柱内；采用甲醇-醋酸(8∶1体积比)洗提的方法从聚合物中吸附和萃取蛋白质；在室温下洗提，并用分光光度计在220nm处进行跟踪。
本发明的工作原理在于：如图1所示，在较低的温度下以水溶性氧化还原引发剂过硫酸钾-亚硫酸氢钠引发自由基聚合反应，低温可减少蛋白质的变性。聚合过程中，体系交联，形成丙烯酰胺和N，N′-亚甲基双丙烯酰胺聚合物网络，蛋白质分子和碳酸钙颗粒被包埋在聚合物网络中。蛋白质是生物大分子，很难从聚合物网络中脱出。
用盐酸洗涤聚合物，碳酸钙与盐酸作用生成水溶性的氯化钙而从聚合物内部洗出。这样，在聚合物网络内就留下了许多原碳酸钙微粒所印迹的空穴，足够量的空穴连通起来还可形成聚合物内部的孔道。而这些空穴和孔道附近的蛋白质就会沿着孔道被洗涤出聚合物母体。这在一定程度上解决了蛋白质难以像小分子化合物那样从聚合物洗脱的问题。
部分蛋白质脱离聚合物母体后，在聚合物内部会留下与蛋白质形状匹配的纳米印迹洞。这些纳米洞可识别模板蛋白质，并倾向于与这种蛋白质结合。
被碾碎、过筛和萃取的聚合物用于高效液相色谱的固定相。以装载在分析柱上的非印迹和BSA印迹的聚丙烯酰胺来分辨蛋白质BSA。BSA在13.4min时从非印迹聚合物中被洗提出来，而对BSA印迹的聚合物在相同的保留时间下并没有峰出现，这说明BSA倾向于结合那些BSA印迹的聚合物。如果用非印迹和BSA印迹的聚丙烯酰胺来分辩鸡蛋白溶菌酶(LSZ)。LSZ在8.2min时分别能从两种聚合物中被洗提出来。说明用BSA印迹的聚丙烯酰胺不能对其它蛋白质进行识别。LSZ在尺寸上小于BSA，说明LSZ分子能够进入聚合物中BSA所印迹的空洞，但它不能与洞有效的结合。
可以认为以某种模板蛋白质来印迹，所得到的聚合物在一定程度上能专一地识别并结合这种模板蛋白质。这种识别可来源于印迹洞与模板蛋白质在形状上的互补，以及静电和氢键上的互补。这种互补增加了蛋白质表面与聚合物洞之间接触的面积，使两者具有更强的多点相互作用。
本发明的优越性在于：用碳酸钙粉体在聚合物内部致孔，使蛋白质分子易于从包埋它的聚合物中洗提出来，从而使聚合物内部印迹出更多的纳米空洞。
(四)附图说明：
图1为本发明所涉蛋白质印迹大孔高分子化合物及其制备方法中的蛋白质印迹聚合物的合成示意图。
(五)具体实施方式：
实施例1：一种蛋白质印迹大孔高分子化合物，其特征在于：该高分子化合物是由交联型聚丙烯酰胺所构成；该高分子化合物结构中含有牛血清白蛋白印迹的空洞；该高分子化合物在液相色谱中可识别牛血清白蛋白。
上述所说的蛋白质印迹大孔高分子化合物不溶于任何溶剂。
一种蛋白质印迹大孔高分子化合物的制备方法，其特征在于它是由以下步骤所构成：
(1)BSA印迹聚合物的制备：
在5℃下，在0.15g的牛血清白蛋白和0.3g的2,500目的碳酸钙粉末的20mL磷酸钾缓冲液(pH 7.5，0.01M)所形成的悬浮液中，加入5g的丙烯酰胺和2g的N，N′-亚甲基双丙烯酰胺，加入0.3g的过硫酸钾-亚硫酸氢钠引发剂；在氮气保护下，强烈搅拌下直至反应体系固化；将固体碾碎并挤压过200目的筛网；所得到的聚合物用250mL0.1M的盐酸洗涤3次以除去碳酸钙；将颗粒用2mg的链霉蛋白酶(XXI型)的5mL磷酸钾缓冲液(pH 8.0，0.1M)处理48～72h以除去部分蛋白质；产物真空干燥；
(2)非印迹聚合物的制备：
在5℃下，在0.3g的2,500目的碳酸钙粉末的20mL磷酸钾缓冲液(0.01M，pH 7.5)所形成的悬浮液中，加入5g的丙烯酰胺和2g的N，N′-亚甲基双丙烯酰胺；加入0.3g的过硫酸钾-亚硫酸氢钠引发剂；反应条件与BSA印迹聚合物的制备方法相同；
(3)高性能液相色谱：
蛋白质印迹聚合物在氯仿-丙酮(15∶3体积比)中匀浆，利用气动流体泵，在300巴的压强下，以丙酮为溶剂装载到不锈钢柱内；采用甲醇-醋酸(8∶1体积比)洗提的方法从聚合物中吸附和萃取蛋白质；在室温下洗提，并用分光光度计在220nm处进行跟踪。
实施例2：一种蛋白质印迹大孔高分子化合物，其特征在于：该高分子化合物是由交联型聚丙烯酰胺所构成；该高分子化合物结构中含有牛血清白蛋白印迹的空洞；该高分子化合物在液相色谱中可识别牛血清白蛋白。
上述所说的蛋白质印迹大孔高分子化合物不溶于任何溶剂。
一种蛋白质印迹大孔高分子化合物的制备方法，其特征在于它是由以下步骤所构成：
(1)BSA印迹聚合物的制备：
在5℃下，在0.3g的牛血清白蛋白和0.6g的2,500目的碳酸钙粉末的40mL磷酸钾缓冲液(pH 7.5，0.01M)所形成的悬浮液中，加入10g的丙烯酰胺和4g的N，N′-亚甲基双丙烯酰胺，加入0.5g的过硫酸钾-亚硫酸氢钠引发剂；在氮气保护下，强烈搅拌下直至反应体系固化；将固体碾碎并挤压过200目的筛网；所得到的聚合物用250mL0.1M的盐酸洗涤5次以除去碳酸钙；将颗粒用4mg的链霉蛋白酶(XXI型)的10mL磷酸钾缓冲液(pH 8.0，0.1M)处理48～72h以除去部分蛋白质；产物真空干燥；
(2)非印迹聚合物的制备：
在5℃下，在0.6g的2,500目的碳酸钙粉末的40mL磷酸钾缓冲液(0.01M，pH 7.5)所形成的悬浮液中，加入10g的丙烯酰胺和4g的N，N′-亚甲基双丙烯酰胺；加入0.5g的过硫酸钾-亚硫酸氢钠引发剂；反应条件与BSA印迹聚合物的制备方法相同；
(3)高性能液相色谱：
蛋白质印迹聚合物在氯仿-丙酮(15∶3体积比)中匀浆，利用气动流体泵，在300巴的压强下，以丙酮为溶剂装载到不锈钢柱内；采用甲醇-醋酸(8∶1体积比)洗提的方法从聚合物中吸附和萃取蛋白质；在室温下洗提，并用分光光度计在220nm处进行跟踪。

Claims (2)

1.一种蛋白质印迹大孔高分子化合物，其特征在于：高分子化合物是由交联型聚丙烯酰胺所构成；高分子化合物结构中含有碳酸钙微粒印迹的孔道和牛血清白蛋白印迹的空洞；高分子化合物在液相色谱中可识别牛血清白蛋白。
2.一种如权利要求1所述的蛋白质印迹大孔高分子化合物的制备方法，其特征在于它是由以下步骤所构成：
(1)在5℃下，在0.15～0.3g的牛血清白蛋白和0.3～0.6g的2,500目的碳酸钙粉末的20～40mL 0.01M的磷酸钾缓冲液，pH为7.5，所形成的悬浮液中，加入5～10g的丙烯酰胺和2～4g的N，N′-亚甲基双丙烯酰胺，加入0.3～0.5g的过硫酸钾-亚硫酸氢钠引发剂；在氮气保护下，强烈搅拌下直至反应体系固化；将固体碾碎并挤压过200目的筛网；所得到的聚合物用250mL 0.1M的盐酸洗涤3～5次以除去碳酸钙；
(2)将颗粒用2～4mg的XXI型链霉蛋白酶的5～10mL 0.1M的磷酸钾缓冲液，pH为8.0，处理48～72h以除去部分蛋白质；产物真空干燥。
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