EP2451441A2 - Mischung amphipathischer moleküle und verfahren zur zellmembranmodifikation durch fusion - Google Patents

Mischung amphipathischer moleküle und verfahren zur zellmembranmodifikation durch fusion

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Publication number
EP2451441A2
EP2451441A2 EP10747151A EP10747151A EP2451441A2 EP 2451441 A2 EP2451441 A2 EP 2451441A2 EP 10747151 A EP10747151 A EP 10747151A EP 10747151 A EP10747151 A EP 10747151A EP 2451441 A2 EP2451441 A2 EP 2451441A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
molecule
mixture
type
fusion
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP10747151A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Bernd Hoffmann
Agnes CSISZÁR
Nils Hersch
Rudolf Merkel
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Forschungszentrum Juelich GmbH
Original Assignee
Forschungszentrum Juelich GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Forschungszentrum Juelich GmbH filed Critical Forschungszentrum Juelich GmbH
Publication of EP2451441A2 publication Critical patent/EP2451441A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/06—Lysis of microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the invention relates to a mixture of amphipathic molecules and a method for cell membrane modification by fusion with these molecules.
  • a further modification of a fusion mixture is effected by the binding of viral components on the surface of the carrier particles.
  • a disadvantage of this process is the complexity and cost with which the complexes must be prepared.
  • Another fusion system is known from Gopalakrishnan et al. (G. Gopalakrishnan, C. Daneion, P. Izewska, M. Prummer, P.-Y. Bolinger, I. Geissbühler, D. Demurtas, J. Dubochet, and H. Vogel (2006) Multifunctional Lipid / Quantum Dot Hybrid Nanocontainers for Controlled Targeting of Live Cells, Angew Chem. Int. Ed. 2006, 45, 5478-5483.).
  • the authors describe the fusion of a living cell membrane with a vesicle structure of DMPE, DOTAP, DPPE-PEG2000, and quantum nanodots.
  • the disadvantage of the method is that non-biodegradable particles (quantum nanodots) are used. As a result, further medical or pharmaceutical uses are excluded.
  • the object of the invention is therefore to provide a molecule mixture which leads to an efficient fusion with cell membranes also in vivo. It is a further object of the invention to provide a method for efficient in vivo cell membrane modification by fusion with a molecular mixture. Another object of the invention is to demonstrate uses for the molecular mixture in the modification of cells.
  • the object is achieved by a mixture according to claim 1 and by the method for in vivo Zellmembran-) modification and by the cells provided in this way according to subsidiary claims.
  • the method is based on membrane fusion between any cell membrane with a mixture of amphipathic molecules according to the invention.
  • biologically or pharmaceutically relevant molecules can be incorporated into the cell interior and / or into the cell membrane by means of fusion and / or also coupled to the surface thereof.
  • the mixture can be used on individual cells as well as advantageously on tissues or tissue sections.
  • the mixture of amphipathic molecules has an amphipathic type of molecule A, which carries a positive total charge in the hydrophilic region, and an amphipathic molecule.
  • Lekülsorte B which forms a delocalized electron system in the hydrophilic and / or hydrophobic region.
  • a type of molecule B with a delocalized electron system therefore comprises according to the invention at least one (or even more) cyclic structural motif, which are formed by conjugated double bonds and / or lone pairs of electrons and / or unoccupied p orbitals. These follow the Hückel rule.
  • Covalently bonded neighboring atoms of the molecule type B in the delocalized electron system particularly advantageously have an electronegativity difference ( ⁇ ) of greater than or equal to 0.4.
  • ⁇ electronegativity difference
  • a type of molecule B that complies with these rules increases the fusion efficiency.
  • the mixture comprises l, 2-dioleoyl-3-trimethylammonium propane (DOTAP) as molecule type A.
  • DOTAP 2-dioleoyl-3-trimethylammonium propane
  • the molecule type B is formed by a phospholipid to which a fluorescence dye with delocalized electron system is bound. But it can also be another dye, for. An azo dye, to be bound to a phospholipid.
  • phospholipid of the molecule type B in particular l-hexadecanoyl-2-dodecanoyl-stt-glycero-S-phosphocholine or 1,2-dihexadecanoyl-1-glycero-3-phosphoethanolamine, or 1,2-dioleoyl-57-ol Glycero-3-phosphoethanolamine provided.
  • the delocalized electron system in the molecule type B is advantageously formed by a group R, as indicated below: 2- (4,4-difluoro-5-methyl-4-bora-3a, 4a-diaza- 5-indacene-3-dodecanoyl) or iV- (4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-5'-indacene-3-propionyl) or Lissamine Rhodamine B sulfonyl or (5- (chlorosulfonyl) -2- (IH, 2H, 3H, 5H, 6H, 7H, 1H, 12H, 13H, 15H, 16H, 17H-pyrido [3, 2, 1-ij] quinolizino [1 ', 9 ': 6, 7, 8] chromeno [2, 3-f] quinolin-4-ium-9-yl) benzenesulfonate or 7-nitro-2-l,
  • the specified basic components of the molecule type B that is z.
  • the phospholipids and said groups R are freely combinable with each other, that is, that each of the dyes can be bound to a phospholipid.
  • the fusion mixture has far-reaching advantages over the previously known fusion mixtures.
  • the mixture in all (mammalian) cell types, and thus ubiquitously applicable.
  • the mixture is highly efficient (> 50%), and there are no damage to the cells due to the fusion.
  • the cells are therefore fully chargeable after the merger.
  • the mixture is also applicable to tissue sections. Further advantages are achieved by the functionalization of the cell membrane with specific molecules, as described below, for. B. in the way 3. indicated.
  • a further amphipathic type of molecule C can be provided as helper molecule.
  • 1,2-dioleoyl-5-glycero-3-phosphoethanolamine can be present as molecule type C for this purpose.
  • the preferred ratio between the types of molecules A, B and C is about 1: 0.05-0.2: 1 wt / wt.
  • the mixture comprises up to 99% wt amphipathic molecule type A, 40% wt amphipathic type of molecule B (with group R), and up to 70% wt amphipathic type of molecule C.
  • any mixtures are dissolved in an organic solvent and homogenized well (eg vortex, ultrasound).
  • the solvent is removed, for.
  • the dried mixture of molecular species dissolved in an aqueous buffer This mixture is durable while cooling.
  • the molecule types A, B and C are present as lipids. These then form a liposome upon uptake in an aqueous buffer. Liposomes are preferred because in an excellent manner, further types of molecules can be arranged in and on the cell membrane, and also molecules incorporated in the liposome can be introduced into the cell interior during the fusion of the liposome with the cell membrane.
  • the mixture is present as a liposome.
  • the liposome according to the invention has a particularly advantageous effect in that further molecules can be arranged in it, which can lead to preferred modifications of the cells.
  • the selected cell with its cell membrane with a preferably buffered mixture, or liposome, in
  • the process of contacting takes advantageously only a few minutes, z. 1 to 120, preferably 10 to 30 minutes, during the fusion.
  • Single cells are advantageously fused in a very short time after contact with the mixture, or the liposome, hereby.
  • Cell tissues may take a little longer, that is, up to about 120 minutes. From the fusion, the endocytosis of the liposome is strictly distinguishable.
  • the method has a high proportion of cells fused to the mixture or liposome compared to the prior art and for the shortness of contact time.
  • the efficiency is therefore advantageously over 50%.
  • various other molecules can be added to the mixture according to the invention.
  • the method according to the invention proves to be versatile and robust in this respect. By this is meant that a variety of different functional molecule types can be mixed individually or simultaneously and thus lead to the desired modifications of the cell and not only the membrane. Because it is a vivo system, the cell remains functional.
  • an amphipathic type of molecule D having a functional group in the hydrophilic region, in particular having a chelate group as functional group can be supplied to the mixture according to the invention having molecular types A, B and optionally C. Then the mixture comprises z.
  • the functional group is placed during the fusion of the mixture, or the liposome, with the cell membrane of the cell on the surface of the cell membrane.
  • the surface of the cell membrane can be specifically modified and functionalized.
  • the functional group protrudes outwards from the surface of the cell and can be selectively modified by further chemical groups. This can result in a particularly advantageous embodiment of the invention for successful cancer therapy.
  • a mixture according to the invention therefore comprises for this purpose z.
  • TNF tumor necrosis factor
  • An amphipathic type of molecule E can be added to the mixture and, during the fusion, arranged in the membrane of the cell, in particular bacteriorhodopsin or glycophorin A or integrin as molecule type E.
  • a non-amphipathic hydrophilic type of molecule F in a buffered solution can be added to a pre-dried mixture and released into the lumen of the cell during the fusion.
  • molecule type F in particular RNA, DNA, Ca 2+ , peptide, protein or a medicament, such as acetylsalicylic acid, is included.
  • a non-amphipathic hydrophobic type of molecule G can also be simultaneously added to the mixture and placed in the membrane of the cell during fusion. These include in particular cholesterol, vitamin A, D, E and K or drugs such as cortisone.
  • All types of molecules A, B, C, D, optionally G can be dissolved in an organic solvent and homogenized. They can then be dried and dissolved in an aqueous buffer and stored. In the solution in an aqueous buffer, the mentioned types of molecules E and / F can be added. Depending on the type of molecule, liposomes from the molecule types A, B, C, D, E, F, G can advantageously be formed.
  • the following molecules for preparing a fusion mixture for cell membrane modification by fusion with the membrane can be used.
  • the following list is not exhaustive or restrictive.
  • the criteria for the molecule A are that (a) the molecule has a hydrophilic region with at least one or more positive charges so that the total charge of the hydrophilic part of the molecule is positive.
  • the object of this molecule is to bring the fusion mixture by electrostatic forces in the vicinity of the negatively charged cell membrane, (b) It also has a hydrophobic region, preferably C 10 -C 30 -content with or without double bonds. Double bonds advantageously have the effect that the membrane of the liposome formed becomes elastic, so that fusion of the liposome with the cell membrane is facilitated.
  • the proportion of molecule type A in the mixture according to the invention can be up to 99 wt / wt%.
  • DOTAP 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium propane (Chloride SaIz)) is called.
  • amphipathic type of molecule B as fusion-inducing molecules according to the invention are as follows: (a) it must have a hydrophilic area with or preferably no charge, (b) and it must have a hydrophobic area, preferably C 10 -C 30 content with or have no double bonds. For the function of the double bonds, see variety A. (c) The molecule has a group (R), either hydrophobic and / or hydrophilic
  • Area which has a delocalized electron system. This means a cyclic structural motif of conjugated double bonds and / or lone pairs of electrons and / or unoccupied p orbitals.
  • group R is a large difference in electronegativity between covalently connected neighboring atoms. This can be particularly advantageous at least 0.4 ( ⁇ > 0.4). This serves to increase polarizability and positively affect fusion, (d) The amount of fusion-inducing type B molecule in the mixture can be adjusted up to 40 wt / wt%.
  • Table 1 Summary of the properties of fusion inducing and non-fusion inducing groups R bound to amphipatic molecules B (eg: phospholipids, such as DHPE or DOPE).
  • B eg: phospholipids, such as DHPE or DOPE.
  • N- (4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-boro-3a, 4a-diaza - ⁇ -indacene-3-propionyl) is BODIPY-FL.
  • This group R is bound to DHPE (1,2-dihexadecanoyl, S77-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt)). Both together give the following structural formula:
  • DiOCi 8 (3) 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate.
  • This molecule is not a lipid-bonded dye as the first two molecules B, but an amphiphatic molecule per se of the structural formula:
  • Lissamine Rhodamine B sulfonyl is group R. This is bound to 1, 2-dioleoyl-s "- glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) as an amphiphatic molecule. Both give the structural formula:
  • Texas Red is (5- (chlorosulfonyl) -2- (IH, 2H, 3H, 5H, 6H, 7H, 1H, 12H, 13H, 15H, 16H, 17H-pyrido [3, 2, 1-ij] quinolizino [ 1 ', 9': 6, 7, 8] chromeno [2, 3-f] quinolin-4-ium-9-yl) benzenesulfonates, ie group R. This is bonded to 1,2-dihexadecanoyl-s-glycero 3-phosphoethanolamines and together give the structural formula:
  • NBD-DOPE Sixth example of molecule type B (NBD-DOPE):
  • NBD (7-nitro-2-l, 3-benzoxadiazol-4-yl) also group R. This is bound to 1,2-dioleoyl-5'-glycero-3-phosphoethanolamines having a structural formula:
  • Carboxyfluorescein is group R and attached to l, 2-dioleoyl-5'-glycero-3-phosphoethanolamines having the structural formula:
  • 1 -pyrenesulfonyl is group R and attached to l, 2-dioleoyl-.SM-glycero-3-phosphoethanolamines having the structural formula:
  • Pyrenedecanoyl group R is attached to l-hexadecanoyl-2-5-glycero-3-phosphocholines having the structural formula:
  • the group R in molecule type B is often present as a dye.
  • the group R itself is formed by a hydrophobic part of an amphipathic molecule and by delocalized double bonds.
  • cap biotinyl would be group R bound to 1-dioloyl-sn-glycero-S-phosphoethanolamines having the structural formula:
  • Methoxy (Polyethylene glycol) -2000 would be group R bound to 1,2-dioleoyl-5 ⁇ -glycero-3-phosphoethanolamine (PEG2000-DOPE) having the structural formula:
  • the following further molecules are possible for producing a fusion mixture or for cell membrane modification.
  • helper molecule / carrier molecule C The criteria for helper molecule / carrier molecule C are: (a) The molecule must have a hydrophilic region and (b) a hydrophobic region (in particular Ci 0 -C 30 ) with or without double bonds. For the function of the double bonds, see variety A and / or B. (c) Both ranges should have a neutral character in order to avoid the large La density and the repulsive forces between positively charged molecules of molecule type A to neutralize. This effect leads to the stabilization of the system, (d) The proportion of the carrier molecule can be set to a maximum of 70% wt / wt.
  • Phosphoethanolamines 1,1-Dimiristoyl-SM-glycero-S-phosphoethanolamines, 1,2-Dielaidoxy® -glycero-3-phosphoethanolamines, 1,2-diphytano-L-S-glycero-3-phosphoethanolamines, 1-dilinoleoyl-glycero-S- Phosphoethanolamines or 1,2-dioleoyl 5'-glycero-3-phosphatidylcholine).
  • DOPE 1,2-dioleoyl-s-glycero-3-phosphoethanolamine
  • the molecule types A, B and C are formed as lipids or as polymers.
  • liposomes are formed in the preparation of the ready-to-use mixture.
  • the weight-mixing ratio (wt / wt) is advantageously 1: 0.05-0.2: 1 between the molecule types A, B and C.
  • amphiphatic molecule type D The criteria for the amphiphatic molecule type D are: (a) The molecule must have a hydrophilic region and (b) a hydrophobic region (in particular with Ci O -C 30 ) with or without double bonds. For the function of the double bonds, see species A, B, or C. (c) The molecule must have a functional group in the hydrophilic region that allows further chemical bonding on the cell surface after fusion.
  • Suitable are molecules such. Long-chain fatty acids and alcohols, chelate complex modified lipids, eg. For example, 1, 2-dioleoyl, 5-glycero-3 - [(N- (5-amino-1-ol)
  • Carboxypentyl) iminodiacetic acid) succinyl] (nickel salt), biotin modified lipids (1,2- Dioleoyl-sw-glycero-S-phosphoethanolamine-N-cap-biotin), or PEG-modified lipids (1,2-dioleoyl-5-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [methoxy (polyethylene glycol) -2000] (ammonium salt ) or pharmaceuticals.
  • a first exemplary embodiment of this is (iminodiacetic acid) succinyl (nickel salt) as a functional group, here in the form of a chelate group, attached to 1,2-dioleoyl-H-glycero-5-amino-1-carboxypentyl. This gives the structural formula:
  • molecule type E are further: (a) they are amphiphatic. (b) These may include membrane proteins, peptides, surface receptors, such as. B. Bacteriorhodopsin, integrin, glycophorin A and many others, (c) type of molecule E, like the other components A, B, C, D are artificially synthesized or derived from cells, (d) modification of these molecules, such as. For example, fluorescence or radioactive label may be present. (E) Molecule Type E may be added to the mixture up to 20% wt / wt. The amphiphatic molecule types E is incorporated into the liposome membrane when using lipids as grade A-D. Non-amphiphatic molecule types E are incorporated on the liposome membrane when lipids are used as grade A-D.
  • the criteria for molecule type F are: (a) The molecules should be water-soluble. The following examples are given: ions, peptides, proteins, drugs, DNA or RNA.
  • Type of molecule F is incorporated into the lumen of the liposome when using lipids as molecular species.
  • Type of molecule G (not water-soluble or hydrophobic):
  • molecule type G The criteria for molecule type G are: (a) The molecules have hydrophobic character and are readily soluble in organic solvents. The following examples are given: cholesterol, vitamin B. Together with the molecule types A, B, C, and D, these are mixed in an organic solvent.
  • the constituents of the mixture according to the invention with the molecule types A and B are together with the optionally further, mixed molecules C, optionally D and optionally G simultaneously in an organic solvent, preferably in chloroform, methanol, ethanol, propanol, hexane, heptane or a mixture thereof, added in the desired weight ratio. After homogenization in the organic solvent, the organic solvent should be removed.
  • the dried mixture is taken up in an aqueous buffer solution, preferably at a pH around 7, and homogenized again. Then, advantageously, a liposome is formed which comprises the added types of molecules.
  • molecules of the molecule type E and F can also be added.
  • the mixtures are durable, for example at 4 0 C for at least one month.
  • the actual method provides that the fusion mixture with a cell medium z.
  • B. 1 100 (mixture: cell medium v / v) diluted, homogenized again and added to the cells.
  • the fusion is preferably generated in vivo. For this it is sufficient that the cells with the mixture for about 1 to 60 minutes, in tissue samples z. B. 60 to 120 minutes are brought into contact. A washing step of the cells should then be inserted.
  • the method is advantageously characterized by a particularly high fusion efficiency of at least 50%, preferably more than 70%, in particular more than 90%.
  • Membrane fusion is particularly not limited to single cell types, but provides an almost universal mechanism as set forth in Table 2. Even dense tissue samples can be successfully treated by prolonged incubation. The method is therefore particularly advantageous very versatile.
  • the vesicular volumes in the form of type of molecule F are introduced into the cell, which can be advantageously used to introduce soluble molecules, ions, proteins or DNA into the cytoplasm of the cell.
  • Molecule type F is therefore in the true sense not a component of the mixture of amphipathic types of molecules.
  • the biologically or pharmaceutically relevant molecule types D, E, or G can be incorporated into intact cell membranes.
  • the introduced in the cell membrane reactive groups of the molecule type D can, for. B. be used for coupling reactions.
  • Additional membrane E-type molecules can be incorporated into the cell membrane, such as peptides or proteins.
  • the mixture of the invention and the method of the present invention provide ways to perform analyzes in a variety of basic research fields, such as the diffusion analysis of molecules incorporated into intact cell membranes, the characterization of lipid micro and nanodomains, also known in the literature as lipid rafts, or the investigation of the regulation and transport pathways of membrane molecules in the cell.
  • the system for example, the medically highly relevant, targeted marking of certain cell types z.
  • certain inventive amphiphatic mixtures of the molecule types A, B, (C), D with TNF ⁇ can therefore be used as medicaments and at the same time in the targeted labeling and treatment of cancer cells.
  • Table 2 Summary of cell modification experiments using the fusion mixture.
  • BODIPY FL DHPE JV- (4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-borora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionyl) -1,3-dihexadecanoyl-sw-glycero-S-phosphoethanolamine , (Triethylammonium salt) DiO: DiOC 18 (3) 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate
  • Fluorescein-DHPE 1, 2-Dioleoyl-.sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- (carboxyfluorescein) (ammonium salt)
  • LR-DHPE lissamine rhodamine B 1 ⁇ -dihexadecanoyl-stt-glycero-S-phosphoethanolamine, (triethylammonium salt)
  • LR-DOPE lissamine rhodamine B l, 2-diolenoyl-5-glycero-3-phosphoethanolamine, (triethylammonium salt)
  • NBD-DOPE N- (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) -l, 2-diolenoyl-1-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt)
  • Pyrene-DOPE 1, 2-Dioleoyl-5-glycero-3-phosphoethanolamine-N- (1-pyrenesulfonyl) (ammonium salt)
  • Texas Red-DHPE Texas Red 1, 2-Dihexadecanoyl-i-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt)
  • DG To molecular types DG:
  • BR-TRITC bacteriorhodopsin from Halobacterium salinarum gelabeled with tetramethylrhodoin isothiocyanate mixed isomers as molecule type E
  • DOGS-NTA 1, 2-Dioleoyl-5'-glycero-3 - [(N- (5-amino-1-carboxypentyl) iminodiacetic acid) succinyl] (nickel salt) as molecular species
  • D. capBioDOPE 1-dioloyl-SM -Glycero ⁇ -phosphoethanolamine-N-cap-biotin as molecule type D
  • B FL-SM N- (4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-dodecanoyl) sphingosyl phosphocholine as the molecular species
  • D GPA-TRITC glycophorin A (MNS blood group) labeled with tetramethylrhodamine isothiocyanate mixed isomers as molecule type E.
  • BSMC Bronchial smooth muscle cells
  • ESMC Embryonic smooth muscle cells
  • HEK Human Embryonic Kidney, HEK293 h.
  • Fibroblasts human fibroblasts
  • Keratinocytes human keratinocytes
  • Macrophages human macrophages
  • Myofibroblasts cardiac fibroblasts of rat neurons: embryonic cortical neurons of rat R37: breast cancer cell line pericardium: rat embryonic heart bag Miscellaneous to Table 2:
  • TNF TNF ⁇ -His tag: tumor necrosis factor linked with ⁇ xhistidine repeat
  • Fig. 3 Corresponds to line 25 in Table 2.
  • DOPE molecule type C
  • DOTAP type of molecule A
  • HPC molecule type B
  • BR- TRITC molecule type E
  • the green-labeled lipid mixture (type of molecule AC) ( ⁇ -Bodipy channel) and the red-labeled channel protein (molecule type E) (TRITC channel) were incorporated into the cell membrane.
  • Scale 20 ⁇ m
  • 4 Corresponds to line 25 in Table 2.
  • Fig. 5 Corresponds to line 16 in Table 2.
  • FIG. 7 corresponds to row 23 in table 2.
  • DOPE type of molecule C
  • DOTAP type of molecule A
  • TexasRedDHPCC type of molecule B
  • capBioDOPE molecule type D
  • Figure 8 Corresponds to row 24 in Table 2.
  • DOPE molecule type C
  • DOTAP molecule type A
  • TexasRedDHPC molecule type B
  • B FL-SM molecule type D
  • the images indicate a successful incorporation of the phospholipids (TexasRed channel) as well as the sphingolipids (BFL channel).
  • Scale 20 ⁇ m
  • Figure 9 Corresponds to row 47 in Table 2.
  • Fig. 1 shows three ways of cell membrane modification according to the invention. Each path is executed in another embodiment.
  • Path 1 from FIG. 1 cell membrane modification by mixing the varieties AC and introducing Ca 2+ ions as type F into the lumen of cells.
  • Human Embryonic Kidney (HEK293) (DSMZ Germany) cells were grown in DMEM medium (Sigma Aldrich, St. Luis, Mo., USA) at a cell density of 30,000 cells per cell culture dish (0-3.5 cm) in Fluo-4 AM-Ca 2 + Indicator (Invitrogen, Eugene, OR, USA) in (l ⁇ g / ml) for 30 minutes. After incubation, the cells were washed with DMEM medium and incubated with a fusion mixture according to the invention for 30 minutes.
  • DMEM medium Sigma Aldrich, St. Luis, Mo., USA
  • Fluo-4 AM-Ca 2 + Indicator Invitrogen, Eugene, OR, USA
  • the fusion mixture according to the invention consists of a lipid mixture of 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE: molecular grade C), 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (DOTAP: molecular grade A) (both Avanti Polar Lipids Inc., Alabama, AL, USA), Lissamine Rhodamine B1, 2-Dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (LR-DHPE: Type B molecule with group R) (Invitrogen) in the weight ratio of DOPE / DOTAP / LR-DHPE (1/1 / 0.1 wt / wt).
  • the lipid components were first homogeneously mixed in chloroform (VWR, Darmstadt, Germany). Subsequently, the solution was dried in vacuo for 30 to 60 minutes at room temperature. The lipid molecules were resuspended in a buffer solution of 20 mM (2- [4- (2-hydroxyethyl) -l-piperazinyl] -ethanesulfonic acid) (HEPES buffer) (VWR) and 1 mM CaCl 2 as the molecular species F (VWR) in a 2 mg lipid / ml buffer and homogenized in an ultrasonic bath (80-100 W) for 20 minutes at room temperature. The mixture is thus present as a liposome. This mixture is stable for about 1 month in the refrigerator at 4 ° C and reusable after a repeated Homogenticians Republic.
  • the cells are incubated in the inventive fusion process for 10 to 30 minutes with the inventive mixture at 37 ° C and 5% CO 2 . Thereafter, the cells were washed with DMEM medium and the fusion of the reagent with the cell membrane was checked on a fluorescence microscope (LSM 710 from Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena) (FIG. 2).
  • the red fluorescent lipid molecules of molecule type B are incorporated into the cell membrane of HEK293 cells.
  • the cell membrane under a fluorescent microscope well visible (see Fig. 2 - LissRhod channel).
  • the images and associated counts show a fusion efficiency above 80%, ie more than 80% of all cells fused with the mixture / liposome according to the invention.
  • HEK293 cells were treated identically except that the vesicle lumen was filled with 20 mM HEPES instead of 1 mM CaCl 2 buffer.
  • the Ca 2+ indicator showed a significantly lower Ca 2+ concentration in the cells (not shown).
  • Cardiac fibroblasts were isolated from embryonic (day 19) rat hearts and in FlO urinary medium (Sigma Aldrich, St. Luis, MO, USA) at a density of 20,000 cells per cell culture dish (0 3.5 cm) at 37 ° C and 5% CO 2 incubated. Over a period of 6 days, the cardiac fibroblasts differentiated into myofibroblasts and were used in the subsequent method according to the invention.
  • the myofibroblasts were prepared in a fusion mixture of 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE: molecular grade C), 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium propane (DOTAP: molecular grade A) (both from Avanti Polar Lipids Inc. Alabama, AL, USA) and 2- (4,4-difluoro-5-methyl-4-bora-3a, 4a-diaza-5'-indacene-3-dodecanoyl) -1-hexadecanoyl-SH-glycero.
  • DOPE 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
  • DOTAP 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium propane
  • 2- (4,4-difluoro-5-methyl-4-bora-3a, 4a-diaza-5'-indacene-3-dodecanoyl) -1-hex
  • 3-phosphocholines ⁇ -BODIPY C 12 -HPC: Type B of B vitamins from Invitrogen (Eugene, OR, USA) in the weight ratio 1/1 / 0.1 in a final concentration of 20 ⁇ g lipid / ml medium and fluorescence-labeled channel protein (bacteriorhodopsin of Halobacterium Sainarium (Sigma Aldrich) -Tetramethylrhodamine isothiocyanate (Sigma Aldrich)) (BR-TRITC: molecule type E) 0.4 ng / ml).
  • the mixture according to the invention was prepared in the following manner.
  • the lipid components type of molecule AC
  • VWR chloroform
  • Path 3 from FIG. 1 cell membrane modification by mixing the varieties A-D for protein binding on the cell membrane surface, principles of a novel tumor treatment and a medicament therefor.
  • HEK 293 Human Embryonic Kidney (HEK 293) (DSMZ, Germany) cells were grown in RPMI medium (Sigma Aldrich, St. Luis, Mo., USA) at a cell density of 40,000 cells per cell culture dish (0 3.5 cm) at 37 ° C and 5 % CO 2 incubated and used at a confluence density of about 90% in the subsequent steps.
  • DOPE 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
  • DOTAP 2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane
  • the fusion mixture was prepared in the following manner.
  • the lipid components (molecule types A to D) were homogeneously mixed first in chloroform (VWR, Darmstadt, Germany). Subsequently, the solution was dried in vacuo for 30 to 60 minutes.
  • the lipid molecules were resuspended in a buffer solution of 20 mM (2- [4- (2-hydroxyethyl) -1- piperazinyl] -ethanesulfonic acid) (HEPES buffer) (VWR) in a final concentration of 2 mg lipid / ml buffer and homogenized in an ultrasonic bath (80-100 W) for 20 minutes.
  • the mixture is thus present as a liposome.
  • This mixture is stable for about 1 month in the refrigerator at 4 ° C and after a repeated Homogenticians Republic reusable.
  • Fig. 5 shows such a check and indicates a fusion efficiency above 80%. This efficiency was determined by counting the microscopic images.
  • the cells were bound in a solution of Tumor Necrosis Factor- ⁇ to a ⁇ xhistidine repeat (TNFa- His-tag) (ProSpec, Rehovot , Israel) at the concentration of 1 to 5 ng / ml of RPMI medium for about 20 minutes, incubated at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • Tumor Necrosis Factor- ⁇ to a ⁇ xhistidine repeat (TNFa- His-tag) (ProSpec, Rehovot , Israel) at the concentration of 1 to 5 ng / ml of RPMI medium for about 20 minutes, incubated at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • TNF ⁇ functions as a macrophage activating factor in the body and is the major factor in the immune system's recognition and control of cancer cells.
  • differentiated macrophages were used. Human monocytes were obtained from blood by Leukoseptsystem (Greiner bio-one, Kremsmuenster, AU) and Biocoll separation medium (Biochrom, Cambridge, UK). After centrifugation at 1000 g, 10 minutes were monocytes harvested from the interphase formed and subsequently washed with phosphate buffer (PBS from Sigma Aldrich).
  • PBS phosphate buffer
  • Monocytes were picked up in RPMI medium (Sigma Aldrich) and incubated at 37 ° C and 5% CO 2 . After 2 days, 0.1 ng / ml granulocyte macrophage colony stimulation factor (G-MCF from Sigma Aldrich) was added to the monocytes. After another 3 days, inactive macrophages differentiated from monocytes.
  • G-MCF granulocyte macrophage colony stimulation factor
  • the macrophages thus obtained were then plated out on a HEK 293 cell lawn, which should carry the recognition signal for macrophages by means of the fusion and subsequent incubation with TNF ⁇ -His-tag. Upon detection, the cellular immune response in macrophages should be induced and HEK 293 cells lysed.
  • HEK cells were treated identically, except that the amphipathic molecule with reactive head group of molecule type D (DOGS-NTA) was released from the fusion mixture. Both batches were incubated for 24 hours and subsequently analyzed by light microscopy (LSM 710 from Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena).
  • Figure 6 shows the detection and lysis of HEK293 cells (formation of plaques) only on the cells incubated with DOGS-NTA (molecule type D) in the fusion mixture.
  • DOGS-NTA molecule type D
  • Cardiac fibroblasts were isolated from embryonic (day 19) rat hearts and in FlO urinary medium (Sigma Aldrich, St. Luis, MO, USA) at a density of 20,000 cells per cell culture dish (0 3.5 cm) at 37 ° C and 5% CO 2 incubated. Over a period of 6 days, the cardiac fibroblasts differentiated into myofibroblasts and were used in the subsequent method according to the invention.
  • the myofibroblasts were directly incubated in a fusion mixture comprising 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE: molecular grade C), 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (DOTAP: molecular grade A), both by Avanti Polar Lipids Inc.
  • DOPE 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
  • DOTAP 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane
  • the fusion mixture was prepared in the following manner.
  • the lipid components (molecule types A to D) were first homogeneously mixed in chloroform (VWR, Darmstadt, Germany). Subsequently, the solution was dried in vacuo for 30 to 60 minutes.
  • the lipid molecules were resuspended in a buffer solution of 20 mM (2- [4- (2-hydroxyethyl) -l-piperazinyl-1-ethanesulfonic acid) (HEPES buffer) (VWR) to a final concentration of 2 mg lipid / ml buffer and sonicated (80-100 W) homogenized for 20 minutes.
  • the mixture is thus present as a liposome.
  • This mixture is stable for about 1 month in the refrigerator at 4 ° C and reusable after a repeated homogenization step.
  • the cells were washed with FlO Ham's medium medium (Sigma Aldrich) and the fusion of the reagent with the cell membrane on the fluorescence microscope (LSM 710 from Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena) checked.
  • FlO Ham's medium medium Sigma Aldrich
  • Fig. 7 shows such a check and indicates a fusion efficiency above 80%. This efficiency was determined by counting with the help of microscopic images.
  • the cells in a solution of streptavidin / streptavidin-AlexaFluoro488 (both from Invitrogen, Eugene, OR, USA) 100/1 mol / mol% in the total protein concentration of 1 mg / ml FlO urinary medium for about 20 minutes, incubated at 37 ° C and 5% CO 2 .
  • Residues of the protein were removed from the suspension by a three-time wash with FlO Ham's medium.
  • Figure 7 shows a clear colocalization of phospholipid (red) and cell surface bound proteins (green). Another embodiment for cell membrane modification by mixing the grades A-D to modify the cell membrane composition:
  • Cardiac fibroblasts were isolated from embryonic (day 19) rat hearts and resuspended in FlO Ham's medium (Sigma Aldrich, St. Luis, Mo., USA) at a density of 20,000 cells per cell culture dish (0-3.5 cm) at 37 ° C and 5%. CO 2 incubated. Over a period of 6 days, the cardiac fibroblasts differentiated into myofibroblasts and were used in the subsequent method according to the invention.
  • the myofibroblasts were directly incubated in a fusion mixture comprising 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE: molecular grade C), 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (DOTAP: molecular grade A), both by Avanti Polar Lipids Inc.
  • DOPE 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
  • DOTAP 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane
  • B FL-SM molecular type D
  • the fusion mixture was prepared in the following manner.
  • the lipid components (molecule types A to D) were homogeneously mixed first in chloroform (VWR, Darmstadt, Germany). Subsequently, the solution was dried in vacuo for 30 to 60 minutes.
  • the lipid molecules were resuspended in a buffer solution of 20 mM (2- [4- (2-hydroxyethyl) -l-piperazinyl] ethanesulfonic acid) (HEPES buffer) (VWR) to a final concentration of 2 mg lipid / ml buffer and incubated in Ultrasonic bath (80-100 W) homogenized for 20 minutes.
  • the mixture is thus present as a liposome.
  • This mixture is stable for about 1 month in the refrigerator at 4 ° C and reusable after a repeated Homogenticians Republic.
  • 5 ⁇ l of this fusion mixture was diluted 100 times with FlO Ham's medium medium (Sigma Aldrich) and homogenized again for 5 to 10 minutes by means of ultrasound (80-100 W) before addition to a cell culture dish with myofibroblasts. All preparation steps were carried out at room temperature.
  • the cells were washed with FlO Ham's medium medium (Sigma Aldrich) and the fusion of the reagent with the cell membrane was checked on the fluorescence microscope (LSM 710 from Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena).
  • Fig. 8 shows such a check in the context of the embodiment and the incorporation of the phospholipid molecules (Texas Red-DHPE) and the sphingolipids (BFL-SM) in the plasma membrane of a myofibroblast.
  • Route 4 Cell membrane modification by mixing varieties A-C on tissue samples:
  • the lipid components (molecule type A to C) were homogeneously mixed first in chloroform (VWR, Darmstadt, Germany). Subsequently, the solution was dried in vacuo for 30 to 60 minutes. The lipid molecules were resuspended in a buffer solution of 20 mM (2- [4- (2-hydroxyethyl) -l-piperazinyl] ethanesulfonic acid) (HEPES buffer) (VWR, Darmstadt, Germany) to a final concentration of 2 mg lipid / ml Buffer recorded and homogenized in an ultrasonic bath (80-100 W) for 20 minutes. The mixture is again present as a liposome stable at 4 ° C.
  • FIG. 10 corresponds to FIG. 2.
  • FIG. 12 corresponds to FIG. 3.
  • FIG. 13 corresponds to FIG. 4.
  • FIG. 14 corresponds to FIG. 5.
  • FIG. 15 corresponds to FIG.
  • FIG. 16 corresponds to FIG. 7.
  • FIG. 17 corresponds to FIG. 8.
  • FIG. 18 corresponds to FIG. 9.

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Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf eine Mischung amphipathischer Moleküle und ein Verfahren zur in vivo Zellmodifikation durch Membranfusion mit diesen Molekülen.

Description

B e s c h r e i b u n g
Mischung amphipathischer Moleküle und Verfahren zur
Zellmembranmodifikation durch Fusion
Die Erfindung bezieht sich auf eine Mischung amphipathischer Moleküle und ein Verfahren zur Zellmembranmodifikation durch Fusion mit diesen Molekülen.
Stand der Technik
Aus der Veröffentlichung von Simberg et al. (D. Simberg, Weisman S., Talmon, Y, Baren- holz (2004) DOTAP (and Other Cationic Lipids): Chemistry Biophysics, and Transfection. Crit. Reviews in Therap. Drug Carr. Systems, 2004, 21, 257-317.) ist bekannt, dass kationische Lipide, wie z. B. DOTAP gemischt mit anderen Phospholipiden, wie z. B. DOPE (S. W. Hui, M. Langner, Y. Zhao, P. Ross, E. Hurley, and K. Chan (1996) The RoIe of Helper Lipids in Cationic Liposome-Mediated Gene Transfer. Biophysical Journal, 1996, 71, 590-599.) für das Einschleusen von DNA in Zellen (Transfektion) verwendet werden können. Der Weg, wie diese Partikel durch die Zellen aufgenommen wird, ist die Endozytose, wie aus Weijun et al. bekannt (Weijun Li and Francis C. Szoka Jr. 2007. Lipid-based Nanoparticles for Nucleic Acid Delivery. Pharmaceutical Research, 24, 438-449.). Dieser Weg erweist sich als besonders ineffizient, da nur 1 bis 10 % der in Liposomen eingeschlossenen DNA durch die Zellen aufgenommen werden. Eine Modifizierung dieser Mischungen mit weiteren Proteinen, wie z. B. Transferrin ist aus Sakaguchi et al. bekannt (N. Sakaguchi, Ch. Kojima, A. Harada, K. Koiwai and K. Kono, 2008. The correlation between fusion capability and transfection activity in hybrid complexws of lipoplexes and pH-sensitive liposomes. Biomaterials 29, 4029-4036).
Eine weitere Modifikation einer Fusionsmischung erfolgt durch die Bindung viraler Kompo- nenten auf der Oberfläche der Carrierpartikel. Nachteilig an diesem Verfahren ist der Aufwand und Kosten mit der die Komplexe hergestellt werden müssen. Ein weiteres Fusionssystem ist aus Gopalakrishnan et al. (G. Gopalakrishnan, C. Daneion, P. Izewska, M. Prummer, P. -Y. Bolinger, I. Geissbühler, D. Demurtas, J. Dubochet, and H. Vogel (2006) Multifunctional Lipid/Quantum Dot Hybrid Nanocontainers for Controlled Targeting of Live Cells. Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 5478 -5483.) bekannt. Die Autoren be- schreiben die Fusion einer lebenden Zellmembran mit einer Vesikelstruktur aus DMPE, DOTAP, DPPE-PEG2000 und Quantum- Nanodots. Der Nachteil des Verfahrens ist, dass biologisch nicht abbaubare Teilchen (Quantum- Nanodots) verwendet werden. Dadurch sind weitere medizinische oder pharmazeutische Verwendungen ausgeschlossen.
Somit sind die Verfahren nach dem Stand der Technik nachteilig ineffizient oder für die ZeI- len mit hohem Stress verbunden. Zusätzlich müssen sie für jeden Zelltyp optimiert werden und sind dadurch arbeits- und kostenintensiv.
Aufgabe und Lösung der Erfindung
Aufgabe der Erfindung ist es daher, eine Molekülmischung bereit zu stellen, die zu einer effizienten Fusion mit Zellmembranen auch in vivo führt. Ferner ist es die Aufgabe der Erfin- düng, ein Verfahren zur effizienten in vivo Zellmembranmodifikation durch Fusion mit einer Molekülmischung bereit zu stellen. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, Verwendungsmöglichkeiten für die Molekülmischung bei der Modifikation von Zellen aufzuzeigen.
Die Aufgabe wird durch eine Mischung nach Anspruch 1 und durch das Verfahren zur in vivo Zellmembran- )modifikation und durch die auf diese Weise bereitgestellten Zellen gemäß Nebenansprüche gelöst. Das Verfahren basiert auf einer Membranfusion zwischen einer beliebigen Zellmembran mit einer erfindungsgemäßen Mischung amphipathischer Moleküle. Hierdurch können biologisch oder pharmazeutisch relevante Moleküle in das Zellinnere und/ oder in die Zellmembran mittels Fusion eingebaut und/ oder auch auf deren Oberfläche an sie angekoppelt werden. Die Mischung ist an Einzelzellen als auch vorteilhaft an Geweben oder Gewebeschnitten einsetzbar.
Die Fusionsmischung
Die Mischung amphipathischer Moleküle weist eine amphipathische Molekülsorte A, welche im hydrophilen Bereich eine positive Gesamtladung trägt, auf, und eine amphipathische Mo- lekülsorte B, welche im hydrophilen und/oder im hydrophoben Bereich ein delokalisiertes Elektronensystem ausbildet.
Eine Molekülsorte B mit einem delokalisierten Elektronensystem umfasst daher erfindungsgemäß mindestens ein (oder auch mehrere) zyklisches Strukturmotiv, welches durch konju- gierte Doppelbindungen und/oder freie Elektronenpaare und / oder unbesetzten p-Orbitale ausgebildet werden. Diese folgen der Hückel-Regel.
Besonders vorteilhaft weisen kovalent gebundene Nachbaratome der Molekülsorte B im delokalisierten Elektronensystem einen Elektronegativitätsunterschied (Δχ) von größer oder gleich 0,4 auf. Eine Molekülsorte B, die diesen Regeln genügt steigert die Fusionseffizienz. Ferner ist es vorteilhaft, dass in der Molekülsorte B am hydrophoben oder hydrophilen Bereich eine Gruppe R gebunden ist, welche das delokalisierte Elektronensystem ausbildet.
In einer Ausgestaltung der Erfindung umfasst die Mischung l,2-Dioleoyl-3- Trimethylammonium-Propan (DOTAP) als Molekülsorte A.
Die Molekülsorte B wird in einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung durch ein Phospholi- pid, an dem ein Fluoreszenzfarbstoff mit delokalisiertem Elektronensystem gebunden ist, ausgebildet. Es kann aber auch ein anderer Farbstoff, z. B. ein Azofarbstoff, an einem Phospholi- pid gebunden sein.
Als Phosholipid der Molekülsorte B ist in der Mischung insbesondere l-Hexadecanoyl-2- Dodecanoyl-stt-Glycero-S-Phosphocholin oder 1 ,2-Dihexadecanoyl-^«-Glycero-3- Phosphoethanolamin, oder l,2-Dioleoyl-57ϊ-Glycero-3-Phosphoethanolamin vorgesehen.
Das delokalisierte Elektronensystem in der Molekülsorte B wird vorteilhaft durch eine Gruppe R ausgebildet, wie nachfolgend angegeben: 2-(4,4-Difluoro-5-Methyl-4-Bora-3a,4a-Diaza- 5-Indacene-3-Dodecanoyl) oder iV-(4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-5'- Indacene-3-Propionyl) oder Lissamine Rhodamine B Sulfonyl oder (5-( Chlorosulfonyl)- 2-( IH, 2H, 3H, 5H, 6H, 7H, 1 IH, 12H, 13H, 15H, 16H, 17H- pyrido[ 3, 2, 1- ij] quinolizino[ 1', 9': 6, 7, 8] chromeno[ 2, 3- f] quinolin- 4- ium- 9- yl) benzenesulfonate oder 7-Nitro-2-l,3- Benzoxadiazol-4-yl oder Carboxyfluorescein oder 1-Pyrensulfonyl.
Die angegebenen Grundbestandteile der Molekülsorte B, das heißt z. B. die Phospholipide und die genannten Gruppen R sind frei miteinander kombinierbar, das heißt, dass jeder der Farbstoffe an einem Phospholipid gebunden werden kann.
Die Fusionsmischung hat weit reichende Vorteile gegenüber den bisher bekannten Fusionsmischungen. So ist die Mischung bei allen (Säugetier-)Zelltypen, und somit ubiquitär anwendbar. Die Mischung ist dabei hocheffizient (>50 %), und es treten durch die Fusion auch keine Schädigungen an den Zellen auf. Die Zellen sind daher nach der Fusion uneingeschränkt tei- lungsfähig. Die Mischung ist dabei auch an Gewebeschnitten anwendbar. Weitere Vorteile werden durch die Funktionalisierung der Zellmembran mit spezifischen Molekülen erzielt, wie unten z. B. im Weg 3. angegeben.
In der erfindungsgemäßen Mischung kann eine weitere amphipathische Molekülsorte C als Helfermolekül vorgesehen sein.
Hierzu kann insbesondere l,2-Dioleoyl-5«-Glycero-3-Phosphoethanolamin (DOPE) als Molekülsorte C vorliegen.
Das bevorzugte Verhältnis zwischen den Molekülsorten A, B und C liegt bei etwa 1 :0,05- 0,2:1 wt/wt.
Die Mischung umfasst bis zu 99 % wt amphipathische Molekülsorte A, 40 % wt amphipathi- sehe Molekülsorte B (mit Gruppe R), und bis zu 70 % wt amphipathische Molekülsorte C.
Für das erfindungsgemäße Verfahren werden beliebige Mischungen in einem organischen Lösungsmittel gelöst und gut homogenisiert (z. B. Vortex, Ultraschall). Das Lösungsmittel wird entfernt, z. B. im Vakuum, und die getrocknete Mischung an Molekülsorten in einem wässrigen Puffer gelöst. Diese Mischung ist dauerhaft haltbar unter Kühlung. Besonders bevorzugt liegen die Molekülsorten A, B und C als Lipide vor. Dann bilden diese bei der Aufnahme in einem wässrigen Puffer ein Liposom aus. Liposome sind bevorzugt, da in hervorragender Weise weitere Molekülsorten in und an die Zellmembran angeordnet werden können und auch in das Liposom eingeschlossene Moleküle während der Fusion des Liposoms mit der Zellmembran in das Zellinnere eingebracht werden können.
Ganz besonders bevorzugt liegt die Mischung daher als Liposom vor. Das erfindungsgemäße Liposom bewirkt besonders vorteilhaft, dass in diesem weitere Moleküle angeordnet werden können, die zu bevorzugten Modifikationen der Zellen fuhren können.
Es ist aber denkbar, Polymere an Stelle der Lipide als Molekülsorte A und/oder B und/oder C anzugeben.
Für das erfindungsgemäße Verfahren zur in vivo Zellmodifikation wird die ausgewählte Zelle mit seiner Zellmembran mit einer vorzugsweise gepufferten Mischung, bzw. Liposom, in
Kontakt gebracht. Der Vorgang des in Kontaktbringens dauert vorteilhaft nur wenige Minuten, z. B. 1 bis 120, bevorzugt 10 bis 30 Minuten, während der Fusion. Einzelzellen werden vorteilhaft in kürzester Zeit nach dem Kontakt mit der Mischung, bzw. dem Liposom, hiermit fusioniert. Zellgewebe benötigen unter Umständen etwas länger, das heißt bis zu etwa 120 Minuten. Von der Fusion ist die Endozytose des Liposoms strikt zu unterscheiden.
Das Verfahren weist im Vergleich zum Stand der Technik und für die Kürze der Kontaktzeit einen hohen Anteil an mit der Mischung oder dem Liposom fusionierten Zellen auf. Die Effizienz liegt daher vorteilhaft über 50 %.
Während des Verfahrens können verschiedene weitere Moleküle der erfindungsgemäßen Mi- schung zugeführt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren erweist sich diesbezüglich als vielseitig und robust. Damit ist gemeint, dass eine Vielzahl an verschiedenen funktionalen Molekülsorten einzeln oder auch gleichzeitig beigemischt werden können und so zur gewünschten Modifikationen der Zelle und nicht nur der Membran führen. Da es sich um ein vivo-System handelt, bleibt die Zelle funktionstüchtig. Beispielhaft kann eine amphipatische Molekülsorte D mit einer Funktionsgruppe im hydrophilen Bereich, insbesondere mit einer Chelatgruppe als Funktionsgruppe, der erfindungsgemäßen Mischung mit Molekülsorten A, B und gegebenenfalls C zugeführt werden. Dann umfasst die Mischung z. B. die Molekülsorten A, B, D und optional C. Die Funktionsgruppe wird während der Fusion der Mischung, bzw. des Liposoms, mit der Zellmembran der Zelle auf der Oberfläche der Zellmembran angeordnet.
Mit diesem Ansatz kann die Oberfläche der Zellmembran spezifisch modifiziert und funktio- nalisiert werden. Die Funktionsgruppe ragt hierzu aus der Oberfläche der Zelle nach außen heraus und ist durch weitere chemische Gruppen gezielt modifizierbar. Dies kann in einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung zur erfolgreichen Krebstherapie führen.
Eine erfindungsgemäße Mischung umfasst daher zu diesem Zweck z. B. l,2-Dioleoyl-3- Trimethylarnmonium-Propan als Molekülsorte A und N-(4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora- Sa^a-Diaza-Ä-Indacene-S-Propiony^-l^-Dihexadecanoyl-^n-Glycero-S-
Phosphoethanolamine als Molekülsorte B und Triethylammonium Salz / 1 ,2-Dioleoyl-s«- Glycero-3-Phosphoethanolamin als Molekülsorte C und l,2-Dioleoyl-s«-Glycero-3-[(N-(5- Amino-l-Carboxypentyl)Iminodiacetic Acid)Succinyl] (Nickelsalz) als Molekülsorte D, z. B. in einem Mischungsverhältnis von 1:0,1 :1 :0,002 wt/wt. Die genannte, weitere Zellmodifikation erfolgt dann durch Zugabe von tumor necrosis factor (TNF)α, gebunden an ein όxHistidin repeat. Dies führt zur erfolgreichen Therapie von Krebs, wie unter Weg 3 (siehe unten) angegeben.
Es kann eine amphipathische Molekülsorte E der Mischung zugeführt und während der Fusion in der Membran der Zelle angeordnet werden, insbesondere Bacteriorhodopsin oder GIy- cophorin A oder Integrin als Molekülsorte E.
Ferner kann eine auch nicht amphipathische, hydrophile Molekülsorte F in einer gepufferten Lösung einer vorab getrockneten Mischung zugeführt und während der Fusion in das Lumen der Zelle abgegeben werden. Mit Molekülsorte F sind insbesondere RNA, DNA, Ca2+, Peptid, Protein oder ein Arzneimittel, wie Azetylsalicylsäure, umfasst. Eine nicht amphipathische, hydrophobe Molekülsorte G kann ebenfalls gleichzeitig der Mischung zugeführt und während der Fusion in der Membran der Zelle angeordnet werden. Hiermit sind insbesondere Cholesterin, Vitamin A, D, E und K oder Arzneimittel, wie Kortison, umfasst.
Alle Moleküslsorten A, B, C, D, gegebenenfalls G können in einem organischen Lösungsmittel gelöst und homogenisiert werden. Sodann können sie getrocknet, und in einem wässrigen Puffer gelöst und gelagert werden. Bei der Lösung im wässrigen Puffer können die genannten Molekülsorten E und / F zugemischt werden. Je nach Art der Molekülsorte können dabei vorteilhaft Liposome aus den Molekülsorten A, B, C, D, E, F, G gebildet werden.
Folgende Moleküle zur Herstellung einer Fusionsmischung zur Zellmembranmodifizierung durch Fusion mit der Membran können verwendet werden. Die nachfolgende Aufzählung ist nicht abschließend bzw. einschränkend.
Ausführungsbeispiele zu Molekülsorte A:
Die Kriterien zum Molekül A sind, dass (a) das Molekül einen hydrophilen Bereich mit mindestens einer oder mehreren positiven Ladungen aufweist, so dass die Gesamtladung des hydrophilen Teils des Moleküls positiv ist. Die Aufgabe dieses Moleküls ist es, die Fusions- mischung durch elektrostatische Kräfte in der Nähe der negativ geladenen Zellmembran zu bringen, (b) Es weist zudem einen hydrophoben Bereich auf, vorzugsweise C10-C3O- Anteil mit oder ohne Doppelbindungen. Doppelbindungen bewirken vorteilhaft, dass die Membran des entstehenden Liposoms elastisch wird, so dass die Fusion des Liposoms mit der Zellmembran erleichtert wird, (c) Der Anteil der Molekülsorte A in der erfindungsgemäßen Mi- schung kann bis zu 99 wt/wt% betragen.
Geeignet sind Moleküle, wie z. B. l,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propane (DOTAP), N-(2,3-Dioleyloxypropyl)-N, N, N-Trimetylammonium Chlorid (DOTMA), Dimetyl- Dioctadecyl Ammonium Bromid (DDAB), oder (l-[2-(Oleoyloxy)Ethyl]-2-Oleyl-3-(2- Hydroxyethyl)Imidazolinium Chloride (DOTIM). Als ein erstes Beispiel wird DOTAP (l,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propane (Chloride SaIz)) genannt. Ausfuhrungsbeispiele zu Molekülsorte B:
Die Kriterien zur amphiphatischen Molekülsorte B als erfindungsgemäße Fusion induzierende Moleküle sind wie folgt, (a) Es muss einen hydrophilen Bereich mit oder vorzugsweise ohne Ladung haben, (b) und es muss einen hydrophoben Bereich, vorzugsweise C I0-C30- Anteil mit oder ohne Doppelbindungen aufweisen. Zur Funktion der Doppelbindungen siehe Sorte A. (c) Das Molekül weist eine Gruppe (R), entweder im hydrophoben und / oder im hydrophilen
Bereich auf, die ein delokalisiertes Elektronensystem aufweist. Damit ist ein zyklisches Strukturmotiv aus konjugierten Doppelbindungen und / oder freien Elektronenpaaren und / oder unbesetzten p-Orbitalen, gemeint.
Besonders bevorzugt ist in Gruppe R ein großer Elektronegativitätsunterschied zwischen ko- valent verbundenen Nachbaratomen. Dieser kann besonders vorteilhaft mindestens 0,4 (Δχ > 0,4) betragen. Dies dient einer erhöhten Polarisierbarkeit und beeinflusst die Fusion auf positive Weise, (d) Der Anteil der Fusion induzierenden Molekülsorte B in der Mischung kann bis zu 40 wt/wt% eingestellt werden.
Die nachfolgende Tabelle fasst einige relevante Gruppen R für die Moleküle der Sorte B zu- sammen.
Tabelle 1 : Zusammenfassung der Eigenschaften von Fusion induzierenden und nicht Fusion induzierenden Gruppen R gebunden an amphipatischen Molekülen B (z. B.: Phospholipiden, wie z. B. DHPE oder DOPE).
a 1-sehr gut, 2-gut, 3 -befriedigend, 4-ausreichend, 5 -funktioniert kaum, 6-funktioniert nicht
Erstes Beispiel zu Molekülsorte B (P-BODIPY-CI2-HPC):
2-(4,4-Difluoro-5-Methyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-,ϊ-Indacene-3-Dodecanoyl) ist ß-BODIPY und stellt die Gruppe R dar. Diese Gruppe R ist gebunden an l-Hexadecanoyl-2-Dodecanoyl-Λ1«- Glycero-3-Phosphocholine (C12-HPC). Beide zusammen ergeben die folgende Strukturformel: Hg)3
Zweites Beispiel zu Molekülsorte B (BODIPY FL DHPE):
N-(4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-^-Indacene-3-Propionyl) ist BODIPY-FL. Diese Gruppe R ist gebunden an DHPE (l,2-Dihexadecanoyl-,S77-Glycero-3- Phosphoethanolamine (Triethylammonium SaIz)). Beide zusammen ergeben nachfolgende Strukturformel:
(CH3CH2J3NH
Drittes Beispiel zu Molekülsorte B (1DiO'):
DiOCi8(3)3,3'-Dioctadecyloxacarbocyanine Perchlorate. Dieses Molekül ist kein lipidgebun- dener Farbstoff wie die ersten beiden Moleküle B, sondern ein amphiphatisches Molekül per se der Strukturformel:
Viertes Beispiel zu Molekülsorte B (LR-DOPE):
Lissamine Rhodamine B Sulfonyl ist Gruppe R. Diese ist gebunden an 1 ,2-Dioleoyl-s«- Glycero-3-Phosphoethanolamine (DOPE) als amphiphatisches Molekül. Beides ergibt die Strukturformel:
Fünftes Ausfuhrungsbeispiel zu Molekülsorte B (Texas Red®-DHPE):
Texas Red ist (5-( Chlorosulfonyl)- 2-( IH, 2H, 3H, 5H, 6H, 7H, 1 IH, 12H, 13H, 15H, 16H, 17H- pyrido[ 3, 2, 1- ij] quinolizino[ 1', 9': 6, 7, 8] chromeno[ 2, 3- f] quinolin- 4- ium- 9- yl) benzenesulfonate also Gruppe R. Dieses ist gebunden an l,2-dihexadecanoyl-s«-glycero-3- phosphoethanolamine und ergibt gemeinsam die Strukturformel:
Sechstes Beispiel zu Molekülsorte B (NBD-DOPE):
NBD ist (7-Nitro-2-l,3-Benzoxadiazol-4-yl) also Gruppe R. Dieses ist gebunden an 1,2- Dioleoyl-5«-Glycero-3-Phosphoethanolamine mit Strukturformel:
Siebtes Beispiel zu Molekülsorte B (Fluorescein-DOPE):
Carboxyfluorescein ist Gruppe R und gebunden an l,2-Dioleoyl-5«-Glycero-3- Phosphoethanolamine mit der Strukturformel:
Achtes Beispiel zu Molekülsorte B (Pyrene - DOPE)
1 -Pyrenesulfonyl ist Gruppe R und gebunden an l,2-Dioleoyl-.SM-Glycero-3- Phosphoethanolamine mit der Strukturformel:
Neuntes Beispiel zu Molekülsorte B (ß-py-C10-HPC):
Pyrenedecanoyl ist Gruppe R gebunden an l-Hexadecanoyl-2-5«-Glycero-3-Phosphocholine mit der Strukturformel:
Alle Gruppen R weisen eine delokalisierte Elektronenstruktur im Sinne der Erfindung auf.
Auf Grund der Delokalisierung liegt die Gruppe R in Molekülsorte B häufig als Farbstoff vor.
Es ist denkbar, dass die Gruppe R selbst durch einen hydrophoben Teil eines amphipathischen Moleküls und durch delokalisierte Doppelbindungen gebildet wird.
Wie der Tabelle 1 zusätzlich zu entnehmen ist, ist die Fusionsqualität umso besser, je stärker die Unterschiede unmittelbar benachbarter Atome bezüglich ihrer Elektronegativität ist.
Nicht funktionieren tun hingegen nachfolgende Moleküle, wie z. B. capBio-DOPE: cap Biotinyl wäre Gruppe R gebunden an l^-Dioleoyl-sn-Glycero-S-Phosphoethanolamine mit der Strukturformel:
Ebenfalls nicht funktionieren tut PI : L-α-Phosphatidylinositol (Natrium Salz)
und
Methoxy(Polyethylene Glycol)-2000 wäre Gruppe R gebunden an l,2-Dioleoyl-5Η-Glycero-3- Phosphoethanolamine (PEG2000-DOPE) mit der Strukturformel:
Den drei letztgenannten Molekülen fehlt es an einer Delokalisierung der Elektronenstruktur. Dies zeigt, dass die erfindungsgemäße Mischung diese aufweisen muss.
Wie beschrieben ist es denkbar, die positiven Eigenschaften der Molekülsorte A in Bezug auf die positive Ladung und die der Molekülsorte B in Bezug auf das delokalisierte Elektronensystem, bzw. in Bezug auf die Unterschiede in der Elektronnegativität in einem chemisch synthetisierten Molekül zu vereinigen. Dieses, den Erfindern bisher nicht bekannte Molekül, soll daher ebenfalls Gegenstand der Erfindung sein.
Optional und zur weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Mischung sind folgende weitere Moleküle zur Herstellung einer Fusionsmischung bzw. für die Zellmembranmodifizierung möglich.
Ausführungsbeispiele zu Molekülsorte C als Helfermolekül
Die Kriterien zum Helfermolekül / Trägermolekül C sind: (a) Das Molekül muss einen hydrophilen Bereich sowie (b) einen hydrophoben Bereich (insbesondere Ci0-C30) mit oder ohne Doppelbindungen aufweisen. Zur Funktion der Doppelbindungen siehe Sorte A und/oder B. (c) Beide Bereiche sollen einen neutralen Charakter aufweisen, um die große La- dungsdichte und die abstoßenden Kräfte zwischen positiv geladenen Molekülen von Molekülsorte A zu neutralisieren. Dieser Effekt führt zur Stabilisierung des Systems, (d) Der Anteil des Trägermoleküls kann bis maximal 70 % wt/wt eingestellt werden.
Geeignet sind Moleküle, wie z. B. Phosphatidylethanolamine, Phosphatidylcholine (1,2- Dioleoyl-^«-Glycero-3-Phosphoethanolamine, 1 ,2-Dipalmitoyl-5«-Glycero-3-
Phosphoethanolamine , l^-Dimiristoyl-SM-Glycero-S-Phosphoethanolamine, 1,2- DielaidoyLs«-Glycero-3-Phosphoethanolamine, l,2-DiphytanoLsτ?-Glycero-3- Phosphoethanolamine, l^-DilinoleoyLsw-Glycero-S-Phosphoethanolamine oder 1,2-Dioleoyl 5«-Glycero-3-Phosphatidylcholine).
Als ein erstes Beispiel wird l,2-Dioleoyl-s«-Glycero-3-Phosphoethanolamine (DOPE) genannt.
Vorteilhaft ist es möglich, die Molekülsorten A, B und C als Lipide oder als Polymere auszubilden. Im Fall von amphipathischen Lipiden werden bei der Herstellung der fertig einsetzba- ren Mischung Liposomen gebildet.
Das Gewichtsmischungsverhältnis (wt/wt) liegt vorteilhaft bei 1 :0,05-0,2: 1 zwischen den Molekülsorten A, B und C.
Molekülsorte D (amphipatisch mit Funktionsgruppe)
Die Kriterien zur amphiphatischen Molekülsorte D sind: (a) Das Molekül muss einen hydrophilen Bereich sowie (b) einen hydrophoben Bereich (insbesondere mit CiO-C30) mit oder ohne Doppelbindungen aufweisen. Zur Funktion der Doppelbindungen siehe Sorte A, B, oder C. (c) Das Molekül muss eine Funktionsgruppe im hydrophilen Bereich aufweisen, die weitere chemische Bindungen auf der Zelloberfläche nach der Fusion ermöglichen.
Geeignet sind Moleküle, wie z. B. langkettige Fettsäuren und Alkohole, Chelat-Komplex mo- difizierte Lipide, z. B. l,2-Dioleoyl-,sw-Glycero-3-[(N-(5-Amino-l-
Carboxypentyl)Iminodiacetic Acid)Succinyl] (Nickel salt), Biotin modifizierte Lipide (1,2- Dioleoyl-sw-Glycero-S-Phosphoethanolamine-N-cap-Biotin), oderPEG modifizierte Lipide ( 1 ,2-Dioleoyl-5«-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-[Methoxy(Polyethylene Glycol)-2000] (Ammonium Salz) oder auch Arzneimittel.
Ein erstes Ausfuhrungsbeispiel hierzu ist (Iminodiacetic Acid)succinyl (Nickel Salz) als Funktionsgruppe, hier in Form einer Chelatgruppe, gebunden an l,2-Dioleoyl-£H-Glycero-5- Amino-1-carboxypentyl. Dies ergibt die Strukturformel:
Molekülsorte E (amphipatisch):
Die Kriterien zur Molekülsorte E sind ferner: (a) Sie sind amphiphatisch. (b) Dies können Membranproteine, Peptide, Oberflächenrezeptoren, wie z. B. Bacteriorhodopsin, Integrin, Glycophorin A und viele andere sein, (c) Molekülsorte E kann wie die übrigen Bestandteile A, B, C, D künstlich synthetisiert oder von Zellen gewonnen werden, (d) Modifikation dieser Moleküle, wie z. B. Fluoreszenz oder Radioaktive Markierung können vorhanden sein, (e) Molekülsorte E kann der Mischung bis zu 20 % wt/wt zugefugt werden. Die amphiphatische Molekülsorten E wird bei der Nutzung von Lipiden als Sorte A-D mit in die Liposommembran eingebaut. Nicht-amphiphatische Molekülsorten E werden bei Nutzung von Lipiden als Sorte A-D auf der Liposommembran gebunden eingebaut.
Molekülsorte F (wasserlöslich oder hydrophil):
Die Kriterien zur Molekülsorte F sind: (a) Die Moleküle sollen wasserlöslich sein. Folgende Beispiele sind gegeben: Ionen, Peptide, Proteine, Arzneimittel, DNA oder RNA.
Molekülsorte F wird bei der Nutzung von Lipiden als Molekülsorten in das Lumen des Liposoms eingebaut. Molekülsorte G (nicht wasserlöslich oder hydrophob):
Die Kriterien zur Molekülsorte G sind: (a) Die Moleküle weisen hydrophoben Charakter auf und sind in organischem Lösungsmittel gut löslich. Folgende Beispiele sind gegeben: Cho- lesterol, Vitamin B. Zusammen mit den Molekülsorten A, B, C, und D werden diese in einem organischen Lösungsmittel gemischt.
Das Fusionsverfahren
Die Bestandteile der erfindungsgemäßen Mischung mit den Molekülsorten A und B werden zusammen mit den optional weiteren, hinzu gemischten Molekülen C, gegebenenfalls D und gegebenenfalls G gleichzeitig in einem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise in Chloro- form, Methanol, Ethanol, Propanol, Hexan, Heptan oder einer Mischung hieraus, im gewünschten Gewichtsverhältnis aufgenommen. Nach der Homogenisierung im organischen Lösungsmittel soll das organische Lösungsmittel entfernt werden.
Die eingetrocknete Mischung wird in einer wässrigen Pufferlösung, vorzugsweise mit einem pH- Wert um 7, aufgenommen, und wieder homogenisiert. Dann bildet sich vorteilhaft ein Liposom aus, das die zugefügten Molekülsorten umfasst. Dabei können Moleküle der Molekülsorte E und F ebenfalls zugemischt werden. In dieser Form liegen die Mischungen haltbar vor, beispielsweise bei 4 0C für mindestens einen Monat. Diese Schritte dienen zur Vorbereitung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Das eigentliche Verfahren sieht vor, dass die Fusionsmischung mit einem Zellmedium z. B. 1 :100 (Mischung: Zellmedium v/v) verdünnt, erneut homogenisiert und auf die Zellen gegeben wird.
Durch Zugabe der erfindungsgemäßen Fusionsmischung zu lebenden Zellen wird vorzugsweise in vivo die Fusion erzeugt. Hierzu ist es ausreichend, dass die Zellen mit der Mischung etwa 1 bis 60 Minuten, bei Gewebeproben z. B. 60 bis 120 Minuten in Kontakt gebracht wer- den. Ein Waschschritt der Zellen sollte dann eingefügt werden. Das Verfahren ist vorteilhaft durch eine besonders hohe Fusionseffizienz von mindestens 50 %, vorzugsweise mehr als 70 %, insbesondere mehr als 90 %, gekennzeichnet.
Die Membranfusion ist besonders vorteilhaft nicht auf einzelne Zelltypen beschränkt, sondern stellt einen fast universellen Mechanismus dar, wie in Tabelle 2 darlegt. Sogar dichte Gewe- beproben können durch einer verlängerten Inkubationszeit erfolgreich behandelt werden. Das Verfahren ist daher besonders vorteilhaft sehr vielseitig verwendbar.
Bei der Fusion der erfindungsgemäßen Mischung mit einer Zellmembran werden die vesiku- lären Volumina in Form von Molekülsorte F in die Zelle eingeschleust, was vorteilhaft zur Einbringung von löslichen Molekülen, Ionen, Proteinen oder DNA in das Zytoplasma der Zelle genutzt werden kann. Molekülsorte F ist daher im eigentlichen Sinn kein Bestandteil der Mischung amphipathischer Molekülsorten.
Während des Fusionsverfahrens können die biologisch oder die pharmazeutisch relevanten Molekülsorten D, E, oder G in intakte Zellmembranen inkorporiert werden. Die in der Zellmembran eingebrachten reaktiven Gruppen der Molekülsorte D können z. B. für Kopplungs- reaktionen eingesetzt werden. Es können zusätzliche membraneigene Moleküle der Sorte E in die Zellmembran eingebaut werden, wie Peptide oder Proteine.
Die erfindungsgemäße Mischung und das erfindungsgemäße Verfahren ermöglichen Wege zur Durchführung von Analysen auf einer Vielzahl von Gebieten der Grundlagenforschung, wie etwa der Diffusionsanalyse von Molekülen eingebaut in intakten Zellmembranen , der Charakterisierung von Lipidmikro- und nanodomänen, in der Literatur auch als Lipid rafts bekannt, oder der Untersuchung der Regulation sowie der Transportwege von Membranmolekülen in der Zelle.
Gleichzeitig kann das System, beispielsweise zur medizinisch hochrelevanten, gezielten Markierung bestimmter Zelltypen z. B. zur Markierung von Krebszellen, zur Unterstützung von Wundverschluss mittels Induktion von Zellwanderung, zur Ausbildung von ZeIl- Zellkontakten, von Zellausläufern oder der Proliferationsinduktion oder Zell-Zellfusion genutzt werden. Bestimmte erfindungsgemäße amphiphatische Mischungen der Molekülsorten A, B, (C), D mit TNFα können daher als Medikamente und gleichzeitig bei der gezielten Markierung und Behandlung von Krebszellen eingesetzt werden.
Eine Übersicht einiger Verfahren zur Zellmembranmodifikation zeigt Tabelle 2. Tabelle 2: Zusammenfassung von Zellmodifizierungsexperimenten mittels der Fusionsmischung.
a Molekülsorte C/ Molekülsorte A Molekülsorte B= 1/1/0,1 wt/wt in jedem durchgeführten Experiment. b ft fü;r die genaue Zusammensetzung siehe Weg 2 unten. c für die genaue Zusammensetzung siehe Weg 3. unten. d DOPE/DOTAP/ß-BODIPY C12-HPC/PI = 1/1/0,1/0,1 Abkürzungen zu Tabelle 2:
Methode 1 : Zellmembranfärbung; Methode 2: Zelloberflächenmodifizierung; Methode 3: Zelllumenmodifizierung; Methode 4: Proteinrekonstruktion in der Zellmembran Zu Molekülsorte C: DOPE = l,2-Dioleoyl-5«-Glycero-3-Phosphoethanolamine Zu Molekülsorte A: DOTAP = l,2-Dioleoyl-sn-Glycero-(Trimethylammonium-Propane (Chloride salt)
Zu Molekülsorte B: ß-BODIPY C^-HPC^^^-Difluoro-S-Methyl^-Bora-Sa^a-Diaza-^-Indacene-S- Dodecanoyl)- 1 -Hexadecanoyl-sH-Glycero-S-Phosphocholine ß-Pyrene C 10-HPC : 1 -Hexadecanoyl-2-( 1 -Pyrenedecanoyl)-5«-Glycero-3 -Phosphocholine
BODIPY FL DHPE: JV-(4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3- Propionyl)- 1 ^-Dihexadecanoyl-sw-Glycero-S-Phosphoethanolamine, (Triethylammonium salt) DiO: DiOC18(3)3,3'-Dioctadecyloxacarbocyanine Perchlorate
Fluorescein-DHPE : 1 ,2-Dioleoyl-.sn-Glycero-3 -Phosphoethanolamine-N- (Carboxyfluorescein) (Ammonium salt)
LR-DHPE: Lissamin Rhodamine B 1 ^-Dihexadecanoyl-stt-Glycero-S-Phosphoethanolamine, (Triethylammonium salt) LR-DOPE: Lissamin Rhodamine B l,2-Diolenoyl-5«-Glycero-3-Phosphoethanolamine, (Triethylammonium salt)
NBD-DOPE: N-(7-nitrobenz-2-oxa-l,3-diazol-4-yϊ)-l,2-Diolenoyl-^-Glycero-3- Phosphoethanolamine (Triethylammonium salt)
Pyrene-DOPE: 1 ,2-Dioleoyl-5«-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-(l -pyrenesulfonyl) (Ammonium salt)
Texas Red-DHPE: Texas Red l,2-Dihexadecanoyl-i«-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Triethylammonium salt) Zu Molekülsorten D-G:
BR-TRITC: Bacteriorhodopsin aus Halobacterium salinarum gelabeled mit Tetramethylrho- damin isothiocyanat gemischte Isomere als Molekülsorte E
DOGS-NTA: 1 ,2-Dioleoyl-5«-Glycero-3-[(N-(5-Amino- 1 -Carboxypentyl)Iminodiacetic Acid)Succinyl] (Nickelsalz) als Molekülsorte D. capBioDOPE: l^-Dioleoyl-SM-Glycero^-Phosphoethanolamine-N-cap-Biotin als Molekülsorte D
B FL-SM : N-(4,4-Difluoro-5 ,7-Dimethyl-4-Bora-3 a,4a-Diaza-s-Indacene-3 - Dodecanoyl)Sphingosyl Phosphocholine als Molekülsorte D GPA-TRITC: Glycophorin A (MNS blood group) gelabeled mit Tetramethylrhodamine isothiocyanate mixed isomers als Molekülsorte E.
PI: L-α- Phosphatidyl-Inositol (Sodium salt) als Molekülsorte E.
CaCl2XH2O als Molekülsorte F.
Zelltypen und Zelllinien: BSMC: Bronchial smooth muscle cells
ESMC: Embryonal smooth muscle cells
HEK: Human Embryonic Kidney, HEK293 h. Fibroblasten: human fibroblasts
Keratinozyten: human keratinocytes Makrophagen: human makrophage Myofibroblasten: cardiac fibroblasts of rat Neuronen: embryonal cortical neurons of rat R37: breast Cancer cell line Herzbeutel: rat embryonic heart bag Sonstiges zu Tabelle 2:
TNF: TNFα-His-Tag: Tumor Necrosis Factor linked with όxhistidin repeat
Im Weiteren wird die Erfindung an Hand von Ausführungsbeispielen und der beigefügten Figuren näher erläutert, ohne dass dies zu einer Beschränkung der Erfindung führen soll.
Es zeigen: Fig. 1 : Schematische Darstellung von drei Einsatzmöglichkeiten des Fusionsreagenzes.
Fig. 2: Entspricht Zeile 11 in der Tabelle 2. Mikroskopische Aufnahmen von in Fluo-4 AM vorinkubierten HEK293 Zellen nach Zugabe der Fusionsmischung (DOPE (Molekülsorte C)/DOTAP (Molekülsorte A)/LR-DHPE (Molekülsorte B)=l/l/0,l wt/wt) gefüllt mit 1 mM CaCl2 (Molekülsorte F) Lösung. Die rot markierte Lipidmischung (Molekülsorten A-C) (LissRhod Kanal) wurde in die Zellmembran eingebaut während der grüne Ca2+-Indikator (Fluo-4 Kanal) auf eine erhöhte Ca2+ - Konzentration (Molekülsorte F) im Zellinneren hinweist. (Maßstab = 20 μm).
Fig. 3: Entspricht Zeile 25 in der Tabelle 2. Mikroskopische Aufnahmen von Fibroblasten 10 Minuten nach Zugabe der Fusionsmischung (DOPE (Molekülsorte C)/DOTAP (Molekülsorte A)/ß-Bodipy-C,2HPC (Molekülsorte B)/BR-TRITC (Molekülsorte E)=l/l/0, 1/0,0005 wt/wt). Die grün markierte Lipidmischung (Molekülsorte A-C) (ß-Bodipy Kanal) sowie das rot markierte Kanalprotein (Molekülsorte E) (TRITC Kanal) wurden in die Zellmembran eingebaut. (Maßstab = 20 μm) Fig. 4: Entspricht Zeile 25 in der Tabelle 2. Mikroskopische Aufnahmen von Fibroblasten 4 Stunden nach dem Abwaschen der Fusionsmischung (DOPE (Molekülsorte C)/DOTAP (Molekülsorte A)/ß-Bodipy-C12HPC (Molekülsorte B)/BR-TRITC (Molekülsorte
E)=l/l/0,l/0,0005 wt/wt). Die grün markierte Lipidmischung (Molekülsorte A-C) (ß-Bodipy Kanal), als auch das rot markierte Kanalprotein (Molekülsorte E) (TRITC Kanal) wurden in der Zellmembran eingebaut. Die Trennung der zwei Farbstoffe in Abhängigkeit der Zeit lässt auf einen unterschiedlichen Transportablauf der Membranlipide und Proteine von der Zellmembran in das Zellinnere schließen. (Maßstab = 20 μm).
Fig. 5: Entspricht Zeile 16 in der Tabelle 2. Mikroskopische Aufnahmen von HEK293 Zellen 10 Minuten nach Zugabe der Fusionsmischung (DOPE (Molekülsorte Q/DOTAP (Molekülsorte A)/Bodipy FL-DHPE (Molekülsorte B)/DOGS-NTA (Molekülsorte D)= 1/1 /0,1 /0,002 wt/wt). (Maßstab = 50 μm)
Fig. 6: Entspricht Zeile 16 in der Tabelle 2. Mikroskopische Aufnahme von TNFα-His-Tag behandelten HEK293 Zellen mit eingebautem DOGS-NTA (Molekülsorte D) in der ZeIl- membran und Makrophagen und B: Mikroskopische Aufnahme von TNFα-His-Tag behandelten HEK293 Zellen ohne DOGS-NTA (Molekülsorte D) in der Zellmembran und Makrophagen. (Maßstab = 50 μm)
Fig. 7: Entspricht Zeile 23 in der Tabelle 2. Mikroskopische Aufnahmen von Fibroblasten nach dem Abwaschen der Fusionsmischung (DOPE (Molekülsorte C)/DOTAP (Molekülsorte A)/TexasRedDHPCC (Molekülsorte B)/capBioDOPE (Molekülsorte D)= 1/1 /0,1 /0,01 wt/wt). Die rot markierte Lipidmischung (Molekülsorte A-C) (TexasRed Kanal), als auch das grün markierte Oberflächenprotein (AlexaFluor488 Kanal) zeigt eine eindeutige Colokalisation von Phospholipid und zu Zelloberfläche gebundene Proteine. (Maßstab = 50 μm)
Fig. 8: Entspricht Zeile 24 in der Tabelle 2. Mikroskopische Aufnahmen von Fibroblasten nach dem Abwaschen der Fusionsmischung (DOPE (Molekülsorte C)/DOTAP (Molekülsorte A)/TexasRedDHPC (Molekülsorte B)/B FL-SM (Molekülsorte D)=l/l/0,l/0,01 wt/wt). Die Aufnahmen weisen auf einen erfolgreichen Einbau der Phospholipide (TexasRed Kanal) als auch der Sphingolipide (BFL Kanal). (Maßstab = 20 μm) Fig. 9: Entspricht Zeile 47 in der Tabelle 2. Mikroskopische Aufnahme von primärem Herzbeutelgewebe (Perikard) aus embryonalen Ratten (Tag 19) nach einer einstündigen Behandlung mit der Fusionsmischung (DOPE (Molekülsorte C)/DOTAP (Molekülsorte A)/Bodipy FL-DHPE (Molekülsorte B)=l/l/0,l wt/wt). Auf der Aufnahme ist deutlich erkennbar, dass die Fusionsmischung aus Molekülsorten A-C bis etwa 3-4 Zellschichten tief in die Gewebe eingedrungen ist und Membranfusion induziert hat. (Maßstab = 70 μm).
Fig. 1 zeigt drei erfindungsgemäße Wege der Zellmembranmodifizierung. Jeder Weg wird in einem weiteren Ausführungsbeispiel ausgeführt.
Weg 1 aus Figur 1 : Zellmembranmodifikation durch Mischung der Sorten A-C und Einbrin- gung von Ca2+ Ionen als Sorte F in das Lumen von Zellen.
Human Embryonic Kidney (HEK293) (DSMZ Deutschland) Zellen wurden in DMEM Medium (Sigma Aldrich, St. Luis, MO, USA) in einer Zelldichte von 30.000 Zellen pro Zellkulturschale (0 3,5 cm) in Fluo-4 AM - Ca2+-Indikator (Invitrogen, Eugene, OR, USA) in (lμg/ml) 30 Minuten inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen mit DMEM Medium gewa- sehen und mit einer erfindungsgemäßen Fusionsmischung 30 Minuten inkubiert.
Die erfindungsgemäße Fusionsmischung besteht aus einer Lipidmischung von 1 ,2-Dioleoyl- sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (DOPE: Molekülsorte C), l,2-Dioleoyl-3- Trimethylammonium-Propane (DOTAP: Molekülsorte A) (beide Avanti Polar Lipids Inc., Alabama, AL, USA), Lissamine Rhodamine B l,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3- Phosphoethanolamine (LR-DHPE: Molekülsorte B mit Gruppe R) (Invitrogen) im Gewichtsverhältnis von DOPE/DOTAP/LR-DHPE (1/1/0,1 wt/wt).
Die Lipidkomponenten wurden zunächst in Chloroform (VWR, Darmstadt, Deutschland) homogen gemischt. Anschließend wurde die Lösung im Vakuum 30 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur eingetrocknet. Die Lipidmoleküle wurden erneut in einer Pufferlösung von 20 mM (2-[4-(2-Hydroxyethyl)-l-piperazinyl]-ethansulfonsäure) (HEPES- Puffer) (VWR) und 1 mM CaCl2 als Molekülsorte F (VWR) in einer Endkonzentration von 2 mg Lipid/ml Puffer aufgenommen und im Ultraschallbad (80-100 W) 20 Minuten bei Raumtemperatur homogenisiert. Die Mischung liegt somit als Liposom vor. Diese Mischung ist etwa 1 Monat lang im Kühlschrank bei 4°C haltbar und nach einem wiederholten Homogenisierungsschritt wieder verwendbar.
5 μl dieser Fusionsmischung werden 100-fach mit DMEM Medium verdünnt und vor der Zu- gäbe zu einer Zellkulturschale mit Ca2+-Indikator Fluo-4 AM (Invitrogen) inkubierten HEK293- Zellen erneut 5 bis 10 Minuten mittels Ultraschall homogenisiert.
Die Zellen werden im erfindungsgemäßen Fusionsverfahren 10 bis 30 Minuten mit der erfin- dungsgemäßen Mischung bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Danach wurden die Zellen mit DMEM Medium gewaschen und die Fusion des Reagenzes mit der Zellmembran am Fluores- zenzmikroskop (LSM 710 von Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena) überprüft (Fig. 2).
Nach erfolgreicher Membranfusion sind die rot fluoreszierenden Lipidmoleküle der Molekülsorte B in die Zellmembran der HEK293-Zellen eingebaut. Hierdurch ist die Zellmembran unter einem Fluoreszenz Mikroskop gut erkennbar (siehe Fig. 2 - LissRhod Kanal).
Einen Beweis der Abgabe des Vesikellumens in das Zellinnere, und dadurch auch der MoIe- külsorte F, liefert die verstärkte grüne Fluoreszenzintensität des Ca2+-Indikators Fluo4 AM, der durch die erhöhte Ca2+ Konzentration im Zellvolumen nach der Membranfusion hervorgerufen wurde (Fig. 2 - Fluo-4 Kanal).
Die Aufnahmen und zugehörigen Zählungen zeigen eine Fusionseffizienz oberhalb von 80 %, das heißt mehr als 80 % aller Zellen fusionierten mit der erfindungsgemäßen Mi- schung/Liposom.
Als Kontrolle wurden HEK293- Zellen identisch behandelt, nur dass das Vesikellumen mit 20 mM HEPES anstatt mit 1 mM CaCl2 Puffer gefüllt wurde. In diesem Fall zeigte der Ca2+- Indikator eine deutlich geringere Ca2+ Konzentration in den Zellen (nicht gezeigt).
Weg 2 aus Figur 1 : Zellmembranmodifikation durch Mischung der Sorten A-C und Einbrin- gung von Bacteriorhodopsin (Molekülsorte E) in die Zellmembran: Kardiale Fibroblasten wurden aus embryonalen (Tag 19) Rattenherzen isoliert und in FlO Harn' s Medium (Sigma Aldrich, St. Luis, MO, USA) in einer Dichte von 20.000 Zellen pro Zellkulturschale (0 3,5 cm) bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Über einen Zeitraum von 6 Tagen differenzierten die kardialen Fibroblasten zu Myofibroblasten und wurden beim nach- folgenden erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt.
Die Myofibroblasten wurden in einer Fusionsmischung von l,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3- Phosphoethanolamine (DOPE: Molekülsorte C), l,2-Dioleoyl-3- Trimethylammonium- Propane (DOTAP: Molekülsorte A) (beide von Avanti Polar Lipids Inc. Alabama, AL, USA) und 2-(4,4-difluoro-5-methyl-4-bora-3a,4a-diaza-5'-indacene-3-dodecanoyl)- 1 -hexadecanoyl- SH-glycero-3-phosphocholine (ß-BODIPY C12-HPC: Molekülsorte B von Invitrogen (Eugene, OR, USA) im Gewichtsverhältnis 1/1/0,1 in einer Endkonzentration von 20 μg Lipid/ml Medium und Fluoreszenz markierten Kanalprotein (Bacteriorhodopsin von Halobacterium SaIi- narum (Sigma Aldrich)-Tetramethylrhodamine Isothiocyanat (Sigma Aldrich)) (BR-TRITC: Molekülsorte E) 0,4 ng/ml) inkubiert. Die erfindungsgemäße Mischung wurde auf folgende Weise angefertigt. Die Lipidkomponen- ten (Molekülsorte A-C) wurden in Chloroform (VWR) homogen gemischt. Nach der Mischung wurde die Lösung im Vakuum für 30-60 Minuten eingetrocknet. Die Lipidmoleküle wurden erneut in einer Pufferlösung von 20 mM HEPES (2-[4-(2-Hydroxyethyl)-l- piperazinyl]-ethansulfonsäure (VWR)) in einer Endkonzentration von 2 mg Lipid/ml Puffer aufgenommen und im Ultraschallbad (80-100 W) 20 Minuten homogenisiert. Alle Schritte wurden bei Raumtemperatur ausgeführt. Die Mischung liegt somit als Liposom vor.
5 μl dieser Fusionsmischung wurden mit 0,7 μl einer BR-TRITC Lösung (Molekülsorte E) (0,06 mg/ml HEPES) 60 Minuten inkubiert, und dabei vorsichtig gerührt. Die Kanalproteine E werden in die Lipiddoppelschichten des Liposom aufgenommen. Die Lösung wurde 100-fach mit FlO Ham's Medium (Sigma Aldrich) verdünnt und vor Zugabe zu einer Zellkulturschale mit Myofibroblasten ein weiteres Mal für 1 bis 2 Minuten mit Ultraschall (80-100 W) behandelt. Die Zellen wurden erfindungsgemäß mit der Fusionsmischung 10 bis 20 Minuten inkubiert, dann mit FlO Ham's Medium gewaschen und analysiert.
Nach dem Waschen konnten etwa 80 bis 100% der Zellen Cytoplasmamembranen der Zellen im Fluoreszenzmikroskop (grün für Lipide, rot für Proteine) (LSM 710 von Carl Zeiss Mic- roimaging GmbH, Jena) nachgewiesen werden, was einen erfolgreichen Membraneinbau sowohl der Lipidmischung (Molekülsorte A-C) als auch der Proteinmoleküle (Molekülsorte E) anzeigt (Fig. 3 und Fig. 4).
Weg 3 aus Figur 1 : Zellmembranmodifikation durch Mischung der Sorten A-D zur Proteinbindung auf der Zellmembranoberfläche, Grundzüge einer neuartigen Tumorbehandlung und eines Medikaments hierfür.
Human Embryonic Kidney (HEK 293) (DSMZ, Deutschland) Zellen wurden in RPMI Medium (Sigma Aldrich, St. Luis, MO, USA) in einer Zelldichte von 40.000 Zellen pro Zellkulturschale (0 3,5 cm) bei 37°C und 5% CO2 inkubiert und bei einer Konfluenzdichte von etwa 90% in die nachfolgenden Schritte eingesetzt. HEK293 -Zellen wurden direkt in einer Fusi- onsmischung, umfassend l,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (DOPE: Molekülsorte C), l,2-Dioleoyl-3- Trimethylammonium-Propane (DOTAP: Molekülsorte A), (beide von Avanti Polar Lipids Inc. Alabama, AL, USA), JV-(4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora- 3 a,4a-Diaza-5-Indacene-3 -Propionyl)- 1 ,2-Dihexadecanoyl-5«-Glycero-3 - Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salz (Bodipy FL-DHPE: Molekülsorte B) (In- vitrogen, Eugene, OR, USA) und l,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-[(N-(5-Amino-l- Carboxypentyl)Iminodiacetic Acid)Succinyl] (Nickel Salz) (DOGS-NTA: Molekülsorte D Avanti Polar Lipids Inc.) im Gewichtsverhältnis von DOPE/DOTAP/Bodipy FL- DHPE/DOGS-NTA (1/1/0,1/0,002 wt/wt) in einer Endkonzentration von 20 μg Lipid/ml RPMI Medium (Sigma Aldrich) 10 bis 20 Minuten lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Die Fusionsmischung wurde auf folgende Weise vorbereitet. Die Lipidkomponenten (Molekülsorten A bis D) wurden erst in Chloroform (VWR, Darmstadt, Deutschland) homogen gemischt. Anschließend wurde die Lösung im Vakuum 30 bis 60 Minuten eingetrocknet. Die Lipidmoleküle wurden erneut in einer Pufferlösung von 20 mM (2-[4-(2-Hydroxyethyl)-l- piperazinyl]-ethansulfonsäure) (HEPES- Puffer) (VWR) in einer Endkonzentration von 2 mg Lipid/ml Puffer aufgenommen und im Ultraschallbad (80-100 W) 20 Minuten homogenisiert.
Die Mischung liegt somit als Liposom vor. Diese Mischung ist etwa 1 Monat lang im Kühlschrank bei 4 °C haltbar und nach einem wiederholten Homogenisierungsschritt wieder ver- wendbar.
5 μl dieser Fusionsmischung wurden 100-fach mit RPMI Medium (Sigma Aldrich) verdünnt und vor Zugabe zu einer Zellkulturschale mit HEK293 -Zellen erneut 5 bis 10 Minuten mittels Ultraschall (80-100 W) homogenisiert. Alle Preparationsschritte wurden bei Raumtemperatur ausgeführt. Anschließend wurden die Zellen mit RPMI Medium (Sigma Aldrich) gewaschen und die Fusion des Reagenzes mit der Zellmembran am Fluoreszenzmikroskop (LSM 710 von Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena) überprüft.
Fig. 5 zeigt eine derartige Überprüfung und weist auf eine Fusionseffizienz oberhalb von 80% hin. Diese Effizienz wurde mit Hilfe der mikroskopischen Aufnahmen durch Zählen festge- stellt.
Um eine Bindung zwischen der reaktiven Kopfgruppe des verwendeten DOGS-NTA als Molekülsorte D mit einem Reaktionspartner zu ermöglichen, wurden die Zellen in einer Lösung von Tumor Necrosis Factor-α gebunden an ein όxhistidin-repeat (TNFa- His-Tag) (ProSpec, Rehovot, Israel) in der Konzentration von 1 bis 5 ng/ml RPMI Medium etwa 20 Minuten, bei 37 0C und 5 % CO2 inkubiert.
Reste des Proteins wurden durch einen dreimaligen Waschprozesses mit RPMI Medium aus der Suspension entfernt. TNFα dient im Körper als Makrophagen aktivierender Faktor und stellt für das Immunsystem den Hauptfaktor in der Erkennung und Bekämpfung von Krebszellen dar. Um die Funktionalität des Systems zu überprüfen, wurden ausdifferenzierte Makrophagen verwendet. Humane Monocyten wurden aus Blut mittel Leukoseptsystem (Greiner bio-one, Kremsmünster, AU) und Biocoll Separationsmedium (Biochrom, Cambridge, UK) gewonnen. Nach der Zentrifugation mit 1000 g, 10 Minuten wurden Monocyten aus der gebildeten Interphase geerntet und nachträglich mit Phosphat-Puffer (PBS von Sigma Aldrich) gewaschen. Monocyten wurden in RPMI Medium (Sigma Aldrich) aufgenommen und bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Nach 2 Tagen wurde 0,1 ng/ml Granulocyten Mac- rophagen Kolonie Stimulationsfaktor (G-MCF von Sigma Aldrich) zu den Monocyten gege- ben. Nach weiteren 3 Tagen differenzierten sich inaktive Makrophagen aus Monocyten.
Die so gewonnenen Makrophagen wurden anschließend auf einem HEK 293-Zell Rasen ausplattiert, die mittels der Fusion und nachfolgender Inkubation mit TNFα- His-Tag das Erkennungssignal für Makrophagen tragen sollten. Bei Erkennung sollte die zelluläre Immunantwort in Makrophagen induziert werden und HEK 293-Zellen lysiert werden. Als Kontrolle wurden HEK-Zellen identisch behandelt, nur dass das amphipatische Molekül mit reaktiver Kopfgruppe von der Molekülsorte D (DOGS-NTA) aus dem Fusionsansatz herausgelassen wurde. Beide Ansätze wurden für 24 Stunden inkubiert und nachfolgend lichtmikroskopisch analysiert (LSM 710 von Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena). Abbildung 6 zeigt die Erkennung und Lyse von HEK293- Zellen (Bildung von Plaques) nur auf den mit DOGS-NTA (Molekülsorte D) im Fusionsansatz inkubierten Zellen. Dieses Beispiel zeigt, dass mittels Membranfusion gezielt Zelltypen markiert und beispielhaft für das Immunsystem sichtbar gemacht werden können.
Weiteres Ausführungsbeispiel zur Zellmembranmodifikation durch Mischung der Sorten A-D zur Proteinbindung auf der Zellmembranoberfläche durch Biotin-Avidin/Streptavidin- Bindung:
Kardiale Fibroblasten wurden aus embryonalen (Tag 19) Rattenherzen isoliert und in FlO Harn' s Medium (Sigma Aldrich, St. Luis, MO, USA) in einer Dichte von 20.000 Zellen pro Zellkulturschale (0 3,5 cm) bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Über einen Zeitraum von 6 Tagen differenzierten die kardialen Fibroblasten zu Myofibroblasten und wurden beim nachfolgenden erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt.
Die Myofibroblasten wurden direkt in einer Fusionsmischung umfassend 1 ,2-Dioleoyl-sn- Glycero-3-Phosphoethanolamine (DOPE: Molekülsorte C), l,2-Dioleoyl-3- Trimethylammo- nium-Propane (DOTAP: Molekülsorte A), (beide von Avanti Polar Lipids Inc. Alabama, AL, USA), Texas Red l^-Dihexadecanoyl-^n-Glycero-S-Phosphoethanolamine (Triethylammoni- um salt) (TexasRed-DHPE: Molekülsorte B) (Invitrogen, Eugene, OR, USA) und 1,2- Dioleoyl-.srt-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-cap-Biotin (capBioDOPE: Molekülsorte D Avanti Polar Lipids Inc.) im Gewichtsverhältnis von DOPE/DOTAP/TexasRed- DHPE/capBioDOPE (1/1/0,1/0,1 wt/wt) in einer Endkonzentration von 20 μg Lipid/ml FlO Harn' s Medium Medium (Sigma Aldrich) 10 bis 20 Minuten lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert.
Die Fusionsmischung wurde auf folgende Weise vorbereitet. Die Lipidkomponenten (Molekülsorten A bis D) wurden erst in Chloroform (VWR, Darmstadt, Deutschland) homogen ge- mischt. Anschließend wurde die Lösung im Vakuum 30 bis 60 Minuten eingetrocknet. Die Lipidmoleküle wurden erneut in einer Pufferlösung von 20 mM (2-[4-(2-Hydroxyethyl)-l- piperazinylj-ethansulfonsäure) (HEPES- Puffer) (VWR) in einer Endkonzentration von 2 mg Lipid/ml Puffer aufgenommen und im Ultraschallbad (80-100 W) 20 Minuten homogenisiert.
Die Mischung liegt somit als Liposom vor. Diese Mischung ist etwa 1 Monat lang im Kühl- schrank bei 4 °C haltbar und nach einem wiederholten Homogenisierungsschritt wieder verwendbar.
5 μl dieser Fusionsmischung wurden 100-fach mit FlO Ham's Medium Medium (Sigma Aldrich) verdünnt und vor Zugabe zu einer Zellkulturschale mit Myofibroblasten erneut 5 bis 10 Minuten mittels Ultraschall (80-100 W) homogenisiert. Alle Preparationsschritte wurden bei Raumtemperatur ausgeführt.
Anschließend wurden die Zellen mit FlO Ham's Medium Medium (Sigma Aldrich) gewaschen und die Fusion des Reagenzes mit der Zellmembran am Fluoreszenzmikroskop (LSM 710 von Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena) überprüft.
Fig. 7 zeigt eine derartige Überprüfung und weist auf eine Fusionseffizienz oberhalb von 80 % hin. Diese Effizienz wurde mit Hilfe der mikroskopischen Aufnahmen durch Zählen festgestellt. Um eine Bindung zwischen der reaktiven Kopfgruppe des verwendeten capBioDOPE als Molekülsorte D mit einem Reaktionspartner zu ermöglichen, wurden die Zellen in einer Lösung von Streptavidin/Streptavidin-AlexaFluoro488 (beide von Invitrogen, Eugene, OR, USA ) 100/1 mol/mol% in der Gesamtproteinkonzentration von 1 mg/ml FlO Harn 's Medium etwa 20 Minuten, bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert.
Reste des Proteins wurden durch einen dreimaligen Waschprozesses mit FlO Ham's Medium Medium aus der Suspension entfernt.
Fig. 7 zeigt eine eindeutige Colokalisation von Phospholipid (rot) und zur Zelloberfläche gebundene Proteine (grün). Weiteres Ausführungsbeispiel zur Zellmembranmodifikation durch Mischung der Sorten A-D zur Modifizierung der Zellmembranzusammensetzung:
Kardiale Fibroblasten wurden aus embryonalen (Tag 19) Rattenherzen isoliert und in FlO Ham's Medium (Sigma Aldrich, St. Luis, MO, USA) in einer Dichte von 20.000 Zellen pro Zellkulturschale (0 3,5 cm) bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Über einen Zeitraum von 6 Tagen differenzierten die kardialen Fibroblasten zu Myofibroblasten und wurden beim nachfolgenden erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt.
Die Myofibroblasten wurden direkt in einer Fusionsmischung umfassend 1 ,2-Dioleoyl-sn- Glycero-3-Phosphoethanolamine (DOPE: Molekülsorte C), l,2-Dioleoyl-3- Trimethylammo- nium-Propane (DOTAP: Molekülsorte A), (beide von Avanti Polar Lipids Inc. Alabama, AL, USA), Texas Red l,2-Dihexadecanoyl-5'n-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Triethylammoni- um salt) (TexasRed-DHPE: Molekülsorte B) und N-(4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora- 3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoyl)Sphingosyl Phosphocholine (B FL-SM: Molekülsorte D) (beide von Invitrogen, Eugene, OR, USA) im Gewichtsverhältnis von DOPE/DOTAP/TexasRed-DHPE/BFL-SM (1/1/0,1/0,01 wt/wt) in einer Endkonzentration von 20 μg Lipid/ml FlO Ham's Medium Medium (Sigma Aldrich) 10 Minuten lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Die Fusionsmischung wurde auf folgende Weise vorbereitet. Die Lipidkomponenten (Molekülsorten A bis D) wurden erst in Chloroform (VWR, Darmstadt, Deutschland) homogen gemischt. Anschließend wurde die Lösung im Vakuum 30 bis 60 Minuten eingetrocknet. Die Lipidmoleküle wurden erneut in einer Pufferlösung von 20 mM (2-[4-(2-Hydroxyethyl)-l- piperazinyl]-ethansulfonsäure) (HEPES- Puffer) (VWR) in einer Endkonzentration von 2 mg Lipid/ml Puffer aufgenommen und im Ultraschallbad (80-100 W) 20 Minuten homogenisiert.
Die Mischung liegt somit als Liposom vor. Diese Mischung ist etwa 1 Monat lang im Kühlschrank bei 4°C haltbar und nach einem wiederholten Homogenisierungsschritt wieder verwendbar. 5 μl dieser Fusionsmischung wurden 100-fach mit FlO Ham's Medium Medium (Sigma Aldrich) verdünnt und vor Zugabe zu einer Zellkulturschale mit Myofibroblasten erneut 5 bis 10 Minuten mittels Ultraschall (80-100 W) homogenisiert. Alle Preparationsschritte wurden bei Raumtemperatur ausgeführt.
Anschließend wurden die Zellen mit FlO Ham's Medium Medium (Sigma Aldrich) gewa- sehen und die Fusion des Reagenzes mit der Zellmembran am Fluoreszenzmikroskop (LSM 710 von Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena) überprüft.
Fig. 8 zeigt eine derartige Überprüfung im Rahmen des Ausführungsbeispiels und des Einbaus der Phospholipid Moleküle (TexasRed-DHPE) als auch der Sphingolipide (BFL-SM) in die Plasmamembran eines Myofibroblasten. Weg 4: Zellmembranmodifikation durch Mischung der Sorten A-C auf Gewebeproben:
Mit der Fusionsmischung können nicht nur einzelne Säugerzellen, sondern auch Zellen im Gewebe und in Gewebeschnitten zur Fusion gebracht werden (siehe Figur 9.). Es wurde primäres Herzbeutelgewebe (Perikard) aus embryonalen Ratten (Tag 19) isoliert und in FlO Ham's Medium (Sigma Aldrich, St. Luis, MO, USA) auf einer 3,5 cm Zellkulturschale mit einer Fusionsmischung von l,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (DOPE: Molekülsorte C), l,2-Dioleoyl-3- Trimethylammonium-Propane (DOTAP: Molekülsorte A), (beide von Avanti Polar Lipids Inc. Alabama, AL, USA) und N-(4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora- Sa^a-Diaza-s-Indacene-S-Propionyty-l^-Dihexadecanoyl-.src-Glycero-S- Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salz (Bodipy FL-DHPE: Molekülsorte B) (In- vitrogen, Eugene, OR, USA) in einem Gewichtsverhältnis von 1/1/0.1 wt/wt, bei 37 °C und 5 % CO2 1 Stunde inkubiert. (Molekülsorte C und B wurden von Avanti Polar Lipids Inc., Alabama, AL, USA; Molekülsorte B von Invitrogen, Eugen, OR, USA besorgt). Die Fusi- onsmischung wurde auf folgende Weise vorbereitet:
Die Lipidkomponenten (Molekülsorte A bis C) wurden erst in Chloroform (VWR, Darmstadt, Deutschland) homogen gemischt. Anschließend wurde die Lösung im Vakuum 30 bis 60 Minuten eingetrocknet. Die Lipidmoleküle wurden erneut in einer Pufferlösung von 20 mM (2- [4-(2-Hydroxyethyl)-l-piperazinyl]-ethansulfonsäure) (HEPES- Puffer) (VWR, Darmstadt, Deutschland) in einer Endkonzentration von 2 mg Lipid/ml Puffer aufgenommen und im Ultraschallbad (80-100 W) 20 Minuten homogenisiert. Die Mischung liegt wiederum als Liposom haltbar bei 4 °C vor.
5 μl dieser Fusionsmischung wurden 100-fach mit FlO Ham's Medium (Sigma Aldrich) verdünnt und vor Zugabe zur Gewebeprobe erneut 5-10 Minuten mittels Ultraschall (80-100 W) homogenisiert. Alle Präparationsschritte wurden bei Raumtemperatur ausgeführt.
Anschließend wurde das fusionierte Gewebe fluoreszenz-mikroskopisch analysiert (LSM 710 von Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena). Fig. 9. zeigt, dass sowohl Zellen der äußeren Gewebeschicht als auch Zellen in tieferen Zellebenen sich erfolgreich fusionieren bzw. anfärben ließen. Etwa 3-4 Zellschichten aus Bindegewebszellen sind deutlich erkennbar. Eventuel- Ie Verwendung in der Gentherapie, Krebsbehandlung und Wundheilung ist hierdurch denkbar.
Es können weitere Ausführungsbeispiele angegeben werden. Diese sind in Tabelle 2 gezeigt. Die Verfahren zur Herstellung der Mischungen sind von den hier angegebenen vier Beispielprotokollen zu entnehmen. Die Zellmembranfusion folgt denen der oben genannten Verfah- ren. Im Sinne der Erfindung, sind alle Verfahrensschritte in den Ausführungsbeispielen in nicht einschränkender Natur anzusehen. Insbesondere sollen die Fusionsmischungen und deren Verwendung weit ausgelegt werden. Dies bedeutet, dass die in Ausführungsbeispielen gezeigte Wege und Fusionsmischungen miteinander kombiniert werden können um zu neue Mischungen und Ausführungen zu gelangen. Die vorliegend ausführlich dargestellten vier Wege gehen von Liposomen aus, da sich nach Chloroformzugabe und der Aufnahme in Puffer die amphiphatischen Bestandteile zu Liposomen umformen.
In der Patentanmeldung wird Bezug genommen auf farbige Figuren 1 -9, die dieser Patentan- meidung beiliegen. Wiedergaben dieser Figuren in schwarz-weiß sind der Patentanmeldung auf Grund der Offenlegungsvorschriften als Figuren 10-18 beigefugt. Dabei entspricht inhaltlich die Figur 10 der Figur 1. Die Figur 11 entspricht der Figur 2. Die Figur 12 entspricht der Figur 3. Die Figur 13 entspricht der Figur 4. Die Figur 14 entspricht der Figur 5. Die Figur 15 entspricht der Figur 6. Die Figur 16 entspricht der Figur 7. Die Figur 17 entspricht der Figur 8. Die Figur 18 entspricht der Figur 9.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Mischung amphipathischer Moleküle mit einer amphipathischen Molekülsorte A, welche im hydrophilen Bereich eine positive Gesamtladung aufweist und einer amphipathischen Molekülsorte B, welche im hydrophilen und/oder im hydrophoben Bereich ein delokalisiertes Elektronensystem ausbildet.
2. Mischung nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
gekennzeichnet durch
eine Molekülsorte B mit einem delokalisierten Elektronensystem, umfassend mindestens ein zyklisches Strukturmotiv, welches durch konjugierte Doppelbindungen und/oder freie Elektronenpaare und/oder unbesetzten p-Orbitale ausgebildet werden.
3. Mischung nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass
kovalent gebundene Nachbaratome der Molekülsorte B im delokalisierten Elektronensystem einen Elektronegativitätsunterschied (Δχ) von größer oder gleich 0,4 aufweisen.
4. Mischung nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
gekennzeichnet durch
eine Molekülsorte B, umfassend eine Gruppe R, welches das delokalisierte
Elektronensystem ausbildet.
5. Mischung nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
gekennzeichnet durch
l,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propan (DOTAP) als Molekülsorte A.
6. Mischung nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
gekennzeichnet durch
ein Phospholipid, an dem ein Fluoreszenzfarbstoff mit delokalisiertem
Elektronensystem als Gruppe R gebunden ist, als Molekülsorte B.
7. Mischung nach vorhergehendem Anspruch,
gekennzeichnet durch
1 -Hexadecanoyl-2-Dodecanoyl-5«-Glycero-3-Phosphocholin oder 1 ,2-Dihexadecanoyl- 5«-Glycero-3-Phosphoethanolamin, oder l,2-Dioleoyl-5«-Glycero-3- Phosphoethanolamin, als Phosholipid der Molekülsorte B.
8. Mischung nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
gekennzeichnet durch
2-(4,4-Difluoro-5-Methyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-5'-Indacene-3-Dodecanoyl) oder N-(4,4- Difluoro-5 ,7-Dimethyl-4-Bora-3 a,4a-Diaza-s-Indacene-3 -Propionyl) oder Lissamine Rhodamine B Sulfonyl oder (5-( Chlorosulfonyl)- 2-( IH, 2H, 3H, 5H, 6H, 7H, 1 IH,
12H, 13H, 15H, 16H, 17H- pyrido[ 3, 2, 1- ij] quinolizino[ 1', 9': 6, 7, 8] chromeno[ 2, 3- f] quinolin- 4- ium- 9- yl) benzenesulfonate oder 7-Nitro-2-l,3-Benzoxadiazol-4-yl oder Carboxyfluorescein oder 1-Pyrensulfonyl, welche das delokalisierte Elektronensystem in der Molekülsorte B ausbildet.
9. Mischung nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
gekennzeichnet durch
eine weitere amphipathische Molekülsorte C als Helfermolekül.
10. Mischung nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
gekennzeichnet durch
1, 2-DiOIeOyI-An-GIyCCrO-S -Phosphoethanolamin (DOPE) als Molekülsorte C.
11. Mischung nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
gekennzeichnet durch
ein Verhältnis von 1 :0,05-0,2:1 wt/wt zwischen den Molekülsorten A, B und C.
12. Mischung nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
mit bis zu
99 % wt amphipathische Molekülsorte A.
13. Mischung nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
mit bis zu
40 % wt amphipathische Molekülsorte B.
14. Mischung nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
mit bis zu
70 % wt amphipathische Molekülsorte C.
15. Mischung nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass
diese in einem wässrigen Puffer gelöst vorliegt.
16. Mischung nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
gekennzeichnet durch
Lipide als Molekülsorte A und/oder B und/oder C.
17. Liposom, umfassend
eine Mischung nach vorhergehendem Anspruch 15 und 16.
18. Mischung nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
gekennzeichnet durch
Polymere als Molekülsorte A und/oder B und/oder C.
19. Verfahren zur in vivo Zellmodifikation,
gekennzeichnet durch
in Kontakt bringen und Fusion der Zellmembran mit einer Mischung oder einem Liposom nach einem der vorhergehenden Ansprüche.
20. Verfahren nach vorhergehendem Anspruch,
gekennzeichnet durch
höchstens 1 bis 120 Minuten, vorzugsweise 10 bis 30 Minuten Kontakt zwischen der Zellmembran einer Zelle und der Mischung während der Fusion.
21. Verfahren nach Ansprüchen 19 bis 20,
gekennzeichnet durch
einen Anteil der fusionierten Zellen mit der Mischung oder dem Liposom (Effizienz) von über 50 %.
22. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche 19 bis 21 ,
gekennzeichnet dadurch,
dass eine Funktionsgruppe im hydrophilen Bereich einer amphipatischen Molekülsorte D, insbesondere eine Chelatgruppe als Funktionsgruppe, der Mischung zugeführt und während der Fusion auf der Oberfläche der Zelle angeordnet wird.
23. Verfahren nach dem vorherigen Anspruch,
gekennzeichnet dadurch,
dass eine Mischung umfassend l,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propan als Molekülsorte A und N-(4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3- Propionyl)-l,2-Dihexadecanoyl-5«-Glycero-3-Phosphoethanolamine als Molekülsorte B und Triethylammonium Salz / 1 ,2-Dioleoyl-srt-Glycero-3-Phosphoethanolamin als Molekülsorte C und l,2-Dioleoyl-5«-Glycero-3-[(N-(5-Amino-l-
Carboxypentyl)Iminodiacetic Acid)Succinyl] (Nickelsalz) als Molekülsorte D z. B. in einem Mischungsverhältnis von 1 :0,l : 1 :0,002 wt/wt zur Fusion verwendet wird.
24. Verfahren nach vorhergehendem Anspruch 23,
dadurch gekennzeichnet, dass
eine weitere Zellmodifikation durch Zugabe von rumor necrosis factor (TNF)α, gebunden an ein όxHistidin repeat, erfolgt.
25. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche 19 bis 24,
gekennzeichnet dadurch, dass
eine amphipathische Molekülsorte E der Mischung zugeführt und während der Fusion in der Membran der Zelle angeordnet wird, insbesondere Bacteriorhodopsin oder GIy- cophorin A oder Integrin als Molekülsorte E.
26. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche 19 bis 25,
gekennzeichnet dadurch, dass
eine nicht amphipathische, hydrophile Molekülsorte F in einer gepufferten Lösung einer getrockneten Mischung zugeführt und während der Fusion in das Lumen der Zelle ab- gegeben wird, insbesondere mit RNA, DNA, Ca2+, Peptid, Protein oder einem Arzneimittel wie Azetylsalicylsäure als Molekülsorte F.
27. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche 19 bis 26,
gekennzeichnet dadurch, dass
eine nicht amphipathische, hydrophobe Molekülsorte G der Mischung zugeführt und während der Fusion in der Membran der Zelle angeordnet wird, insbesondere Cholesterin, Vitamin A, D, E and K oder Arzneimittel wie Kortison als Molekülsorte G.
28. Mischung nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 18,
gekennzeichnet durch
l,2-Dioleoyl-3-Trimethylarnmonium-Propan als Molekülsorte A und iV-(4,4-Difluoro- 5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-5-Indacene-3-Propionyl)- 1 ,2-Dihexadecanoyl-s«-
Glycero-3-Phosphoethanolamine als Molekülsorte B und Triethylammonium Salz / 1,2- Dioleoyl-SH-Glycero-3-Phosphoethanolamin als Molekülsorte C und 1 , 2-Dioleoyl-5Η- Glycero-3-[(N-(5-Amino- 1 -Carboxypentyl)Iminodiacetic Acid)Succinyl] (Nickelsalz) als Molekülsorte D, insbesondere in einem Mischungsverhältnis von 1 :0,1 :1 :0,002 wt/wt.
29. Zelle, fusioniert in vivo mit einer Mischung bzw. einem Liposom nach einem der vorhergehenden Ansprüche.
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