CN110564692B - 免疫调节能力增强的干细胞及其制备方法、组合物及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开免疫调节能力增强的干细胞及其制备方法、含其的组合物及用途。本发明通过使干细胞内Id3基因的表达量降低或ID3的活性降低来增强干细胞的免疫调节能力。本发明的免疫调节能力增强的干细胞可用于治疗自身免疫相关的疾病或病况。

Description

免疫调节能力增强的干细胞及其制备方法、组合物及用途
技术领域
本发明大致涉及生物医药领域，具体涉及一种免疫调节能力的干细胞及其制备方法、含其组合物及增强和检测干细胞的免疫调节能力的方法。
背景技术
自身免疫性疾病(autoimmune diseases，AD)是一种免疫应答紊乱，机体免疫系统对自身抗原攻击，造成组织器官损伤和功能障碍的疾病，具有较高的致残率和致死率。大多数的AD为多发性硬化症、全身性硬化症、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎和免疫细胞减少症等。自身免疫疾病的发生是一个及其复杂的调控网络，除了淋巴细胞，如T细胞、B细胞、树突状细胞以及NK细胞参与自身免疫疾病的发病过程之外，间充质干细胞(MSCs)的免疫调节功能的紊乱在自身免疫疾病发病中也具有重要的作用。目前靶向抑制T细胞、B细胞药物并不能有效治疗自身免疫疾病，而自体或异体的MSCs移植能有效的缓解多种自身免疫疾病的症状，如糖尿病，类风湿性关节炎，干燥综合征等。因此如何调控内源性MSCs的免疫调节功能，对自身免疫疾病治疗具有关键作用。
MSCs是一类可从多类成体组织中分离的能向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞等分化的成体干细胞。随着对MSCs认识的不断深入，还发现MSCs具有低/无免疫原性和免疫调节功能，对固有免疫系统和获得性免疫系统的多种免疫细胞都有免疫抑制的效果。MSCs既能通过细胞与细胞间的直接接触，也可通过旁分泌产生细胞因子对靶细胞进行免疫调控。MSCs通过细胞与细胞直接作用的方式可作用于多种免疫细胞，如自然杀伤细胞、T细胞和B细胞等。MSCs通过旁分泌的方式产生细胞因子、趋化因子和生长因子等大量生物活性物质，参与对免疫细胞的调控，包括吲哚胺2,3双加氧酶(indoleamine-2,3-dioxygenase,IDO)、前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)、白细胞介素(IL-6,IL-10)、转化生长因子(transforming growth factor-β，TGF-β)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)、HLA-G和一氧化氮(nitricoxide,NO)等，共同形成了一个复杂的网络调控体系。MSCs可诱导外周免疫耐受并且可迁移到受损组织，抑制促炎症因子表达，促进受损细胞的存活。MSCs免疫调节功能受低氧、炎症、衰老等多种因素的影响，越来越多的课题组都开始意识到寻找构建一种提高MSCs免疫调节功能方法的重要性，使其产生更加明显和持久的治疗作用。
发明内容
为解决至少部分上述技术问题，本发明进行了深入研究，并发现通过使干细胞内Id3基因的表达量降低或ID3的活性降低可以增强干细胞的免疫调节能力。至少部分地基于该发现完成了本发明。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的第一方面，提供一种免疫调节能力增强的干细胞，其细胞内Id3基因的表达量降低或ID3的活性降低，其中所述活性包括ID3与E2A的结合活性。
在某些实施方案中，免疫调节能力增强的干细胞的细胞表面至少表达有Stro-1、CD146、CD90。
在某些实施方案中，所述干细胞选自间充质干细胞和造血干细胞中的至少之一。优选骨髓间充质干细胞。
本发明的第二方面，提供一种免疫调节能力增强的干细胞的制备方法，其包括降低细胞内Id3基因的表达量或降低ID3蛋白的活性，其中所述活性包括ID3与E2A的结合活性。
在某些实施方案中，本发明的制备方法包括以下步骤：
(1)合成Id3基因的siRNA；
(2)将所述siRNA转入干细胞，优选地，其中所述siRNA选自SEQ ID No:1-3中的至少之一；
(3)筛选出细胞内ID3蛋白的表达下降或不表达的细胞，即为免疫调节能力增强的干细胞。
在某些实施方案中，本发明的制备方法包括以下步骤：
(1)构建包含失活Id3基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA的基因载体；
(2)将所述基因载体导入同源胚胎干细胞中，使所述基因载体与胚胎干细胞的基因组相应部分发生同源重组，从而使所述基因载体整合到内源基因组中，得到同源重组胚胎干细胞；
(3)将所述同源重组胚胎干细胞注射入小鼠囊胚中，获得嵌和体小鼠；
(4)将嵌和体小鼠与野生型小鼠交配获得F1代杂合小鼠；
(5)使F1代杂合小鼠交配，从其中筛选得到纯合体；
(6)从所述纯合体小鼠的骨髓中分离得到免疫调节能力增强的干细胞。
本发明的第三方面，提供第一组合物，其包含本发明第一方面所述的免疫调节能力增强的干细胞和任选的药物学可接受载体。
在某些实施方案中，第一组合物包括生理盐水，且所述免疫调节能力增强的干细胞在所述生理盐水中的浓度为1至109个/ml。
本发明的第四方面，提供第二组合物，其包含待处理的干细胞和处理剂，其中所述处理剂包括抑制干细胞中Id3基因表达的化合物和/或ID3蛋白活性抑制剂。
本发明的第五方面，提供一种增强机体免疫调节能力的方法，其包括向有需要的受试者施用本发明第一方面所述的干细胞或其后代的步骤；或者向有需要的受试者施用第一组合物或第二组合物的步骤。
本发明的第六方面，提供一种用于检测干细胞的免疫调节能力的方法，其包括检测所述干细胞中Id3基因的表达水平的步骤，或检测所述干细胞中ID3活性的步骤。
在某些实施方案中，用于检测干细胞的免疫调节能力的方法包括检测同一受试者或同一干细胞在不同时期的Id3基因的表达水平或ID3活性，并比较不同时期表达水平或ID3活性的步骤。
在某些实施方案中，用于检测干细胞的免疫调节能力的方法包括检测来自受试者的干细胞的Id3基因的表达水平A1或ID3活性B1，并将所得检测值与参照物进行比较的步骤。优选地，所述参照物包括正常或健康同类个体中相同干细胞内的表达值A0和/或ID3活性值B0。还优选地，所述参照物包括对多个相似同类个体检测得到的相同干细胞内的表达值进行统计得到的第一参考数值区间，和/或对多个相似同类个体检测得到的相同干细胞内的ID3活性值进行统计得到的第二参考数值区间。
附图说明
图1为示例性示出本发明的干细胞的细胞增殖和凋亡情况的图。其中图1A示出了本发明的干细胞的细胞增殖率的图；图1B示出了本发明的干细胞的细胞凋亡率的图。
图2示例性示出了本发明的干细胞仍具有起始干细胞的特征的图。表达干细胞表面标记CD90，Strol1和CD146，同时具有成骨向及成脂向分化能力。
图3示例性示出了本发明的干细胞的免疫抑制功能的图。其中图3A示出了与对照干细胞相比，本发明的干细胞与T淋巴细胞共培养后抑制T淋巴细胞增殖能力更强的图；图3B示出了本发明的干细胞与T淋巴细胞共培养后T淋巴细胞凋亡率不受影响的图。
图4示例性示出了本发明的干细胞分泌免疫调节因子的图。其中图4A示出了本发明的干细胞分泌前列腺素E2(PGE2)的图；图4B示出了本发明的干细胞分泌肿瘤坏死因子α(TNF-α)的图；图4C示出了本发明的干细胞分泌白细胞介素10(IL-10)的图；图4D示出了本发明的干细胞分泌白细胞介素6(IL-6)的图。
图5示例性示出了本发明的干细胞对T淋巴细胞的影响的图。
图6示例性示出了干燥综合征患者BMMSCs及NOD/Ltj小鼠BMMSCs、颌下腺组织及血清中BMP4和PGE2水平的图。
图7示例性示出了本发明的干细胞明显缓解NOD/Ltj小鼠口干症状的图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
分化抑制因子，又称DNA结合抑制因子(Inhibitors of differentiation/DNAbinding，ID)属于螺旋-环-螺旋(HLH)转录因子家族成员之一。ID蛋白是分子量为10-20KD的小分子蛋白，高保守螺旋区通过螺旋上疏水基团的相互作用形成同源或异源二聚体，从而发挥转录调控作用。大部分HLH蛋白有一个与HLH基序相邻的强碱性区域，为DNA结合所必须，故此类HLH又称为碱性HLH(bHLH)蛋白。ID分子是一类特殊的HLH蛋白，因其本身缺乏DNA结合必需的碱性氨基酸序列，与bHLH结合成异二聚体后，抑制bHLH与DNA及其他组织特异性bHLH转录因子(如E蛋白)的结合，对bHLH转录因子活性起负调节作用，影响细胞特异性基因的表达，从而抑制细胞分化。Id蛋白(Inhibitors of differentiation or DNA binding)和E蛋白因都具有basic helix-loop-helix结构域而同属于bHLH转录因子家族。E蛋白家族包括E2A、HEB、E2-2，其特点是除了具有N端的bHLH蛋白相互作用结构域外，还具有C端的DNA结合结构域，特异性识别E box(CANNTG)，激活下游靶基因的表达。Id蛋白与E蛋白不同的是，他们仅具有bHLH蛋白结构域，但缺乏DNA结合结构域。其作用是与E蛋白结合，竞争性的抑制E蛋白的转录活性，调控E蛋白下游靶基因的表达。
ID3是Id蛋白家族成员(Id1-Id4)之一，其通过与E2A结合，在细胞的分化和成熟中发挥重要作用。通过分子动力学和对接法分析提示E2A/E12中的Lys570、Ala595、Val598和Ile599，以及ID3中的Glu53、Gln63和Gln66可能是Id3-E2A/E12相互作用的关键残基，其相互之间通过氢键连接以保持Id3-E2A/E12复合体的稳定。
发明人研究发现，ID3敲除后BMMSCs免疫调节功能明显增强，抑制T细胞增殖。其原因可能在于ID3与E2A竞争性结合，阻止E2A形成二聚体结合DNA，最终抑制BMP4表达和减少PGE2的分泌，静脉回输Id3敲除BMMSCs更有效地改善NOD/Ltj小鼠口干症状。Id3敲除后，E2A与DNA结合增加，促进BMP4和PGE2表达，诱导BMMSCs的免疫耐受。同时，干燥综合征病人和NOD/Ltj老鼠也发现BMP4和PGE2不同程度下降。揭示ID3-E2A-BMP4-PGE2轴在调控MSCs的免疫耐受以及在自身免疫性疾病中的作用。至少部分地基于上述发现完成了本发明。具体地，本发明至少包括以下几方面的内容。下面详细说明。
[免疫调节能力增强的干细胞]
本发明的第一方面，提供一种免疫调节能力增强的干细胞(本发明有时简称为“本发明的干细胞”)，其中，该细胞内Id3基因的表达量降低或ID3蛋白的活性降低。
本发明中，“表达量降低”包括ID3蛋白的产生量降低，其中既包括绝对量的降低，也包括与正常干细胞相比细胞内Id3基因的表达量相对降低。“正常干细胞”包括作为得到本发明的免疫调节能力增强的干细胞的起始细胞的干细胞，其包括从动物体分离得到的原代干细胞，也包括经传代的干细胞。表达量降低还包括表达量为零。即，不表达的含义。
本发明中，“活性降低”包括ID3蛋白与E2A蛋白的结合活性降低或丧失，其包括虽然Id3基因的表达量没有变化，但产生的ID3蛋白与E2A蛋白的结合活性降低或丧失的情况。
本发明中，“干细胞”优选具有免疫调节能力的细胞。本发明通过使细胞内Id3基因的表达量降低或ID3蛋白的活性降低来增强免疫调节能力。需要说明的是，本发明可使用任何类型的干细胞，但是由于相关法律的禁止性规定等原因，本发明的干细胞优选非胚胎干细胞。在某些实施方案中，本发明的干细胞选自间充质干细胞和/或造血干细胞。更优选为骨髓间充质干细胞(BMMSCs)。干细胞的来源对象不特别限定，可为非人类动物，例如小鼠、大鼠、猴、猩猩、猪等哺乳动物，也可为人类。优选地，干细胞的来源与待施用的受试者为相同或相关物种。更优选地，干细胞来源于待施用的受试者本身。
本发明的干细胞除了细胞内Id3基因的表达量降低或ID3蛋白的活性降低以外，维持了起始干细胞或原干细胞的基本性质。例如，维持了基本的细胞形态，保持了细胞间连接，并且保存了细胞外基质连接形成的支架，未破坏细胞表面蛋白的粘附增殖及分化等功能。上述基本性质的表征可通过例如干细胞表面的标记性分子的存在而得到确认。在间充质干细胞的情况下，这些标记性分子包括间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标记性分子。其实例包括黏附分子，例如CD166、CD54、CD102、CD44、CD106等；生长因子和细胞因子受体，例如白介素21受体(IL-1R)、IL-3R、IL-4R、IL-6R、IL-7R、C干扰素受体(IFN-CR)、肿瘤坏死因子(TNF)-A等；整合素家族成员，例如CD49a、CD49b、CD49c、CD29、CD104等；其他分子，例如CD90、CD105等。在造血细胞的情况下，这些标记性分子的实例包括但不限于CD34、CD45、CD14、CD3、CD4和CD8。因此，本发明的干细胞的表面具有上述标记性分子。优选地，本发明的干细胞表面至少表达有Stro-1、CD146、CD90。
除了上述基本性质之外，本发明的干细胞的免疫调节能力得到增强。其包括成骨能力明显提高，并且可持续大幅度提高细胞PGE2的分泌水平，与T细胞共培养可显著抑制T细胞增殖。
[免疫调节能力增强的干细胞的制备方法]
本发明的第二方面，提供一种免疫调节能力增强的干细胞的制备方法(本发明中有时简称为“本发明的制备方法”或“本发明的方法”)，包括利用例如，基因工程手段降低细胞内的Id3基因的表达量或降低ID3蛋白的活性的步骤。
在某些实施方案中，本发明的制备方法包括利用RNA干扰技术降低细胞内的Id3基因的表达量的步骤。RNA干扰技术是外源性和内源性双链RNA在生物体内诱导同源靶基因的RNA特异性降解，导致转录后基因沉默的技术。优选为利用siRNA或shRNA的技术。在示例性方法中，本发明的制备方法包括以下步骤：
(1)合成Id3基因的siRNA；
(2)将所述siRNA转入干细胞；
(3)筛选出细胞内ID3蛋白的表达下降或不表达的细胞，即为免疫调节能力增强的干细胞。
本发明的制备方法中，优选地，使用SEQ ID No:1-3中的至少之一的siRNA。其中SEQ ID No:1(siRNA1)的序列为GGAGCTTTTGCCACTGACT；SEQ ID No:2(siRNA2)的序列为GCTTGCTGGACGACATGAA；SEQ ID No:3(siRNA3)的序列为GCCAGGTGGAAATCCTACA。本发明可使用上述siRNA中的任一种或组合使用其中的多种。
在某些实施方案中，本发明的制备方法包括利用同源重组技术降低细胞内的Id3基因的表达量的步骤。在示例性方法中，本发明的制备方法包括以下步骤：
(1)构建包含失活Id3基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA的基因载体；
(2)将所述基因载体导入同源胚胎干细胞中，使所述基因载体与胚胎干细胞的基因组相应部分发生同源重组，从而使所述基因载体整合到内源基因组中，得到同源重组胚胎干细胞；
(3)将所述同源重组胚胎干细胞注射入小鼠囊胚中，获得嵌和体小鼠；
(4)将嵌和体小鼠与野生型小鼠交配获得F1代杂合小鼠；
(5)使F1代杂合小鼠交配，从其中筛选得到纯合体；
(6)从所述纯合体小鼠的骨髓中分离得到免疫调节能力增强的干细胞。
[第一组合物]
本发明的第三方面，提供第一组合物，其包含本发明第一方面所述的免疫调节能力增强的干细胞或其后代和任选的药物学可接受载体。
本发明的免疫调节能力增强的干细胞的后代是指由本发明的干细胞分裂后得到的细胞，包括具有与分裂前相同性质的干细胞，也包括由本发明的干细胞分化后得到的分化细胞。例如，成骨细胞和成脂细胞。
本发明的第一组合物中免疫调节能力增强的干细胞的量可根据待施用的剂量而变化，可由本领域技术人员确定，只要可提供治疗有效量的细胞，即，达到预期的局部或系统性的效果或性能，则不限定第一组合物中干细胞的量。通常情况下，每ml第一组合物中免疫调节能力增强的干细胞的量从1至109个细胞，例如为102至108之间，103至107之间，104至109之间等。可基于受试者个体因素，包括体重、年龄、病况等而由本领域技术人员确定。
本发明的第一组合物中免疫调节能力增强的干细胞的纯度基于重量，通常在50％至100％之间。例如，50％至60％之间，60％至80％之间，80％至90％之间，90％至100％之间。优选90％至100％之间。可根据细胞表面标记物谱来确定干细胞的纯度。
本发明中药物学可接受载体为适于与本发明的干细胞活性组合来保持、增强其活性的任何物质。其实例包括但不限于添加剂、稀释剂、赋形剂和其他载体。本发明的药物学可接受载体可施用上述物质中的一种或多种的组合。药物学可接受载体的量通常情况下为0.001％至90％(基于重量或基于体积)。优选0.01％至50％(基于重量或基于体积)，例如0.01％至20％(基于重量或基于体积)，0.1％至10％(基于重量或基于体积)等。
在某些实施方案中，在不影响本发明的目的的情况下，药物学可接受载体包括各种添加剂，从而提高第一组合物的其他性质，例如稳定性、等渗性等。添加剂的实例包括抗菌防腐剂、抗氧化剂和缓冲液等。优选地，本发明的第一组合物包括氯化钠作为缓冲液来确保所需的等渗性。
在某些实施方案中，药物学可接受载体包括高分子或合成聚合物，从而将干细胞掺入高分子或合成聚合物中，有效增加干细胞的存活。其中高分子的实例包括但不限于纤连蛋白、纤维蛋白、纤维蛋白原、凝血酶、胶原蛋白、蛋白聚糖。进一步还可包括细胞因子、生长因子、分化因子等。
本发明的第一组合物优选配制为单位剂量注射剂，包括但不限于溶液、悬液、分散剂、乳剂等。优选无菌水溶液或分散剂。例如，本发明的干细胞在水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、多元醇或其混合物中的注射剂。
在某些实施方案中，在不影响本发明的目的的情况下，药物学可接受载体包括缓释吸收剂，从而延长可注射药剂的吸收。例如，单硬脂酸铝和明胶等。
[第二组合物]
本发明的第四方面，提供第二组合物，其包含待处理的干细胞和处理剂，其中所述处理剂包括抑制干细胞中Id3基因表达的化合物和/或ID3蛋白活性抑制剂。本发明的第二组合物中，待处理的干细胞与处理剂可分别单独存在，或两者以混合物形式存在。优选地，在第二组合物中的处理剂存在于待处理的干细胞之外。需要说明的是，虽然第二组合物中处理剂存在于待处理的干细胞之外，但在特定条件下或经特定处理，处理剂可进入待处理的干细胞内部，从而抑制干细胞中Id3基因表达和/或抑制ID3蛋白的活性。其中所述“活性”包括ID3蛋白与E2A蛋白的结合活性。
本发明的“待处理的干细胞”为用于得到本发明第一方面所述的免疫调节能力增强的干细胞的起始细胞，其具有干细胞的基本性质。例如，维持了基本的细胞形态，保持了细胞间连接，并且保存了细胞外基质连接形成的支架，未破坏细胞表面蛋白的粘附增殖及分化等功能。上述基本性质的表征可通过例如，干细胞表面的标记性分子的存在而得到确认。标记性分子的实例如上所述。优选待处理的干细胞的表面至少表达有Stro-1、CD146、CD90。待处理的干细胞的可使用任何类型的干细胞，但是由于相关法律的禁止性规定等原因，待处理的干细胞优选为非胚胎干细胞。其具体实例可参见本发明的第一方面，在此不再赘述。
本发明的“处理剂”为处理待处理的干细胞后能够使其免疫调节能力增强或提高的化合物。其实例包括抑制干细胞中Id3基因表达的化合物和/或ID3蛋白活性抑制剂。抑制干细胞中Id3基因表达的化合物优选为核酸构建体。其实例包括siRNA，例如SEQ ID No:1-3所述的siRNA等。ID3蛋白活性抑制剂包括小分子化合物和多肽类物质。
[增强机体免疫调节能力的方法]
本发明的第五方面，提供增强免疫调节能力的方法，其包括向有需要的受试者施用根据本发明第一方面所述的干细胞或其后代的步骤，或向受试者施用根据本发明第三方面或第四方面所述的组合物的步骤。其中，此处的后代与本发明第三方面中所述的后代的含义相同，在此不再赘述。
本发明中有需要的受试者包括具有自身免疫性疾病(autoimmune diseases，AD)及其并发病况的患者。其中疾病或病况的实例包括但不限于多发性硬化症、全身性硬化症、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎和免疫细胞减少症等。优选糖尿病、类风湿性关节炎、干燥综合征等病况。特别优选干燥综合征。
本发明的施用方式不特别限定，优选通过注射、导管或植入方式进行施用。具体地，包括局部注射、系统性注射、静脉注射等。优选静脉注射方式。
[用于检测干细胞的免疫调节能力的方法]
本发明的第六方面，提供用于检测干细胞的免疫调节能力的方法(本发明有时简称为“本发明的检测方法”)，其包括检测所述干细胞中Id3基因的表达水平的步骤，和/或检测所述干细胞中ID3活性的步骤。本发明的干细胞包括体外培养的干细胞，还包括机体内的干细胞。特别优选间充质干细胞或造血干细胞。
在某些实施方案中，本发明的检测方法包括检测同一受试者或同一干细胞在不同时期的Id3基因的表达水平或ID3活性，并比较不同时期表达水平或ID3活性的步骤。优选地，在第一时间T1时，检测体内的干细胞中Id3基因的表达水平A1，和/或检测所述干细胞中的ID3活性B1，此后在第二时间T2时，再次检测体内的干细胞中的Id3基因的表达水平A2，和/或检测所述干细胞中ID3活性B2。当A1大于A2和/或B1大于B2时，则判定干细胞的免疫调节能力增强；当A1等于A2和或B1等于B2时，则判定干细胞的免疫调节能力未变化或未发生实质变化；当A1小于A2和/或B1小于B2时，则判定干细胞的免疫调节能力变弱。
在某些实施方案中，本发明的检测方法包括检测来自受试者的干细胞的Id3基因的表达水平A1和/或ID3活性B1，并将检测值与参照物进行比较的步骤。其中参照物可为正常或健康同类个体中相同干细胞内的表达值A0和/或ID3活性值B0。当A1大于A0和/或B1大于B0时，则判定干细胞的免疫调节能力差；当A1等于A0和/或B1等于B0时，则判定干细胞的免疫调节能力正常；当A1小于A0和/或B1小于B0时，则判定干细胞的免疫调节能力强或优良。在某些实施方案中，参照物还可以是对多个相似同类个体检测得到的相同干细胞内的表达值进行统计得到的第一参考数值区间，和/或对多个相似同类个体检测得到的相同干细胞内的ID3活性值进行统计得到的第二参考数值区间。当A1大于第一参考数值区间和/或B1大于第二参考数值区间的最大值时，则判定干细胞的免疫调节能力差；当A1在第一参考数据区间内和/或B1在第二参考数据区间内时，则判定干细胞的免疫调节能力正常；当A1小于第一参考数值区间和/或B1小于第二参考数值区间时，则判定干细胞的免疫调节能力强或优良。
实施例
1.人干细胞库来源的BMMSCs经Id3修饰
Id3 siRNA敲除BMMSCs制备
1)合成Id3 siRNA，序列为GGAGCTTTTGCCACTGACT，或GCTTGCTGGACGACATGAA，或GCCAGGTGGAAATCCTACA
2)铺5×105/孔BMMSCs细胞至24孔板中，每孔中有150μL培养基，为α-MEM完全培养基；
3)第二天，50μL/孔的OPTI-MEM与1μL Lipofectamin 2000混合，孵育5min；
4)将4μL合成的si-Id3，siRNA control与另外50μL/孔的OPTI-MEM混合；
5)上述两种混合液混合，室温避光孵育20min；
6)吸掉原先的完全培养基，将混合液慢慢滴加到细胞培养板中；
7)转染6小时后，吸掉混合液，换提前预热的无抗生素的完全培养液，三天后，收集细胞，提取细胞中蛋白并检测细胞的蛋白表达水平。
2.小鼠来源的Id3敲除BMMSCs获取
利用同源重组构建Id3敲除小鼠：
1)基因载体的构建：把失活Id3基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记neo基因的载体上，成为重组载体。
2)同源重组：将重组载体通过电穿孔法导入同源的胚胎干细胞中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中，从而得以表达。
3)选择筛选已击中的细胞：PCR法筛出阳性同源重组的胚胎干细胞
4)将筛选同源重组的胚胎干细胞注射入小鼠囊胚中，获得嵌和体小鼠
5)嵌和体小鼠与野生型小鼠交配获得F1代杂合小鼠
6)得到纯合体：F1代杂合小鼠交配，需要进行至少两代遗传
Id3敲除小鼠BMMSCs培养
小鼠断颈处死后，75％酒精浸泡1分钟，超净台内解剖分离出上下肢，小心剔除胫骨、股骨、肱骨表面肌肉及筋膜，眼科剪剪除长骨两端关节，使用5ml注射器抽取培养基，配3号针头，将长骨内骨髓冲入5cm培养皿。于37℃、5％ CO2培养，3天后换液一次，7天后使用0.25％胰蛋白酶加细胞刮传代至25cm2培养瓶中，每3天换液一次。
3.BMMSCs表征
3.1流式细胞仪检测表面标志物
1)细胞消化离心后用4％多聚甲醛室温下固定20分钟；
2)用PBS洗一次，再用PBS混悬细胞，调整细胞浓度为106个细胞/100μl
3)各取100μl细胞混悬液，分别加入抗Stro-1抗体(1:10)、CD146抗体(1.0μg)、CD90抗体(2μg)-，4℃下避光孵育1小时；
4)1000转/分钟离心5分钟，用PBS洗一次；
5)弃上清，加入100μl PBS混悬细胞，Stro-1抗体染色再加入FITC标记的抗小鼠IgM抗体(1:200)，室温避光30分钟；
6)流式细胞仪上样，检测相关分子的表达情况。
3.2CFSE掺入及流式细胞术检测细胞增殖实验
1)细胞消化后，以0.1％BSA重悬细胞，调整细胞浓度为1×106个/ml；
2)加入2μl 5mM CFSE，使CFSE终浓度为10μM；
3)37℃孵育10分钟，冰上孵育5分钟；
4)1500rpm离心10分钟，去上清，以DMEM培养基洗3次后，放入5cm培养皿，37℃、5％CO2培养；
5)3天后，消化细胞，1500rpm离心10分钟，500μl 0.1％BSA重悬；
6)流式细胞仪检测(488通道)，使用Modfit软件分析增殖指数。
3.3成骨诱导分化
配制成骨诱导培养液：含10％胎牛血清α-MEM培养基中加入2mmol/L谷氨酰胺，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素，10mMβ-甘油磷酸钠，10nM地塞米松，50mg/L维生素C。
第3-4代细胞以2×103/cm2的浓度接种于6孔板中，等细胞生长至80％融合后，更换为成骨诱导培养液，每2天换液1次，光镜下观察钙结节形成情况。于诱导2周后，进行茜素红染色和提取总RNA进行real-time PCR实验。
茜素红染色
1)去培养基，PBS洗2次；
2)70％乙醇固定，4℃，1h；
3)双蒸水洗2次；
4)40mM茜素红溶液(pH 4.2)室温染色1-10分钟，肉眼观察着色情况；
5)双蒸水洗5次，轻轻吹打；
6)镜下观察并采集图像；
7)随机取15个视野，使用Image Pro Plus 6.0软件计算茜素红染色面积。
3.4成脂诱导分化
配制成脂诱导培养液：含10％胎牛血清α-MEM培养基中加入2mmol/L谷氨酰胺，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素，1μM地塞米松，0.5mM IBMX，10mg/L胰岛素，10mM吲哚美辛。
油红染色
1)油红储存液：将150mg油红O溶于50ml异丙醇中，37℃，30分钟；4℃储存；
2)油红工作液：用双蒸水稀释储存液，比例为水：储存液＝4:6，过滤使溶液呈清澈桔红色方可使用；
3)甲醛钙固定液：40％甲醛10ml,CaCl2 2.0g,超纯水90ml；
4)细胞诱导后，去培养基，用PBS洗2次；
5)甲醛-钙室温固定15分钟；
6)PBS洗2次；
7)60％异丙醇媒染1分钟；
8)去异丙醇，油红工作液室温染色30分钟；
9)60％异丙醇浸洗一次；
10)PBS洗2次；
11)镜下观察，甘油三脂脂滴染成红色；
12)随机取15个视野，计数阳性细胞数占总细胞数比例。
3.5小鼠T淋巴细胞的分离培养
小鼠颈椎脱位处死，置75％乙醇中浸泡2分钟，右卧位，超净台内取脾脏，PBS洗去血迹，置于含Hanks液的平皿中，用注射器芯研磨脾，至脾呈白色絮状，Hanks液冲洗，100目滤网过滤细胞，收集细胞悬液于15ml无菌离心管中，1500rpm离心5分钟，用Hanks液洗1次，以RPMI-1640(含10％胎牛血清，2mmol/L谷氨酰胺，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)2ml悬浮细胞，计数，调整浓度至106/ml，放入培养板中培养。
3.6 BMMSCs与小鼠T淋巴细胞共培养
1)第四代BMMSCs以1×105密度接种至6孔板；
2)完全贴壁后，加入5μg/ml丝裂霉素，室温孵育3小时；
3)弃培养基，PBS洗3次，每次5分钟；
4)加入含1×105小鼠T淋巴细胞的RPMI-1640培养基2ml，共培养；
5)加入10μg/ml Anti-CD3及2μg/ml Anti-CD28mAbs刺激T淋巴细胞增殖。
3.7 CFSE掺入及流式细胞术检测T淋巴细胞增殖实验
1)以0.1％BSA重悬小鼠T淋巴细胞，调整细胞浓度为1×106/ml；
2)加入2μl 5mM CFSE，使CFSE终浓度为10μM；
3)37℃孵育10分钟，冰上孵育5分钟；
4)1500rpm离心10分钟，去上清，以新鲜RPMI-1640培养基洗3次；
5)BMMSCs与小鼠T淋巴细胞1:1共培养；
6)加入10μg/ml Anti-CD3及2μg/ml Anti-CD28mAbs刺激T淋巴细胞增殖；
7)3天后，取悬浮细胞1500rpm离心10分钟，去上清，500μl 0.1％BSA重悬；
8)流式细胞仪检测，使用Modfit软件分析增殖指数。
4.基因修饰BMMSCs移植治疗实验性干燥综合征动物模型NOD/Ltj小鼠
4.1实验分组
选用6周龄雌性NOD/Ltj(购自北京华阜康生物科技股份有限公司)小鼠作为预防组，6周龄雌性ICR(购自北京华阜康生物科技股份有限公司)小鼠作为相应实验对照组。
4.2BMMSCs移植
将获得的BMMSCs消化，PBS洗涤3次，注射用生理盐水重悬至浓度106/ml；使用1ml注射器3号针头小鼠尾静脉注射BMMSCs悬液0.1ml(105细胞)/只。2周后开始检测。
4.3小鼠唾液流率检测
小鼠腹腔注射麻醉剂3分钟后，腹腔注射50mg/ml毛果芸香碱0.1ml/kg；待小鼠完全麻醉后将毛细玻璃管置入小鼠口内，将提前称重的0.75ml离心管置于毛细管另一端；自第一滴唾液流入管中时开始计时，10分钟后停止收集唾液；将唾液称重。
4.4小鼠颌下腺组织学观察
小鼠颈椎脱位处死，解剖游离颌下腺并取出，置于4％多聚甲醛中4℃下固定24小时，脱水、包埋、切片、HE染色。于光镜下观察，拍片。随机取10个200×放大倍数视野，使用Image Pro Plus 6.0软件计算炎性细胞浸润面积。
5.实验结果
5.1 Id3基因敲除不影响BMMSCs增殖及凋亡
图1A为基因敲除BMMSCs在第0天和第4天时的细胞增殖率；图1B为基因敲除BMMSCs第4天后的细胞凋亡率的图。如图1A和1B所示，基因敲除的BMMSCs增殖到第4天后，与对照BMMSCs相比，Id3基因敲除BMMSCs的增殖及凋亡无明显影响。
5.2 Id3基因敲除不影响BMMSCs的干细胞特征
图2为示例性示出了本发明的干细胞仍具有起始干细胞的特征的图。图2的CD90、CD146和Strol1中，左侧矮峰为空白对照的图，右侧高峰为对应的分子标记物对应的峰。如图2所示，在Id3基因敲除BMMSCs中仍然检测到表达干细胞表面标志分子CD90、CD146和Strol1。由图2下方的细胞染色照片图还可以看出Id3基因敲除的BMMSCs能向成骨及成脂方向分化。
5.3 Id3基因敲除明显增强BMMSCs免疫抑制功能
图3示例性示出了本发明的干细胞的免疫抑制功能的图。如图3所示，BMMSCs分别按照1:1、1:2和1:4与T淋巴细胞共培养，CFSE分析显示与Id3基因敲除BMMSCs共培养后T淋巴细胞增殖明显受到抑制，凋亡不受影响。
5.4 Id3基因敲除明显改善BMMSCs分泌免疫调节因子的功能
图4示例性示出了本发明的干细胞的分泌免疫调节因子功能的图。如图4所示，BMMSCs分别单独培养、或与T淋巴细胞共培养，Elisa分析显示与Id3基因敲除BMMSCs单独培养或与T淋巴细胞共培养分泌前列腺素E2(PGE2)的能力均能显著上升。
5.5 Id3基因敲除的人源BMMSCs明显抑制T淋巴细胞增殖
图5示例性示出了本发明的干细胞对T淋巴细胞的影响的图。从干细胞库中获取人源BMMSCs，利用siRNA干扰技术敲减BMMSCs中Id3表达，发现Id3表达明显下降(A)，与T淋巴细胞共培养，CFSE阳性T淋巴细胞比例明显增高(B)，说明T淋巴细胞增殖明显受到抑制，ELISA检测发现Id3敲除能上调重要的免疫调节因子PGE2的分泌。
5.6干燥综合征患者及NOD/Ltj小鼠BMMSCs中BMP4及PGE2水平
图6示例性示出了干燥综合征患者及NOD/Ltj小鼠BMMSCs中BMP4在mRNA及蛋白水均下降，NOD/Ltj小鼠中颌下腺组织内及BMMSCs分泌PGE2下降，血清中PGE2无明显改变。
5.7 Id3基因敲减的BMMSCs明显缓解NOD/Ltj小鼠口干症状
图7示例性示出了本发明的干细胞明显缓解NOD/Ltj小鼠口干症状的图。将对照BMMSCs及Id3基因敲减的BMMSCs静脉注射入6周NOD/Ltj小鼠体内，2周后发现Id3基因敲减的BMMSCs治疗组中NOD/Ltj小鼠颌下腺中淋巴细胞浸润明显减少，唾液流率明显升高。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
SEQUENCE LISTING
<110> 首都医科大学
汇富北斗（北京）科技有限公司
<120> 免疫调节能力增强的干细胞及其制备方法、组合物及用途
<130> 1
<150> CN2018108585261
<151> 2018-07-31
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> siRNA
<400> 1
ggagcttttg ccactgact 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> siRNA
<400> 2
gcttgctgga cgacatgaa 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> siRNA
<400> 3
gccaggtgga aatcctaca 19

Claims (8)

1.一种免疫调节能力增强的骨髓间充质干细胞，其特征在于，所述干细胞内Id3基因的表达量降低或ID3的活性降低，其中所述活性包括ID3与E2A的结合活性，所述干细胞的表面至少表达有Stro-1、CD146、CD90。
2.一种免疫调节能力增强的骨髓间充质干细胞的制备方法，其特征在于，其包括降低细胞内Id3基因的表达量或降低ID3蛋白的活性的步骤，其中所述活性包括ID3与E2A的结合活性。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：
(1)合成Id3基因的siRNA；
(2)将所述siRNA转入骨髓间充质干细胞；
(3)筛选出细胞内ID3蛋白的表达下降或不表达的细胞，即为免疫调节能力增强的骨髓间充质干细胞。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，其中所述siRNA选自SEQ ID No:1-3中的至少之一。
5.一种免疫调节能力增强的骨髓间充质干细胞的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：
(1)构建包含失活Id3基因载体；
(2)将所述基因载体导入同源胚胎干细胞中，使所述基因载体与胚胎干细胞的基因组相应部分发生同源重组，从而使所述基因载体整合到内源基因组中，得到同源重组胚胎干细胞；
(3)将所述同源重组胚胎干细胞注射入小鼠囊胚中，获得嵌和体小鼠；
(4)将嵌和体小鼠与野生型小鼠交配获得F1代杂合小鼠；
(5)使F1代杂合小鼠交配，从其中筛选得到纯合体；
(6)从所述纯合体小鼠的骨髓中分离得到免疫调节能力增强的骨髓间充质干细胞。
6.一种组合物，其包含根据权利要求1所述的免疫调节能力增强的骨髓间充质干细胞和药物学可接受载体。
7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述的组合物包括生理盐水，且所述免疫调节能力增强的骨髓间充质干细胞在所述生理盐水中的浓度为104至109个/ml。
8.试剂在制备用于通过下述方法增强机体免疫调节能力的药物中的用途，其特征在于，所述试剂包括权利要求1所述的骨髓间充质干细胞，或者权利要求6或7所述的组合物；
所述方法包括向有需要的受试者施用根据权利要求1所述的骨髓间充质干细胞或其后代的步骤；或者向有需要的受试者施用根据权利要求6或7所述的组合物的步骤。
CN201910680636.8A 2018-07-31 2019-07-26 免疫调节能力增强的干细胞及其制备方法、组合物及用途 Active CN110564692B (zh)

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