CN116376973A - 经基因修饰的啮齿动物基因组 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及经基因修饰的啮齿动物基因组。本文中公开编码嵌合C1q多肽的核酸和表达嵌合C1q多肽的蛋白质、包含所述核酸的非人类动物以及制备或使用所述非人类动物的方法。

Description

经基因修饰的啮齿动物基因组
本申请是申请号为201880066080.7的中国专利申请的分案申请。
相关申请案的交叉引用
本申请案要求2017年9月29日提交的美国临时申请案第62/565,438号的优先权，其内容以全文引用的方式并入本文中。
序列表以引用的方式并入
序列表以引用的方式并入本文中，其呈ASCII文本文档形式，名为35342_10353US01_SequenceListing.txt，大小为50KB，创建于2018年9月25日且通过EFS-Web提交给美国专利和商标局(United States Patent and Trademark Office)。
技术领域
背景技术
在临床前药物研发阶段期间，通常基于候选药剂的功效、毒性以及其它药物动力学和药效学特性来研究候选药剂。候选药剂，如抗体，通常靶向人类抗原，因为研究的最终目标是研发人类疗法。螯合补体路径的能力赋予候选治疗剂显著优点。补体路径是先天性免疫应答的一部分并且有助于体液免疫应答将巨噬细胞和吞噬细胞募集到抗原位点。补体路径的活化引起细胞因子释放和由吞噬细胞进行的抗体结合的抗原的调理作用。在旨在活化补体路径和先天性免疫应答以对抗人类疾病的治疗剂的研发期间，允许研究药剂的作用机制和/或治疗潜力的模型非人类动物系统是非常宝贵的；但缺乏这类系统。
发明内容
本文中公开嵌合哺乳动物C1q多肽(例如嵌合哺乳动物C1qa、C1qb和/或C1qc多肽)、编码嵌合哺乳动物C1q多肽的核酸分子，以及包含所述核酸分子和表达嵌合C1q多肽的非人类动物(例如哺乳动物，如啮齿动物)。
在一个方面中，本文中公开经基因修饰的非人类动物，其在其基因组中包含编码嵌合C1q多肽(例如嵌合C1qa多肽、嵌合C1qb多肽或嵌合C1qc多肽)的核酸，其中核酸包含非人类核酸序列和人类核酸序列。
在一些实施例中，经基因修饰的非人类动物在其基因组中包含超过一个编码嵌合C1q多肽的核酸；例如，非人类动物在其基因组中包含以下的组合(例如，两种或全部三种)：编码嵌合C1qa多肽的核酸、编码嵌合C1qb多肽的核酸和编码嵌合C1qc多肽的核酸。
在一些实施例中，非人类动物是哺乳动物。在一些实施例中，非人类动物是啮齿动物，如大鼠或小鼠。
在一些实施例中，嵌合C1q多肽包含基本上人类型球状头部结构域(即，与人类C1q多肽的球状头部结构域基本上一致)，和基本上非人类型N端茎-干区域(即，与非人类C1q多肽(如内源性C1q多肽)的N端茎-干区域基本上一致)。
在一些实施例中，非人类动物包含编码嵌合C1q多肽(其是嵌合C1qa多肽)的核酸。在一些实施例中，嵌合C1qa多肽包含与人类C1qa多肽的球状头部结构域基本上一致的球状头部结构域，和与非人类C1qa多肽(如内源性C1qa多肽)的N端茎-干区域基本上一致的N端茎-干区域。在一些实施例中，人类C1qa多肽的球状头部结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸108-245。
在一些实施例中，非人类动物是小鼠，其包含编码嵌合C1qa多肽的核酸，所述多肽包含与人类C1qa多肽的球状头部结构域基本上一致的球状头部结构域，和与小鼠C1qa多肽(如内源性小鼠C1qa多肽)的N端茎-干区域基本上一致的N端茎-干区域。在某些实施例中，内源性小鼠C1qa多肽的N端茎-干区域包含SEQ ID NO:1的氨基酸23-107。在特定实施例中，嵌合C1qa多肽包含SEQ ID NO:10(小鼠/人类)的氨基酸23-245。在特定实施例中，嵌合C1qa多肽包含SEQ IDNO:10(小鼠/人类)的氨基酸序列。
在一些实施例中，经基因修饰的非人类动物是大鼠，其包含编码嵌合C1qa多肽的核酸，所述多肽包含与人类C1qa多肽的球状头部结构域基本上一致的球状头部结构域，和与大鼠C1qa多肽(如内源性大鼠C1qa多肽)的N端茎-干区域基本上一致的N端茎-干区域。在一些实施例中，内源性大鼠C1qa多肽的N端茎-干区域包含SEQ ID NO:7的氨基酸23-107。在特定实施例中，嵌合C1qa多肽包含SEQ ID NO:55(大鼠/人类)的氨基酸23-245。在特定实施例中，嵌合C1qa多肽包含SEQ ID NO:55(大鼠/人类)的氨基酸序列。
在一些实施例中，非人类动物包含编码嵌合C1q多肽(其为嵌合C1qb多肽)的核酸。在一些实施例中，嵌合C1qb多肽包含与人类C1qb多肽的球状头部结构域基本上一致的球状头部结构域，和与非人类C1qb多肽(如内源性C1qb多肽)的N端茎-干区域基本上一致的N端茎-干区域。在一些实施例中，人类C1qb多肽的球状头部结构域包含SEQ ID NO:5的氨基酸115-251。
在一些实施例中，非人类动物是小鼠，其包含编码嵌合C1qb多肽的核酸，所述多肽包含与小鼠C1qb多肽(如内源性小鼠C1qb多肽)的N端茎-干区域基本上一致的N端茎-干区域。在一些实施例中，内源性小鼠C1qb多肽的N端茎-干区域包含SEQ ID NO:2的氨基酸26-114。在特定实施例中，嵌合C1qb多肽包含SEQ ID NO:11(小鼠/人类)的氨基酸26-251。在特定实施例中，嵌合C1qb多肽包含SEQ IDNO:11(小鼠/人类)的氨基酸序列。
在一些实施例中，非人类动物是大鼠，其包含编码嵌合C1qb多肽的核酸，所述多肽包含与大鼠C1qb多肽(如内源性大鼠C1qb多肽)的N端茎-干区域基本上一致的N端茎-干区域。在一些实施例中，内源性大鼠C1qb多肽的N端茎-干区域包含SEQ ID NO:8的氨基酸26-114。在特定实施例中，嵌合C1qb多肽包含SEQ ID NO:56(大鼠/人类)的氨基酸26-251。在特定实施例中，嵌合C1qb多肽包含SEQ IDNO:56(大鼠/人类)的氨基酸序列。
在一些实施例中，非人类动物包含编码嵌合C1q多肽(其为嵌合C1qc多肽)的核酸。在一些实施例中，嵌合C1qc多肽包含与人类C1qc多肽的球状头部结构域基本上一致的球状头部结构域，和与非人类C1qc多肽(如内源性C1qc多肽)的N端茎-干区域基本上一致的N端茎-干区域。在一些实施例中，人类C1qc多肽的球状头部结构域包含SEQ ID NO:6的113-245。
在一些实施例中，非人类动物是小鼠，其包含编码嵌合C1qc多肽的核酸，所述多肽包含与人类C1qc多肽的球状头部结构域基本上一致的球状头部结构域，和与小鼠C1qc多肽(如内源性小鼠C1qc多肽)的N端茎-干区域基本上一致的N端茎-干区域。在某些实施例中，内源性小鼠C1qc多肽的N端茎-干区域包含SEQ ID NO:3的氨基酸30-113。在特定实施例中，嵌合C1qc多肽包含SEQ ID NO:12(小鼠/人类)的氨基酸30-246。在特定实施例中，嵌合C1qc多肽包含SEQ IDNO:12(小鼠/人类)的氨基酸序列。
在一些实施例中，经基因修饰的非人类动物是大鼠，其包含编码嵌合C1qc多肽的核酸，所述多肽包含与人类C1qc多肽的球状头部结构域基本上一致的球状头部结构域，和与大鼠C1qc多肽(如内源性大鼠C1qc多肽)的N端茎-干区域基本上一致的N端茎-干区域。在一些实施例中，内源性大鼠C1qc多肽的N端茎-干区域包含SEQ ID NO:9的氨基酸32-115。在特定实施例中，嵌合C1qc多肽包含SEQ ID NO:57(大鼠/人类)的氨基酸32-248。在特定实施例中，嵌合C1qc多肽包含SEQ ID NO:57(大鼠/人类)的氨基酸序列。
在一些实施例中，在非人类动物中翻译嵌合C1q多肽以含有非人类C1q信号肽，如内源性非人类C1q信号肽。换句话说，编码嵌合C1q多肽的核酸分子还包含非人类C1q信号肽(如内源性C1q信号肽)的编码序列。举例来说，编码嵌合C1qa多肽的核酸分子还包含非人类C1qa信号肽(如内源性C1qa信号肽)的编码序列；编码嵌合C1qb多肽的核酸分子还包含非人类C1qb信号肽(如内源性C1qb信号肽)的编码序列；并且编码嵌合C1qc多肽的核酸分子还包含非人类C1qc信号肽(如内源性C1qc信号肽)的编码序列。本文中公开小鼠和大鼠C1q信号肽的实例(参见例如图3A-3C)。
在一些实施例中，编码嵌合C1q多肽的核酸位于除内源性非人类C1q基因座以外的基因座处。在其他实施例中，编码嵌合C1q多肽的核酸位于内源性非人类C1q基因座处。举例来说，编码嵌合C1qa多肽的核酸位于内源性非人类C1qa基因座处；编码嵌合C1qb多肽的核酸位于内源性非人类C1qb基因座处；和/或编码嵌合C1qc多肽的核酸位于内源性非人类C1qc基因座处。
在其中编码嵌合C1q多肽的核酸位于内源性非人类C1q基因座处的实施例中，在一些这类实施例中，内源性非人类C1q基因座处的内源性基因组序列已由人类核酸序列置换。在一些实施例中，人类核酸序列(如人类C1q基因的基因组片段)基本上编码人类C1q多肽的球状头部结构域。在一些实施例中，人类核酸序列还包括人类C1q基因的3'UTR(包括人类C1q基因的聚腺苷酸化信号和聚腺苷酸化位点)。
在一些实施例中，经基因修饰的非人类动物包含编码嵌合C1qa多肽的核酸，其中核酸包含人类和非人类核酸序列，且其中人类核酸序列基本上编码人类C1qa多肽的球状头部结构域。在一些实施例中，人类C1qa多肽的球状头部结构域包含SEQ ID NO:4的氨基酸108-245。在一些实施例中，人类核酸序列编码SEQ ID NO:4的氨基酸112-245。
在一些实施例中，经基因修饰的非人类动物包含编码嵌合C1qb多肽的核酸，其中核酸包含人类和非人类核酸序列，且其中人类核酸序列基本上编码人类C1qb多肽的球状头部结构域。在一些实施例中，人类C1qb多肽的球状头部结构域包含SEQ ID NO:5的氨基酸115-251。在一些实施例中，人类核酸序列编码SEQ ID NO:5的氨基酸118-251。
在一些实施例中，经基因修饰的非人类动物包含编码嵌合C1qc多肽的核酸，其中核酸包含人类和非人类核酸序列，且其中人类核酸序列基本上编码人类C1qc多肽的球状头部结构域。在一些实施例中，人类C1qc多肽的球状头部结构域包含SEQ ID NO:6的氨基酸113-245。在一些实施例中，人类核酸序列编码SEQ ID NO:6的氨基酸114-245。
在包含编码嵌合C1q多肽的核酸的经基因修饰的非人类动物的实施例中，其中核酸包含人类和非人类核酸序列，非人类核酸序列基本上编码非人类C1q多肽(如内源性非人类C1q多肽)的N端茎-干区域。在其中内源性非人类C1q基因座处的内源性基因组序列已由人类核酸序列置换的实施例中，在一些这类实施例中，留存在C1q基因座处的内源性基因组序列基本上编码内源性C1q多肽的N端茎-干区域。
在一些实施例中，非人类动物是小鼠，并且内源性C1q多肽的N端茎-干区域包含SEQ ID NO:1的氨基酸23-107(对于C1qa来说)、SEQ ID NO:2的氨基酸26-114(对于C1qb来说)或SEQ ID NO:3的氨基酸30-113(对于C1qc来说)。在一些实施例中，小鼠包含编码嵌合C1qa多肽的核酸，其中核酸包含小鼠核酸序列和人类核酸序列，且其中小鼠核酸序列编码SEQ ID NO:1的氨基酸23-111。在一些实施例中，小鼠包含编码嵌合C1qb多肽的核酸，其中核酸包含小鼠核酸序列和人类核酸序列，且其中小鼠核酸序列编码SEQ ID NO:2的氨基酸26-117。在一些实施例中，小鼠包含编码嵌合C1qc多肽的核酸，其中核酸包含小鼠核酸序列和人类核酸序列，其中小鼠核酸序列编码SEQ ID NO:3的氨基酸30-114。
在一些实施例中，非人类动物是大鼠，并且内源性C1q多肽的N端茎-干区域包含SEQ ID NO:7的氨基酸23-107(对于C1qa来说)、SEQ ID NO:8的氨基酸26-114(对于C1qb来说)或SEQ ID NO:9的氨基酸32-115(对于C1qc来说)。在一些实施例中，大鼠包含编码嵌合C1qa多肽的核酸，其中核酸包含大鼠核酸序列和人类核酸序列，其中大鼠核酸序列编码SEQID NO:7的氨基酸23-111。在一些实施例中，大鼠包含编码嵌合C1qb多肽的核酸，其中核酸包含大鼠核酸序列和人类核酸序列，其中大鼠核酸序列编码SEQ ID NO:8的氨基酸26-117。在一些实施例中，大鼠包含编码嵌合C1qc多肽的核酸，其中核酸包含大鼠核酸序列和人类核酸序列，其中大鼠核酸序列编码SEQ ID NO:9的氨基酸32-116。
在特定实施例中，经基因修饰的非人类动物是大鼠并且在其基因组中包含：(i)在内源性C1qa基因座处，编码嵌合大鼠/人类C1qa多肽的核酸序列，其中核酸序列包含(5'-3')编码SEQ ID NO:7的大鼠C1qa多肽的氨基酸1-111的第一核苷酸序列和编码SEQ ID NO:4的人类C1qa多肽的氨基酸112-245的第二核苷酸序列且与上述两个序列可操作地连接；(ii)在内源性C1qb基因座处，编码嵌合大鼠/人类C1qb多肽的核酸序列，其中核酸序列包含(5'-3')编码SEQ ID NO:8的大鼠C1qb多肽的氨基酸1-117的第三核苷酸序列和编码SEQ IDNO:5的人类C1qb多肽的氨基酸118-251的第四核苷酸序列且与上述两个序列可操作地连接；以及(iii)在内源性C1qc基因座处，编码嵌合大鼠/人类C1qc多肽的核酸序列，其中核酸序列包含(5'-3')编码SEQ IDNO:9的大鼠C1qc多肽的氨基酸1-116的第五核苷酸序列和编码SEQ ID NO:6的人类C1qc多肽的氨基酸114-245的第六核苷酸序列且与上述两个序列可操作地连接。在具体实施例中，经基因修饰的非人类动物是大鼠，其在其基因组中包含：在内源性C1qa基因座处，编码嵌合大鼠/人类C1qa多肽的核酸序列，所述多肽包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；在内源性C1qb基因座处，编码嵌合大鼠/人类C1qb多肽的核酸序列，所述多肽包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列；以及在内源性C1qa基因座处，编码嵌合大鼠/人类C1qc多肽的核酸序列，所述多肽包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列。
在另一特定实施例中，经基因修饰的非人类动物是小鼠并且在其基因组中包含：(i)在内源性C1qa基因座处，编码嵌合小鼠/人类C1qa多肽的核酸序列，其中核酸序列包含(5'-3')编码SEQ ID NO:1的小鼠C1qa多肽的氨基酸1-111的第一核苷酸序列和编码SEQ IDNO:4的人类C1qa多肽的氨基酸112-245的第二核苷酸序列且与上述两个序列可操作地连接；(ii)在内源性C1qb基因座处，编码嵌合小鼠/人类C1qb多肽的核酸序列，其中核酸序列包含(5'-3')编码SEQ ID NO:2的小鼠C1qb多肽的氨基酸1-117的第三核苷酸序列和编码SEQ ID NO:5的人类C1qb多肽的氨基酸118-251的第四核苷酸序列且与上述两个序列可操作地连接；以及(iii)在内源性C1qc基因座处，编码嵌合小鼠/人类C1qc多肽的核酸序列，其中核酸序列包含(5'-3')编码SEQ IDNO:3的小鼠C1qc多肽的氨基酸1-114的第五核苷酸序列和编码SEQ ID NO:6的人类C1qc多肽的氨基酸114-245的第六核苷酸序列且与上述两个序列可操作地连接。在具体实施例中，经基因修饰的非人类动物是小鼠，其在其基因组中包含：在内源性C1qa基因座处，编码嵌合小鼠/人类C1qa多肽的核酸序列，所述多肽包含SEQID NO:10的氨基酸序列；在内源性C1qb基因座处，编码嵌合小鼠/人类C1qb多肽的核酸序列，所述多肽包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；以及在内源性C1qa基因座处，编码嵌合小鼠/人类C1qc多肽的核酸序列，所述多肽包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
在本文中所公开的一些实施例中，经基因修饰的非人类动物不表达功能性内源性C1qa、C1qb和/或C1qc多肽。
在另一个方面中，本文中提供用于制备在基因组中包含嵌合C1q基因座的经基因修饰的非人类动物(例如非人类哺乳动物，如啮齿动物，包括(但不限于)小鼠或大鼠)的方法，所述基因座包括编码嵌合非人类/人类C1qa多肽的基因、编码嵌合非人类/人类C1qb多肽的基因和/或编码嵌合非人类/人类C1qc多肽的基因，所述方法包含将包含以下的核酸序列引入非人类动物基因组：a)编码嵌合非人类/人类C1qa多肽的基因，b)编码嵌合非人类/人类C1qb多肽的基因，和/或c)编码嵌合非人类/人类C1qc多肽的基因。在一些实施例中，包含编码嵌合C1q多肽的基因的核酸位于基因组中的内源性基因座外部的位置。因此，在一些实施例中，可以使内源性C1q基因或其一部分沉默和/或将其删除，使得非人类动物不表达功能性内源性C1q多肽(例如，不表达功能性内源性C1qa、C1qb和/或C1qc多肽)。在其它实施例中，包含编码嵌合多肽的基因的核酸位于内源性非人类C1q基因座处；且在一个实施例中，包含编码嵌合C1q多肽的基因的核酸置换内源性C1q基因座处的内源性非人类C1q基因。
因此，本文中提供用于制备本文中所描述的经基因修饰的非人类动物的方法，其中在内源性非人类哺乳动物C1q基因座处引入编码嵌合C1q多肽的核酸序列。在特定方面中，公开一种用于制备经基因修饰的非人类动物的方法，其中编码嵌合C1q多肽的核酸序列置换编码内源性非人类哺乳动物C1q多肽的核苷酸序列。
在一些实施例中，用于制备本文中所描述的经基因修饰的非人类动物(例如经基因修饰的大鼠或小鼠)的方法包含产生靶向载体(例如大型靶向载体(LTVEC))，所述靶向载体包含编码嵌合C1qa、C1qb和/或C1qc多肽的核酸序列；将所述靶向载体引入ES细胞；和由所述ES细胞产生所述非人类动物。
在另一个方面中，本文中公开嵌合C1q多肽，其包含基本上人类型球状头部结构域和基本上非人类型N端茎-干区域，其中嵌合C1q多肽选自由以下组成的群组：嵌合C1qa多肽、嵌合C1qb多肽和嵌合C1qc多肽。在一些实施例中，此类嵌合C1q多肽是由本文中公开的经基因修饰的非人类动物制得。在其它实施例中，嵌合C1q多肽是由合适的宿主细胞制得。
在另一个方面中，本文中公开嵌合C1q蛋白质，其包含本文中公开的嵌合C1q多肽中的一种或多种。在一些实施例中，嵌合C1q蛋白质包含至少一个嵌合C1qa、一个嵌合C1qb和一个嵌合C1qc多肽。在一些实施例中，嵌合C1q蛋白质包含6个以下中的每一个：嵌合C1qa多肽、嵌合C1qb多肽和嵌合C1qc多肽。
在另一个方面中，本文中公开经分离的核酸，其编码嵌合C1q多肽(C1qa多肽、C1qb多肽或C1qc多肽)且包含非人类哺乳动物核酸序列和人类核酸序列。在一些实施例中，人类核酸序列基本上编码人类C1q多肽的球状头部结构域且非人类核酸序列基本上编码同源非人类C1q多肽的N端茎-干区域。在一些实施例中，经分离的核酸编码嵌合C1q蛋白质，且包含第一、第二或第三核苷酸序列中的一个或多个，其中第一核苷酸序列编码嵌合C1qa多肽，第二核苷酸序列编码嵌合C1qb多肽且第三核苷酸序列编码嵌合C1qc多肽。
在另一个方面中，本文中提供一种包含本文中公开的经分离的核酸的细胞。在一些实施例中，细胞是胚胎干(ES)细胞，例如啮齿动物(如小鼠或大鼠)ES细胞。
在另一个方面中，本文中提供一种用于测试基于C1q的双特异性抗原结合蛋白的啮齿动物模型，其中抗原结合蛋白结合人类C1q和相关抗原，包含本文中公开的经基因修饰的啮齿动物且进一步包含相关抗原或表达相关抗原的细胞。
在另一个方面中，本文中公开用于筛选靶向相关抗原的药物候选物的方法，其包含将相关抗原引入本文中提供的经基因修饰的非人类动物(例如啮齿动物，例如大鼠或小鼠)，使所述动物与相关药物候选物接触，其中药物候选物是针对人类C1q和相关抗原，以及分析以确定药物候选物是否有效预防、减少或消除特征在于相关抗原的存在或表达的细胞。在一个实施例中，引入步骤包含在动物中表达相关抗原(例如对表达相关抗原的啮齿动物进行遗传修饰)或将表达相关抗原的细胞或病毒引入所述动物。在一个特定方面中，细胞可以是肿瘤细胞或细菌细胞。在另一个态样中，相关抗原可以是肿瘤相关抗原或细菌抗原。在另一个方面中，细胞可以是细菌细胞。
在另一个方面中，本文中提供用于筛选靶向相关抗原的治疗性药物候选物的方法，所述方法包含混合表达相关抗原的细胞或病毒与(i)相关药物候选物，其中药物候选物是针对人类C1q和相关抗原，和(ii)本文中所描述的经基因修饰的啮齿动物的血液样品(例如全血样品)，和(b)分析以确定药物候选物是否有效减少或消除特征在于相关抗原的存在或表达的细胞或病毒。可以基于测量例如与对照性药物或完全无药物相比，在使用药物候选物时的细胞或病毒的存活百分比来进行确定。相关抗原可以是肿瘤相关抗原或感染性疾病相关抗原，例如细菌或病毒抗原。在一些实施例中，相关抗原是细菌抗原，如葡萄球菌(Staphylococcus)抗原。在一些实施例中，细胞是细菌细胞，如葡萄球菌细胞。
在一些实施例中，提供一种筛选药物候选物的方法，其中引入步骤包含用相关抗原(例如病毒抗原或细菌抗原，如葡萄球菌抗原)感染动物(例如大鼠或小鼠)。因此，在一个方面中，引入步骤包含用病毒或细菌感染动物。
在一些实施例中，本文中提供的经基因修饰的非人类动物(例如啮齿动物，例如大鼠或小鼠)是免疫活性动物(例如免疫活性大鼠或小鼠)。
在另一个方面中，本文中公开用于评估包含人类Fc区的抗体是否可以通过利用本文中公开的表达人类化C1q蛋白质的经基因工程改造的非人类动物(例如啮齿动物，如小鼠或大鼠)来活化经典补体路径的方法。在一些实施例中，所述方法包含(a)提供在细胞表面上表达相关抗原的细胞、包含人类Fc区且针对相关抗原的候选抗体和来自表达人类化C1q蛋白质的经基因工程改造的非人类动物的血清样品；(b)混合细胞与候选抗体以使得抗体结合于细胞表面上表达的相关抗原；(c)向细胞-抗体混合物中添加血清样品以实现血清样品中的人类化C1q蛋白质与结合于细胞上的相关抗原的抗体的结合；以及(d)测量细胞的细胞毒性。
附图说明
并入且组成本说明书的一部分的随附图式说明若干实施例且与说明书一起说明所公开的组合物和方法。
除非特别说明(例如loxP等)，否则所有人类外显子序列以空心框表示且所有人类内含子序列以双线表示。所有小鼠或大鼠序列以实心框(外显子)或单线(内含子)表示。
图1A是删除包含所有三种小鼠C1q基因(小鼠基因由基因标记前的“m”指示)的小鼠C1q基因座的例示性方法的示意性表示(未按比例)。在图式下方标记三种C1q基因的外显子(例如E1、E2和E3)。小鼠BAC表示细菌人工染色体；BHR表示细菌同源重组；EP表示电致孔。HET＝杂合；CM＝氯霉素(chloramphenicol)；lox＝loxP位点；pgk-Neo＝新霉素(选择)盒。
图1B展示产生人类化小鼠C1q靶向载体的示意性表示(未按比例)，其中通过消化/连接和/或细菌同源重组(BHR)将嵌合人类/小鼠基因插入小鼠BAC基因(小鼠基因由基因标记前的“m”指示)。在图式下方标记三种C1q基因的外显子(例如E1、E2和E3)。指示若干限制酶位置。CM＝氯霉素；lox＝loxP位点；Ub-Hyg＝潮霉素(hygromycin)选择盒；p＝polyA尾区；Spec＝壮观霉素。
图1C展示小鼠C1q KO HET ES细胞中含有所有三种小鼠/人类嵌合C1q基因的大型靶向载体的电致孔(EP)的示意性表示(未按比例)。在图式下方标记三种C1q基因的外显子(例如E1、E2和E3)。Lox＝loxP位点；Ub-Hyg＝潮霉素选择盒；pgk-Neo＝新霉素选择盒；p＝polyA序列。小鼠、人类或盒序列之间的序列接合区由各接合区下方的各别序列的线和SEQID NO指示。
图2A展示删除包含所有三种大鼠C1q基因(大鼠基因由基因标记前的“r”指示)的大鼠C1q基因座的例示性方法的示意性表示(未按比例)。在图式下方标记三种C1q基因的外显子(例如E1、E2和E3)。大鼠C1q BAC表示大鼠细菌人工染色体；BHR表示细菌同源重组；EP表示电致孔。HET＝杂合；CM＝氯霉素；loxP＝loxP位点；SDC-loxP-Hyg＝自缺失型LoxP-潮霉素选择盒。
图2B展示产生人类化大鼠C1q盒的示意性表示(未按比例)，其中通过消化/吉布森组装(Gibson assembly)和/或CAS9/吉布森组装将嵌合人类/大鼠基因插入大鼠BAC基因(大鼠基因由基因标记前的“r”指示)。在图式下方标记三种C1q基因的外显子(例如E1、E2和E3)。指示若干限制酶位置。CM＝氯霉素；SDC-loxp-puro＝自缺失型loxp-嘌呤霉素盒。
图2C展示大鼠C1q KO HET ES细胞中含有所有三种大鼠/人类嵌合C1q基因的大型靶向载体的电致孔(EP)的示意性表示(未按比例)。在图式下方标记三种C1q基因的外显子(例如E1、E2和E3)。SDC-loxp-puro＝自缺失型loxp-嘌呤霉素盒；p＝polyA序列。大鼠、人类或盒序列之间的序列接合区由各接合区下方的各别序列的线和SEQ ID NO指示。
图3A展示大鼠(rC1qa)、人类(hC1QA)和小鼠(mC1qa)多肽的C1qa氨基酸比对，其中概述相似性且在较低情况下展示错配。信号肽序列被加框和标记。胶原蛋白三螺旋重复序列被加框和标记。C1qa球状头部结构域序列用虚线加框，且用虚线描绘和用箭头指示嵌合多肽中小鼠/人类或大鼠/人类序列的接合区。
图3B展示大鼠(rC1qb)、人类(hC1QB)和小鼠(mC1qb)多肽的C1qb比对，其中概述相似性且在较低情况下展示错配。信号肽序列被加框和标记。胶原蛋白三螺旋重复序列被加框和标记。C1qb球状头部结构域序列用虚线加框，且用虚线描绘和用箭头指示嵌合多肽中小鼠/人类或大鼠/人类序列的接合区。
图3C展示大鼠(rC1qc)、人类(hC1QC)和小鼠(mC1qc)多肽的C1qc氨基酸比对，其中概述相似性且在较低情况下展示错配。信号肽序列被加框和标记。胶原蛋白三螺旋重复序列被加框和标记。C1qc球状头部结构域序列用虚线加框，且用虚线描绘和用箭头指示嵌合多肽中小鼠/人类或大鼠/人类序列的接合区。
图4中的上图展示人类化C1q小鼠的血清中存在嵌合C1q蛋白质，如通过抗人类C1q抗体检测。图4中的下图展示测量补体活性的溶血分析法，其比较来自野生型同窝出生小鼠(WT)和嵌合C1q小鼠(1615HO；HO＝纯合)以及人类血清的血清样品。
图5展示Raji细胞上由2nM的人类抗CD20抗体和血清样品(正常人类血清、人类化C1q小鼠血清或野生型小鼠血清)介导的补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。
图6展示测量补体活性的溶血分析法的结果，其比较来自野生型同窝出生大鼠(“WT”)、人类化C1q大鼠(“C1q Humin”或100015HO；HO＝纯合)、C1q基因敲除大鼠(“C1qKO”)、正常人类血清(“NHS”)和C1q耗尽型人类血清的血清样品。左图：雌性大鼠；右图，除C1q KO大鼠以外：雄性大鼠。
图7展示Raji细胞上由20nM的人类抗CD20抗体和血清样品(正常人类血清、人类化C1q大鼠血清或野生型大鼠血清)介导的补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。
具体实施方式
在公开和描述本发明的化合物、组合物、制品、装置和/或方法之前，应理解，除非另外指定，否则其不限于特定的合成方法或特定的重组生物技术方法，或除非另外指定，否则不限于具体的试剂，因为这类合成方法或重组生物技术方法或具体试剂显然可以变化。还应理解，本文中所用的术语仅仅是为了描述具体实施例，并且不打算作为限制。
A.定义
除非上下文另有明确规定，否则如说明书和所附权利要求书中所使用的单数形式“一(a/an)”和“所述(a/an)”包括多个指示物。因此，举例来说，对“医药载剂”的参考包括两种或更多种这类载剂的混合物等。
范围在本文中可以表示为从“约”一个具体值和/或到“约”另一个具体值。当表示这类范围时，另一实施例包括从一个具体值和/或到另一个具体值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，应理解，具体值形成另一实施例。应进一步理解，每个范围的端点在与另一端点相关以及独立于另一端点的情况下都是有效的。
在本说明书和随后的权利要求书中，将参考多个术语，其应被定义以具有以下含义：
“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，并且所述描述包括所述事件或情况发生的情形以及所述事件或情况不发生的情形。
“引物”是能够支持某种类型的酶促操作并且可以与目标核酸杂交使得可以进行酶促操作的探针的子集。引物可以由不干扰酶促操作的所属领域中可用的核苷酸或核苷酸衍生物或类似物的任何组合制备。
“探针”是能够典型地以序列特异性方式，例如通过杂交与目标核酸相互作用的分子。核酸的杂交在所属领域中充分理解且在本文中讨论。通常，探针可以由所属领域中可以获得的核苷酸或核苷酸衍生物或类似物的任何组合制得。
如本文中所使用，“功能性”，例如参考功能性蛋白质，包括保留至少一种通常与原生蛋白质相关联的生物活性的蛋白质。举例来说，在一些实施例中，内源性基因座处的置换(例如，内源性非人类C1q基因座处的置换)产生不能表达功能性内源性蛋白质的基因座。
术语“可操作地连接”包括一种并接，其中如此描述的组分处于允许其按预定方式发挥作用的关系。因此，编码蛋白质的核酸序列可以可操作地连接到调节序列(例如启动子、强化子、静止子序列等)，以便保留适当的转录调节。举例来说，“可操作地连接”意指核酸表达控制序列(如启动子)与第二核酸序列之间的功能性连接，其中表现控制序列引导对应于第二序列的核酸的转录。此外，本公开的人类化蛋白质的各种部分可以可操作地连接或融合，以保留细胞中蛋白质的适当折叠、处理、靶向、表达和其它功能特性。除非另外说明，否则本公开的人类化蛋白质的各种结构域是彼此可操作地连接。
如短语“人类化C1q等位基因”、“人类化C1qa等位基因”、“人类化C1qb等位基因”、“人类化C1qc等位基因”、“人类化C1q基因”、“人类化C1qa基因”、“人类化C1qb基因”或“人类化C1qc基因”中所使用，术语“人类化”包括(但不限于)其中所有或一部分内源性非人类C1q、C1qa、C1qb和/或C1qc基因或等位基因由人类C1q、C1qa、C1qb和/或C1qc基因或等位基因的对应部分置换的实施例。举例来说，在一些实施例中，术语“人类化”是指内源性非人类C1q、C1qa、C1qb和/或C1qc基因或等位基因的编码区(例如外显子)被人类C1q、C1qa、C1qb和/或C1qc基因或等位基因的相应编码区完全置换，而非人类动物的内源性非编码区(如(但不限于)启动子、5'和/或3'非翻译区、强化子元件等)可以不被置换。在一些实施例中，人类化基因或等位基因在基因组中随机安置或靶向基因组内的具体位置。因此，在一些实施例中，人类化基因或等位基因位于基因组中不是相应内源性基因或等位基因的原生位置的位置，即，其位于除内源性基因座以外的位置。在其它实施例中，人类化基因或等位基因位于内源性基因座；例如人类化基因或等位基因可以置换内源性基因座处的内源性基因或等位基因。在一些实施例中，非人类动物是啮齿动物，如大鼠或小鼠。
“人类化蛋白质”包括(但不限于)其中所有或一部分经编码的内源性非人类C1q、C1qa、C1qb和/或C1qc蛋白质由人类C1q、C1qa、C1qb和/或C1qc蛋白质的对应部分置换的实施例。在一些实施例中，“人类化蛋白质”可以由人类化C1q、C1qa、C1qb和/或C1qc基因或等位基因编码，但仍然是完全人类C1q、C1qa、C1qb和/或C1qc蛋白质(如(但不限于)以下情形：内源性非人类C1q、C1qa、C1qb和/或C1qc基因或等位基因的所有编码区(例如外显子)由人类C1q、C1qa、C1qb和/或C1qc基因或等位基因的相应编码区置换，但非人类动物的内源性非编码区(如(但不限于)启动子、5'和/或3'非翻译区、强化子元件等不被置换)。在一些实施例中，人类化蛋白质由人类化基因或等位基因表达，所述人类化基因或等位基因不位于其在基因组中的原生位置，例如，其不位于内源性基因座。在其它实施例中，人类化蛋白质由位于内源性基因座的人类化基因或等位基因表达。在一些实施例中，人类化蛋白质由人类化基因或等位基因表达，所述人类化基因或等位基因置换内源性基因座处的内源性基因或等位基因。在一些实施例中，非人类动物是啮齿动物，如大鼠或小鼠。
本公开涉及同类对比人类化。举例来说，内源性非人类C1q基因的核苷酸序列可操作地连接到同源人类C1q基因的核苷酸序列以形成嵌合人类化基因。在一些实施例中，内源性C1qa基因的核苷酸序列可操作地连接到人类C1qa基因的核苷酸序列以形成人类化C1qa基因。在其它实施例中，内源性C1qb基因的核苷酸序列可操作地连接到人类C1qb基因的核苷酸序列以形成人类化C1qb基因。在其它实施例中，内源性C1qc基因的核苷酸序列可操作地连接到人类C1qc基因的核苷酸序列以形成人类化C1qc基因。
如本文中所使用，术语“嵌合”包括一种序列，例如核酸或多肽序列，其中一部分序列来源于一种生物体且一部分序列来源于不同的生物体。举例来说，嵌合C1q多肽可以包含来源于小鼠或大鼠的序列，和来源于人类C1q蛋白质的另一序列。在一个实施例中，嵌合C1q多肽包含人类C1q多肽的球状头部结构域或其片段，和同源小鼠或大鼠C1q多肽的茎结构域和干结构域。
如“C1q基因座”中的术语“基因座”是指包含C1q编码区的基因组DNA的位置。举例来说，C1qa基因座是指包含C1qa编码区的基因组DNA的位置；C1qb基因座是指包含C1qb编码区的基因组DNA的位置；且C1qc基因座是指包含C1qc编码区的基因组DNA的位置。对“C1q基因座”的参考意指C1qa、C1qb或C1qc基因座中的任一个。C1q基因座中可以包括出于基因操作目的而引入的其它序列，例如选择盒、限制位点等。
遍及相关章节包括遍及本说明书和权利要求书中所使用的各种术语的其它定义和含义。
遍及本申请案，参考各种公开案。这些公开案的公开内容以全文引用的方式并入本申请案中。所公开的参考文献还针对其中所含的材料而单独地且特定地以全文引用的方式并入本文中，所述材料在提及参考文献的句子中讨论。
B.组合物
公开用于制备本公开的组合物的组分以及在本文中公开的方法中使用的组合物本身。本文中公开这些和其它材料，且应理解，当公开这些材料的组合、子集、相互作用、群组等时，虽然可能未明确地列举对这些组分的每个各种个体和集体组合和排列的特定参考，但各自特定地涵盖且描述于本文中。举例来说，如果公开和讨论具体嵌合C1qa、C1qb和/或C1qc核酸或多肽且讨论可以对多种分子(包括嵌合C1qa、C1qb和/或C1qc核酸或多肽)进行的多种修饰，那么除非特定地相反指示，否则特定地涵盖嵌合C1qa、C1qb和/或C1qc核酸或多肽与可能的修饰的每个组合和排列。因此，如果公开一类分子A、B和C以及一类分子D、E和F并且公开组合分子A-D的实例，那么即使每个并未经单独地叙述，但每个被单独地并且共同地涵盖，从而意味着认为公开组合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E和C-F。同样，还公开这些组合的任何子集或组合。因此，举例来说，认为公开A-E、B-F和C-E的子群组。这一概念适用于本申请案的所有方面，包括(但不限于)制造和使用本公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果存在可以进行的多个额外步骤，应理解，这些额外步骤中的每一个可以与所公开的方法的任何特定实施例或实施例组合一起进行。
C.多肽
本公开提供新型嵌合哺乳动物C1q多肽、编码所述多肽的核酸以及包含所述核酸且可以表达嵌合C1q多肽的经基因修饰的非人类哺乳动物。
如本文中所使用，“C1q”(例如“C1q蛋白质”或“C1q复合物”中)是C1复合物的一部分，其与C1r和C1s一起引发补体路径的活化。C1q是清除病原体、凋亡小体和可能的肿瘤细胞所需的经典补体路径的第一组分(Ghai R等人,《免疫生物学(Immunobiology.)》2007；212(4-5):253-66；Lu JH等人,《细胞分子免疫学(Cell Mol Immunol.)》2008年2月；5(1):9-21)。补体路径是先天性免疫系统的一部分。补体路径的活化可以引起抗原的直接溶解、吞噬细胞和巨噬细胞募集到抗原位点、由吞噬细胞进行的抗原的调理作用以及细胞因子分泌。
人类/小鼠/大鼠C1q蛋白质由多肽构成，所述多肽由三种基因，即C1qa、C1qc和C1qb基因编码，其以顺序A-C-B按5'-3'串联排列(Petry F等人,《免疫遗传学(Immunogenetics.)》1996；43(6):370-6)。这些多肽在本文中也称为“C1q多肽”，其可以是C1qa多肽、C1qb多肽或C1qc多肽。每个C1qa、C1qb和C1qc多肽链具有N端区域，其包括茎(或颈部)结构域，所述茎(或颈部)结构域含有半胱氨酸残基，接着是胶原蛋白样结构域(干结构域)，和C端区域(球状头部结构域)。N端区域在本文中也称为“N端茎-干区域”，且C端区域也称为“球状头部结构域”。人类C1q蛋白质(约410kDa)与由六个胶原茎组装的花束状结构类似，所述胶原茎各自由球状头部封端。每个干/球状头部由三个多肽链(C1qA、C1qB和C1qC)组成，总共18个多肽(六个A-链、六个B-链和六个C-链组成一个C1q分子(Reid KB《生物化学学会学报(Biochem Soc Trans.)》1983年1月；11(1):1-12))。
C1q在人类和啮齿动物中由脾巨噬细胞和树突状细胞表达(Castellano G等人,《血液学(Blood.)》2004年5月15日；103(10):3813-20)。在人类循环中，C1q以约100μg/ml分泌和发现，且在小鼠中具有类似水平(Dillon SP等人,《生物技术杂志(Biotechnol J.)》2009年8月；4(8):1210-1214；Yonemasu K等人,《国际变态反应与应用免疫学档案(IntArch Allergy Appl Immunol.)》1988；86(1):97-101)。蛋白质属于识别病原体相关分子模式(PAMP)的防御性胶原蛋白的群组，其中C1q的C端/球状头部识别IgM的CH3结构域；IgG的CH2结构域；β-淀粉状蛋白；包括DNA的聚阴离子；C-反应性蛋白质；血清淀粉样蛋白P，以及与LPS、病毒和朊病毒相关联的PAMP(Dunkelberger JR,Song WC,《细胞研究(Cell Res.)》2010年1月；20(1):34-50；Ghai R等人,《免疫生物学(Immunobiology.)》2007；212(4-5):253-66)。C1q自发地与C1s-C1r-C1r-C1s四聚体组装在一起以形成C1大复合物。C1大复合物是三种蛋白质的五聚物，其包含一个C1q复合物以及两个C1r和两个C1s，其中C1r和C1s与C1q的茎-干结构域结合。C1r和C1s由丝氨酸蛋白酶抑制因子家族成员C1抑制因子(C1INH)调节(Beinrohr L等人,《分子医学趋势(Trends Mol Med.)》2008年12月；14(12):511-21)。C1q还结合包括CD93、DC-SIGN和CR1/CD35的受体(Hosszu KK等人,《血液学》2012年8月9日；120(6):1228-36；Bohlson SS等人,《分子免疫学(Mol Immunol.)》2007年1月；44(1-3):33-43)。通过结合PAMP，C1q调理且有助于病原体清除，且可以增强由C3b/C4b或IgG分别通过CR1或FcgR来次最佳调理的目标粒子的吞噬作用(Bobak DA等人,《免疫学杂志(JImmunol.)》1987年2月15日；138(4):1150-6)。因此，C1q活化经典补体路径，引起形成攻膜复合物(目标溶解)以及产生活化片段C3a和C5a(Bohlson SS等人,《分子免疫学》2007年1月；44(1-3):33-43)。最后，C1q通过识别凋亡细胞相关分子模式来介导免疫复合物以及经历细胞凋亡的细胞和细胞泡的清除。
为了活化经典补体路径，C1q通过其六个球状头部结合于抗体的病原体表面或Fc结构域，其引起C1r和C1s丝氨酸蛋白酶的活化，从而引起下游补体组分的裂解且最终通过攻膜复合物引起补体活化、沉积和细胞溶解(参见Reid KB《生物化学学会学报》1983年1月；11(1):1-12))。
人类、小鼠和大鼠C1qa、C1qb和C1qc的例示性序列和GenBank寄存编号呈现于以下表1、2和8以及图3A(C1qa)、图3B(C1qb)和图3C(C1qc)中。
因为C1q直接识别抗体或抗原的Fc结构域，所以C1q是提供人类化补体系统的关键。因为C1q的球状头部结构域(通常简称为gC1q)识别人类抗体或人类病原体，所以在本文中提供的某些实施例中，C1q的球状头部结构域经工程改造使得其更易于识别这些分子。在某些实施例中，C1q的球状头部结构域是人类型，而蛋白质的其余部分是非人类型。在这类实施例中，本文中提供的非人类动物保留已知与C1r/C1s相互作用的蛋白质部分和补体系统的其余部分(例如蛋白质的干和茎部分)。因此，在本文中提供的实施例中，表达具有基本上人类型球状头部结构域和基本上非人类型N端茎-干区域的C1q的非人类动物适用于评估对补体系统作为治疗性分子(例如抗体)的作用的效应机制的要求。在所提供的实施例中，如果补体系统由抗体接合，那么所述非人类动物还适用于研究治疗性治疗的有效性。在所提供的实施例中，所述非人类动物还适用作活体内模型以测试经设计以用于感染性疾病适应症的完全人类治疗性抗体(例如双特异性抗体)的功效。
因此，在一个方面中，本文中公开嵌合哺乳动物C1q多肽(例如嵌合哺乳动物C1qa、C1qb和/或C1qc多肽)。
在一些实施例中，本文中提供的嵌合C1q多肽包含人类C末端区，其负责识别免疫球蛋白Fc结构域，或负责识别病原体相关分子模式(PAMP)。
在一些实施例中，本文中提供的嵌合C1q多肽包含人类球状头部结构域或其片段。
在一些实施例中，本文中提供的嵌合C1q多肽包含基本上人类型球状头部结构域。“基本上人类型球状头部结构域”意指嵌合(人类化)C1q多肽中的球状头部结构域与人类C1q多肽的球状头部结构域基本上一致。“基本上一致”是指(i)在一些实施例中，与人类C1q多肽的球状头部结构域具有至少90％、95％、98％、99％或100％序列一致性的球状头部结构域；(ii)在其它实施例中，与人类C1q多肽的球状头部结构域相差不超过5、4、3、2或1个氨基酸的球状头部结构域；(iii)在其它实施例中，与人类C1q多肽的球状头部结构域仅在结构域的N或C端部分处不同的球状头部结构域，例如具有相同长度，但在球状头部结构域的N或C端部分内(例如在球状头部结构域的N或C端处的5-10个氨基酸内)具有一个或多个(例如1、2、3、4或5个，但不超过5个)氨基酸取代(如保守性取代)；和/或(iv)在其它实施例中，在结构域的N或C端比人类C1q多肽的球状头部结构域短或长1、2、3、4、5个(但不超过5个)氨基酸的球状头部结构域。在一些实施例中，与人类C1q多肽的球状头部结构域基本上一致的球状头部结构域与人类球状头部结构域在结构域的N端部分内(例如，在从N端开始的5-10个氨基酸内)相差不超过1、2或3个氨基酸；且在某些这类实施例中，差异包含人类球状头部结构域中的氨基酸由来自同源非人类(例如小鼠或大鼠)球状头部结构域的相应位置处的氨基酸取代。举例来说，本文中的图3A中公开一种嵌合C1qa多肽，其具有基本上人类型球状头部结构域，这一嵌合C1qa多肽的球状结构域与具有SEQ ID NO:4的人类C1qa的球状头部结构域的不同之处仅在于从球状头部结构域的N端开始的第三位置处的一个氨基酸(人类中是“K”，且嵌合、小鼠和大鼠C1qa多肽中是“R”)。
在一些实施例中，嵌合C1q多肽包含N末端茎-干区域，其负责识别非人类(例如内源性啮齿动物)C1s和C1r和/或补体路径的其它非人类(例如内源性啮齿动物)组分。
在一些实施例中，嵌合C1q多肽包含非人类茎-干区域。在一些实施例中，嵌合C1q多肽包含非人类茎结构域。在一些实施例中，嵌合C1q多肽包含非人类胶原蛋白三螺旋结构域。在一些实施例中，嵌合C1q多肽包含非人类N末端区，其包含非人类干和非人类茎结构域。
在一些实施例中，本文中提供的嵌合C1q多肽包含基本上非人类型N端茎-干区域。“基本上非人类型N端茎-干区域”意指嵌合C1q多肽的N端茎-干区域与非人类(例如啮齿动物)C1q多肽的相应N端茎-干区域基本上一致。“基本上一致”意指(i)在一些实施例中，与非人类C1q多肽的N端茎-干区域具有至少90％、95％、95％、99％或100％序列一致性的N端茎-干区域；(ii)在其它实施例中，与非人类C1q多肽的N端茎-干区域相差不超过5、4、3、2或1个氨基酸的N端茎-干区域；(iii)在其它实施例中，仅在C端与非人类C1q多肽的N端茎-干区域不同的N端茎-干区域，例如具有相同长度，但具有从茎-干区域的C端开始的5-10个氨基酸的一个或多个氨基酸取代；和/或(iv)在其它实施例中，在区域的N或C端比非人类C1q多肽的N端茎-干区域短或长1、2、3、4或5个(但不超过5个)氨基酸的N端茎-干区域。在特定实施例中，嵌合C1q多肽的N端茎-干区域与非人类(例如啮齿动物)C1q多肽的N端茎-干区域一致。
在一个实施例中，人类C1qa多肽包含如SEQ ID NO:4中所阐述的氨基酸序列。在另一实施例中，人类C1qa多肽包含如GenBank寄存编号NP_001334394.1中所阐述的氨基酸序列。在一个实施例中，人类C1qb多肽包含SEQ ID NO:5中所阐述的氨基酸序列。在另一实施例中，人类C1qb多肽包含如GenBank寄存编号NP_000482.3中所阐述的氨基酸序列。在一个实施例中，人类C1qc多肽包含如SEQ ID NO:6中所阐述的氨基酸序列。在另一实施例中，人类C1qc多肽包含如GenBank寄存编号NP_001334548.1中所阐述的氨基酸序列。
在一个实施例中，小鼠C1qa多肽包含如SEQ ID NO:1中所阐述的氨基酸序列。在另一实施例中，小鼠C1qa多肽包含如GenBank寄存编号NP_031598.2中所阐述的氨基酸序列。在一个实施例中，小鼠C1qb多肽包含如SEQ ID NO:2中所阐述的氨基酸序列。在另一实施例中，小鼠C1qb多肽包含如GenBank寄存编号NP_033907.1中所阐述的氨基酸序列。在一个实施例中，小鼠C1qc多肽包含如SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列。在另一实施例中，小鼠C1qc多肽包含如GenBank寄存编号NP_031600.2中所阐述的氨基酸序列。
在一个实施例中，大鼠C1qa多肽包含如SEQ ID NO:7中所阐述的氨基酸序列。在另一实施例中，大鼠C1qa多肽包含如GenBank寄存编号NP_001008515.1中所阐述的氨基酸序列。在一个实施例中，大鼠C1qb多肽包含如SEQ ID NO:8中所阐述的氨基酸序列。在另一实施例中，大鼠C1qb多肽包含如GenBank寄存编号NP_062135.1中所阐述的氨基酸序列。在一个实施例中，大鼠C1qc多肽包含如SEQ ID NO:9中所阐述的氨基酸序列。在另一实施例中，大鼠C1qc多肽包含如GenBank寄存编号NP_001008524.1中所阐述的氨基酸序列。
因此，在一个方面中，嵌合哺乳动物C1q多肽是嵌合C1qa多肽。
在一些实施例中，嵌合C1qa多肽包含人类球状头部结构域或其片段。在一个实施例中，多肽是嵌合C1qa多肽，其包含如SEQ ID NO:4中所阐述的人类C1qa多肽的氨基酸122-222(例如，嵌合哺乳动物C1qa多肽，其包含人类C1qa多肽的氨基酸122-235或112-245)。
在一些实施例中，嵌合C1qa多肽包含基本上人类型球状头部结构域(即，与人类C1qa多肽的球状头部结构域基本上一致的球状头部结构域)。在一个实施例中，人类C1qa多肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，且SEQ ID NO:4的氨基酸108-245组成具有SEQ ID NO:4的人类C1qa多肽的球状头部结构域(参见图3A)。因此，在一些实施例中，嵌合C1qa多肽包含球状头部结构域，所述球状头部结构域与由SEQ IDNO:4的氨基酸108-245表示的人类C1qa球状头部结构域基本上一致。在特定实施例中，嵌合C1qa多肽的球状头部结构域由SEQ IDNO:10的氨基酸108-245表示，这类结构域与由SEQ ID NO:4的氨基酸108-245表示的人类C1qa球状头部结构域相差一个氨基酸(小鼠和大鼠C1qa中的第三个氨基酸残基是“R”，而非人类C1qa中的“K”)。在另一特定实施例中，嵌合C1qa多肽包含球状头部结构域，所述球状头部结构域与由SEQ ID NO:4的氨基酸108-245表示的人类C1qa球状头部结构域一致。
在一些实施例中，嵌合C1qa多肽包含非人类C1qa茎和/或干结构域。因此，在一些实施例中，嵌合哺乳动物C1qa多肽包含非人类序列，其是至少包含SEQ ID NO:1中所阐述的小鼠C1qa多肽的氨基酸33-102、30-102、25-105、23-107或23-111的小鼠序列。在其它实施例中，嵌合哺乳动物C1qa多肽包含非人类序列，其是至少包含SEQ IDNO:7中所阐述的大鼠C1qa多肽的氨基酸33-102、30-102、25-105、23-107或23-111的大鼠序列。
在一些实施例中，嵌合C1qa多肽包含基本上非人类型N端茎-干区域，即，与非人类C1qa多肽的N端茎-干区域基本上一致的N端茎-干区域。在某些实施例中，嵌合C1qa多肽包含与小鼠C1qa多肽的N端茎-干区域基本上一致的N端茎-干区域。在一个实施例中，小鼠C1qa多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列(图3A)，且SEQ ID NO:1的氨基酸23-107组成具有SEQ ID NO:1的小鼠C1qa多肽的N端茎-干区域(图3A)。因此，在一些实施例中，嵌合C1qa多肽包含与由SEQ ID NO:1的氨基酸23-107表示的小鼠C1qaN端茎-干区域基本上一致的N端茎-干区域。在特定实施例中，嵌合C1qa多肽的N端茎-干区域由SEQ IDNO:1的氨基酸23-107表示。在一些实施例中，嵌合C1qa多肽包含与大鼠C1qa多肽的N端茎-干区域基本上一致的N端茎-干区域。在一个实施例中，大鼠C1qa多肽包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列(图3A)，且SEQ ID NO:7的氨基酸23-107组成具有SEQ ID NO:7的大鼠C1qa多肽的N端茎-干区域(图3A)。因此，在一些实施例中，嵌合C1qa多肽包含与由SEQ ID NO:7的氨基酸23-107表示的大鼠C1qaN端茎-干区域基本上一致的N端茎-干区域。在特定实施例中，嵌合C1qa多肽的N端茎-干区域由SEQ ID NO:7的氨基酸23-107表示。
在一些实施例中，嵌合C1qa多肽包含基本上人类型球状头部结构域和基本上非人类型N端茎-干区域。举例来说，本文中公开嵌合哺乳动物C1qa多肽，其中嵌合哺乳动物C1qa多肽至少包含SEQ ID NO:10(小鼠/人类)中所阐述的多肽的氨基酸23-245或至少包含SEQIDNO:55(大鼠/人类)中所阐述的多肽的氨基酸23-245。在一个方面中，嵌合C1qa多肽是或包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:55。
在另一个方面中，嵌合哺乳动物C1q多肽是C1qb多肽。
在一些实施例中，嵌合C1qb多肽包含人类C1qb球状头部或其片段。在一个实施例中，多肽是嵌合C1qb多肽，其包含如SEQ ID NO:5中所阐述的人类C1qb多肽的氨基酸125-233(例如人类C1qb多肽的氨基酸120-250或118-251)。
在一些实施例中，嵌合C1qb多肽包含基本上人类型球状头部结构域(即，与人类C1qb多肽的球状头部结构域基本上一致的球状头部结构域)。在一个实施例中，人类C1qb多肽包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列(图3B)，且SEQ ID NO:5的氨基酸115-251组成具有SEQID NO:5的人类C1qb多肽的球状头部结构域(图3B)。因此，在一些实施例中，嵌合C1qb多肽包含球状头部结构域，所述球状头部结构域与由SEQ IDNO:5的氨基酸115-251表示的人类球状头部结构域基本上一致。在特定实施例中，嵌合C1qb多肽的球状头部结构域由SEQ IDNO:11的氨基酸115-251表示，这类结构域与由SEQ ID NO:5的氨基酸115-251表示的人类C1qb球状头部结构域相差一个氨基酸(小鼠C1qb中第一个氨基酸残基是“G”，而非人类C1qb中的“K”)。在另一特定实施例中，嵌合C1qb多肽包含球状头部结构域，所述球状头部结构域与由SEQ ID NO:5的氨基酸115-251表示的人类C1qb球状头部结构域一致。
在一些实施例中，嵌合C1qb多肽包含非人类C1qb茎和/或干结构域。在一些实施例中，嵌合哺乳动物C1qb多肽包含非人类哺乳动物序列，其是至少包含SEQ ID NO:2中所阐述的小鼠C1qb多肽的氨基酸32-105、27-105、27-110、26-114或26-117的小鼠序列。在其它实施例中，嵌合哺乳动物C1qb多肽包含非人类哺乳动物序列，其是至少包含SEQ ID NO:8中所阐述的大鼠C1qb多肽的氨基酸32-105、27-105、27-110、26-114或26-117的大鼠序列。
在一些实施例中，嵌合C1qb多肽包含基本上非人类型N端茎-干区域，即，与非人类C1qb多肽的N端茎-干区域基本上一致的N端茎-干区域。在某些实施例中，嵌合C1qb多肽包含与小鼠C1qb多肽的N端茎-干区域基本上一致的N端茎-干区域。在一个实施例中，小鼠C1qb多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列(图3B)，且SEQ ID NO:2的氨基酸26-114组成具有SEQ ID NO:2的小鼠C1qb多肽的N端茎-干区域(图3B)。因此，在一些实施例中，嵌合C1qb多肽包含与由SEQ ID NO:2的氨基酸26-114表示的小鼠C1qb N端茎-干区域基本上一致的N端茎-干区域。在特定实施例中，嵌合C1qb多肽的N端茎-干区域由SEQ IDNO:2的氨基酸26-114表示。在一些实施例中，嵌合C1qb多肽包含与大鼠C1qb多肽的N端茎-干区域基本上一致的N端茎-干区域。在一个实施例中，大鼠C1qb多肽包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列(图3B)，且SEQ ID NO:8的氨基酸26-114组成具有SEQ ID NO:8的大鼠C1qb多肽的N端茎-干区域(图3B)。因此，在一些实施例中，嵌合C1qb多肽包含与由SEQ ID NO:8的氨基酸26-114表示的大鼠C1qb N端茎-干区域基本上一致的N端茎-干区域。在特定实施例中，嵌合C1qb多肽的N端茎-干区域由SEQ ID NO:8的氨基酸26-114表示。
在一些实施例中，嵌合C1qb多肽包含基本上人类型球状头部结构域和基本上非人类型N端茎-干区域。举例来说，本文中公开嵌合哺乳动物C1qb多肽，其中多肽至少包含SEQID NO:11(小鼠/人类)中所阐述的多肽的氨基酸26-251或至少包含SEQ ID NO:56(大鼠/人类)中所阐述的多肽的氨基酸26-251。在一个方面中，嵌合C1qb多肽是或包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:56。
在另一个方面中，嵌合哺乳动物C1q多肽是嵌合C1qc多肽。
在一些实施例中，嵌合C1qc多肽包含人类C1qc球状头部或其片段。在一个实施例中，多肽是嵌合C1qc多肽，其包含如SEQ ID NO:6中所阐述的人类C1qc多肽的氨基酸118-234(例如，包含SEQ ID NO:6中所阐述的人类C1qc多肽的氨基酸114-245的嵌合哺乳动物C1qc多肽)。
在一些实施例中，嵌合C1qc多肽包含基本上人类型球状头部结构域(即，与人类C1qc多肽的球状头部结构域基本上一致的球状头部结构域)。在一个实施例中，人类C1qc多肽包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列(图3C)，且SEQ ID NO:6的氨基酸113-245组成具有SEQID NO:6的人类C1qc多肽的球状头部结构域(图3C)。因此，在一些实施例中，嵌合C1qc多肽包含球状头部结构域，所述球状头部结构域与由SEQ IDNO:6的氨基酸113-245表示的人类C1qc球状头部结构域基本上一致。在特定实施例中，嵌合C1qc多肽的球状头部结构域与由SEQ ID NO:6的氨基酸113-245表示的人类C1qc球状头部结构域一致。
在一些实施例中，嵌合C1qc多肽包含非人类C1qc茎和/或干结构域。举例来说，本文中公开嵌合哺乳动物C1qc多肽，其中非人类哺乳动物序列是小鼠序列，其至少包含SEQID NO:3中所阐述的小鼠C1qc多肽的氨基酸31-111、30-113或30-114；或其中非人类哺乳动物序列是至少包含SEQ ID NO:9中所阐述的大鼠C1qc多肽的氨基酸33-113、32-115或32-116的大鼠序列的嵌合哺乳动物C1qc多肽。
在一些实施例中，嵌合C1qc多肽包含基本上非人类型N端茎-干区域，即，与非人类C1qc多肽的N端茎-干区域基本上一致的N端茎-干区域。在某些实施例中，嵌合C1qc多肽包含与小鼠C1qc多肽的N端茎-干区域基本上一致的N端茎-干区域。在一个实施例中，小鼠C1qc多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列(图3C)，且SEQ ID NO:3的氨基酸30-113组成具有SEQ ID NO:3的小鼠C1qc多肽的N端茎-干区域(图3C)。因此，在一些实施例中，嵌合C1qc多肽包含与由SEQ ID NO:3的氨基酸30-113表示的小鼠C1qc N端茎-干区域基本上一致的N端茎-干区域。在特定实施例中，嵌合C1qc多肽的N端茎-干区域由SEQ IDNO:3的氨基酸30-113表示。在一些实施例中，嵌合C1qc多肽包含与大鼠C1qc多肽的N端茎-干区域基本上一致的N端茎-干区域。在一个实施例中，大鼠C1qc多肽包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列(图3C)，且SEQ ID NO:9的氨基酸32-115组成具有SEQ ID NO:9的大鼠C1qc多肽的N端茎-干区域(图3C)。因此，在一些实施例中，嵌合C1qc多肽包含与由SEQ ID NO:9的氨基酸32-115表示的大鼠C1qc N端茎-干区域基本上一致的N端茎-干区域。在特定实施例中，嵌合C1qc多肽的N端茎-干区域由SEQ ID NO:9的氨基酸32-115表示。
在一些实施例中，嵌合C1qc多肽包含基本上人类型球状头部结构域和基本上非人类型N端茎-干区域。举例来说，本文中还公开嵌合哺乳动物C1qc多肽，其中多肽至少包含SEQ ID NO:12(小鼠/人类)中所阐述的多肽的氨基酸30-246或至少包含SEQ ID NO:57(大鼠/人类)中所阐述的多肽的氨基酸32-248。在一个方面中，嵌合C1qc多肽是或包含SEQ IDNO:12或SEQ ID NO:57。
在一个具体方面中，本文中公开嵌合C1q蛋白质，其包含本文中所描述的嵌合C1q多肽中的一种或多种。举例来说，本文中公开嵌合C1q蛋白质，其中蛋白质包含至少一种、两种、三种、四种、五种或六种嵌合C1qa；一种、两种、三种、四种、五种或六种嵌合C1qb；和/或一种、两种、三种、四种、五种或六种嵌合C1qc多肽。因此，在一些实施例中，嵌合蛋白包含六种以下中的每一个：嵌合C1qa多肽、嵌合C1qb多肽和嵌合C1qc多肽。
所公开的C1q多肽是包含部分人类型和部分非人类型氨基酸结构的嵌合多肽。应理解且本文中涵盖，所公开的嵌合多肽的人类和非人类部分是以保留C1q多肽的功能性的方式连接、融合或以其它方式化学接合。如本文中所使用，“功能”和“功能性”是指履行原生分子的职责的能力。对于C1qa、C1qb和C1qc，功能性包括形成二聚体(对于C1qa和C1qb，形成异源二聚体，且对于C1qc，形成同源二聚体)的能力；嵌合多肽的各部分呈现适当折叠的能力；组装成二聚体的三聚体，从而形成C1q复合物的能力(对于每个三聚体，两个C1qa和C1qb异源二聚体和1个C1qc同源二聚体)；与C1r和C1s一起形成五聚体C1复合物的能力；识别抗体的Fc结构域或PAMP的能力；以及起始经典补体路径的能力。已描述C1q蛋白质的组装(参见例如Lu等人(《细胞分子免疫学(Cellular&Mol.Immunol.)》2008,5(1):9-21)，尤其图1)。C1qa和C1qb多肽链通过N末端处的二硫键来二聚合且两个C1qc链通过类似的二硫键结来形成同源二聚体。C1qa-C1qb二聚体和单一C1qc链形成三螺旋且C1qc-C1qc二聚体中的另一个C1qc链与另一个C1qa-C1qb二聚体三聚合，形成由两个C1qc链之间的二硫键连接的两个三螺旋。三个这类结构通过N端连接而形成C1q蛋白质分子。
在具体方面中，本文中公开嵌合哺乳动物C1qa、C1qb和/或C1qc多肽，其中本文中公开的多肽进一步分别包含人类、小鼠或大鼠C1qa、C1qb和/或C1qc信号序列。例示性人类、小鼠和大鼠C1qa、C1qb和C1qc信号序列分别展示于图3A、3B和3C中。
应理解且本文中涵盖，可以在非人类动物中表达所公开的嵌合多肽中的任一种。因此，本发明涵盖经基因修饰的非人类动物，例如啮齿动物，例如小鼠或大鼠，其表达本文中所描述的嵌合C1q蛋白质或本文中所描述的包含氨基酸序列的变体(例如保守性氨基酸取代)的嵌合C1q蛋白质。
因此，嵌合多肽可以是已知且本文中涵盖的嵌合C1qa、C1qb和/或C1qc多肽的多种变体中的一种。除已知的功能性C1qa、C1qb和/或C1qc物种和菌株变体以外，存在也可以在所公开的方法和组合物中起作用的C1qa、C1qb和/或C1qc多肽的衍生物。所属领域的技术人员良好地理解蛋白质变体和衍生物，并且可以涉及氨基酸序列修饰。举例来说，氨基酸序列修饰通常属于三种类别中的一种或多种：取代型、插入型或缺失型变体。这些类型的修饰和用于实现其的分子技术是所属领域中已知的。取代、缺失、插入或其任何组合可以组合以获得最终构筑体。这些修饰不得使序列位于阅读框架外，且优选不会产生可以产生次级mRNA结构的互补区。当用于描述保守性氨基酸取代时，术语“保守性”包括一个氨基酸残基由另一个具有侧链R基团的氨基酸残基取代，所述侧链R基团具有类似化学特性(例如，电荷或疏水性)。保守性氨基酸取代可以通过修饰核苷酸序列，以引入将编码保守性取代的核苷酸变化来实现。通常，保守性氨基酸取代不会显著改变蛋白质的相关功能特性，例如，C1q复合物结合免疫球蛋白或活化补体路径的能力。侧链具有类似化学特性的氨基酸群组的实例包括：脂族侧链，如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；脂族羟基侧链，如丝氨酸和苏氨酸；含酰胺侧链，如天冬酰胺和谷氨酰胺；芳香族侧链，如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；碱性侧链，如赖氨酸、精氨酸和组氨酸；酸性侧链，如天冬氨酸和谷氨酸；以及含硫侧链，如半胱氨酸和甲硫氨酸。保守性氨基酸取代群组包括例如缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸、苯丙氨酸/酪氨酸、赖氨酸/精氨酸、丙氨酸/缬氨酸、谷氨酸/天冬氨酸和天冬酰胺/谷氨酰胺。在一些实施例中，保守性氨基酸取代可以是蛋白质中的任何原生残基被丙氨酸取代，如例如丙氨酸扫描突变诱发中所使用。在一些实施例中，进行保守性取代，其在Gonnet等人((1992)《完整蛋白质序列数据库的穷举匹配(Exhaustive Matching of the Entire ProteinSequence Database)》,《科学(Science)》256:1443-45)中公开的PAM250对数似然性矩阵中具有正值，所述文献以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，取代是中度保守性取代，其中取代在PAM250对数似然性矩阵中具有非负值。
通过选择保守性低于上文所列举的取代的取代来实现功能的显著变化，即，选择在保持以下的作用方面更显著不同的残基：(a)取代区域中多肽主链的结构，例如呈片状或螺旋状构形，(b)目标位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的主体。通常预期将引起蛋白质特性的最大变化的取代是满足以下条件的取代：(a)亲水性残基(例如丝氨酰基或苏氨酰基)取代疏水性残基(例如亮氨酰基、异亮氨酰基、苯丙氨酰基、缬氨酰基或丙氨酰基)(或被疏水性残基取代)；(b)半胱氨酸或脯氨酸取代任何其它残基(或被任何其它残基取代)；(c)具有正电性侧链的残基(例如赖氨酰基、精氨酰基或组氨酰基)取代负电性残基(例如谷氨酰基或天冬氨酰基)(或被负电性残基取代)；或(d)具有大型侧链的残基(例如苯丙氨酸)取代不具有侧链的残基(例如甘氨酸)(或被不具有侧链的残基取代)，(e)增加硫酸化和/或糖基化位点的数目。
可以使用取代型或缺失型突变诱发来插入N-糖基化(Asn-X-Thr/Ser)或O-糖基化(Ser或Thr)位点。也可能需要半胱氨酸或其它不稳定残基的缺失。通过例如删除一个碱性残基或用谷氨酰胺基或组氨酰基残基取代一个碱性残基来实现潜在蛋白水解位点(例如Arg)的缺失或取代。
应理解，一种定义本文中所公开的蛋白质的变体和衍生物的方式是根据与特定已知序列的同源性/一致性来定义变体和衍生物。举例来说，SEQ ID NO:1阐述小鼠C1qa多肽的具体序列，SEQ ID NO:2阐述小鼠C1qb多肽的具体序列，SEQ ID NO:3阐述小鼠C1qc多肽的具体序列，SEQ ID NO:4阐述人类C1qa多肽的具体序列，SEQ ID NO:5阐述人类C1qb多肽的具体序列，SEQ ID NO:6阐述人类C1qc多肽的具体序列，SEQ ID NO:7阐述大鼠C1qa多肽的具体序列，SEQ ID NO:8阐述大鼠C1qb多肽的具体序列且SEQ ID NO:9阐述大鼠C1qc多肽的具体序列。特定公开本文中所公开的这些和其它蛋白质的变体，其与所述序列具有至少90％、95％、98％或99％同源性。在一些实施例中，同源序列是由表1、2和8中列举的GenBank寄存编号表示的序列。所属领域的技术人员易于理解如何确定两个蛋白质的同源性。举例来说，可以在比对两个序列之后计算同源性，使得同源性处于其最高水平。
另一种计算同源性的方式可以通过公布的算法进行。用于比较的序列的最佳比对可以通过以下进行：Smith和Waterman《应用数学进展(Adv.Appl.Math.)》2:482(1981)的局部同源算法；Needleman和Wunsch,《分子生物学杂志(J.MoL Biol.)》48:443(1970)的同源比对算法；Pearson和Lipman,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)》85:2444(1988)的相似性搜寻方法；这些算法的计算机化实施(威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package Software Package),遗传学计算机组(Genetics Computer Group),575Science Dr.,Madison,WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)；或检查。
可以通过例如以下中公开的算法获得核酸的相同类型的同源性：Zuker,M.《科学》244:48-52,1989；Jaeger等人《美国国家科学院院刊》86:7706-7710,1989；Jaeger等人《酶学方法(Methods Enzymol.)》183:281-306,1989。
应理解，保守性突变和同源性的说明可以按任何组合方式组合在一起，如与其中变体是保守性突变的具体序列具有至少70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同源性的实施例。
如本说明书讨论各种蛋白质和蛋白质序列，应理解，还公开可以编码这些蛋白质序列的核酸。这将包括与特定蛋白质序列相关的所有简并序列，即，所有具有编码一个具体蛋白质序列的序列的核酸以及所有编码所公开的蛋白质序列的变体和衍生物的核酸，包括简并核酸。因此，尽管本文中可能未写出每个具体核酸序列，但应理解，实际上本文中通过所公开的蛋白质序列公开和描述每个序列。
D.核酸
本文中公开多种基于核酸的分子，包括例如编码例如嵌合C1qa、C1qb、C1qc的核酸或本文中公开的任何用于制备C1qa、C1qb和/或C1qc基因修饰的非人类动物的核酸，以及各种功能性核酸。
本文中公开编码嵌合哺乳动物C1qa、C1qb和/或C1qc多肽的经分离的核酸，其包含非人类和人类核酸序列。在一些实施例中，本文中所描述的经分离的核酸序列是大型靶向载体，其包括基因组的全部区域，且包括外显子、内含子和/或基因间序列。这些区域可以包括5'和3'非翻译区、强化子、启动子和其它调节区域。在一些实施例中，这些调节元件是非人类调节元件，例如内源性非人类C1q基因的调节元件。在其它实施例中，这些调节元件是人类调节元件，例如人类C1q基因的调节元件。在其它实施例中，本文中所描述的经分离的核酸序列是cDNA序列。在一些实施例中，本文中所描述的经分离的核酸(例如大型靶向载体)可以包括超过一种C1q基因，例如两种或三种基因(例如，其可以编码本文中所描述的全部三种嵌合C1qa、C1qb和C1qc基因)。
在一个方面中，本文中公开包含非人类和人类核酸序列的经分离的核酸，其中核酸编码上文所描述的嵌合哺乳动物C1q多肽(例如C1qa、C1qb或C1qc多肽)，例如包含基本上非人类型N端茎-干区域和基本上人类型球状头部结构域的嵌合C1q多肽。
在一些实施例中，编码嵌合哺乳动物C1qa多肽的经分离的核酸包含非人类和人类核酸序列，其中人类核酸序列基本上编码人类C1q多肽的球状头部结构域，且非人类核酸序列基本上编码同源非人类C1q多肽的N端茎-干区域。
“基本上编码人类C1q多肽的球状头部结构域的人类C1q核酸序列”意指人类C1q基因的一个片段，其编码球状头部结构域或略微长于或短于人类C1q多肽的球状结构域的多肽片段。“略微长于或短于”意指长度差不超过5、4、3、2或1个氨基酸。类似地，“基本上编码非人类C1q多肽的N端茎-干区域的非人类C1q核酸序列”意指非人类C1q基因的一个片段，其编码N端茎-干区域或略微长于或短于非人类C1q多肽的N端茎-干区域的多肽片段。
在其中非人类C1q多肽和同源人类C1q多肽在茎-干区域与球状头部结构域之间的接合区附近共有共同氨基酸的情形下，可能无需利用精确编码人类C1q多肽的球状头部结构域的人类C1q核酸序列。有可能使用基本上编码人类C1q多肽的球状头部结构域的人类C1q基因的核酸序列，其与基本上编码非人类动物C1q多肽的茎-干区域的核酸可操作地连接，使得嵌合C1q多肽包括与人类C1q多肽的球状头部结构域基本上或完全一致的球状头部结构域，和与非人类C1q多肽的茎-干区域基本上或完全一致的茎-干区域。类似地，在其中非人类C1q多肽和人类C1q多肽在球状头部结构域的C端附近共有共同氨基酸的情形下，可能无需利用精确编码人类C1q多肽的球状头部结构域的人类C1q核酸。有可能插入略微较短的人类C1q基因的核酸，其编码略微短于人类C1q多肽的球状头部结构域的多肽且与编码球状头部结构域的C端处的其余氨基酸的非人类核酸可操作地连接，使得嵌合C1q多肽包括仍与人类C1q多肽的球状头部结构域基本上或完全一致的球状头部结构域。
在一个方面中，本文中公开编码嵌合哺乳动物C1qa多肽的经分离的核酸，其中人类核酸序列基本上编码人类C1qa多肽的球状头部结构域，例如编码人类C1qa多肽的球状头部结构域或其片段。举例来说，在一个方面中，本文中公开编码嵌合哺乳动物C1qa多肽的经分离的核酸，其中核酸至少包含编码如SEQ ID NO:4中所阐述的人类C1qa多肽的氨基酸122-222的核酸序列。举例来说，核酸可以包含编码如SEQ IDNO:4中所阐述的人类C1qa多肽的氨基酸122-235或112-245的核酸序列(例如，人类C1qa外显子3的一部分)。
所公开的编码嵌合哺乳动物C1qa多肽的核酸可以进一步包含非人类核酸序列(例如，基本上编码非人类C1qa多肽的N端茎-干区域的核酸序列)。因此，本文中还公开经分离的核酸，其中核酸序列至少包含编码SEQ ID NO:1中所阐述的小鼠C1qa多肽的氨基酸33-102、30-102、25-105、23-107或23-111的核苷酸序列，或至少包含编码SEQ ID NO:7中所阐述的大鼠C1qa多肽的氨基酸33-102、30-102、25-105、23-107或23-111的核苷酸序列。在具体方面中，本文中公开经分离的核酸，其中经分离的核酸至少编码SEQ ID NO:10(小鼠/人类)中所阐述的多肽的氨基酸23-245，或至少编码SEQ ID NO:55(大鼠/人类)中所阐述的多肽的氨基酸23-245。在一个方面中，经分离的核酸编码功能性嵌合哺乳动物C1qa多肽，其是或包含SEQ ID NO:10或SEQ IDNO:55。
本文中还公开编码嵌合哺乳动物C1qb多肽的经分离的核酸，其包含基本上编码人类C1qb多肽的球状头部结构域(例如编码人类C1qb多肽的球状头部结构域或其片段)的核酸序列。举例来说，编码嵌合哺乳动物C1qb多肽的核酸至少包含编码如SEQ ID NO:5中所阐述的人类C1qb多肽的氨基酸125-233的核酸序列。举例来说，核酸可以包含编码如SEQ IDNO:5中所阐述的人类C1qb多肽的氨基酸118-251的核酸序列(例如，人类C1qb外显子3的一部分)。
所公开的编码嵌合哺乳动物C1qb多肽的核酸可以进一步包含非人类核酸序列(例如，基本上编码非人类C1qb多肽的N端茎-干区域的核酸序列)。因此，本文中还公开经分离的核酸，其中核酸序列至少包含编码SEQ ID NO:2中所阐述的小鼠C1qb多肽的氨基酸32-105、27-105、27-110、26-114或26-117的核苷酸序列，或其中核酸序列至少包含编码SEQ IDNO:8中所阐述的大鼠C1qb多肽的氨基酸32-105、27-105、27-110、26-114或26-117的核苷酸序列。在具体方面中，本文中公开经分离的核酸，其中经分离的核酸至少编码SEQ ID NO:11(小鼠/人类)中所阐述的多肽的氨基酸26-251，或其中经分离的核酸至少编码SEQ ID NO:56(大鼠/人类)中所阐述的多肽的氨基酸26-251。在一个方面中，经分离的核酸编码功能性嵌合哺乳动物C1qb多肽，其是或包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:56。
本文中还公开编码嵌合哺乳动物C1qc多肽的经分离的核酸，其包含基本上编码人类C1qc多肽的球状头部结构域(例如编码人类C1qc多肽的球状头部结构域或其片段)的核酸序列。在一个方面中，经分离的核酸编码嵌合哺乳动物C1qc多肽，其中编码嵌合哺乳动物C1qc多肽的核酸至少包含编码SEQ ID NO:6中所阐述的人类C1qc多肽的氨基酸118-234的核酸序列。举例来说，核酸可以包含编码如SEQ ID NO:6中所阐述的人类C1qc多肽的氨基酸114-245的核酸序列(例如，人类C1qa外显子3的一部分)。
编码嵌合哺乳动物C1qc多肽的核酸可以进一步包含非人类核酸序列(例如，基本上编码非人类C1qc多肽的N端茎-干区域的核酸序列)。因此，本文中还公开经分离的核酸，其中核酸序列至少包含编码SEQ ID NO:3中所阐述的小鼠C1qc多肽的氨基酸31-111、30-113或30-114的核苷酸序列，或其中核酸序列至少包含编码SEQ ID NO:9中所阐述的大鼠C1qc多肽的氨基酸33-113、32-115或32-116的核苷酸序列。在具体方面中，本文中公开经分离的核酸，其中经分离的核酸至少编码SEQ ID NO:12(小鼠/人类)中所阐述的多肽的氨基酸30-246，或其中经分离的核酸至少编码SEQ ID NO:57(大鼠/人类)中所阐述的多肽的氨基酸32-248。在一个方面中，经分离的核酸编码功能性嵌合哺乳动物C1qc多肽，其是或包含SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:57。
在一些实施例中，编码嵌合C1q多肽的经分离的核酸中的非人类核酸序列还编码非人类信号肽，例如内源性非人类C1q多肽的信号肽。
在一些实施例中，编码嵌合C1q多肽的经分离的核酸中的非人类核酸序列还包含非人类5'UTR区域，例如内源性非人类C1q基因的5'UTR区域。
在一些实施例中，编码嵌合C1q多肽的经分离的核酸中的人类核酸序列还包含人类3'UTR区域，例如人类C1q基因的3'UTR区域。
在一些实施例中，非人类核酸序列是非人类C1q基因的基因组片段，其包含外显子2的编码部分(例如，编码非人类C1q多肽的成熟形式的氨基酸的部分)和外显子3的一部分(例如，编码N端茎-干区域的氨基酸的部分)。在一些实施例中，非人类核酸序列是非人类C1q基因的基因组片段，其包含外显子2的整个编码部分，所述编码部分编码非人类C1q多肽的成熟形式的信号肽和氨基酸，和外显子3中编码N端茎-干区域的氨基酸的部分。在一些实施例中，非人类核酸序列是非人类C1q基因的基因组片段，其包含外显子1、外显子2和外显子3中编码N端茎-干区域的氨基酸的部分，由此涵盖非人类C1q基因的5'UTR。
在一些实施例中，人类核酸序列是人类C1q基因的基因组片段，其包含外显子3中编码人类C1q多肽的球状头部结构域或其片段的部分。人类核酸序列可操作地连接到非人类核酸序列，使得经编码的嵌合C1q多肽包含基本上非人类型N端茎-干区域和基本上人类型球状头部结构域且是功能性C1q多肽。
在一些实施例中，人类核酸序列是人类C1q基因的基因组片段且包括人类C1q基因的整个3'UTR，所述基因组片段包含编码球状头部结构域或其片段的外显子3的3'部分。
在一个具体方面中，本文中公开编码嵌合非人类C1q蛋白质的经分离的核酸，其中核酸包含编码嵌合C1qa、嵌合C1qb和/或嵌合C1qc的序列。在一些实施例中，一个或多个编码嵌合C1qa、C1qb和/或C1qc的序列包含编码人类球状头部结构域或其片段的序列。在一些实施例中，一个或多个编码嵌合C1qa、C1qb和/或C1qc的序列包含编码非人类(例如啮齿动物，例如大鼠或小鼠)干和/或茎的序列。在一些实施例中，一个或多个编码嵌合C1qa、C1qb和/或C1qc的序列包含编码非人类(例如啮齿动物，例如大鼠或小鼠)胶原蛋白三螺旋结构域的序列。
因此，在一些实施例中，本文中公开经分离的核酸，其中经分离的核酸编码嵌合非人类哺乳动物C1q蛋白质，包含第一、第二或第三核苷酸序列中的一个或多个，其中第一核苷酸序列编码嵌合非人类哺乳动物C1qa多肽，第二核苷酸序列编码嵌合非人类哺乳动物C1qb多肽，且第三核苷酸序列编码嵌合非人类哺乳动物C1qc多肽。
在一个实施例中，所公开的经分离的核酸可以进一步包含编码如图3A、3B和/或3C中所阐述的人类、小鼠或大鼠C1qa、C1qb和/或C1qc信号肽的核苷酸序列。
本文中还公开编码嵌合哺乳动物C1q多肽的经分离的核酸，其中非人类哺乳动物核酸序列包含非人类哺乳动物C1qa、C1qb和/或C1qc基因的外显子1和2。
应理解且本文中涵盖，所公开的核酸可以并入细胞中以被翻译和表达。因此，可以将任何所公开的核酸克隆到细胞的基因组中以用于嵌合C1q多肽的表达。因此，本文中提供经基因修饰的细胞，其包含根据任一前述方面所述的一种或多种经分离的核酸。
术语“细胞”包括任何适用于表达重组核酸序列的细胞。细胞包括原核生物和真核生物细胞(单细胞或多细胞)、细菌细胞(例如大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌属(Bacillusspp.)、链霉菌属(Streptomyces spp.)等的菌株)、分枝杆菌细胞、真菌细胞、酵母细胞(例如酿酒酵母(S.cerevisiae)、裂殖酵母(S.pombe)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、嗜甲醇毕赤酵母(P.methanolica)等)、植物细胞、昆虫细胞(例如SF-9、SF-21、杆状病毒感染的昆虫细胞、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)等)、非人类动物细胞、人类细胞或细胞融合物，例如融合瘤或四源杂交瘤。在一些实施例中，细胞是人类、猴、猿、仓鼠、大鼠或小鼠细胞。在一些实施例中，细胞是真核细胞且选自以下细胞：CHO(例如CHO K1、DXB-11CHO、Veggie-CHO)、COS(例如COS-7)、视网膜细胞、Vero、CV1、肾脏(例如HEK293、293EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK)、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo205、HB 8065、HL-60(例如BHK21)、Jurkat、Daudi、A431(表皮)、CV-1、U937、3T3、L细胞、C127细胞、Sp2/0、NS-0、MMT 060562、塞特利氏细胞(Sertoli cell)、BRL 3A细胞、HT1080细胞、骨髓瘤细胞、肿瘤细胞，和来源于前述细胞的细胞系。在一些实施例中，细胞包含一种或多种病毒基因，例如表达病毒基因的视网膜细胞(例如PER.C6TM细胞)。在一些实施例中，细胞是ES细胞。在其它实施例中，细胞是树突状细胞、成纤维细胞、上皮细胞或初生细胞。在一些实施例中，使用细胞产生经基因修饰的非人类动物。还应理解，一些所述细胞可以并入和用于研发包含任何所公开的核酸的经基因修饰的非人类动物且可以表达所述多肽，所述所公开的核酸至少编码一种或多种嵌合C1qa、C1qb和/或C1qc多肽。在一些实施例中，从本文中提供的经基因修饰的非人类动物获得的细胞。在一些这类实施例中，细胞可以是初生细胞。在一些实施例中，细胞可以是巨噬细胞或树突状细胞。
所属领域的技术人员将理解，除编码本文中所描述的人类化C1q蛋白质的核酸残基以外，由于遗传密码的简并，其它核酸可以编码本公开的多肽。因此，除在基因组中包含编码本文中所描述的人类化C1q蛋白质的核苷酸序列的经基因修饰的非人类动物以外，还提供由于遗传密码的简并而在基因组中包含与本文中所描述的核苷酸序列不同的核苷酸序列的非人类动物。
存在多种与蛋白质C1q(例如多肽C1qa、C1qb和/或C1qc以及嵌合C1qa、C1qb和/或C1qc)或本文中公开的任何用于制备嵌合C1qa、C1qb和/或C1qc多肽的核酸相关的序列，其都由核酸编码或是核酸。可以在多种蛋白质和基因数据库(包括Genbank)中获得这些基因的人类类似物和其它类似物以及这些基因的对偶基因和剪接变体和其它类型的变体的序列。所属领域的技术人员理解如何解析序列差异和不同以及使与具体序列相关的组合物和方法适应其它相关序列。
E.经基因修饰的人类化C1q动物
在另一个方面中,本文中提供经基因修饰的非人类动物(例如啮齿动物，如小鼠或大鼠)，其表达如上文所描述的嵌合、人类化C1q多肽(例如，嵌合C1qa、C1qb或C1qc)。这类非人类动物表达人类化C1q复合物，其包含人类化C1q多肽。
在一个方面中，本文中公开非人类动物(例如啮齿动物，如小鼠或大鼠)，其在其基因组中包含编码上文所描述的嵌合C1q多肽(例如，包含基本上非人类型(内源性)N端茎-干区域和基本上人类型球状头部结构域的嵌合C1q多肽(C1qa、C1qb或C1qc))的核酸分子。
在一些实施例中，本文中公开的动物包含编码如上文所描述的嵌合C1q多肽(例如C1qa、C1qb或C1qc多肽)的核酸分子，其中所述核酸分子包含非人类(例如内源性)和人类核酸序列。
在一些实施例中，编码嵌合C1q多肽的核酸分子包括非人类(例如内源性)C1q核酸序列和同源人类C1q核酸序列，其彼此可操作地连接使得核酸分子编码功能性C1q多肽。在本文中，术语“同源”在嵌合分子的情形下用于指示嵌合分子中的序列具有对应于相同基因的不同起点。举例来说，小鼠或大鼠C1qa序列连接到人类C1qa序列以形成嵌合C1qa分子，小鼠或大鼠C1qb序列连接到人类C1qb序列以形成嵌合C1qb分子，小鼠或大鼠C1qc序列连接到人类C1qc序列以形成嵌合C1qc分子。在一些实施例中，嵌合C1q多肽包含基本上非人类型N端茎-干区域和基本上人类型球状头部结构域。
在一些实施例中，经基因修饰的非人类动物的基因组中的编码嵌合C1q多肽的核酸分子包括非人类C1q核酸序列(例如内源性非人类C1q核酸序列)和人类C1q核酸序列，其中人类C1q核酸序列基本上编码人类C1q多肽的球状头部结构域。
在一些实施例中，经基因修饰的非人类动物的基因组中的编码嵌合C1q多肽的核酸分子包括非人类(例如内源性)C1q核酸序列和人类C1q核酸序列，其中非人类C1q核酸序列基本上编码非人类(例如内源性)C1q多肽的N端茎-干区域。
在一些实施例中，编码嵌合C1q多肽的核酸分子可操作地连接到非人类(例如内源性)C1q基因的5'调节元件，如启动子和/或强化子。
在一些实施例中，基因组中的编码嵌合C1q多肽的核酸分子位于除内源性C1q基因座以外的基因座。
在一些实施例中，基因组中的嵌合C1q核酸分子位于内源性C1q基因座。在一些这类实施例中，基因组中的嵌合C1q核酸分子可以由内源性C1q基因的在其内源性基因座处的核苷酸序列由同源人类C1q基因的核苷酸序列置换而产生。
在一些实施例中，非人类C1q基因中的位于内源性C1q基因座的相邻基因组序列已由同源人类C1q基因的相邻基因组序列置换，以形成嵌合、人类化C1q基因。
在一些实施例中，插入内源性非人类C1q基因中的人类C1q基因的相邻基因组序列包括人类C1q基因的外显子3的一部分，使得所得嵌合、人类化C1q基因编码包含基本上人类型球状头部结构域的嵌合C1q多肽。在一些实施例中，插入内源性非人类C1q基因中的人类C1q基因的相邻基因组序列包括人类C1q基因的外显子3的一部分，其基本上编码人类C1q多肽的球状头部结构域。
在一些实施例中，在人类化之后留存在内源性基因座处且可操作地连接到所插入的相邻人类C1q基因组序列的内源性C1q基因的基因组序列包括外显子2的3'部分和外显子3的5'部分，且基本上编码内源性C1q多肽的N端茎-干区域。
在其中非人类C1q多肽和同源人类C1q多肽在茎-干区域与球状头部结构域之间的接合区附近共有共同氨基酸的情形下，可能无需插入精确编码人类C1q多肽的球状头部结构域的人类C1q核酸。有可能插入基本上编码人类C1q多肽的球状头部结构域的人类C1q基因的略微更长或更短的核酸，其与基本上编码非人类动物C1q多肽的茎-干区域的核酸可操作地连接，使得嵌合C1q多肽包括与人类C1q多肽的球状头部结构域基本上或完全一致的球状头部结构域，和与非人类C1q多肽的茎-干区域基本上或完全一致的茎-干区域。类似地，在其中非人类C1q多肽和人类C1q多肽在球状头部结构域的C端附近共有共同氨基酸的情形下，可能无需利用精确编码人类C1q多肽的球状头部结构域的人类C1q核酸。有可能插入略微较短的人类C1q基因的核酸，其基本上编码(即，略微短于)人类C1q多肽的球状头部结构域且与编码球状头部结构域的C端处的其余氨基酸的非人类核酸可操作地连接，使得嵌合C1q多肽包括仍与人类C1q多肽的球状头部结构域基本上或完全一致的球状头部结构域。
在一些实施例中，人类化、嵌合C1q基因中所包括的人类C1q核苷酸序列还包括人类C1q基因的3'非翻译区(“UTR”)，其是所有C1q基因(即，C1qa、C1qb和C1qc基因)中的外显子3的最后一部分。在某些实施例中，除人类C1q基因的3'UTR以外，还可以包括来自人类C1q基因的基因座的其它人类基因组序列。其它人类基因组序列可以由在紧接在人类C1q基因的3'UTR下游的人类C1q基因的基因座中发现的至少10-200bp(例如50bp、75bp、100bp、125bp、150bp、175bp、200bp或更多)组成。在其它实施例中，人类化C1q基因中所包括的人类C1q核苷酸序列不包括人类C1q基因的3'UTR；取而代之，包括内源性C1q基因的3'UTR且紧接在人类化C1q基因的终止密码子之后。
在一些实施例中，人类化、嵌合C1q基因中所包括的内源性非人类C1q核酸序列(例如，在人类化之后留存在内源性基因座处的内源性基因组C1q序列)包括内源性C1q基因的5'UTR(其可以包括外显子1且在大多数情况下，外显子2的5'部分)。在一些实施例中，人类化、嵌合C1q基因中所包括的内源性非人类C1q核苷酸序列还包括编码内源性C1q多肽的信号肽的核苷酸序列(例如，外显子2的5'部分)。
在一些实施例中，本文中提供的非人类动物对于其基因组中的人类化C1q基因来说是杂合的。在其它实施例中，本文中提供的非人类动物对于其基因组中的人类化C1q基因来说是纯合的。
在某些实施例中，非人类动物在其基因组中包括多个(即，两个或更多个)嵌合C1q基因，其各自位于内源性C1q基因座或不同基因座。在一些实施例中，多个嵌合C1q基因在非内源性C1q基因座处的相邻核酸片段上。在一些实施例中，多个嵌合C1q基因各自位于其内源性C1q基因座。举例来说，已经使用同源人类C1q基因的核苷酸序列使非人类动物中的两个或全部三个内源性C1q基因(C1qa、C1qb和C1qc)人类化。
在所提供的各种实施例中，经基因修饰的非人类动物表达由嵌合非人类/人类C1q核酸分子编码的多肽。因此，本文中公开经基因修饰的非人类动物，其中非人类动物表达一种或多种嵌合非人类/人类C1qa、C1qb和/或C1qc多肽。在这类方面中，经基因修饰的非人类动物可以表达一、二、三、四、五或六种嵌合非人类/人类C1qa多肽；一、二、三、四、五或六种嵌合非人类/人类C1qb多肽；和/或一、二、三、四、五或六种嵌合非人类/人类C1qc多肽。在各种实施例中，所表达的嵌合C1q多肽是功能性C1q多肽。在各种实施例中，本文中提供的C1q多肽以典型C1q花束状结构排列，以形成包含18个多肽链的功能性C1q蛋白质。
在一些实施例中，非人类动物不表达功能性内源性C1q多肽(例如，内源性C1qa、C1qb或C1qc多肽)。在一些实施例中，非人类动物不表达功能性内源性C1qa多肽、功能性内源性C1qb多肽或功能性内源性C1qc多肽。功能性内源性C1q多肽的表达不足可以由内源性C1q基因的不活化、缺失和/或人类化引起。
在一些方面中，非人类动物表达一种或多种包含人类C1qa、C1qb和/或C1qc多肽的球状头部结构域的嵌合C1qa、C1qb和/或C1qc多肽。在一些方面中，非人类动物表达嵌合C1qa多肽，其包含SEQ ID NO:4中所阐述的人类C1qa的球状头部结构域或其片段(例如SEQID NO:4中所阐述的氨基酸112-245、122-235或122-222)。在一些方面中，非人类动物表达嵌合C1qb多肽，其包含SEQ ID NO:5中所阐述的人类C1qb的球状头部结构域或其片段(例如SEQ ID NO:5中所阐述的氨基酸118-251、120-251或125-233)。在一些方面中，非人类动物表达嵌合C1qc多肽，其包含SEQ ID NO:6中所阐述的人类C1qc的球状头部结构域或其片段(例如SEQ ID NO:6中所阐述的氨基酸118-234或氨基酸114-245)。在一些方面中，非人类动物表达如SEQ ID NO:10或55中所阐述的嵌合C1qa、如SEQ ID NO:11或56中所阐述的C1qb和/或如SEQ ID NO:12或57中所阐述的C1qc多肽。
在一个方面中，应理解且本文中涵盖，所公开的经基因修饰的非人类动物包含编码C1q多肽的核酸，所述多肽包含非人类氨基酸序列和人类氨基酸序列。还应理解，嵌合C1q的全部或一部分球状头部结构域包含人类氨基酸序列。在一个方面中，本文中公开经基因修饰的非人类动物(例如啮齿动物，如小鼠或大鼠)，其中编码人类C1qa多肽的球状头部或其片段的核酸序列至少编码如SEQ ID NO:4中所阐述的人类C1qa多肽的氨基酸122-222(例如，编码如SEQ ID NO:4中所阐述的人类C1qa多肽的氨基酸122-235或112-245的核酸序列)。在一个方面中，经基因修饰的非人类动物是大鼠并且进一步包含至少编码SEQ ID NO:7中所阐述的大鼠C1qa多肽的氨基酸33-102、30-102、25-105、23-107或23-111的核苷酸序列，其可操作地连接到编码人类C1qa多肽的球状头部结构域或其片段的核酸序列，或经基因修饰的非人类动物是小鼠并且进一步包含至少编码SEQ ID NO:1中所阐述的小鼠C1qa多肽的氨基酸33-102、30-102、25-105、23-107或23-111的核苷酸序列，其可操作地连接到编码人类C1qa多肽的球状头部结构域或其片段的核酸序列。在一个方面中，经基因修饰的非人类动物包含一个或多个至少编码如SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:55中所阐述的C1qa多肽的氨基酸23-245的核酸序列。在特定方面中，本文中公开经基因修饰的非人类动物(例如啮齿动物，如小鼠或大鼠)，其中非人类动物包含一个或多个编码如SEQ ID NO:10或SEQ IDNO:55中所阐述的C1qa多肽的核酸序列。在一些实施例中，经基因修饰的非人类动物是小鼠，其包含编码如SEQ ID NO:10中所阐述的C1qa多肽的核酸。在一些实施例中，经基因修饰的非人类动物是大鼠，其包含编码如SEQ IDNO:55中所阐述的C1qa多肽的核酸。
在另一个方面中，本文中公开经基因修饰的非人类动物(例如啮齿动物，如小鼠或大鼠)，其中编码人类C1qb多肽的球状头部或其片段的核酸序列至少编码如SEQ ID NO:5中所阐述的人类C1qb多肽的氨基酸125-233(例如，编码人类C1qb多肽的氨基酸120-250或118-251的核酸序列)。
本文中还公开经基因修饰的非人类动物(例如啮齿动物，如小鼠或大鼠)，其中经基因修饰的非人类动物是大鼠且包含至少编码SEQ IDNO:8中所阐述的大鼠C1qb多肽的氨基酸32-105、27-105、27-110、26-114或26-117的核苷酸序列，其可操作地连接到编码人类C1qb多肽的球状头部结构域或其片段的核酸序列，或其中经基因修饰的非人类动物是小鼠且进一步包含至少编码SEQ ID NO:2中所阐述的小鼠C1qb多肽的氨基酸32-105、27-105、27-110、26-114或26-117的核苷酸序列，其可操作地连接到编码人类C1qb多肽的球状头部结构域或其片段的核酸序列。
在一个方面中，经基因修饰的非人类动物包含一个或多个至少编码如SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:56中所阐述的C1qb多肽的氨基酸26-251的核酸序列。在特定方面中，本文中公开经基因修饰的非人类动物(例如啮齿动物，如小鼠或大鼠)，其中非人类动物包含一个或多个编码如SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:56中所阐述的C1qb多肽的核酸序列。在一些实施例中，经基因修饰的非人类动物是小鼠，其包含编码如SEQ ID NO:11中所阐述的C1qb多肽的核酸。在一些实施例中，经基因修饰的非人类动物是大鼠，其包含编码如SEQ ID NO:56中所阐述的C1qb多肽的核酸。
在一个方面中，经基因修饰的非人类动物(例如啮齿动物，如小鼠或大鼠)包含核酸，其中编码人类C1qc多肽的球状头部或其片段的核酸序列至少编码如SEQ ID NO:6中所阐述的人类C1qc多肽的氨基酸118-234(例如，编码人类C1qc多肽的氨基酸114-245的核酸序列)。
本文中还公开经基因修饰的非人类动物(例如啮齿动物，如小鼠或大鼠)，其中非人类动物是大鼠且进一步包含至少编码SEQ ID NO:9中所阐述的大鼠C1qc多肽的氨基酸33-113、32-115或32-116的核苷酸序列，其可操作地连接到编码人类C1qc多肽的球状头部结构域或其片段的核酸序列，或其中非人类动物是小鼠且进一步包含至少编码SEQ ID NO:3中所阐述的小鼠C1qc多肽的氨基酸31-111、30-113或30-114的核苷酸序列，其可操作地连接到编码人类C1qc多肽的球状头部结构域或其片段的核酸序列。
在一个方面中，经基因修饰的非人类动物包含一个或多个至少编码如SEQ ID NO:12中所阐述的C1qc多肽的氨基酸30-246的核酸序列，或一个或多个至少编码如SEQ ID NO:57中所阐述的C1qc多肽的氨基酸32-248的核酸序列。在特定方面中，本文中公开经基因修饰的非人类动物(例如啮齿动物，如小鼠或大鼠)，其中非人类动物包含一个或多个编码如SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:57中所阐述的C1qc多肽的核酸序列。在一些实施例中，经基因修饰的非人类动物是小鼠，其包含编码如SEQ ID NO:12中所阐述的C1qc多肽的核酸。在一些实施例中，经基因修饰的非人类动物是大鼠，其包含编码如SEQ ID NO:57中所阐述的C1qb多肽的核酸。
在一些方面，存在信号序列的多肽的表达是有利的。所公开的多肽和所公开的编码所述多肽的核酸可以包含信号序列或不具有信号序列。因此，在一个方面中，本文中公开经基因修饰的非人类动物(例如啮齿动物，如小鼠或大鼠)，其中非人类动物以可操作的连接形式进一步包含编码大鼠、小鼠或人类C1qa、C1qb和/或C1qc信号肽的核苷酸序列。来自大鼠、小鼠和人类C1qa、C1qb和C1qc多肽的信号肽的实例展示于图3A-3C中。举例来说，本文中公开非人类动物，其以可操作的连接形式包含核酸序列，所述核酸序列分别包含大鼠或小鼠C1qa、C1qb和/或C1qc基因的信号肽编码部分，且至少包含编码人类C1qa、C1qb和/或C1qc多肽的球状头部结构域或其片段的核酸序列。
在一个方面中，本文中公开经基因修饰的非人类动物(例如啮齿动物，如小鼠或大鼠)，其在其基因组中包含：a)在内源性C1qa基因座处，编码嵌合大鼠/人类C1qa多肽的核酸序列，其中核酸序列包含(5'-3')编码SEQ ID NO:7的大鼠C1qa多肽的氨基酸1-111的第一核苷酸序列和编码SEQ ID NO:4的人类C1qa多肽的氨基酸112-245的第二核苷酸序列且与上述两个序列可操作地连接；b)在内源性C1qb基因座处，编码嵌合大鼠/人类C1qb多肽的核酸序列，其中核酸序列包含(5'-3')编码SEQ ID NO:8的大鼠C1qb多肽的氨基酸1-117的第三核苷酸序列和编码SEQ ID NO:5的人类C1qb多肽的氨基酸118-251的第四核苷酸序列且与上述两个序列可操作地连接；以及c)在内源性C1qc基因座处，编码嵌合大鼠/人类C1qc多肽的核酸序列，其中核酸序列包含(5'-3')编码SEQ ID NO:9的大鼠C1qc多肽的氨基酸1-116的第五核苷酸序列和编码SEQ ID NO:6的人类C1qc多肽的氨基酸114-245的第六核苷酸序列且与上述两个序列可操作地连接。在一个实施例中，这类经基因修饰的非人类动物是大鼠。
本文中还公开经基因修饰的非人类动物(例如啮齿动物，如小鼠或大鼠)，其在其基因组中包含：a)在内源性C1qa基因座处，编码嵌合小鼠/人类C1qa多肽的核酸序列，其中核酸序列包含(5'-3')编码SEQ ID NO:1的小鼠C1qa多肽的氨基酸1-111的第一核苷酸序列和编码SEQ ID NO:4的人类C1qa多肽的氨基酸112-245的第二核苷酸序列且与上述两个序列可操作地连接；b)在内源性C1qb基因座处，编码嵌合小鼠/人类C1qb多肽的核酸序列，其中核酸序列包含(5'-3')编码SEQ ID NO:2的小鼠C1qb多肽的氨基酸1-117的第三核苷酸序列和编码SEQ ID NO:5的人类C1qb多肽的氨基酸118-251的第四核苷酸序列且与上述两个序列可操作地连接；以及c)在内源性C1qc基因座处，编码嵌合小鼠/人类C1qc多肽的核酸序列，其中核酸序列包含(5'-3')编码SEQ ID NO:3的小鼠C1qc多肽的氨基酸1-114的第五核苷酸序列和编码SEQ ID NO:6的人类C1qc多肽的氨基酸114-245的第六核苷酸序列且与上述两个序列可操作地连接。在一个实施例中，这类经基因修饰的非人类动物是小鼠。
在一个态样中，本文中公开经基因修饰的非人类动物，其中非人类动物(例如大鼠或小鼠)不表达功能性内源性C1qa、C1qb和/或C1qc多肽。
在一些实施例中，非人类动物是哺乳动物。在一个方面中，非人类动物是例如跳鼠总科(Dipodoidea)或鼠总科(Muroidea)的小型哺乳动物。在一个实施例中，经基因修饰的动物是啮齿动物。在一个实施例中，啮齿动物是选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施例中，啮齿动物是选自鼠总科。在一个实施例中，经基因修饰的动物是来自选自以下的科：丽仓鼠科(Calomyscidae)(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(Cricetidae)(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠(New World rats and mice)、田鼠)、鼠科(Muridae)(真小鼠和大鼠、沙鼠、棘鼠、冠鼠)、马岛鼠科(Nesomyidae)(攀鼠、岩鼠、具尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠(Malagasy rats andmice))、刺睡鼠科(Platacanthomyidae)(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(Spalacidae)(例如鼹鼠、竹鼠和鼢鼠)。在特定实施例中，经基因修饰的啮齿动物是选自真小鼠或大鼠(鼠科)、沙鼠、棘鼠和冠鼠。在一个实施例中，经基因修饰的小鼠是来自鼠科的成员。在一个实施例中，动物是啮齿动物。在特定实施例中，啮齿动物是选自小鼠和大鼠。在一个实施例中，非人类动物是小鼠。
在一个实施例中，非人类动物是啮齿动物，其是选自以下的C57Bl品系的小鼠：C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola。在另一实施例中，小鼠是选自由以下组成的群组的129品系：129P1、129P2、129P3、129X1、129S1(例如12951/SV、129S1/SvIm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2品系(参见例如Festing等人(1999)《129品系小鼠的命名法修订版(Revised nomenclature forstrain 129mice)》,《哺乳动物基因组(Mammalian Genome)》10:836，还参见Auerbach等人(2000)《129/SvEv和C57BL/6衍生的小鼠胚胎干细胞系的建立和嵌合体分析(Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv-and C57BL/6-Derived MouseEmbryonic Stem Cell Lines)》)。在特定实施例中，经基因修饰的小鼠是前述129品系和前述C57BL/6品系的混合物。在另一特定实施例中，小鼠是前述129品系的混合物，或前述BL/6品系的混合物。在特定实施例中，混合物中的129品系是129S6(129/SvEvTac)品系。在另一实施例中，小鼠是BALB品系，例如BALB/c品系。在另一实施例中，小鼠是BALB品系与另一种前述品系的混合物。
在一个实施例中，非人类动物是大鼠。在一个实施例中，大鼠是选自威斯塔鼠(Wistar rat)、LEA品系、史泊格多利品系(Sprague Dawley strain)、费舍尔品系(Fischerstrain)、F344、F6和深灰鼠(Dark Agouti)。在一个实施例中，大鼠品系是两种或更多种选自由以下组成的群组的品系的混合物：威斯塔、LEA、史泊格多利、费舍尔、F344、F6和深灰鼠。
在一些实施例中，本文中公开的经基因工程改造的动物在其血清中表达包含一种或多种嵌合C1q多肽的人类化C1q蛋白质。在特定实施例中，动物在其血清中表达由嵌合C1qa、C1qb和C1qc多肽构成的C1q蛋白质，所述多肽各自包含基本上人类型球状头部结构域。在一些实施例中，经基因工程改造的动物的血清中的人类化C1q蛋白质的含量与未经人类化的对照动物中的C1q蛋白质的含量类似，如通过任何常规分析法(如蛋白质印迹(Western Blot)或ELISA)检测。“类似”意指差异在例如10％、20％、30％或40％以内的量和值。
在一些实施例中，在血清中表达人类化C1q蛋白质的经基因工程改造的动物显示补体活性。在一些实施例中，可以通过经典溶血分析法检测补体活性，如以下实例中进一步说明。在特定实施例中，经基因工程改造的动物在其血清中以与未经人类化的对照动物中的水平类似的水平显示经典溶血活性。在其它实施例中，可以在试管内补体依赖性细胞毒性(CDC)分析法中检测补体活性。在特定实施例中，包含人类化C1q蛋白质的经基因工程改造的动物的血清以与正常人类血清类似的水平显示CDC活性。
在另一个方面中,本文中提供用于制备本文中所描述的经基因修饰的非人类动物的方法。
在一些实施例中，所述方法包含修饰非人类动物的基因组，使得经修饰的基因组包含编码人类化C1q多肽(即，人类化C1qa、C1qb和/或C1qc多肽)的核酸分子。
在一些实施例中，经修饰的基因组包含编码嵌合C1q多肽的核酸，其中所述核酸位于与内源性C1q基因座不同的基因座。在某些实施例中，包含编码不同的人类化C1q多肽的多个核酸分子的相邻核酸片段位于与内源性C1q基因座不同的基因座。举例来说，包含编码人类化C1qa多肽的核酸序列、编码人类化C1qb多肽的核酸序列和编码人类化C1qc多肽的核酸序列的相邻核酸片段位于与内源性C1q基因座不同的基因座。
在一些实施例中，经修饰的基因组包含编码嵌合C1q多肽的核酸，其中所述核酸位于内源性C1q基因座。在某些实施例中，包含编码人类化C1qa多肽的核酸序列、编码人类化C1qb多肽的核酸序列和编码人类化C1qc多肽的核酸序列的相邻核酸片段位于内源性C1q基因座。
在一些实施例中，用于将编码嵌合C1q多肽的核酸引入内源性C1q基因座的修饰可以引起内源性C1q核苷酸序列被人类C1q核苷酸序列置换。在一个实施例中，置换包含C1qa、C1qb和C1qc的序列的置换。
人类化可以通过以下方式实现：产生大型靶向载体，其合并有基因修饰，例如一个、两个或全部三个C1q基因座中的基因修饰，且接着将所述大型靶向载体引入非人类(例如啮齿动物，如小鼠或大鼠)ES细胞，以产生非人类动物，如小鼠(例如实例1中所描述)或大鼠(例如实例2中所描述)。
因此，在一个实施例中，本文中提供用于制备本公开的经基因修饰的动物的大型靶向载体。在例示性实施例中，大型靶向载体包含5'和3'小鼠同源臂；包含C1qa基因的DNA片段，其包含由人类C1qa编码外显子3的部分序列进行的小鼠C1qa编码外显子3的部分序列的置换；包含C1qb基因的DNA片段，其包含由人类C1qb编码外显子3的部分序列进行的小鼠C1qb编码外显子3的部分序列的置换；包含C1qc基因的DNA片段，其包含由人类C1qc编码外显子3的部分序列进行的小鼠C1qc编码外显子3的部分序列的置换；以及选择盒。在另一个例示性实施例中，大型靶向载体包含5'和3'大鼠同源臂；包含C1qa基因的DNA片段，其包含由人类C1qa编码外显子3的部分序列进行的大鼠C1qa编码外显子3的部分序列的置换；包含C1qb基因的DNA片段，其包含由人类C1qb编码外显子3的部分序列进行的大鼠C1qb编码外显子3的部分序列的置换；包含C1qc基因的DNA片段，其包含由人类C1qc编码外显子3的部分序列进行的大鼠C1qc编码外显子3的部分序列的置换；以及选择盒。
在一些实施例中，大型靶向载体是经基因修饰的细菌人工染色体(BAC)无性系。携带非人类(例如啮齿动物)C1qa、C1qb和C1qc基因中的一个或多个的BAC无性系可以使用细菌同源重组和
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技术修饰和人类化(参见例如U.S.6,586,251和Valenzuela等人(2003),《与高分辨率表达分析偶合的小鼠基因组的高通量工程改造(High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolutionexpression analysis)》,《自然生物技术(Nature Biotech)》.21(6):652-659)。在其中BAC无性系包含超过一种非人类C1q基因(例如，非人类C1qa、C1qb和C1qc基因的组合)的实施例中，可以通过连续细菌同源重组来依序修饰多种非人类C1q基因。因此，从原始BAC无性系删除非人类C1q核苷酸序列且插入人类C1q核苷酸序列，产生由5'和3'非人类同源臂侧接的携带一种或多种人类化C1q基因的经修饰的BAC无性系。
选择盒是插入靶向构筑体以促进整合相关构筑体的细胞(例如细菌细胞、ES细胞)的选择的核苷酸序列。所属领域中已知多种合适的选择盒(Neo、Hyg、Pur、CM、SPEC等)。此外，选择盒可以通过重组位点侧接，所述重组位点允许在用重组酶处理时删除选择盒。常用的重组位点是loxP和Frt，分别由Cre和Flp酶识别，但所属领域中已知其它重组位点。选择盒可位于编码区外的构筑体中的任何位置。在一个实施例中，在所插入的人类C1qa序列的上游插入选择盒。
可以通过已知技术(例如电致孔)将大型靶向载体(如经修饰的BAC无性系)引入非人类(例如啮齿动物)胚胎干(ES)细胞。所属领域中已描述小鼠ES细胞和大鼠ES细胞。参见例如US 7,576,259、US 7,659,442、US 7,294,754和US 2008-0078000 A1(其都以引用的方式并入本文中)描述小鼠ES细胞和用于制备经基因修饰的小鼠的
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方法；US 2014/0235933 A1、US 2014/0310828 A1、Tong等人(2010)《自然(Nature)》467:211-215和Tong等人(2011)《自然实验手册(Nat Protoc)》.6(6):doi:10.1038/nprot.2011.338(其都以引用的方式并入本文中)描述大鼠ES细胞和用于制备经基因修饰的大鼠的方法。在一些实施例中，引入经修饰的BAC无性系的受体ES细胞包含内源性C1q基因座处的核苷酸序列的缺失。在一些实施例中，缺失包含C1qa、C1qb和C1qc基因中的一个或多个的编码区。在特定实施例中，缺失包含所有C1qa、C1qb和C1qc基因的编码区；例如，包含C1qa的起始密码子到C1qb的终止密码子的缺失。在一些实施例中，受体ES细胞对于内源性C1q基因座处的缺失来说是杂合的。在其它实施例中，受体ES细胞对于内源性C1q基因座处的缺失来说是纯合的。
在完成基因靶向后，筛选ES细胞或经基因修饰的非人类动物以确认成功地并入相关外源性核苷酸序列或表达外源性多肽。所属领域的技术人员已知多种技术，且包括(但不限于)DNA印迹(Southern blotting)、长PCR、定量PCR(例如使用TAQMAN的实时PCR)、荧光原位杂交、RNA印迹(Northern blotting)、流式细胞测量术、威斯登分析(Westernanalysis)、免疫细胞化学、免疫组织化学等。在一个实例中，具有相关基因修饰的非人类动物(例如小鼠)可以通过使用以下文献中描述的等位基因修饰分析法，针对小鼠等位基因的损失和/或人类等位基因的增加进行筛选来鉴别：Valenzuela等人(2003)《与高分辨率表达分析偶合的小鼠基因组的高通量工程改造》,《自然生物技术》21(6):652-659。所属领域的技术人员已知其它用于鉴别经基因修饰的动物中的特定核苷酸或氨基酸序列的分析法。接着，使用所选择的ES细胞作为供体ES细胞，以通过使用
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方法(参见例如US 7,576,259、US 7,659,442、US 7,294,754和US2008-0078000A1)或US 2014/0235933A1和US 2014/0310828 A1中描述的方法注射到桑椹体前期胚胎(例如8细胞期胚胎)中。培育包含供体ES细胞的胚胎直到囊胚期，且接着植入代孕母体以产生F0啮齿动物。可以使用非人类等位基因的损失和/或人类等位基因的增加分析法，通过从剪下的尾部片段分离的DNA的基因分型来鉴别具有人类化C1q基因的幼鼠。对于人类化C1q基因来说是杂合的非人类动物可以杂交以产生纯合后代。
在一个方面中，提供一种用于制备嵌合人类/非人类C1q分子的方法，其包含在单细胞中表达如本文中所描述的来自核苷酸构筑体的嵌合C1q蛋白质。在一个实施例中，核苷酸构筑体是病毒载体；在特定实施例中，病毒载体是慢病毒载体。在一个实施例中，细胞是选自CHO、COS、293、HeLa和表达病毒核酸序列的视网膜细胞(例如PERC.6TM细胞)。
在一个方面中，提供表达嵌合人类/非人类C1q蛋白质的细胞。在一个实施例中，细胞包含表现载体，其包含如本文中所描述的嵌合C1q序列。在一个实施例中，细胞是选自CHO、COS、293、HeLa和表达病毒核酸序列的视网膜细胞(例如PERC.6TM细胞)。
还提供由如本文中所描述的非人类动物制得的嵌合C1q分子，其中，在一个实施例中，嵌合C1q分子包含人类C1qa、C1qb和/或C1qc多肽的全部或实质上全部球状头部结构域的氨基酸序列，和来自非人类C1q蛋白质(例如小鼠C1q蛋白质)的至少干和/或茎结构域。
除经基因工程改造的非人类动物以外，还提供非人类胚胎(例如啮齿动物，例如小鼠或大鼠胚胎)，其中胚胎包含如上文所公开制得或来源于如本文中所描述的非人类动物(例如啮齿动物，例如小鼠或大鼠)的供体ES细胞。在一个方面中，胚胎包含ES供体细胞(其包含嵌合C1q基因)和宿主胚胎细胞。
还提供一种组织，其中所述组织是来源于如本文中所描述的非人类动物(例如啮齿动物，例如小鼠或大鼠)且表达嵌合C1q蛋白质。在一些实施例中，组织是选自血液、血浆、血清、骨髓、脾、淋巴结、脑和其组合。
此外，提供从如本文中所描述的非人类动物分离的非人类细胞。在一个实施例中，细胞是ES细胞。在一个实施例中，细胞是树突状细胞。
F.用于测试人类疗法的啮齿动物模型
研究C1q分子作为双特异性药剂(例如双特异性抗体)的目标，其中一个臂结合人类C1q且另一个结合相关抗原。
在临床前药物研发阶段期间，通常基于候选药剂的功效、毒性以及其它药物动力学和药效学特性来研究候选药剂。候选药剂，如抗体，通常靶向人类抗原，因为研究的最终目标是研发人类疗法。在大型动物(如灵长类动物)中进行许多临床前研究，因为其生理学和药物代谢最类似于人类。为了进行与药物候选物的功效、毒性和其它参数相关的有效临床前研究，首先，必须确定药物候选物以识别灵长类动物C1q分子。
然而，使抗C1q疗法的研发复杂化的单独因素是大型灵长类动物(如黑猩猩)是濒危的，并且在许多国家禁止用黑猩猩进行研究；而在其它灵长类动物，例如食蟹猕猴(长尾猕猴(Macaca fascicularis))中的研究可能引起伦理问题。因此，可以在较小动物模型(如啮齿动物，例如小鼠)中获得的任何关于特定治疗候选物的初步数据都可以有助于确定大型灵长类动物中的临床前研究的进一步进展。
最适用于进行初步研究的小型动物模型是非人类动物，例如啮齿动物，其表达人类或人类化C1q蛋白质，且允许测试还靶向例如肿瘤抗原、病毒抗原或细菌抗原(例如葡萄球菌抗原)的抗C1q药物候选物。
因此，在一些方面中，本文中提供用于测试靶向C1q(“抗C1q”)的治疗剂的啮齿动物模型(例如小鼠或大鼠模型)。在一些实施例中，本文中提供用于测试抗C1q抗原结合蛋白的啮齿动物模型(例如小鼠或大鼠模型)。在一些实施例中，本文中提供用于测试抗C1q抗体的啮齿动物模型(例如小鼠或大鼠模型)。在一些这类实施例中，提供用于测试抗C1q多特异性(例如双特异性)抗原结合蛋白或抗C1q双特异性抗体的啮齿动物模型。因此，抗C1q多特异性抗原结合蛋白(例如抗C1q双特异性抗原结合蛋白)靶向或特异性结合所述人类化C1q多肽或人类化C1q复合物和至少一种其它相关抗原。在各种方面中，用于测试抗C1q双特异性抗原结合蛋白(其中所述抗原结合蛋白质能够结合人类化C1q复合物(其中复合物的一个或多个C1qa、C1qb和/或C1qc多肽被人类化)和相关抗原)的啮齿动物模型包含编码人类化C1q复合物的核酸序列，其中人类化C1q多肽是选自由以下组成的群组：C1qa、C1qb、C1qc和/或其组合，和表达或包含相关抗原的细胞。在一个实施例中，啮齿动物包含表达所述人类化C1q蛋白质的树突状细胞。
关于免疫球蛋白核酸序列的术语“生殖系”包括可以传递给后代的核酸序列。
短语“免疫球蛋白分子”包括两个免疫球蛋白重链和两个免疫球蛋白轻链。重链可以一致或不同，且轻链可以一致或不同。
如本文中所使用，术语“抗原结合蛋白”包括能够结合相关抗原的抗体和各种天然产生和经工程改造的分子。这类物质包括例如结构域特异性抗体、单结构域抗体(例如来源于骆驼和鱼等)、结构域缺失抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、微型抗体、纳米抗体(例如单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小型模块免疫药物(SMIP)、鲨鱼可变IgNAR结构域、T细胞受体分子和包含T细胞受体可变域和其片段的分子等。抗原结合蛋白还可以包括抗原结合片段，例如(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；以及(vii)由模拟抗体的高变区(例如经分离的互补决定区(CDR)，如CDR3肽)的氨基酸残基组成的最小识别单位等。
如本文中所使用，术语“抗体”包括免疫球蛋白分子，其包含通过二硫键相互连接的四条多肽链(两条重(H)链和两条轻(L)链)。每条重链包含重链可变域和重链恒定区(CH)。重链恒定区包含三个结构域，CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变域和轻链恒定区(CL)。重链和轻链可变域可以进一步细分成高变区，称为互补决定区(CDR)，其间穿插有保守性更高的区域，称为构架区(FR)。每个重链和轻链可变域包含三个CDR和四个FR，其从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(重链CDR可以简称为HCDR1、HCDR2和HCDR3；轻链CDR可以简称为LCDR1、LCDR2和LCDR3)。
如本文中所使用，“结合C1q的抗体”或“抗C1q抗体”包括特异性识别单个C1q子单元(例如C1qa、C1qb和/或C1qc)的抗体和其抗原结合片段，以及特异性识别两个C1q子单元的二聚复合物(例如C1qa/C1qb，和C1qc/C1qc二聚体)以及二聚体的三聚体的抗体和其抗原结合片段。抗体和抗原结合片段还可以结合可溶性C1q和/或IgM或IgG结合的C1q。
术语“高亲和力”抗体或抗原结合蛋白是指对其目标表位具有以下KD的抗体：约10-9M或更低(例如约1×10-9M、1×10-10M、1×10-11M或约1×10-12M)。
短语“双特异性抗体”或“双特异性抗原结合蛋白”包括能够选择性地结合两个表位的抗体或抗原结合蛋白。双特异性抗体通常包含两个臂，其各自结合不同的表位(例如，两条具有不同特异性的重链)，所述表位在两个不同的分子上(例如，两个不同的免疫原上的不同表位)或在相同分子上(例如，相同免疫原上的不同表位)。如果双特异性抗体或抗原结合蛋白能够选择性地结合两个不同的表位(第一表位和第二表位)，那么第一抗体臂对第一表位的亲和力将通常比第一抗体臂对第二表位的亲和力低至少一个到两个或三个或四个或更多个数量级，且反之亦然。由双特异性抗体特异性结合的表位可以在相同或不同目标上(例如在相同或不同蛋白质上)。例示性双特异性抗体包括具有对C1q具有特异性的第一抗体臂和对相关抗原(例如，感染性试剂的抗原)具有特异性的第二抗体臂的抗体。可以例如通过组合识别相同免疫原的不同表位的重链来制备双特异性抗体。举例来说，编码识别相同免疫原的不同表位的重链可变序列的核酸序列可以与编码相同或不同重链恒定区的核酸序列融合，并且这类序列可以在表达免疫球蛋白轻链的细胞中表达。典型双特异性抗体具有两条重链，其各自具有三个重链CDR，接着(N端到C端)是CH1结构域、铰链、CH2结构域和CH3结构域，以及满足以下条件的免疫球蛋白轻链：不赋予表位结合特异性，但可以与每条重链结合，或可以与每条重链结合且可以结合一个或多个由重链表位结合区结合的表位，或可以与每条重链结合且使一条或两条重链能够与一个或两个表位结合。类似地，短语“多特异性抗体”包括能够选择性地结合多个表位(例如两个、三个、四个表位)的抗体。
短语“互补决定区”或术语“CDR”包括由生物体的免疫球蛋白基因的核酸序列编码的氨基酸序列，所述免疫球蛋白基因通常(即，在野生型动物中)出现在免疫球蛋白分子的轻链或重链的可变区中的两个构架区之间。CDR可以由例如生殖系序列或者重排或未重排序列，以及例如未处理或成熟B细胞编码。CDR可以是体细胞突变(例如，不同于在动物的生殖系中编码的序列)、人类化和/或由氨基酸取代、添加或缺失修饰。在一些情况下(例如对于CDR3)，CDR可以由两个或更多个序列(例如，生殖系序列)编码，所述两个或更多个序列是不相邻的(例如，在未重排的核酸序列中)，但在B细胞核酸序列中是邻接的，例如由于剪接或连接序列(例如，V-D-J重组以形成重链CDR3)。
短语“功能性片段”包括抗原结合蛋白(如抗体)的片段，其可以被表达、分泌和以微摩尔、纳摩尔或皮摩尔范围内的KD特异性结合于表位。特异性识别包括具有至少在微摩尔范围、纳摩尔范围或皮摩尔范围内的KD。
如“免疫球蛋白重链”中的短语“重链”包括来自任何生物体的免疫球蛋白重链序列，包括免疫球蛋白重链恒定区序列。除非另外说明，否则重链可变域包括三个重链CDR和四个FR区。重链的片段包括CDR、CDR和FR以及其组合。典型重链在可变域之后具有(从N端到C端)CH1结构域、铰链、CH2结构域和CH3结构域。重链的功能性片段包括能够特异性识别表位(例如，以微摩尔、纳摩尔或皮摩尔范围内的KD识别表位)、能够由细胞表达和分泌以及包含至少一个CDR的片段。重链可变域是由可变区基因序列编码，所述可变区基因序列通常包含来源于生殖系中的VH、DH和JH区段的谱系的VH、DH和JH区段。各种生物体的V、D和J重链区段的序列、位置和命名法可以见于国际免疫遗传学信息系统(International ImmunogeneticsInformation System)(IMGT数据库)的网站上。
如“免疫球蛋白轻链”中的短语“轻链”包括来自任何生物体的免疫球蛋白轻链序列，且除非另外说明，否则包括人类κ和λ轻链和VpreB，以及替代性轻链。除非另外说明，否则轻链可变域通常包括三个轻链CDR和四个构架(FR)区。通常，全长轻链从氨基端到羧基端包括可变域和轻链恒定区，所述可变域包括FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。轻链可变域是由轻链可变区基因序列编码，所述轻链可变区基因序列通常包含来源于生殖系中的V和J区段的谱系的VL和JL区段。各种生物体的V和J轻链区段的序列、位置和命名法可以见于国际免疫遗传学信息系统(IMGT数据库)的网站上。轻链包括例如不选择性地结合由其存在的抗原结合蛋白(例如抗体)识别的任何表位的轻链。轻链还包括结合和识别或帮助重链结合和识别由所述轻链存在的抗原结合蛋白(例如抗体)选择性结合的一个或多个表位的轻链。
在各种实施例中，抗原结合蛋白结合C1q和相关抗原。
在另一实施例中，使用啮齿动物模型确定候选双特异性抗原结合蛋白是否能够阻断或影响相关抗原，所述相关抗原是感染性疾病相关抗原。在一个实施例中，用感染性试剂感染啮齿动物。在一个实施例中，感染性疾病相关抗原是病毒抗原。
在另一实施例中，其中相关抗原是感染性疾病相关抗原，相关抗原是细菌抗原。在一些方面中，细菌抗原是葡萄球菌抗原。
在一些方面中，基于C1q的双特异性抗原结合蛋白是基于人类C1q的抗原结合蛋白。在一个实施例中，抗原结合蛋白是抗体，例如人类抗体，或其抗原结合片段。
在一些实施例中，使用本文中公开的经基因工程改造的动物在体内进行具有一个靶向人类C1q的臂和另一个靶向感染性疾病相关抗原(如金黄色葡萄球菌(S.aureus))的臂的双特异性抗体的测试，所述经基因工程改造的动物表达人类化C1q，所述人类化C1q在其C1qa、C1qb和C1qc多肽链中的每一个中具有人类型或基本上人类型球状头部结构域。可以用感染性疾病相关抗原(如金黄色葡萄球菌)感染动物，且可以在这类动物中评估双特异性抗体，例如降低细菌负荷和/或改善存活期的能力。
G.经基因修饰的非人类动物的用途
还公开各种使用本文中所描述的经基因修饰的非人类动物的方法。
在一个实施例中，本文中提供用于筛选靶向相关抗原的治疗性药物候选物的方法，其包含(a)提供或接收经基因修饰的啮齿动物(如小鼠或大鼠)，其在其内源性啮齿动物C1q基因座处包含编码嵌合、人类化C1qa多肽、C1qb多肽和/或C1qc多肽和/或其任何组合的核酸序列，(b)将相关抗原引入所述经基因修饰的啮齿动物，(c)使所述啮齿动物与相关药物候选物接触，其中所述药物候选物是针对人类C1q和相关抗原，和(d)分析药物候选物是否有效预防、减少或消除特征在于相关抗原的存在或表达的细胞或病毒。在各种实施例中，啮齿动物表达功能性人类化C1q复合物。在所述方法的一个实施例中，经基因修饰的啮齿动物在内源性啮齿动物C1q基因座处包含编码以下的核酸序列：包含基本上人类型球状头部结构域的嵌合C1qa多肽、包含基本上人类型球状头部结构域的嵌合C1qb多肽和包含基本上人类型球状头部结构域的嵌合C1qc多肽。在本文中所描述的方法的一个实施例中，啮齿动物不包含编码相应啮齿动物蛋白质的功能性球状头部结构域的核酸序列。
在本文中所描述的方法的各种实施例中，将相关抗原引入本文中所描述的经基因修饰的啮齿动物可以通过所属领域的技术人员已知的任何方法实现，所述方法可以包括(但不限于)转基因、注射、感染、组织或细胞移植。因此，引入可以通过在啮齿动物中表达相关抗原来实现，其可以包含基因修饰所述啮齿动物以表达相关抗原。或者，引入可以包含将表达相关抗原的细胞引入所述啮齿动物，例如在细胞或组织移植中。引入还可以包含用相关抗原感染所述啮齿动物，例如在细菌或病毒感染中。在一个实施例中，相关抗原可以是相关人类抗原。在另一实施例中，其可以是相关细菌或病毒抗原。相关抗原可以是肿瘤相关抗原或感染性疾病相关抗原，例如细菌或病毒抗原，如上文详细描述。
在另一实施例中，本文中提供用于评估或筛选靶向相关抗原的治疗性药物候选物的方法，其包含混合表达相关抗原的细胞或病毒与(i)相关药物候选物，其中药物候选物是针对人类C1q和相关抗原，和(ii)本文中所描述的经基因修饰的啮齿动物的血液样品(例如全血样品)，和(b)分析以确定药物候选物是否有效减少或消除特征在于相关抗原的存在或表达的细胞或病毒。可以基于测量例如与对照性药物或完全无药物相比，在使用药物候选物时的细胞或病毒的存活百分比来进行确定。相关抗原可以是肿瘤相关抗原或感染性疾病相关抗原，例如细菌或病毒抗原，如上文详细描述。在一些实施例中，相关抗原是细菌抗原，如葡萄球菌抗原。在一些实施例中，细胞是细菌细胞，如葡萄球菌细胞。
在筛选治疗性药物候选物的方法的各种实施例中，药物候选物可以是抗原结合蛋白，例如抗体，例如双特异性抗体。在各种方面中，这类药物候选物能够结合人类C1q和相关抗原。相关抗原可以是人类抗原。相关抗原还可以是灵长类动物(例如猴)抗原。因此，除结合人类C1q以外，用于筛选的药物候选物可能能够结合人类抗原和相应的灵长类动物抗原。药物候选物还可能能够结合灵长类动物(例如猴)C1q。因此，药物候选物可能能够结合人类和灵长类动物(例如猴)C1q；并且在一个实施例中，还能够结合相关人类抗原。在另一实施例中，相关抗原可以是细菌或病毒抗原，并且药物候选物可能能够结合人类和灵长类动物(例如猴)C1q和相关抗原(例如，病毒或细菌抗原)。
在本文中所描述的方法的各种实施例中，治疗性候选物能够减轻、消除或预防疾病。在一个实施例中，疾病是肿瘤，并且与不靶向相关抗原的药剂相比，治疗性候选物能够降低、消除或预防肿瘤生长。在所述方法的这类实施例中，可以使用以下来进行关于药物候选物是否有效预防、减少或消除特征在于相关抗原的存在或表达的细胞的确定：肿瘤体积分析法、肿瘤细胞杀伤分析法、诱导肿瘤中的凋亡标记物、降低肿瘤中的血管生长、免疫细胞浸润到肿瘤中等。在另一实施例中，疾病是感染性疾病，并且与不靶向相关抗原的药剂相比，治疗性候选物能够降低、消除或预防细菌或病毒感染。在所述方法的这类实施例中，可以使用以下来进行关于药物候选物是否有效预防、减少或消除特征在于相关抗原的存在或表达的细胞或病毒的确定：测量细菌或病毒效价、诱导受感染的细胞中的凋亡标记物等，或通过使用血液样品(例如，全血样品)测量细菌细胞或病毒的存活期。
除评估具有一个靶向人类化C1q蛋白质的臂和另一个靶向相关抗原的臂的双特异性抗体以外，本文中公开的表达人类化C1q蛋白质的经基因工程改造的非人类动物适用于评估其它抗体(例如具有人类Fc区的单特异性抗体(如人类抗体))的作用。人类化C1q与抗体的人类Fc区的结合可以活化经典补体路径，其产生补体依赖性细胞毒性(CDC)。难以评估抗体是否对受体的补体系统具有影响，或补体系统的作用是否可以引起治疗抗体的功效或补体系统的作用可以引起的治疗抗体的功效的程度。本文中公开的表达人类化C1q的经基因工程改造的非人类动物将允许评估具有人类Fc区的抗体(例如，人类抗体)是否能够活化经典补体路径，且这类评估的结果将更准确地反映当给予人类患者时，这类抗体是否将活化经典补体路径。
因此，在另一个方面中,本文中公开通过利用本文中公开的表达人类化C1q蛋白质的经基因工程改造的非人类动物(例如啮齿动物，如小鼠或大鼠)来评估包含人类Fc区的抗体是否可以活化经典补体路径的方法。
在一些实施例中，所述方法利用在细胞表面上表达相关抗原的细胞、包含人类Fc区且针对相关抗原的候选抗体和来自表达人类化C1q蛋白质的经基因工程改造的非人类动物的血清样品，并且被设计成评估表达相关抗原的细胞的试管内补体依赖性细胞毒性。在特定实施例中，细胞首先与候选抗体混合，以使抗体结合于在细胞表面上表达的相关抗原；接着，向细胞-抗体混合物中添加血清样品以实现血清样品中的C1q蛋白质与结合于细胞上的相关抗原的抗体的结合。接着，可以使用流式细胞测量术方法或预装载的放射性同位素从目标细胞的释放，使用易于获得的试剂(包括来自商业来源的试剂，例如来自Promega的CytoTox-GloTM试剂)测量细胞毒性(即，所述细胞的杀伤)。可以比较使用来自表达人类化C1q蛋白质的人类化非人类动物的血清样品的细胞毒性与来自未经人类化的对照性非人类动物的血清样品(阴性对照)和人类血清样品(阳性对照)。
在一些实施例中，适用于这种方法的细胞包括Raji细胞、Ramos细胞、Daudi细胞、HEK293细胞和A431细胞。在一些实施例中，在本发明的方法中使用Raji细胞、Ramos细胞或Daudi细胞。细胞可以天然地在细胞表面上表达相关抗原，或可以经修饰以在细胞表面上以重组方式表达相关抗原。
在一些实施例中，候选抗体是针对肿瘤抗原、细菌或病毒抗原等的人类抗体。候选抗体的实例包括例如抗CD20等。
在一些实施例中，通过比较候选抗体在C1q人类化动物中与在C1q基因敲除动物中的作用，在体内进行用于评估包含人类Fc区的抗体是否可以活化经典补体路径的方法。为了排除所述作用是由ADCC(相对于CDC)引起，可以耗尽动物中的NK细胞、嗜中性白血球和巨噬细胞，保留完整的补体系统。
实例
提供以下实例以便向所属领域的一般技术人员提供如何制造和评估本文所要求的化合物、组合物、制品、装置和/或方法的完整公开和说明，并且旨在单纯作为示例而非意图限制本公开。已经作出努力以确保关于数字(例如量、温度等)的准确性，但应该允许一些误差和偏差。除非另外指示，否则部分是指重量份，温度是以C计或是在环境温度下，且压力是处于或接近大气压。
实例1.产生人类化C1q小鼠
可以根据NCBI寄存编号NC_000070.6发现C1q基因的小鼠基因组序列，且C1q基因座位于小鼠染色体4D3(参考GRCm38.p4C57BL/6J)。可以根据NCBI寄存编号NG_007281.1、NG_007283.1和NG_007565.1发现C1q基因的人类基因组序列，且C1q基因座位于人类染色体1p36.1。人类和小鼠C1q的基因组和氨基酸序列的一些实例列举于以下表1和2中。指示所列举的SEQ ID NO边界中的所预测的信号肽。图3A-3C中也将信号肽边界加框。
表1：小鼠C1q序列的GeneBank寄存编号
Figure SMS_4
表2：人类C1q序列的GeneBank寄存编号
Figure SMS_5
简单来说，为了产生嵌合C1q小鼠，通过使用小鼠BAC文库Mouse BAC ES第2版(Incyte Genomics，pBeloBAC11中的129/SvJ)，使用
Figure SMS_6
技术(参见例如美国专利案第6,586,251号和Valenzuela等人(2003)《与高分辨率表达分析偶合的小鼠基因组的高通量工程改造》,《自然生物技术》21(6):652-659，其都以引用的方式并入本文中)由人类和小鼠细菌人工染色体(BAC)DNA构筑独特靶向载体来人类化小鼠C1q基因座。修饰来自小鼠BAC无性系302p21的DNA，以分别用人类C1qa、C1qb和C1qc的相应部分(人类C1q基因在人类染色体1的正链上彼此极紧密的定位)置换小鼠C1qa、C1qb和C1qc的基因组DNA编码部分(小鼠C1q基因在小鼠染色体4的反链上彼此极紧密的定位)。
通过引入人类C1q序列来修饰小鼠C1q BAC，以产生包含人类化C1qa、C1qb和C1qc基因的BAC。分别用相应的基本上编码人类C1qa、C1qb和C1qc球状结构域的序列置换基本上编码小鼠C1qa、C1qb和C1qc球状结构域的序列。人类和小鼠C1q(和大鼠)蛋白质序列的比对描绘于图3A、B和C中，其中球状头部的边界如所指示，且小鼠/人类基因的边界用箭头指示。人类化小鼠C1qa、C1qb和C1qc蛋白质的氨基酸序列分别阐述于SEQ ID NO:10、11和12中，且列举于以下表3中，其中小鼠序列用斜体表示。
表3：嵌合小鼠/人类C1q蛋白质的氨基酸序列
Figure SMS_7
实例1.1.产生C1q基因敲除小鼠
详细地说，首先，修饰包含所有三种C1q基因的小鼠C1q基因座以删除包含编码小鼠C1q的基因的17.6kB核苷酸序列(参见图1A)。通过细菌同源重组将包含LacZ-neo盒、20Kb5'同源臂和55kb 3'同源臂的靶向载体引入小鼠BAC 302p21，使得删除从C1qa ATG到C1qb终止密码子的包含所有三种小鼠C1q基因的17.6Kb核苷酸序列。删除从刚好在起始ATG之后的C1qa外显子2跨越到终止密码子后的C1qb外显子3，包括C1qb 3'UTR中的19bp。插入盒使得LacZ编码序列与C1qa ATG密码子同框。LacZ编码序列之后是SV40聚腺苷酸化位点，接着是由小鼠磷酸甘油酸激酶1(Pgk1)启动子用Pgk1聚腺苷酸化信号控制的条件性基因敲除(floxed)新霉素抗性盒。使用所得载体对小鼠ES细胞进行电致孔以产生经修饰的ES细胞，以用于产生缺乏内源性C1q基因座的小鼠。在图1C中的第二示意图中标记缺失的基因座中的各种接合区的序列，且相应的核酸序列列举于以下表4中。在本实例中的表格中展示的接合区仅列举短核苷酸序列，但为所属领域的技术人员指引小鼠基因组中的序列插入位置。
表4：小鼠C1q基因敲除基因座的接合序列
Figure SMS_8
通过定量TAQMANTM分析法(参见例如Lie和Petropoulos,1998.《当前生物技术观点(Curr.Opin.Biotechnology)》9:43-48，其以引用的方式并入本文中)，一种等位基因修饰分析法(MOA)，来鉴别含有小鼠C1q序列缺失的ES细胞。设计特异性引物集合和探针以用于检测盒序列的插入(等位基因增加，GOA)和小鼠序列的缺失(等位基因损失，LOA)。表5鉴别定量PCR分析法中使用的引物/探针集合中的每一个的名称和位置。
表5：用于MOA分析法以确认小鼠C1q基因座的缺失的引物和探针
Figure SMS_9
Figure SMS_10
使用上文所描述的目标ES细胞作为供体ES细胞且通过
Figure SMS_11
方法引入8细胞期小鼠胚胎(参见例如美国专利案第7,294,754号和Poueymirou等人(2007)《实现即时表型分析的基本上完全来源于供体基因靶向的ES细胞的F0代小鼠(F0 generationmice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cellsallowing immediate phenotypic analyses)》,《自然生物技术(Nature Biotech.)》25(1):91-99)。使用等位基因修饰分析法(参见上文，其检测是否不存在小鼠C1q基因序列)，通过基因分型来鉴别独立地具有小鼠C1q缺失的/>
Figure SMS_12
(完全来源于供体ES细胞的F0小鼠)。包含缺失的小鼠C1q基因座的经修饰的小鼠ES细胞(小鼠C1q KO HET ES细胞)用于如下文所描述的人类化C1q构筑。
这一方法中使用的选择盒可以通过所属领域的技术人员已知的方法去除。举例来说，可以用表达Cre的构筑体转染具有C1q基因敲除基因座的ES细胞，以去除条件性基因敲除盒。可以任选地通过培育到表达Cre重组酶的小鼠中来去除选择盒。任选地，选择盒保留在小鼠中。
实例1.2.产生人类化C1q小鼠
为了产生人类化小鼠C1q，使用C1q球状头部结构域序列(与以下实例中用于人类化C1q大鼠相同的序列)和重叠小鼠序列，由In-Fusion HD Cloning KitsTM(Clontech)产生供体质体。对于C1qb人类化构筑体，通过人类C1qb polyA序列下游的限制消化来插入loxP-Ub-Hyg选择盒。对于C1qa和C1qc构筑体，通过每个C1qa和C1qc polyA序列下游的限制消化来插入壮观霉素(Spec)选择盒。通过细菌同源重组将所得构筑体依序引入小鼠C1q BAC(302p21)，接着进行选择和/或消化步骤以去除选择盒，如图1B中说明。在这一具体实施例中，首先引入C1qb的嵌合核酸序列(图中的1)，接着引入嵌合C1qc DNA(图中的2)，且接着引入嵌合C1qa DNA(图中的3)。
将含有所有三种嵌合C1q基因的大型靶向载体电致孔到小鼠C1qKO HET ES细胞中，如图1C所描绘，且通过上文所描述的
Figure SMS_13
实时基于PCT的等位基因修饰(MOA)分析法来确认成功整合。用于MOA分析法的引物和探针以及其位置描述于表6中。
表6：用于MOA分析法以确认是否存在嵌合小鼠/人类C1q基因的引物和探针
Figure SMS_14
嵌合基因座处的各种经基因工程改造的组分之间的接合序列描绘于以下表7中，且在图1C中的底部示意图上指示。在本实例中的表格中展示的接合区仅列举短核苷酸序列，但为所属领域的技术人员指引小鼠基因组中的序列插入位置。
表7：嵌合人类/小鼠C1q基因座的接合序列
Figure SMS_15
/>
Figure SMS_16
使用上文所描述的目标ES细胞作为供体ES细胞且通过上文所描述的
Figure SMS_17
方法引入8细胞期小鼠胚胎。使用等位基因修饰分析法(参见上文)，通过基因分型来鉴别独立地具有人类化C1q基因的/>
Figure SMS_18
所述分析法检测是否存在独特的人类C1q基因序列。将包含C1q基因的杂合修饰的小鼠培育成纯合性。
为了在无潮霉素抗性盒的情况下产生ES细胞，将含有cre重组酶编码序列的质体电致孔到小鼠C1q KO HET ES细胞中且使用表6中描绘的引物和探针，通过TaqMan分析法针对潮霉素抗性盒的损失来筛选所得ES细胞无性系。接着，将所选择的无性系微注射到如上文所描述的8细胞期小鼠胚芽中且将所得小鼠培育成纯合性。所得被表达的嵌合蛋白质展示于以上表3和序列表中。
实例2.产生人类化C1q大鼠
可以根据NCBI寄存编号NC_005104.4发现C1q基因的大鼠基因组序列，且C1q基因座位于大鼠染色体5(参考Rnor_6.0主要组件)。可以根据NCBI寄存编号NG_007283.1、NG_007282.1和NG_007565.1发现C1q基因的人类基因组序列，且C1q基因座位于人类染色体1p36.1。大鼠和人类C1q的基因组和氨基酸序列的一些实例分别列举于表8和2中。指示所列举的SEQ ID NO中的所预测的信号肽边界。图3A-3C中也将信号肽边界加框。
表8：大鼠C1q序列的GeneBank寄存编号
Figure SMS_19
为了产生嵌合C1q大鼠，简单来说，使用Regeneron的通过来自大鼠深灰鼠ES细胞的
Figure SMS_20
产生的大鼠BAC文库和US2014/0310828(其以全文引用的方式并入本文中)中描述的大鼠靶向技术，通过由合成的人类序列和大鼠细菌人工染色体(BAC)DNA构筑独特靶向载体来人类化大鼠C1q基因座基于来自下一代测序(Next GenerationSequencing)的数据确认和更新BAC序列。修饰来自大鼠BAC(大鼠C1q BAC，/>
Figure SMS_21
)的DNA，以分别用人类C1qa、C1qb和C1qc的相应部分(人类C1q基因在人类染色体1的正链上彼此极紧密的定位)置换大鼠C1qa、C1qb和C1qc的基因组DNA编码部分(大鼠C1q基因在大鼠染色体5的反链上彼此极紧密的定位)。
通过引入人类C1q序列来修饰内部产生和上文所描述的大鼠C1qBAC，以产生包含人类化C1qa、C1qb和C1qc基因的载体。分别用相应的人类C1qa、C1qb和C1qc的序列置换编码大部分大鼠C1qa、C1qb和C1qc球状结构域的序列。人类和大鼠C1q(和小鼠)蛋白质序列的比对描绘于图3A、B和C中，其中球状头部的边界如所指示，且大鼠/人类基因的边界用箭头指示。人类化大鼠C1qa、C1qb和C1qc蛋白质的氨基酸序列分别阐述于SEQ ID NO:55、56和57中且列举于表9中，其中大鼠序列用斜体表示。
表9：嵌合大鼠/人类C1q蛋白质的氨基酸序列
Figure SMS_22
Figure SMS_23
实例2.1产生C1q基因敲除大鼠
详细地说，首先，修饰包含所有三种C1q基因的大鼠C1q基因座以删除包含编码大鼠C1q的基因的17.6Kb核苷酸序列(参见图2A)。合成靶向载体以包含LacZ基因和自删除潮霉素选择盒，且含有5'和3'同源臂的载体允许删除从C1qa ATG到C1qb终止密码子的所有三种大鼠C1q基因。通过细菌同源重组(BHR)将包含C1q序列缺失的载体引入大鼠C1q BAC，且使用所得BAC DNA对大鼠ES细胞进行电致孔以产生经修饰的ES细胞，以用于产生缺乏内源性C1q基因座的大鼠。在图2C中的第二示意图中标记缺失的基因座中的各种接合区的序列，且相应的核酸序列列举于以下表10中。在本实例中的表格中展示的接合区仅列举短核苷酸序列，但为所属领域的技术人员指引大鼠基因组中的序列插入位置。
表10：大鼠C1q基因座的缺失的接合序列
Figure SMS_24
通过上文所描述的定量TAQMANTM分析法，一种等位基因修饰分析法(MOA)，来鉴别含有大鼠C1q序列的缺失的ES细胞。表11鉴别定量PCR分析法中使用的引物/探针集合中的每一个的名称和位置。使用相同的ES细胞以引入人类C1q序列，以产生嵌合大鼠，如下文所描述。
表11：用于MOA分析法以确认大鼠C1q基因座的缺失的引物和探针
Figure SMS_25
将目标嵌合C1q深灰鼠ES细胞植入史泊格多利大鼠胚芽以产生具有C1q基因座的缺失的F0幼鼠。将F0嵌合幼鼠培育成野生型大鼠，以产生对于基因操作来说是杂合的F1幼鼠；通过如上文所描述的
Figure SMS_26
分析法来确认存在经修饰的等位基因。接着，将F1幼鼠培育成纯合性。
实例2.2.产生人类化C1q大鼠
为了产生人类化C1q大鼠，使用人类C1q球状头部结构域的序列(与以上实例1中用于人类化C1q小鼠相同的序列)和重叠大鼠序列，通过Blue Heron合成质体。对于C1qb人类化构筑体，通过人类C1qb polyA序列下游的限制消化来插入自删除loxP-嘌呤霉素(SDC-loxp-Puro)选择盒。对于C1qa和C1qc构筑体，通过每个C1qa和C1qc polyA序列下游的限制消化来插入壮观霉素(Spec)选择盒。通过组合CRISPR/CAS9技术和吉布森组装或细菌同源重组(BHR)将所得构筑体依序引入来自
Figure SMS_27
的大鼠C1q BAC，接着进行选择和/或消化步骤以去除选择盒，如图2B中所说明。在这一具体实施例中，首先通过BHR引入C1qb的嵌合核酸序列(图中的1)，接着进行嵌合C1qc DNA的BHR(图中的2)，且接着通过BHR引入嵌合C1qa DNA(图中的3)。
将含有所有三种嵌合C1q基因的大型靶向载体电致孔到大鼠C1qKO HET ES细胞中，如图2C所描绘，且通过
Figure SMS_28
实时基于PCT的等位基因修饰(MOA)分析法来确认成功整合。用于MOA分析法的引物和探针描述于表12中。
表12：用于MOA分析法以确认是否存在嵌合人类/大鼠C1q基因的引物和探针
Figure SMS_29
嵌合基因座处的各种经基因工程改造的组分之间的接合序列描绘于以下表13中，且在图2C中的底部示意图上指示。在本实例中的表格中展示的接合区仅列举短核苷酸序列，但为所属领域的技术人员指引大鼠基因组中的序列插入位置。
表13：嵌合人类/大鼠C1q基因座的接合序列
Figure SMS_30
/>
Figure SMS_31
将目标嵌合C1q深灰鼠ES细胞植入史泊格多利大鼠胚芽以产生具有嵌合人类/大鼠C1q基因座的F0幼鼠。将F0嵌合幼鼠培育成野生型大鼠，以产生对于基因操作来说是杂合的F1幼鼠；通过如上文所描述的
Figure SMS_32
分析法来确认存在经修饰的等位基因。接着，将F1幼鼠培育成纯合性。
实例3：表征人类化C1q小鼠
实例3.1：嵌合C1q在小鼠血清中存在且具有功能性
为了确定嵌合C1q是否在小鼠血清中表达和具有功能性，通过蛋白质印迹和经典补体溶血分析法对人类化C1q小鼠进行表型分型。在Regeneron Pharmaceuticals，在特定的无病原体设备中圈养和培育所有小鼠。所有动物实验由IACUC和RegeneronPharmaceuticals批准。
(1)蛋白质印迹：
使用蛋白质印迹，在1615HO小鼠(如上文所描述对于人类化C1q来说是纯合的小鼠)分析血清C1q浓度，如下所述：在PBS中稀释小鼠或正常人类血清(NHS)。使用正常人类血清(Quidel)作为阳性对照。将血清添加到含有巯基乙醇和SDS的电泳样品上样缓冲液中且在还原/变性条件下，在聚丙烯酰胺凝胶上运行，接着转移到硝化纤维膜上。阻断印迹，接着用山羊抗人类C1q初级抗体(Quidel)探测，接着用驴抗山羊IgG HRP(Santa Cruz)进行检测。使用ThermoScientific Super Signal West Pico Chemiluminescent Subtrate研究印迹。使用GE Image Quant LAS4000进行成像。
(2)经典路径溶血分析法：
在GVB++缓冲液中洗涤所需数目的SRBC(绵羊红细胞)且以1×109个细胞/毫升再悬浮，且用兔抗绵羊溶血素调理。被致敏的SRBC在GVB++缓冲液中稀释到2×108个细胞/毫升，接着用于溶血分析法。在七至九周龄时收集来自WT同窝出生仔(n＝5)和1615HO(n＝4)小鼠的血清。小鼠血清在6点，2倍稀释系列中用GVB++缓冲液(100μl稀释的血清/孔)从1/5连续稀释到1/160。立即添加100μL被致敏的SRBC(以2×108个细胞/毫升)，达到200μL总体积且在37℃下培育1小时。在培育时间之后，细胞在1250xg下，在4℃下通过离心向下旋转。将总共100μL上清液转移到新鲜的96孔平底盘中且用Molecular Devices Spectramax M5微板读取器和SoftMax Pro软件在541nm下进行读取。计算溶血活性：将所有实验样品的OD541除以在最大细胞溶解下的OD541(用100μL水处理的细胞)且接着乘以100。所表示的数据是单点(未进行复制)。
如图4，上图中说明，在人类化C1q小鼠的血清中检测嵌合C1q蛋白质(如由抗人类C1q抗体检测)，尽管与在人类血清中相比，在人类化C1q小鼠血清中检测到较少的C1q蛋白质。如通过溶血分析法测量，从人类化小鼠获得的嵌合C1q蛋白质显示与在包含野生型小鼠C1q的小鼠中所观察到的类似的经典补体活性(图4，底部图)。
还用对C1q的人类头部具有特异性的抗体，使用夹心ELISA格式确定小鼠血清中嵌合人类/小鼠C1q的浓度。使用已知浓度的人类C1q蛋白质产生标准曲线，且确定小鼠血清中嵌合C1q的浓度在约10-30μg/mL范围内。
实例4：作为用于测试人类治疗剂的模型的人类化C1q小鼠
为了确认人类化C1q小鼠是否可以充当用于测试人类治疗剂的模型，我们首先研发试管内分析法以评估人类化C1q通过结合于人类抗CD20抗体来活化Raji细胞(表达细胞表面抗原CD20的B细胞)的补体依赖性细胞毒性(CDC)的能力。已证实针对B细胞特异性细胞表面抗原CD20的治疗性抗CD20抗体能引起B细胞的CDC(Glennie等人2007,《抗CD20单株抗体的杀伤机制(Mechanisms of killing by anti-CD20 monoclonal antibodies)》,《分子免疫学》,第44(16)卷第3823-37页)，且先前已描述使用表达CD20的细胞系的CDC分析法(Flieger等人2000,《表达CD20的淋巴瘤品系中由嵌合小鼠人单克隆抗体IDEC-C2BB诱导的细胞毒性的机制(Mechanisms of Cytotoxicity Induced by Chimeric Mouse HumanMonoclonal Antibody IDEC-C2BB in CD20-Expressing Lymphoma Lines)》,《细胞免疫学(Cell Immunol.)》,第204(1)卷第55-63页)。
对于CDC生物分析法，Raji细胞在含有RPMI 1640的1％ BSA中以10,000个细胞/孔接种到96孔分析盘上。为了用人类或小鼠血清(来自人类化C1q或WT小鼠)测量CDC，人类抗CD20抗体以1:4从2nM稀释到0.007nM且与细胞一起在25℃下培育10分钟。在与抗CD20抗体一起培育结束时，将血清以1％的最终浓度添加到细胞中。在37℃下且在5％ CO2中培育1小时之后测量细胞毒性，接着在25℃下培育30分钟且添加CytoTox-GloTM试剂(Promega，#G9291)。CytoTox-GloTM是基于发光的试剂，其测量细胞杀伤，使得在增加的细胞毒性下观察到增加的发光(以相对光单位RLU测量)。通过用毛地黄皂苷处理10分钟来使对照孔中的未经处理的细胞溶解，接着添加CytoTox-GloTM试剂以确定细胞的最大杀伤。在添加CytoTox-GloTM之后，用Victor X仪器(Perkin Elmer)经10-15分钟针对发光对盘进行读取。在计算时，使用以下方程式，由RLU值计算细胞毒性百分比：
Figure SMS_33
在这一方程式中，“背景细胞溶解”是来自仅用培养基和血清而未用任何抗CD20抗体处理的细胞的发光且“最大细胞溶解”是来自用毛地黄皂苷处理的细胞的发光。用Prism7软件(GraphPad)，使用非线性回归(4参数逻辑)分析结果，表示为细胞毒性百分比或RLU。
由2nM人类抗CD20抗体和正常人类血清介导的补体依赖性细胞毒性(CDC)活性引起83％的最大溶解，而由2nM人类CD20抗体和来自人类化C1q小鼠的血清介导的CDC是55-58％的最大溶解(图5)。使用野生型小鼠血清未检测到细胞溶解。因此，与含有野生型小鼠C1q蛋白质的血清相比，含有人类化C1q球状头部的血清引起更有效的由人类抗CD20抗体介导的Raji细胞的补体依赖性溶解。
对于体内测试，选择金黄色葡萄球菌感染模型。金黄色葡萄球菌是患者中菌血症的主要起因，且这些感染通常是致命的。已由多个实验室使用多种实验室调适和临床金黄色葡萄球菌分离物且在多种小鼠背景中研发菌血症的小鼠模型(O'Keeffe KM等人,《感染与免疫(Infect Immun.)》2015年9月；83(9):3445-57,《吞噬细胞中的自噬操作有助于金黄色葡萄球菌血流感染(Manipulation of Autophagy in Phagocytes FacilitatesStaphylococcus aureus Bloodstream Infection)》；Rauch等人,《感染与免疫》2012年10月；80(10):3721-32,《金黄色葡萄球菌腹膜感染的小鼠模型中的脓肿形成和α-溶血素诱导的毒性(Abscess formation and alpha-hemolysin induced toxicity in a mousemodel of Staphylococcus aureus peritoneal infection)》)，以研究感染动力学和潜在治疗剂的作用。建立菌血症模型以评估表达于金黄色葡萄球菌上的双特异性抗体(bisAb)在降低细菌负荷和改善存活期方面的活性，所述双特异性抗体具有一个靶向C1q的臂和另一个靶向抗原的臂。
在37℃下，在TSB中，在OD600≤1下，在生长到对数期的200μl体积的纽曼(Newman)金黄色葡萄球菌中，用1.7×108个菌落形成单位(CFU)/小鼠腹膜内感染人类化C1q小鼠和对照性野生型小鼠且在PBS中洗涤3次。在感染之后，立即以100μl体积向小鼠腹膜内给予100μg各bisAb和同型匹配抗体。在第3天处死小鼠且收集肾脏以确定器官负荷。简单来说，肾脏在5.0mL PBS中用gentleMACS Octo Dissociator(Miltenyi Biotec)均质化。组织匀浆在PBS中稀释，且将多份10倍连续稀释物涂布在LB琼脂板上且在37℃下培育过夜。次日，对各个菌落进行计数以确定在所述感染后时间点时的细菌负荷且结果报道为CFU/克组织。
在雌性人类化C1q小鼠和WT对照小鼠中，测试BisAb和同型对照抗体在降低细菌肾脏负荷方面的功效。与用同型对照Ab处理的小鼠相比，在处理之后第3天，在用bisAb处理的人类化C1q小鼠的肾脏中检测到细菌CFU的2-4倍对数降低；然而，与用同型对照抗体获得的结果类似，在用BisAb处理的表达内源性小鼠C1q的WT小鼠中未观察到细菌负荷的降低(数据未展示)。
为了检验bisAb对存活期的作用，用纽曼金黄色葡萄球菌以1.5×108 CFU/小鼠感染人类化C1q小鼠且用如上文所描述的测试抗体处理。代替在第3天处死小鼠，对其进行监测直到第18天。将损失20％起始体重的小鼠处死且记录为死亡。在研究结束时报道存活动物的百分比。
在人类化C1q雌性小鼠(n＝9)中，在存活期研究中测试BisAb和同型对照抗体的功效。如表14中所示，在研究结束时，在感染后第18天，100％的用BisAb处理的小鼠存活，相比之下，78％的同型对照处理小鼠存活。
表14：菌血症模型中人类化C1q小鼠的存活率
Ab 感染后D18时的存活率(％) 小鼠(n)
BisAb 100 9
同型对照 78 9
Sham(PBS) 56 9
总之，本研究表明人类化C1q小鼠是用于测试针对人类C1q蛋白质的治疗剂(如抗体，例如双特异性抗体)的有价值的模型。
实例5：人类化C1q大鼠的表征
为了确定嵌合C1q在大鼠血清中是否具有功能性，通过经典补体溶血分析法对实例2中描述的人类化C1q大鼠进行表型分型。将结果与C1q基因敲除(KO)大鼠和正常人类血清进行比较。所有大鼠是50％深灰鼠50％史泊格多利背景。在RegeneronPharmaceuticals，在特定的无病原体设备中圈养和培育所有大鼠。所有动物实验由IACUC和Regeneron Pharmaceuticals批准。
(1)经典路径溶血分析法
在GVB++缓冲液中洗涤所需数目的SRBC(绵羊红细胞)且以1×109个细胞/毫升再悬浮，且用兔抗绵羊溶血素调理。被致敏的SRBC在GVB++缓冲液中稀释到2×108个细胞/毫升，接着用于溶血分析法。在十至十七周龄时收集来自WT(n＝3只雌性和n＝4只雄性)、100015HO(纯合人类化C1q大鼠)(n＝5只雌性和n＝6只雄性)和纯合C1q基因敲除大鼠(n＝2只雌性)的血清。使用正常人类血清(Quidel)作为阳性对照，而使用C1q耗尽的人类血清(Quidel)作为阴性对照。大鼠和人类血清在12点，2倍稀释系列中，用GVB++缓冲液从1/5连续稀释到1/10240(100μl稀释的血清/孔)。立即添加100μL被致敏的SRBC(以2×108个细胞/毫升)，达到200μL总体积且在37℃下培育1小时。在培育时间之后，细胞在1250 xg下，在4℃下通过离心向下旋转。将总共100μL上清液转移到新鲜的96孔平底盘中且用MolecularDevices Spectramax M5微板读取器和SoftMax Pro软件在412nm下进行读取。计算溶血活性：将所有实验样品的OD541除以在最大细胞溶解下的OD541(用100μL水处理的细胞)且接着乘以100。所表示的数据是单点(未进行复制)。
如图6中所示，如通过溶血分析法所测量，从人类化大鼠获得的嵌合C1q蛋白质显示与在包含野生型大鼠C1q的大鼠中所观察到的和在正常人类血清情况下所观察到的类似的经典补体活性。在雄性与雌性大鼠之间未观察到差异。
实例6：作为用于测试人类治疗剂的模型的人类化C1q大鼠
为了确认人类化C1q大鼠是否可以充当用于测试人类治疗剂的模型，进行试管内补体依赖性细胞毒性分析法和全血细菌存活分析法。
(1)补体依赖性细胞毒性(CDC)分析法
对于CDC生物分析法，使用Raji细胞(表达CD20的人类B细胞系)、血清样品(补体保存人类血清、WT大鼠血清或来自如实例2中所描述的纯合C1q人类化大鼠的血清)和抗CD20抗体。
Raji细胞在含有RPMI 1640的1％ BSA中以10,000个细胞/孔接种到96孔分析盘上。为了用人类或大鼠血清测量CDC，抗CD20抗体以1:4从20nM稀释到0.019nM(包括不含抗体的对照样品)且与细胞一起在25℃下培育10分钟，接着添加0.5％血清。在37℃下且在5％CO2中培育1小时之后测量细胞毒性，接着在25℃下培育30分钟且添加CytoTox-GloTM试剂(Promega，#G9291)。CytoTox-GloTM是基于发光的试剂，其测量细胞杀伤，使得在增加的细胞毒性下观察到增加的发光(以相对光单位RLU测量)。通过在添加CytoTox-GloTM试剂之后立即用毛地黄皂苷处理来使对照孔中的未经处理的细胞溶解，以确定细胞的最大杀伤。在添加CytoTox-GloTM之后，用Victor X仪器(Perkin Elmer)经10-15分钟针对发光对盘进行读取。在计算时，使用以下方程式，由RLU值计算细胞毒性百分比：
Figure SMS_34
在这一方程式中，“背景细胞溶解”是来自仅用培养基和血清而未用任何抗CD20抗体处理的细胞的发光且“最大细胞溶解”是来自用毛地黄皂苷处理的细胞的发光。用Prism7软件(GraphPad)，使用非线性回归(4参数逻辑)分析结果，表示为细胞毒性百分比或RLU。
如图7中所示，由20nM CD20抗体和人类化C1q大鼠(MAID10015)血清介导的补体依赖性细胞毒性引起85-90％的Raji细胞最大溶解，其与使用野生型大鼠血清(93-112％溶解)和正常人类血清(83％溶解)的溶解类似。与大鼠C1q相比，C1q分子的人类化未改变由CD20抗体介导的Raji细胞的补体依赖性溶解。
(2)C1q人类化大鼠血液中的金黄色葡萄球菌存活率和双特异性抗体的作用
可以在体外分析法中评估完全人类血液中的金黄色葡萄球菌存活率，以探索补体和免疫效应细胞在调节细菌生长方面的作用(Thammavongsa等人,《实验医学杂志(J ExpMed.)》2009年10月26日；206(11):2417-27)。在这一分析法中，测量靶向C1q和金黄色葡萄球菌抗原的双特异性抗体在调节金黄色葡萄球菌存活率方面的活性，其中将双特异性抗体添加到全血中且在24小时后评估存活率。在本实例中，这一分析法已被调适成使用C1q人类化大鼠血液且检验人类化嵌合C1q蛋白质在介导特异性识别金黄色葡萄球菌抗原的双特异性抗体的作用方面和人类或人类化C1q蛋白质而非大鼠C1q蛋白质的功能性。使用针对相同金黄色葡萄球菌/g6]抗原的二价单特异性抗体作为对照。
简单来说，纽曼金黄色葡萄球菌的培养物在RPMI中生长过夜，在PBS中洗涤且在PBS中再悬浮达到1.25×108个菌落形成单位(CFU)/毫升的浓度，且连续稀释到105个CFU/mL的浓度。一式两份，将104CFU的金黄色葡萄球菌悬浮液与100μg/mL的双特异性抗体、对照抗体或无抗体以及100μL人类化C1q或野生型(WT)大鼠血液(在作为抗凝剂的柠檬酸钠和用于防止凝块形成的额外500nM达比加群(dabigatran)中)混合。样品在96孔盘中，在37℃下，在振荡(100rpm)下培育24小时。在培育之后，将100μl凝集溶解缓冲液(每毫升PBS补充有200U链球菌激酶、2μg/mL的RNA酶、10μg/mL的DNA酶、0.5％皂苷、100μg胰蛋白酶的PBS)添加到样品中且剧烈涡旋直到团块消失。在PBS中连续稀释总共50μL各样品且涂布到LB琼脂板上以用于CFU的清点。
在本分析法中，测试从11只人类化C1q和10只WT大鼠新近抽取的血液样品。确定在用双特异性或对照抗体处理之后的金黄色葡萄球菌的存活百分比。将在不存在测试抗体的情况下大鼠血液中的整体生长标准化成100％。用双特异性抗体处理的WT大鼠血液中的金黄色葡萄球菌的存活率在58-131％范围内，而C1q人类化大鼠血液中的双特异性抗体处理引起7-49％存活率。用对照抗体处理的WT大鼠血液中的金黄色葡萄球菌的存活率在40-139％范围内，且C1q人类化大鼠血液中的对照抗体处理引起61-114％存活率。

Claims (9)

1.一种经基因修饰的非人类动物，其在其基因组中包含编码嵌合C1q多肽的核酸，其中所述核酸包含非人类核酸序列和人类核酸序列，其中所述嵌合C1q多肽是选自由以下组成的群组：嵌合C1qa多肽、嵌合C1qb多肽和嵌合C1qc多肽，且其中所述嵌合C1q多肽包含基本上人类型球状头部结构域和基本上非人类型N端茎-干区域。
2.根据权利要求1所述的经基因修饰的非人类动物，其中所述非人类动物表达嵌合C1qa多肽、嵌合C1qb多肽、嵌合C1qc多肽或其组合。
3.一种用于制备经基因修饰的非人类动物的方法，其包含修饰非人类动物的基因组以包含编码嵌合C1q多肽的核酸，其中所述核酸包含非人类核酸序列和人类核酸序列，其中所述嵌合C1q多肽是选自由以下组成的群组：嵌合C1qa多肽、嵌合C1qb多肽、嵌合C1qc多肽和其组合，且其中所述嵌合C1q多肽包含基本上人类型球状头部结构域和基本上非人类型N端茎-干区域。
4.根据权利要求3所述的方法，其中修饰所述非人类动物的基因组以包含编码嵌合C1qa多肽的核酸、编码嵌合C1qb多肽的核酸和编码嵌合C1qc多肽的核酸。
5.一种嵌合C1q多肽，其包含基本上人类型球状头部结构域和基本上非人类型N端茎-干区域，其中所述嵌合C1q多肽是选自由以下组成的群组：嵌合C1qa多肽、嵌合C1qb多肽和嵌合C1qc多肽。
6.一种嵌合C1q多肽，其由根据权利要求1至2中任一项所述的非人类动物制得。
7.一种嵌合C1q蛋白质，其包含根据权利要求5或6所述的嵌合C1q多肽中的一种或多种。
8.一种细胞，其包含编码嵌合非人类哺乳动物C1q蛋白质的经分离的核酸，其包含第一、第二或第三核苷酸序列中的一个或多个，其中：
a.所述第一核苷酸序列编码嵌合C1qa多肽，
b.所述第二核苷酸序列编码嵌合C1qb多肽，和
c.所述第三核苷酸序列编码嵌合C1qc多肽，
其中所述第一、第二和第三核苷酸序列中的每一个包含非人类哺乳动物核酸序列和人类核酸序列，其中所述人类核酸序列分别基本上编码人类C1qa、C1qb和C1qc多肽的球状头部结构域，且非人类核酸序列分别基本上编码同源非人类C1q多肽C1qa、C1qb和C1qc多肽的N端茎-干区域。
9.一种用于测试基于C1q的双特异性抗原结合蛋白的转基因啮齿动物模型，其中所述抗原结合蛋白结合人类C1q和相关非啮齿动物抗原，所述转基因啮齿动物模型包含根据权利要求1至59中任一项所述的经基因修饰的啮齿动物，并且进一步包含所述相关非啮齿动物抗原或表达所述相关非啮齿动物抗原的细胞。
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