ES2961713T3 - Roedores que expresan el complejo C1Q humanizado - Google Patents

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Abstract

En el presente documento se describen ácidos nucleicos que codifican proteínas que expresan polipéptidos C1q quiméricos, animales no humanos que comprenden dichos ácidos nucleicos y métodos para producir o usar dichos animales no humanos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Roedores que expresan el complejo c1q humanizado
Referencia cruzada a la solicitud relacionada
Esta solicitud reivindica el beneficio de la prioridad de la solicitud provisional de los Estados Unidos núm.
62/565,438, presentada el 29 de septiembre de 2017.
Antecedentes
Durante la etapa preclínica de desarrollo de fármacos, los agentes candidatos típicamente se estudian en base a su eficacia, toxicidad y otras propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas. Los agentes candidatos, tales como los anticuerpos, se dirigen típicamente a un antígeno humano, ya que el objetivo final de la investigación es desarrollar una terapia humana. La capacidad de secuestrar la vía del complemento proporciona una ventaja significativa a los agentes terapéuticos candidatos. La vía del complemento forma parte de la respuesta inmunitaria innata y ayuda a las respuestas inmunitarias humorales en el reclutamiento de macrófagos y fagocitos en el sitio antigénico. La activación de la vía del complemento da como resultado la liberación de citocinas y la opsonización del antígeno unido al anticuerpo por los fagocitos. Durante el desarrollo de agentes terapéuticos dirigidos a la activación de la vía del complemento y de la respuesta inmunitaria innata para combatir enfermedades humanas, resulta inestimable contar con un sistema animal no humano modelo que permita estudiar los mecanismos de acción y/o el potencial terapéutico del agente; pero se carece de tal sistema.
Sumario
En la presente descripción se describen polipéptidos C1q quiméricos de mamífero (tales como, por ejemplo, polipéptidos C1qa, C1qb y/o C1qc quiméricos de mamífero), moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos C1q quiméricos de mamífero, y roedores que comprenden dichas moléculas de ácido nucleico y expresan polipéptidos C1q quiméricos.
En un aspecto, la presente invención proporciona un animal roedor modificado genéticamente que comprende en su genoma
a. un ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qa quimérico, en donde el polipéptido C1qa quimérico comprende (i) un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % idéntico al dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qa humano en donde el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qa humano comprende los aminoácidos 108-245 de la SEQ ID NO: 4, y (ii) una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos un 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qa endógeno de roedor;
b. un ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qb quimérico, en donde el polipéptido C1qb quimérico comprende (i) un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % idéntico al dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qb humano en donde el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qb humano comprende los aminoácidos 115-251 de la SEQ ID NO: 5, y (ii) una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos un 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qb endógeno de roedor; y
c. un ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qc quimérico, en donde el polipéptido C1qc quimérico comprende (i) un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % idéntico al dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qc humano en donde el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qc humano comprende los aminoácidos 113-245 de la SEQ ID NO: 6, y (ii) una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos un 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qc endógeno de roedor;
en donde los polipéptidos C1qa, C1qb y C1qc quiméricos se expresan en el animal roedor y forman un complejo C1q funcional; y
en donde el animal roedor no expresa un polipéptido C1qa endógeno funcional, un polipéptido C1qb endógeno funcional, o un polipéptido C1qc endógeno funcional.
En algunas modalidades, el roedor es una rata o un ratón.
En algunas modalidades, el roedor es un ratón que comprende en su genoma un ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qa quimérico que comprende: (i) un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % idéntico al dominio de cabeza globular de un C1qa humano en donde el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qa humano comprende los aminoácidos 108-245 de la SEQ ID NO: 4, y (ii) una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos un 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qa endógeno de ratón. En determinadas modalidades, la región tallo-pedúnculo N-terminal del polipéptido C1qa endógeno de ratón comprende los aminoácidos 23-107 de la SEQ ID NO: 1. En modalidades específicas, el polipéptido C1qa quimérico comprende los aminoácidos 23-245 de la SEQ ID NO: 10 (ratón/humano). En modalidades específicas, el polipéptido C1qa quimérico comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 (ratón/humano).
En algunas modalidades, el roedor genéticamente modificado es una rata, que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qa quimérico que comprende: (i) un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % idéntico al dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qa humano en donde el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qa humano comprende los aminoácidos 108-245 de la SEQ ID NO: 4, y (ii) una región tallopedúnculo N-terminal que es al menos un 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qa endógeno de rata. En algunas modalidades, la región tallo-pedúnculo N-terminal del polipéptido C1qa endógeno de rata comprende los aminoácidos 23-107 de la SEQ ID NO: 7. En modalidades específicas, el polipéptido C1qa quimérico comprende los aminoácidos 23-245 de la SEQ ID NO: 55 (rata/humano). En modalidades específicas, el polipéptido C1qa quimérico comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 55 (rata/humano).
el roedor comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido C1q quimérico que es un polipéptido C1qb quimérico. El polipéptido C1qb quimérico comprende: (i) un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % idéntico al dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qb humano en donde el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qb humano comprende los aminoácidos 115-251 de SEQ ID NO: 5; y (ii) una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos un 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qb endógeno de roedor. En algunas modalidades, el roedor es un ratón, que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qb quimérico que comprende una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos un 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qb endógeno de ratón. En algunas modalidades, la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qb endógeno de ratón comprende los aminoácidos 26-114 de la SEQ ID NO: 2. En modalidades específicas, el polipéptido C1qb quimérico comprende los aminoácidos 26-251 de la SEQ ID NO: 11 (ratón/humano). En modalidades específicas, el polipéptido C1qb quimérico comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11 (ratón/humano).
En algunas modalidades, el roedor es una rata, que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qb quimérico que comprende una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos un 90 % idéntica a la región tallopedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qb endógeno de rata. En algunas modalidades, la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qb endógeno de rata comprende los aminoácidos 26-114 de la SEQ ID NO: 8. En modalidades específicas, el polipéptido C1qb quimérico comprende los aminoácidos 26-251 de la SEQ ID NO: 56 (rata/humano). En modalidades específicas, el polipéptido C1qb quimérico comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID nO: 56 (rata/humano).
El roedor comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido C1q quimérico que es un polipéptido C1qc quimérico. El polipéptido C1qc quimérico comprende: (i) un dominio de cabeza globular que es al menos idéntico al dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qc humano, en donde el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qc humano comprende los aminoácidos 113-245 de la SEQ ID NO: 6; y (ii) una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos un 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qc endógeno C1qc no humano tal como un polipéptido C1qc endógeno. En algunas modalidades, el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qc humano comprende 113-245 de la SEQ ID NO: 6.
En algunas modalidades, el roedor es un ratón que comprende un ácido nucleico que codifica un polipépitido quimérico C1qc que comprende: (i) un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % idéntico al dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qc humano en donde el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qc humano comprende los aminoácidos 113-245 de la SEQ ID NO: 6, y (ii) una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos un 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qc endógeno de ratón. En determinadas modalidades, la región tallo-pedúnculo N-terminal del polipéptido C1qc endógeno de ratón comprende los aminoácidos 30-113 de la SEQ ID NO: 3. En modalidades específicas, el polipéptido C1qc quimérico comprende los aminoácidos 30-246 de la SEQ ID NO: 12 (ratón/humano). En modalidades específicas, el polipéptido C1qc quimérico comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12 (ratón/humano).
En algunas modalidades, el roedor genéticamente modificado es una rata, que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qc quimérico que comprende: (i) un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % idéntico al dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qc humano en donde el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qc humano comprende los aminoácidos 113-245 de la SEQ ID NO: 6, y (ii) una región tallopedúnculo N-terminal que es al menos un 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qc endógeno de rata. En algunas modalidades, la región tallo-pedúnculo N-terminal del polipéptido C1qc endógeno de rata comprende los aminoácidos 32-115 de la SEQ ID NO: 9. En modalidades específicas, el polipéptido C1qc quimérico comprende los aminoácidos 32-248 de la SEQ ID NO: 57 (rata/humano). En modalidades específicas, el polipéptido C1qc quimérico comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 57 (rata/humano).
En algunas modalidades, un polipéptido C1q quimérico se traduce en el no roedor para contener un péptido señal de C1q de roedor tal como un péptido señal de C1q endógeno de roedor. En otras palabras, la molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido C1q quimérico comprende además una secuencia codificante para un péptido señal de C1q de roedor tal como un péptido señal de C1q endógeno. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qa quimérico comprende además una secuencia codificante para un péptido señal C1qa de roedor tal como un péptido señal C1qa endógeno; una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qb quimérico comprende además una secuencia codificante para un péptido señal de C1qb de roedor tal como un péptido señal de C1qb endógeno; y una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qc quimérico comprende además una secuencia codificante para un péptido señal de C1qc de roedor tal como un péptido señal de C1qc endógeno. Los ejemplos de péptidos señal de C1q de ratón y rata se describen en la presente descripción (ver, por ejemplo, en las Figuras 3A-3C).
En algunas modalidades, el ácido nucleico que codifica un polipéptido C1q quimérico está en un locus diferente de un locus C1q endógeno de roedor. En otras modalidades, el ácido nucleico que codifica un polipéptido C1q quimérico está en un locus C1q endógeno de roedor. Por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qa quimérico está en un locus C1qa endógeno de roedor; un ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qb quimérico está en un locus C1qb endógeno de roedor; y/o un ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qc quimérico está en un locus C1qc endógeno de roedor.
En modalidades donde el ácido nucleico que codifica un polipéptido C1q quimérico está en un locus C1q endógeno de roedor, en algunas de tales modalidades, una secuencia genómica endógena en el locus C1q endógeno de roedor se ha reemplazado por una secuencia de ácido nucleico humana. En algunas modalidades, la secuencia de ácido nucleico humano, tal como un fragmento genómico de un gen de C1q humano, codifica un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % idéntico al dominio de cabeza globular de un dominio de cabeza globular humano de un polipéptido C1q humano. En algunas modalidades, la secuencia de ácido nucleico humano también incluye la UTR 3' del gen de C1q humano (que incluye la señal de poliadenilación y el sitio de poliadenilación del gen de C1q humano).
El roedor genéticamente modificado comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qa quimérico, en donde el polipéptido C1qa quimérico comprende (i) un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % idéntico al dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qa humano en donde el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qa humano comprende los aminoácidos 108-245 de la SEQ ID NO: 4, y (ii) una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos un 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qa endógeno de roedor. En algunas modalidades, la secuencia de ácido nucleico humana codifica los aminoácidos 112 245 de la SEQ ID NO: 4.
El roedor genéticamente modificado proporcionado comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qb quimérico, en donde el polipéptido C1qb quimérico comprende (i) un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % idéntico al dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qb humano, en donde el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qb humano comprende los aminoácidos 115-251 de la SEQ ID NO: 5, y (ii) una región tallopedúnculo N-terminal que es al menos un 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qb endógeno de roedor. En algunas modalidades, la secuencia de ácido nucleico humana codifica los aminoácidos 118-251 de la SEQ ID NO: 5.
El roedor genéticamente modificado proporcionado comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qc quimérico, en donde el polipéptido C1qc quimérico comprende (i) un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % idéntico al dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qc humano en donde el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qc humano comprende los aminoácidos 113-245 de la SEQ ID NO: 6, y (ii) una región tallopedúnculo N-terminal que es al menos un 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qc endógeno de roedor. En algunas modalidades, la secuencia de ácido nucleico humana codifica los aminoácidos 114-245 de la SEQ ID NO: 6.
En modalidades donde una secuencia genómica endógena en el locus C1q endógeno de roedor se ha reemplazado por una secuencia de ácido nucleico humana, en algunas de tales modalidades, la secuencia genómica endógena que permanece en el locus C1q codifica una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos un 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal endógena de roedor del polipéptido C1q endógeno.
En algunas modalidades, el roedor es un ratón, y la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1q endógeno comprende los aminoácidos 23-107 de la SEQ ID NO: 1 (para C1qa), los aminoácidos 26-114 de la SEQ ID NO: 2 (para C1qb), o los aminoácidos 30-113 de la SEQ ID NO: 3 (para C1qc). En algunas modalidades, el ratón comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qa quimérico, en donde el ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico de ratón y una secuencia de ácido nucleico humana, y en donde la secuencia de ácido nucleico de ratón codifica los aminoácidos 23-111 de la SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, el ratón comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qb quimérico, en donde el ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico de ratón y una secuencia de ácido nucleico humana, y en donde la secuencia de ácido nucleico de ratón codifica los aminoácidos 26-117 de la SEQ ID NO: 2. En algunas modalidades, el ratón comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qc quimérico, en donde el ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico de ratón y una secuencia de ácido nucleico humana, en donde la secuencia de ácido nucleico de ratón codifica los aminoácidos 30-114 de la SEQ ID NO: 3.
En algunas modalidades, el roedor es una rata, y la región tallo-pedúnculo N-terminal de los polipéptidos C1q endógenos comprende los aminoácidos 23-107 de la SEQ ID NO: 7 (para C1qa), los aminoácidos 26-114 de la SEQ ID NO: 8 (para C1qb), o los aminoácidos 32-115 de la SEQ ID NO: 9 (para C1qc). En algunas modalidades, la rata comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qa quimérico, en donde el ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico de rata y una secuencia de ácido nucleico humana, en donde la secuencia de ácido nucleico de rata codifica los aminoácidos 23-111 de la SEQ ID NO: 7. En algunas modalidades, la rata comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qb quimérico, en donde el ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico de rata y una secuencia de ácido nucleico humana, en donde la secuencia de ácido nucleico de rata codifica los aminoácidos 26-117 de la SEQ ID NO: 8. En algunas modalidades, la rata comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qc quimérico, en donde el ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico de rata y una secuencia de ácido nucleico humana, en donde la secuencia de ácido nucleico de rata codifica los aminoácidos 32-116 de la SEQ ID NO: 9.
En una modalidad específica, el roedor genéticamente modificado es una rata y comprende en su genoma: (i) en el locus C1qa endógeno, una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qa quimérico de rata/humano en donde la secuencia de ácido nucleico comprende, 5'-3' y en la unión operativa de una primera secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 1-111 de un polipéptido C1qa de rata de la SEQ ID NO: 7 y una segunda secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 112-245 de un polipéptido C1qa humano de la SEQ ID NO: 4; (ii) en el locus C1qb endógeno, una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qb quimérico de rata/humano en donde la secuencia de ácido nucleico comprende, 5'-3' y en enlace operativo una tercera secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 1-117 de un polipéptido C1qb de rata de la SEQ ID NO: 8 y una cuarta secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 118-251 de un polipéptido C1qb humano de la SEQ ID NO: 5; y (iii) en el locus C1qc endógeno una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qc quimérico de rata/humano en donde la secuencia de ácido nucleico comprende, 5'-3' y en enlace operativo una quinta secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 1-116 de un polipéptido C1qc de rata de la SEQ ID NO: 9 y una sexta secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 114-245 de un polipéptido C1qc humano de la SEQ ID NO: 6. En una modalidad particular, el animal no humano genéticamente modificado es una rata que comprende en su genoma: en el locus C1qa endógeno, una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qa quimérico de rata/humano que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 55; en el locus C1qb endógeno, una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qb quimérico de rata/humano que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 56; y en el locus C1qa endógeno, una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qc quimérico de rata/humano que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 57.
En otra modalidad específica, el roedor genéticamente modificado es un ratón y comprende en su genoma: (i) en el locus C1qa endógeno una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qa quimérico de ratón/humano en donde la secuencia de ácido nucleico comprende, 5'-3' y en enlace operativo una primera secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 1-111 de un polipéptido C1qa de ratón de la SEQ ID NO: 1 y una segunda secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 112-245 de un polipéptido C1qa humano de la SEQ ID NO: 4; (ii) en el locus C1qb endógeno, una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qb quimérico de ratón/humano en donde la secuencia de ácido nucleico comprende, 5'-3' y en enlace operativo una tercera secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 1-117 de un polipéptido C1qb de ratón de la SEQ ID NO: 2 y una cuarta secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 118-251 de un polipéptido C1qb humano de la SEQ ID NO: 5; y (iii) en el locus C1qc endógeno una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qc quimérico de ratón/humano en donde la secuencia de ácido nucleico comprende, 5'-3' y en enlace operativo una quinta secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 1-114 de un polipéptido C1qc de ratón de la SEQ ID NO: 3 y una sexta secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 114-245 de un polipéptido C1qc humano de la SEQ ID NO: 6. En una modalidad particular, el animal roedor modificado genéticamente es un ratón que comprende en su genoma: en el locus C1qa endógeno, una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qa quimérico de ratón/humano que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10; en el locus C1qb endógeno, una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qb quimérico de ratón/humano que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11; y en el locus C1qa endógeno una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qc quimérico de ratón/humano que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12.
El roedor modificado genéticamente proporcionado no expresa los polipéptidos C1qa, C1qb o C1qc endógenos funcionales.
En otro aspecto, en la presente descripción se proporcionan métodos para fabricar un roedor genéticamente modificado, que comprende modificar un genoma de roedor de manera que el genoma de roedor modificado comprenda
a) un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico de C1qa de roedor y una secuencia de ácido nucleico de C1qa humano, y codificar un polipéptido C1qa quimérico, en donde el polipéptido C1qa quimérico comprende (i) un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % idéntico al dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qa humano en donde el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qa humano comprende los aminoácidos 108-245 de la SEQ ID NO: 4, y (ii) una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos un 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qb endógeno de roedor;
b) un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico de C1qb de roedor y una secuencia de ácido nucleico de C1qb humano, y codificar un polipéptido C1qb quimérico, en donde el polipéptido C1qb quimérico comprende (i) un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % idéntico al dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qb humano en donde el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qb humano comprende los aminoácidos 115-251 de la SEQ ID NO: 5, y (ii) una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos un 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qb endógeno de roedor; y
c) un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico de C1qc de roedor y una secuencia de ácido nucleico de C1qc humano, y codificar un polipéptido C1qc quimérico, en donde el polipéptido C1qc quimérico comprende (i) un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % idéntico al dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qc humano en donde el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qc humano comprende los aminoácidos 113-245 de la SEQ ID NO: 6, y (ii) una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos un 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qc endógeno de roedor;
en donde cada uno de los ácidos nucleicos a) hasta c) se introduce en el locus C1q endógeno de roedor respectivo, y en donde opcionalmente cada uno de los ácidos nucleicos que codifican un polipéptido C1q quimérico reemplaza una secuencia de nucleótidos del gen de C1q endógeno de roedor respectivo en el locus C1q endógeno de roedor; y
en donde opcionalmente el roedor es un ratón o una rata.
En algunas modalidades, el ácido nucleico que comprende un gen que codifica un polipéptido C1q quimérico está en una ubicación en el genoma fuera del locus endógeno. Por lo tanto, en algunas modalidades, el/los gen(es) de C1q endógenos o una porción de estos pueden silenciarse y/o eliminarse, de manera que el roedor no expresa un polipéptido C1q endógeno funcional (no expresa un polipéptido C1qa, C1qb o C1qc endógeno funcional). En otras modalidades, el ácido nucleico que comprende un gen que codifica un polipéptido quimérico está en el locus C1q endógeno de roedor; y en una modalidad, el ácido nucleico que comprende un gen que codifica un polipéptido C1q quimérico reemplaza el gen de C1q endógeno de roedor en el locus C1q endógeno.
Por lo tanto, en la presente descripción se proporcionan métodos para fabricar el roedor genéticamente modificado descrito en la presente descripción, en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido C1q quimérico se introduce en el locus C1q endógeno de roedor. En un aspecto específico, se proporciona un método para fabricar un roedor genéticamente modificado, en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido C1q quimérico reemplaza una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido C1q endógeno de mamífero de roedor.
En algunas modalidades, el método para fabricar un roedor modificado genéticamente descrito en la presente descripción, por ejemplo, una rata o un ratón modificados genéticamente, comprende generar un vector objetivo (por ejemplo, un vector dirigido grande (LTVEC)) que comprende secuencia(s) de ácido nucleico que codifica(n) un polipéptido(s) quimérico C1qa, C1qb, y/o C1qc, introducir dicho vector objetivo en células ES, y generar dicho roedor a partir de dicha célula ES
También se hace referencia a un polipéptido C1q quimérico que comprende un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % idéntico a un dominio de cabeza globular humano y una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos un 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido con región de tallo N-terminal endógeno de roedor, en donde el polipéptido C1q quimérico se selecciona del grupo que consiste en un polipéptido C1qa quimérico, un polipéptido C1qb quimérico y un polipéptido C1qc quimérico. En algunos casos, tal polipéptido C1q quimérico se produce a partir del roedor modificado genéticamente de la presente invención. En otros casos, un polipéptido C1q quimérico se produce a partir de una célula huésped adecuado.
También se describe en la presente descripción una proteína C1q quimérica que comprende uno o más de los polipéptidos C1q quiméricos descritos en la presente descripción. En algunos casos, la proteína C1q quimérica comprende al menos un polipéptido C1qa quimérico, un polipéptido C1qb quimérico y un polipéptido C1qc quimérico. En algunos casos, la proteína C1q quimérica comprende 6 de cada uno de un polipéptido C1qa quimérico, un polipéptido C1qb quimérico y un polipéptido C1qc quimérico.
En otro aspecto, también se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica una proteína C1q quimérica de roedor, que comprende una o más de una primera,
segunda o tercera secuencias de nucleótidos, en donde:
la primera secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido C1qa quimérico,
la segunda secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido C1qb quimérico, y
la tercera secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido C1qc quimérico,
en donde cada una de la primera, segunda y tercera secuencias de nucleótidos comprende una secuencia de ácido nucleico de roedor y una secuencia de ácido nucleico humana,
en donde la secuencia de ácido nucleico humano codifica un polipéptido al menos 90%idéntico al dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qa, C1qb y C1qc humano, respectivamente, en donde el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qa humano comprende los aminoácidos 108-245 de la SEQ ID NO: 4, en donde el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qb humano comprende los aminoácidos 115-251 de la SEQ ID NO: 5, y el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qc humano comprende los aminoácidos 113-245 de la SEQ ID NO: 6; y
en donde la secuencia de ácido nucleico de roedor codifica un polipéptido al menos 90 % idéntico a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1q cognado de roedor de los polipéptidos C1qa, C1qb y C1qc, respectivamente.
En aún otro aspecto, se proporciona en la presente descripción una célula que comprende un ácido nucleico aislado descrito en la presente descripción. En algunas modalidades, la célula es una célula madre embrionaria (ES), por ejemplo, una célula ES de roedor (tal como ratón o rata). En particular, la presente invención proporciona una célula madre embrionaria (ES) de roedor que comprende el ácido nucleico aislado de la presente invención, en donde la célula ES de roedor es opcionalmente una célula ES de ratón o una célula ES de rata
En un aspecto adicional, en la presente descripción se proporciona un modelo de roedor para probar una proteína de unión a antígeno biespecífica basada en C1q, en donde la proteína de unión a antígeno se une tanto a C1q humano como a un antígeno de interés, que comprende un roedor modificado genéticamente de la presente invención y que comprende además el antígeno de interés o una célula que expresa el antígeno de interés.
En otro aspecto, también se proporciona un método de cribado de un candidato a fármaco dirigido a un antígeno de interés que comprende la introducción del antígeno de interés en un animal roedor modificado genéticamente de la presente invención,
poner en contacto dicho animal roedor con un candidato a fármaco de interés, en donde el candidato a fármaco está dirigido contra el C1q humano y el antígeno de interés, y ensayar si el candidato a fármaco es eficaz para prevenir, reducir o eliminar células caracterizadas por la presencia o expresión del antígeno de interés;
en donde opcionalmente el antígeno de interés es un antígeno asociado a un tumor, una célula bacteriana tal como una célula de Staphylococcus, un antígeno bacteriano tal como un antígeno de Staphylococcus, o un antígeno viral; y/o
en donde opcionalmente el animal roedor es un ratón o una rata inmunocompetentes; y/o
en donde opcionalmente el candidato a fármaco es un anticuerpo o una proteína de unión a antígeno tal como un anticuerpo biespecífico o una proteína de unión a antígeno biespecífica que es capaz de unirse tanto a la proteína C1q humana como al antígeno de interés.
En una modalidad, la etapa de introducción comprende expresar en el animal el antígeno de interés (tal como, por ejemplo, modificar genéticamente el roedor que expresa el antígeno de interés) o introducir en dicho animal una célula o virus que expresa el antígeno de interés. En un aspecto específico, la célula puede ser una célula tumoral o una célula bacteriana. En un aspecto adicional, el antígeno de interés puede ser un antígeno asociado a un tumor o un antígeno bacteriano. En otro aspecto, la célula puede ser una célula bacteriana.
En otro aspecto, se proporciona en la presente descripción un método para cribar entre candidatos a fármacos terapéuticos que se dirigen a un antígeno de interés, el método comprende mezclar una célula o virus que expresa el antígeno de interés con (i) un candidato a fármaco de interés, en donde el candidato a fármaco se dirige contra la C1q humana y el antígeno de interés, y (ii) una muestra de sangre (por ejemplo, una muestra de sangre completa) de un roedor modificado genéticamente de la presente invención, y (b) evaluar para determinar si el candidato a fármaco es eficaz para reducir o eliminar la célula o virus caracterizado por la presencia o expresión del antígeno de interés. La determinación puede realizarse en base a la medición, por ejemplo, el porcentaje de supervivencia de la célula donde se usa un candidato a fármaco en comparación con un fármaco de control o ningún fármaco en absoluto. El antígeno de interés puede ser un antígeno asociado al tumor o un antígeno asociado a una enfermedad infecciosa, por ejemplo, un antígeno bacteriano o viral. En algunas modalidades, el antígeno de interés es un antígeno bacteriano tal como un antígeno de Staphylococcus. En algunas modalidades, la célula es una célula bacteriana, tal como una célula de Staphylococcus.
En algunas modalidades, se proporciona un método de cribado de un candidato a fármaco, en donde la etapa de introducción comprende infectar al animal (por ejemplo, la rata o el ratón) con el antígeno de interés (por ejemplo, un antígeno viral o un antígeno bacteriano como un antígeno de Staphylococcus). Por lo tanto, en un aspecto, la etapa de introducción comprende infectar al animal con un virus o bacteria.
En algunas modalidades, el roedor genéticamente modificado que se proporciona en la presente descripción es un animal inmunocompetente (por ejemplo, rata o ratón inmunocompetentes).
En otro aspecto, se describen en la presente descripción métodos para evaluar si un anticuerpo que comprende una región Fc humana puede activar la vía clásica del complemento mediante la utilización de un roedor modificado genéticamente (por ejemplo, un ratón o rata) que expresa una proteína C1q humanizada descrita en la presente descripción. En particular, la presente invención proporciona además un método para evaluar si un anticuerpo candidato
activa la vía del complemento, que comprende
proporcionar una célula que expresa un antígeno de interés en la superficie celular, un anticuerpo candidato que comprende una región Fc humana y dirigida al antígeno de interés, y una muestra de suero de un animal roedor modificado genéticamente de la presente invención;
mezclar la célula con el anticuerpo candidato para permitir que el anticuerpo se una al antígeno de interés expresado en la superficie celular;
añadir la muestra de suero a la mezcla célula-anticuerpo para permitir la unión de las proteínas C1q humanizadas en la muestra de suero a anticuerpos unidos al antígeno de interés en la célula; y
medir la citotoxicidad de la célula.
La presente invención proporciona además un método para evaluar un anticuerpo biespecífico candidato dirigido a un antígeno de interés y C1q humano, que comprende
mezclar una célula o virus que expresa el antígeno de interés, el anticuerpo biespecífico candidato y una muestra de sangre de un animal roedor modificado genéticamente de la presente invención, e incubar para permitir que el anticuerpo se una al antígeno de interés expresado por la célula o virus y a las moléculas de C1q humanizadas en la muestra de sangre; y medir la supervivencia de la célula o virus,
opcionalmente, en donde la célula es una célula bacteriana tal como una célula de Staphylococcus, y el antígeno es un antígeno bacteriano tal como un antígeno de Staphylococcus.
Breve descripción de las figuras
Los dibujos adjuntos, que constituyen una parte de esta descripción, ilustran varias modalidades y junto con la descripción ilustran las composiciones y métodos descritos.
A menos que se indique específicamente (por ejemplo, loxP, etc.), todas las secuencias de exones humanos están en cajas vacías y todas las secuencias de intrones humanos están en líneas dobles. Todas las secuencias de ratón o rata están en cajas llenas (exones) o líneas individuales (intrones).
La Figura 1A es una representación esquemática (que no está a escala) del método ilustrativo para eliminar el locus C1q de ratón que comprende los tres genes C1q de ratón (los genes de ratón se indican con "m" delante de la etiqueta del gen). Los exones de los tres genes C1q se etiquetan más abajo del diagrama (por ejemplo, E1, E2 y E3). BAC de ratón significa cromosoma artificial bacteriano; BHR significa recombinación homóloga bacteriana; EP significa electroporación. HET=heterocigoto; CM=cloranfenicol; lox = sitio loxP; pgk-Neo = casete de selección con neomicina.
La Figura 1B muestra una representación esquemática (no a escala) de la creación de un vector humanizado de ratón dirigido a C1q, con genes quiméricos humanos/ratón insertados por digestión/ligación y/o recombinación homóloga bacteriana (BHR) en los genes BAC de ratón (los genes de ratón se indican con "m" delante de la etiqueta del gen). Los exones de los tres genes C1q se etiquetan más abajo del diagrama (por ejemplo, E1, E2 y E3). Se indican varias ubicaciones de enzimas de restricción. CM=cloranfenicol; lox = sitio loxP; Ub-Hyg = casete de selección con higromicina; p=cola de poliA; especificación=espectromicina. La Figura 1C muestra una representación esquemática (no a escala) de la electroporación (EP) de un vector dirigido grande que contiene los tres genes C1q quiméricos de ratón/humano en células ES C1q KO HET de ratón. Los exones de los tres genes C1q se etiquetan más abajo del diagrama (por ejemplo, E1,<e>2 y E3). Lox = sitio loxP; Ub-Hyg = casete de selección con higromicina; pgk-Neo = casete de selección con neomicina; p=secuencia poliA. Las uniones de secuencias entre secuencias de ratón, humano o casete se indican con una línea y una SEQ ID NO para esa secuencia respectiva más abajo de cada unión.
La Figura 2A muestra una representación esquemática (no a escala) del método ilustrativo para eliminar el locus C1q de rata que comprende los tres genes de C1q de rata (los genes de rata se indican con "r" delante de la etiqueta del gen). Los exones de los tres genes C1q se etiquetan más abajo del diagrama (por ejemplo, E1, E2 y E3). BAC C1q de rata significa cromosoma artificial bacteriano de rata; BHR significa recombinación homóloga bacteriana; EP significa electroporación. HET=heterocigoto; CM=cloranfenicol; loxP = sitio loxP; SDC-loxP-Hyg = casete de selección con LoxP-higromicina autoeliminable.
La Figura 2B muestra una representación esquemática (no a escala) de la creación de un casete C1q de rata humanizado, con genes quiméricos humanos/ratas insertados por el ensamble de digestión/Gibson y/o el ensamble CAS9/Gibson en los genes BAC de rata (los genes de rata se indican con "r" delante de la etiqueta del gen). Los exones de los tres genes C1q se etiquetan más abajo del diagrama (por ejemplo, E1, E2 y E3). Se indican varias ubicaciones de enzimas de restricción. CM=cloranfenicol; SDC-loxp- puro= cassette de autoeliminación loxp - puromicina.
La Figura 2C muestra una representación esquemática (no a escala) de la electroporación (EP) de un vector dirigido grande que contiene los tres genes C1q quiméricos de rata/humano en células ES C1q KO HET de rata. Los exones de los tres genes C1q se etiquetan más abajo del diagrama (por ejemplo, E1, E2 y E3). SDC-loxppuro= cassette de autoeliminación loxp - puromicina; p=secuencia poliA. Las uniones de secuencias entre secuencias de rata, humano o casete se indican con una línea y una SEQ ID NO para esa secuencia respectiva más abajo de cada unión.
La Figura 3A muestra las alineaciones de aminoácidos de C1qa para los polipéptidos de rata (rC1qa), humano (hC1QA) y ratón (mC1qa), con las similitudes subrayadas y las discordancias mostradas en los casos inferiores. Las secuencias del péptido señal están encuadradas y etiquetadas. Las secuencias de repetición de triple hélice de colágeno están encuadradas y etiquetadas. Las secuencias del dominio de la cabeza globular de C1qa están encuadradas con líneas discontinuas, y la unión de la secuencia ratón/humano o rata/humano en los polipéptidos quiméricos se representa con una línea discontinua y se indica con una flecha.
La Figura 3B muestra alineaciones de aminoácidos C1qb para polipéptidos de rata (rC1qb), humano (hC1QB) y ratón (mC1qb), con las similitudes subrayadas y las discordancias mostradas en los casos inferiores. Las secuencias del péptido señal están encuadradas y etiquetadas. Las secuencias de repetición de triple hélice de colágeno están encuadradas y etiquetadas. Las secuencias del dominio de la cabeza globular C1qb se encuadran con líneas discontinuas, y la unión de la secuencia de ratón/humano o rata/humano en los polipéptidos quiméricos se representa con una línea discontinua y se indica con una flecha.
La Figura 3C muestra alineaciones de aminoácidos C1qc para polipéptidos de rata (rC1qc), humano (hC1QC) y ratón (mC1qc), con las similitudes subrayadas y las discordancias mostradas en los casos inferiores. Las secuencias del péptido señal están encuadradas y etiquetadas. Las secuencias de repetición de triple hélice de colágeno están encuadradas y etiquetadas. Las secuencias del dominio de la cabeza globular C1qc se encuadran con líneas discontinuas, y la unión de la secuencia de ratón/humano o rata/humano en los polipéptidos quiméricos se representa con una línea discontinua y se indica con una flecha.
La Figura 4 panel superior muestra la presencia de proteínas C1q quiméricas en el suero de ratones C1q humanizados detectadas por el anticuerpo anti-C1q humano. La parte inferior del panel de la figura 4 muestra un ensayo de hemólisis que mide la actividad del complemento mediante la comparación de muestras de suero de ratones de camada genéticamente intacta (WT) y ratones quiméricos C1q (1615 HO; HO=homocigoto), y suero humano.
La Figura 5 muestra la actividad de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) mediada por un anticuerpo anti-CD20 humano a 2 nM y una muestra de suero (suero humano normal, suero de ratón C1q humanizado o suero de ratón genéticamente intactos) en células Raji. La figura 6 muestra los resultados de un ensayo de hemólisis que mide la actividad del complemento mediante la comparación de muestras de suero de ratas de camada genéticamente intacta ("WT"), ratas C1q humanizadas ("C1q Humin" o 100015HO; HO=homocigótico), ratas C1q genomanipuladas ("C1q KO"), suero humano normal ("n Hs") y suero humano C1q empobrecido. Panel izquierdo: ratas hembra; panel derecho, con la excepción de las ratas C1q KO: ratas macho. La Figura 7 muestra la actividad de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) mediada por un anticuerpo anti-CD20 humano a 20 nM y una muestra de suero (suero humano normal, suero de rata C1q humanizado o suero de rata genéticamente intacta) en células Raji.
Descripción detallada
Antes de que se expliquen y describan los presentes compuestos, composiciones, artículos, dispositivos y/o métodos, debe entenderse que no se limitan a métodos sintéticos específicos ni a métodos biotecnológicos recombinantes específicos, a menos que se especifique de cualquier otra manera, o a reactivos particulares, a menos que se especifique de cualquier otra manera, ya que éstos pueden, por supuesto, variar. También debe entenderse que la terminología empleada en la presente descripción tiene como único propósito describir modalidades particulares y no pretende ser limitativa.
A. Definiciones
Tal como se usa en la especificación y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto lo indique claramente de cualquier otra manera. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "un portador farmacéutico" incluye mezclas de dos o más de dichos portadores, y similares
Los intervalos pueden expresarse en la presente descripción como de "aproximadamente" un valor particular, y/o a "aproximadamente" otro valor particular. Cuando se expresa tal intervalo, otra modalidad incluye desde un valor particular y/o al otro valor particular. De manera similar, cuando los valores se expresan como aproximaciones, mediante el uso del precedente "aproximadamente", se debe entender que el valor particular forma otra modalidad. Se entenderá además que los criterios de valoración de cada uno de los intervalos son significativos tanto en relación con el otro criterio de valoración como independientemente del otro criterio de valoración.
En esta descripción y en las reivindicaciones que siguen, se hará referencia a una serie de términos que se definirán para tener los siguientes significados:
"Opcional" u "opcionalmente" significa que el evento o circunstancia descrito subsecuentemente puede o no ocurrir, y que la descripción incluye casos donde dicho evento o circunstancia ocurre y casos donde no ocurre.
Los "Cebadores" son un subconjunto de sondas que son capaces de soportar algún tipo de manipulación enzimática y que pueden hibridarse con un ácido nucleico objetivo de manera que pueda ocurrir la manipulación enzimática. Un cebador puede obtenerse a partir de cualquier combinación de nucleótidos o derivados de nucleótidos o análogos disponibles en la técnica que no interfieran con la manipulación enzimática.
Las "sondas" son moléculas capaces de interactuar con un ácido nucleico objetivo, típicamente de forma específica para la secuencia, por ejemplo, a través de la hibridación. La hibridación de ácidos nucleicos se entiende bien en la técnica y se discute en la presente descripción. Típicamente, una sonda puede producirse a partir de cualquier combinación de nucleótidos o derivados de nucleótidos o análogos disponibles en la técnica.
"Funcional" como se usa en la presente descripción, por ejemplo, en referencia a una proteína funcional, incluye una proteína que retiene al menos una actividad biológica normalmente asociada con la proteína nativa. Por ejemplo, en algunas modalidades, un reemplazo en un locus endógeno (por ejemplo, reemplazo en loci de C1q endógeno no humano) da como resultado un locus que no expresa una proteína endógena funcional.
El término "enlace operativo" incluye una yuxtaposición en donde los componentes así descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera prevista. Como tal, una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína puede unirse operativamente a secuencias reguladoras (por ejemplo, promotor, potenciador, secuencia silenciadora, etc.) para retener una regulación transcripcional adecuada.
Por ejemplo, por "enlace operativo" se entiende un enlace funcional entre una secuencia de control de expresión de ácido nucleico ( tal como un promotor) y una segunda secuencia de ácido nucleico, en donde la secuencia de control de expresión dirige la transcripción del ácido nucleico correspondiente a la segunda secuencia. Además, diversas porciones de la proteína humanizada de la presente descripción en enlace o fusión operativa para retener el plegamiento, procesamiento, objetivo, expresión y otras propiedades funcionales adecuadas de la proteína en la célula. A menos que se indique de cualquier otra manera, diversos dominios de la proteína humanizada de la presente descripción se enlazan operativamente entre sí.
El término "humanizado", tal como se usa en las frases "alelo C1q humanizado", "alelo C1qa humanizado", "alelo C1qb humanizado", "alelo C1qc humanizado", "gen C1q humanizado", "gen C1qa humanizado", "gen C1qb humanizado" o "gen C1qc humanizado, "incluye, pero no se limita a, modalidades en donde todo o una porción de un gen o alelo C1q, C1qa, C1qb y/o C1qc endógeno de roedor se sustituye por una porción correspondiente del gen o alelo C1q, C1qa, C1qb y/o C1qc humano. Por ejemplo, en algunas modalidades, el término "humanizado" se refiere al reemplazo completo de la región codificante ( por ejemplo, los exones) del gen o alelo C1q, C1qa, C1qb y/o C1qc endógeno no humano por la región codificante correspondiente del gen o alelo C1q, C1qa, C1qb y/o C1qc humano, mientras que la(s) región(es) endógena(s) no codificante(s) ( tales como, pero no limitadas a, el promotor, la(s) región(es) no traducida(s) 5' y/o 3', elementos potenciadores, etc.) del animal no humano pueden no reemplazarse. En algunas modalidades, el gen o alelo humanizado se coloca aleatoriamente en el genoma o dirigido a una ubicación particular dentro del genoma. Por lo tanto, en algunas modalidades, el gen o alelo humanizado se coloca en una ubicación en el genoma que no es la ubicación nativa para el gen o alelo endógeno correspondiente, es decir, se coloca en una ubicación distinta del locus endógeno. En otras modalidades, el gen o alelo humanizado se coloca en el locus endógeno; por ejemplo, el gen o alelo humanizado puede reemplazar el gen o alelo endógeno en el locus endógeno. En algunas modalidades, el roedor es una rata o un ratón.
Una "proteína humanizada" incluye, pero no se limita a, modalidades en donde una porción de la proteína C1q, C1qa, C1qb, y/o C1qc endógena de roedor codificada se reemplaza por la porción correspondiente de la proteína C1q, C1qa, C1qb, y/o C1qc humana. En algunas modalidades, una "proteína humanizada" puede estar codificada por un gen o alelo C1q, C1qa, C1qb y/o C1qc humanizado, pero aun así es una proteína C1q, C1qa, C1qb y/o C1qc totalmente humana ( tal como, pero sin limitarse a, la situación en donde todas las regiones codificantes ( por ejemplo, los exones) del gen o alelo C1q, C1qa, C1qb y/o C1qc endógeno no humano se sustituyen por las regiones codificantes correspondientes del gen o alelo C1q, C1qa, C1qb y/o C1qc humano, pero no se sustituyen las regiones no codificantes endógenas (tales como, pero sin limitarse a, el promotor, la(s) región(es) no traducida(s) 5' y/o 3', elementos potenciadores, etc.) del animal no humano). En algunas modalidades, la proteína humanizada se expresa a partir del gen o alelo humanizado que no está en su ubicación nativa en el genoma, por ejemplo, no está en el locus endógeno. En otras modalidades, la proteína humanizada se expresa a partir del gen o alelo humanizado que está en el locus endógeno. En algunas modalidades, la proteína humanizada se expresa a partir del gen o alelo humanizado que reemplaza el gen o alelo endógeno en el locus endógeno. En algunas modalidades, el roedor es una rata o un ratón.
La presente descripción se dirige a una humanización similar. Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos de un gen C1q de roedor endógeno en enlace operativo a una secuencia de nucleótidos de un gen C1q cognado humano para formar un gen quimérico humanizado. En algunas modalidades, una secuencia de nucleótidos de un gen C1qa endógeno en enlace operativo a una secuencia de nucleótidos de un gen C1qa humano para formar un gen C1qa humanizado. En otras modalidades, una secuencia de nucleótidos de un gen C1qb endógeno en enlace operativo a una secuencia de nucleótidos de un gen C1qb humano para formar un gen C1qb humanizado. En otras modalidades más, una secuencia de nucleótidos de un gen C1qc endógeno en enlace operativo a una secuencia de nucleótidos de un gen C1qc humano para formar un gen C1qc humanizado.
El término "quimérico", como se usa en la presente descripción, incluye una secuencia, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico o polipéptido, donde una porción de la secuencia se deriva de un organismo y una porción de la secuencia se deriva de un organismo diferente. Por ejemplo, un polipéptido C1q quimérico puede comprender una secuencia derivada de un ratón o una rata, y otra secuencia derivada de una proteína C1q humana. En una modalidad, un polipéptido C1q quimérico comprende un dominio de cabeza globular o un fragmento del mismo de un polipéptido C1q humano, y un dominio de pedúnculo y un dominio de tallo de un polipéptido C1q cognado de ratón o rata.
El término "locus" como en "locus C1q" se refiere a la ubicación del ADN genómico que comprende una región codificante de C1q. Por ejemplo, un locus C1qa se refiere a la ubicación del ADN genómico que comprende la región codificante C1qa; un locus C1qb se refiere a la ubicación del ADN genómico que comprende la región codificante C1qb; y un locus C1qc se refiere a la ubicación del ADN genómico que comprende la región codificante C1qc. Una referencia a "un locus C1q" significa cualquiera de los locus C1qa, C1qb o C1qc. Pueden incluirse otras secuencias en un locus C1q que se han introducido con fines de manipulación genética, por ejemplo, casetes de selección, sitios de restricción, etc.
Otras definiciones y significado de diversos términos usados a lo largo de esta especificación y las reivindicaciones se incluyen a lo largo de las secciones relevantes.
B. Composiciones
Se describen los componentes que se usarán para preparar las composiciones descritas, así como también las composiciones en sí mismas que se usarán dentro de los métodos descritos en la presente descripción. Estos y otros materiales se describen en la presente descripción, y se entiende que cuando se describen combinaciones, subconjuntos, interacciones, grupos, etc. de estos materiales, mientras que la referencia específica a cada una de las diversas combinaciones y permutaciones individuales y colectivas de estos componentes puede no enumerarse explícitamente, cada uno se contempla y describe específicamente en la presente descripción. Por ejemplo, si una C1qa quimérica particular, C1qb, y/o se describe y discute el ácido nucleico o polipéptido C1qc y un número de modificaciones que pueden realizarse a un número de moléculas que incluyen el C1qa quimérico, C1qb, y/o se discuten el ácido nucleico o polipéptido C1qc, se contempla específicamente cada una de las combinaciones y permutaciones de C1qa quimérica, C1qb, y/o polipéptido o ácido nucleico C1qc y las modificaciones que son posibles a menos que se indique específicamente lo contrario. Por lo tanto, si se describe una clase de moléculas A, B y C, así como también una clase de moléculas D, E y F y un ejemplo de una molécula de combinación, se describe A-D, entonces incluso si cada una no se menciona individualmente cada una se contempla individual y colectivamente con significados combinaciones, A-E, A-F, B-D, B-E, B-F, C-D, C-E y C-F se consideran descritos. Igualmente, también se describe cualquier subconjunto o combinación de estos. Por lo tanto, por ejemplo, el subgrupo de A-E, B-F y C-E se consideraría descrito. Este concepto se aplica a todos los aspectos de esta solicitud, que incluyen, pero no se limitan a, las etapas en los métodos de fabricación y mediante el uso de las composiciones descritas. Por lo tanto, si hay una variedad de etapas adicionales que pueden realizarse, se entiende que cada una de estas etapas adicionales puede realizarse con cualquier modalidad específica o combinación de modalidades de los métodos descritos.
C. Polipéptidos
La presente descripción incluye nuevos polipéptidos C1q de mamíferos quiméricos y ácidos nucleicos que codifican dichos polipéptidos. La presente invención proporciona roedores genéticamente modificados que comprenden dichos ácidos nucleicos y pueden expresar los polipéptidos C1q quiméricos.
Como se usa en la presente descripción, "C1q" (por ejemplo, como en "proteína C1q" o "complejo C1q"), es una porción del complejo C1 que, junto con C1r y C1s, inicia la activación de la vía del complemento. C1q es el primer componente de la vía clásica del complemento, requerida para el aclaramiento de patógenos, cuerpos apoptóticos y posiblemente células tumorales (Ghai R y otros, Immunobiology. 2007;212(4-5):253-66; Lu JH y otros, Cell Mol Immunol. febrero de 2008;5(1):9-21). La vía del complemento es parte del sistema inmunitario innato. La activación de la vía del complemento puede resultar en lisis directa del antígeno, reclutamiento de fagocitos y macrófagos al sitio antigénico, opsonización del antígeno por los fagocitos y secreción de citocinas.
La proteína C1q humana/ratón/rata está compuesta por polipéptidos codificados por tres genes, los genes C1qa, C1qc y C1qb, que están dispuestos en tándem 5'-3' en el orden A-C-B (Petry F y otros, Immunogenetics.
1996;43(6):370-6). Estos polipéptidos también se denominan en la presente descripción como un "polipéptido C1q", que puede ser un polipéptido C1qa, un polipéptido C1qb o un polipéptido C1qc. Cada una de las cadenas polipeptídicas C1qa, C1qb y C1qc tiene una región N-terminal que incluye un dominio de tallo (o cuello) que contiene un residuo de cisteína seguido de un dominio similar al colágeno (dominio de pedúnculo), y una región C-terminal (dominio de cabeza globular). La región N-terminal también se denomina en la presente descripción como "región tallo-pedúnculo N-terminal", y la región C-terminal también se denomina como el "dominio de cabeza globular". La proteína C1q humana (aprox. 410 kDa) se asemeja a una estructura en forma de buqué ensamblada a partir de seis pedúnculos colágenos, cada uno de los cuales termina con una cabeza globular. Cada pedúnculo/cabeza globular está formado por tres cadenas polipeptídicas (C1qA, C1qB y C1qC) para un total de 18 polipéptidos (seis cadenas A, seis cadenas B y seis cadenas C forman una molécula C1q (Reid KB Biochem Soc Trans. enero de 1983;11(1):1-12)).
C1q se expresa en macrófagos esplénicos y células dendríticas tanto en humanos como en roedores (Castellano G y otros, Blood. 15 de mayo de 2004;103(10):3813-20) C1q se secreta y se encuentra en la circulación humana a aproximadamente 100 ug/ml, y a niveles similares en ratones (Dillon SP y otros, Biotechnol J. agosto de 2009; 4(8): 1210-1214; Yonemasu K y otros, Int Arch Allergy Appl Immunol. 1988;86(1):97-101). La proteína pertenece a un grupo de colágenos de defensa que reconocen patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP), donde el C-terminal/cabeza globular de C1q reconoce el dominio CH3 de IgM; el dominio CH2 de IgG; beta-amiloide; polianiones que incluyen ADN; proteína C-reactiva; amiloide sérico P, así como también PAMP asociados a LPS, virus y priones (Dunkelberger JR, Song WC, Cell Res. enero de 2010;20(1):34-50; Ghai R y otros, Immunobiology.
2007;212(4-5):253-66). C1q se ensambla espontáneamente con el tetrámero C1s-C1r-C1s para formar el macrocomplejo C1. El macrocomplejo C1 es un pentámero de tres proteínas que comprende un complejo C1q, y dos cada uno de C1r y C1s, donde C1r y C1s se asocian con los dominios tallo-pedúnculo de C1q. C1r y C1s están regulados por el inhibidor C1, miembro de la familia de los inhibidores de la serpina proteasa (C1INH) (Beinrohr L y otros, Trends Mol Med. diciembre de 2008;14(12):511-21). C1q también se une a receptores que incluyen CD93, DC-SIGN y CR1/CD35 (Hosszu KK y otros, Blood. 9 de agosto de 2012;120(6):1228-36; Bohlson SS y otros, Mol Immunol. enero de 2007;44(1-3):33-43). Al unirse a los PAMP, C1q opsoniza y facilita la eliminación de patógenos y puede potenciar la fagocitosis de partículas objetivo opsonizadas de forma subóptima con C3b/C4b o IgG, a través de CR1 o FcgR, respectivamente (Bobak DA y otros, J Immunol. 15 de febrero de 1987;138(4):1150-6). Por lo tanto, C1q activa la vía clásica del complemento, lo que resulta tanto en la formación del complejo de ataque a la membrana (lisis del objetivo) y también la generación de fragmentos de activación C3a y C5a (Bohlson SS y otros, Mol Immunol. enero de 2007;44(1-3):33-43). Por último, el C1q interviene en la eliminación de complejos inmunitarios, así como también de células que sufren apoptosis y vesículas celulares por reconocimiento de patrones moleculares asociados a células apoptóticas.
Para activar la vía clásica del complemento, C1q se une a la superficie del patógeno o al dominio Fc de los anticuerpos a través de sus seis cabezas globulares, lo que resulta en la activación de las serina proteasas C1r y C1s, que conducen a la escisión de los componentes aguas abajo del complemento y, en última instancia, a la activación del complemento, la deposición y la lisis celular a través del complejo de ataque de membrana ( ver Reid KB Biochem Soc Trans. enero de 1983;11(1):1-12)).
Las secuencias ilustrativas y los números de acceso de GenBank de C1qa, C1qb y C1qc humano, de ratón y de rata se presentan en las Tablas 1, 2 y 8, más abajo, y en la Figura 3A (C1qa), Figura 3B (C1qb), y Figura 3C (C1qc).
Como es el C1q el que reconoce el dominio Fc de los anticuerpos o el antígeno directamente, es el C1q la clave para proporcionar un sistema de complemento humanizado. Como el dominio de cabeza globular de C1q (a menudo abreviado como gC1q) es lo que reconoce el anticuerpo humano o el patógeno humano, en determinadas modalidades proporcionadas en la presente descripción, el dominio de cabeza globular de C1q se modificó genéticamente de manera que reconoce más fácilmente estas moléculas. En determinadas modalidades, el dominio de cabeza globular de C1q es humano mientras que el resto de la proteína es no humano. En tal modalidad, los animales no humanos proporcionados en la presente descripción retienen la porción de la proteína que se sabe que interactúa con los C1r/C1s y el resto del sistema del complemento (por ejemplo, la porción de tallo y pedúnculo de la proteína). Por lo tanto, en las modalidades proporcionadas en la presente descripción, el roedor que expresa C1q que alberga un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % idéntico a un dominio de cabeza globular humano y una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos un 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido con región de tallo N-terminal endógeno de roedor es útil para evaluar el requisito de sistema del complemento como un mecanismo de acción efector de una molécula terapéutica, por ejemplo, un anticuerpo. En las modalidades proporcionadas, dicho roedor también es útil para estudiar la efectividad del tratamiento terapéutico si el sistema del complemento se acopla por el anticuerpo. En las modalidades proporcionadas, tales roedores también son útiles como modeloin vivopara probar la eficacia de anticuerpos terapéuticos totalmente humanos, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, diseñados para indicaciones de enfermedades infecciosas.
Por lo tanto, en la presente descripción se describen polipéptidos C1q de mamíferos quiméricos (tales como, por ejemplo, polipéptidos C1qa, C1qb y/o C1qc de mamíferos quiméricos).
En algunas modalidades, el polipéptido C1q quimérico proporcionado en la presente descripción comprende una región terminal C humana que es responsable del reconocimiento del dominio Fc de inmunoglobulina, o responsable de reconocer patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP).
En los polipéptidos C1q quiméricos expresados por los roedores proporcionados en la presente descripción comprende un dominio de cabeza globular humano o un fragmento de este.
Un polipéptido C1q quimérico comprende un dominio de cabeza globular que es sustancialmente humano. Por "un dominio de cabeza globular que es sustancialmente humano", se entiende que el dominio de cabeza globular en un polipéptido C1q quimérico (humanizado) es sustancialmente idéntico al dominio de cabeza globular de un polipéptido C1q humano. Por "sustancialmente idéntico", se refiere a un dominio de cabeza globular que es al menos 90 %, 95 %, 98 %, 99%o 100%idéntico en secuencia al dominio de cabeza globular de un polipéptido C1q humano. En otras modalidades, un dominio de cabeza globular difiere del dominio de cabeza globular de un polipéptido C1q humano en no más de 5, 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s). En otras modalidades más, un dominio de cabeza globular que difiere del dominio de cabeza globular de un polipéptido C1q humano solo en la porción N- o C-terminal del dominio, por ejemplo, al tener la misma longitud pero con una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o 5, pero no más de 5) sustituciones de aminoácidos (tal como una sustitución conservadora) dentro de la porción N- o C-terminal del dominio de cabeza globular (por ejemplo, dentro de los 5-10 aminoácidos en el extremo N- o C-terminal del dominio de cabeza globular). En otras modalidades, un dominio de cabeza globular es más corto o largo que el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1q humano en 1, 2, 3, 4, 5 pero no más de 5 aminoácidos en el extremo N- o C-terminal del dominio. En algunas modalidades, un dominio de cabeza globular sustancialmente idéntico al dominio de cabeza globular de un polipéptido C1q humano difiere del dominio de cabeza globular humana en no más de 1, 2, o 3 aminoácidos dentro de la porción N-terminal (por ejemplo, dentro de los 5-10 aminoácidos del extremo N-terminal) del dominio; y en determinadas de tales modalidades, la diferencia comprende una(s) sustitución(es) de un aminoácido en el dominio de cabeza globular humana con el aminoácido en la posición correspondiente de un cognado no humano (por ejemplo, un dominio de cabeza globular de ratón o rata). Por ejemplo, se describe en la presente descripción en la Figura 3A un polipéptido C1qa quimérico que tiene un dominio de cabeza globular que es sustancialmente humano - el dominio globular de este polipéptido C1qa quimérico difiere del dominio de cabeza globular de un C1qa humano de la SEQ ID NO: 4 por solo un aminoácido en la tercera posición del extremo N-terminal del dominio de cabeza globular ("K" en humano, y "R" en los polipéptidos C1qa quiméricos, de ratón y de rata).
En algunas modalidades, el polipéptido C1q quimérico comprende una región tallo-pedúnculo N terminal que es responsable de reconocer C1s y C1r de roedores (por ejemplo, roedores endógenos) y/u otros componentes de roedores (por ejemplo, roedores endógenos) de la vía del complemento.
El polipéptido C1q quimérico comprende una región tallo-pedúnculo de roedor que es al menos 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de una región tallo-pedúnculo N-terminal endógena de roedor. En algunas modalidades, el polipéptido C1q quimérico comprende un dominio de triple hélice de colágeno no humano. En algunas modalidades, el polipéptido C1q quimérico comprende una región terminal N de roedor que comprende un pedúnculo de roedor y dominios de tallo de roedor.
Un polipéptido C1q quimérico proporcionado en la presente descripción comprende una región tallo-pedúnculo N-terminal que es sustancialmente no humana. Por "una región tallo-pedúnculo N-terminal que es sustancialmente no humana", se entiende que la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1q quimérico es sustancialmente idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal correspondiente a un polipéptido C1q de roedor. Por "sustancialmente idéntico", se entiende una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos 90 %, 95 %, 95 %, 99 % o 100 % idéntica en secuencia con la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1q no humano. En otras modalidades, una región tallo-pedúnculo N-terminal difiere de la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido
C1q no humano en no más de 5, 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s). En otras modalidades más, una región tallo-pedúnculo N-terminal difiere de la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1q no humano solo en el extremo C-terminal, por ejemplo, al tener la misma longitud, pero con una o más sustituciones de aminoácidos de los 5-10 aminoácidos del extremo C-terminal de la región tallo-pedúnculo. En otras modalidades, una región tallo-pedúnculo
N-terminal es más corta o larga que la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1q no humano por 1, 2,
3, 4 o 5 pero no más de 5 aminoácidos en el extremo N- o C-terminal de la región. En modalidades específicas, la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1q quimérico es idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1q de roedor.
En una modalidad, un polipéptido C1qa humano comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 4. En otra modalidad, un polipéptido C1qa humano comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en el núm. de acceso de GenBank NP_001334394.1. En una modalidad, un polipéptido C1qb humano comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 5. En otra modalidad, un polipéptido C1qb humano comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en el núm. de acceso de GenBank NP_000482.3. En una modalidad, un polipéptido C1qc humano comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 6. En otra modalidad, un polipéptido C1qc humano comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en el núm. de acceso de GenBank NP_001334548.1.
En una modalidad, un polipéptido C1qa de ratón comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 1. En otra modalidad, un polipéptido C1qa de ratón comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en el núm. de acceso de GenBank NP_031598.2. En una modalidad, un polipéptido C1qb de ratón comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 2. En otra modalidad, un polipéptido C1qb de ratón comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en el núm. de acceso de GenBank NP_033907.1. En una modalidad, un polipéptido C1qc de ratón comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 3. En otra modalidad, un polipéptido C1qc de ratón comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en el núm. de acceso de GenBank NP_031600.2.
En una modalidad, un polipéptido C1qa de rata comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ
ID NO: 7. En otra modalidad, un polipéptido C1qa de rata comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en el núm. de acceso de GenBank NP_001008515.1. En una modalidad, un polipéptido C1qb de rata comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 8. En otra modalidad, un polipéptido C1qb de rata comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en el núm. de acceso de GenBank Np_062135.1. En una modalidad, un polipéptido C1qc de rata comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 9. En otra modalidad, un polipéptido C1qc de rata comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en el núm. de acceso de GenBank nP_001008524.1.
El roedor de la invención expresa un polipéptido C1qa de mamíferos quiméricos.
El polipéptido C1qa quimérico comprende un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % idéntico al dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qa humano en donde el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qa humano comprende los aminoácidos 108-245 de la SEQ ID NO: 4. En una modalidad, el polipéptido es un polipéptido C1qa quimérico que comprende los aminoácidos 122-222 del polipéptido C1qa humano como se expone en la SEQ ID NO: 4 (por ejemplo, un polipéptido C1qa de mamíferos quiméricos que comprende los aminoácidos 122-235 o 112-245 del polipéptido C1qa humano).
El polipéptido C1qa quimérico comprende un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % idéntico al dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qa humano, el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qa humano comprende los aminoácidos 108-245 de la SEQ ID NO: 4. En una modalidad, un polipéptido C1qa humano comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4, y los aminoácidos 108-245 de la SEQ ID NO: 4 constituyen el dominio de cabeza globular del polipéptido C1qa humano de la SEQ ID NO: 4 (ver Figura 3A). En una modalidad específica, el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qa quimérico está representado por los aminoácidos 108-245 de la SEQ ID NO: 10, dicho dominio difiere del dominio de cabeza globular de C1qa humano representado por los aminoácidos 108-245 de la SEQ ID NO: 4 en un aminoácido (el tercer residuo de aminoácido es "R" como en C1qa de ratón y rata, en lugar de "K" en C1qa humano). En otra modalidad específica, un polipéptido C1qa quimérico comprende un dominio de cabeza globular que es idéntico al dominio de cabeza globular C1qa humano representado por los aminoácidos 108-245 de la SEQ ID NO: 4.
Un polipéptido C1qa quimérico comprende una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos un 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qa endógeno de roedor. Por lo tanto, en algunas modalidades, un polipéptido C1qa quimérico de mamífero comprende una secuencia de roedor que es una secuencia de ratón que comprende al menos los aminoácidos 33-102, 30-102, 25-105, 23-107 o 23-111 del polipéptido C1qa de ratón establecido en la SEQ ID NO: 1. En otras modalidades, el polipéptido C1qa de mamífero quimérico comprende una secuencia de roedor que es una secuencia de rata que comprende al menos los aminoácidos 33-102, 30-102, 25-105, 23-107 o 23-111 del polipéptido C1qa de rata establecido en la SEQ ID NO: 7. En determinadas modalidades, el polipéptido C1qa quimérico comprende una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qa de ratón. En una modalidad, el polipéptido C1qa de ratón comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 (Figura 3A), y los aminoácidos 23-107 de la SEQ ID NO: 1 constituyen la región de tallo-pedúnculo N-terminal del polipéptido C1qa de ratón de la SEQ ID NO: 1 (Figura 3A). Por lo tanto, en algunas modalidades, un polipéptido C1qa quimérico comprende una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de C1qa de ratón representada por los aminoácidos 23-107 de la SEQ ID NO: 1. En una modalidad específica, la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qa quimérico se representa por los aminoácidos 23-107 de la SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, el polipéptido C1qa quimérico comprende una región tallopedúnculo N-terminal que es al menos 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qa de rata. En una modalidad, el polipéptido C1qa de rata que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 (Figura 3A), y los aminoácidos 23-107 de la SEQ ID NO: 7 constituyen la región tallo-pedúnculo N-terminal del polipéptido C1qa de rata de la SEQ ID NO: 7 (Figura 3A). Por lo tanto, en algunas modalidades, un polipéptido C1qa quimérico comprende una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de C1qa de rata representada por los aminoácidos 23-107 de la SEQ ID NO: 7. En una modalidad específica, la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qa quimérico se representa por los aminoácidos 23-107 de la SEQ ID NO: 7.
El polipéptido C1qa quimérico comprende (i) un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % idéntico al dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qa humano, en donde el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qa humano comprende los aminoácidos 108-245 de la SEQ ID NO: 4, y (ii) una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos un 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qa endógeno de roedor. Por ejemplo, se describe en la presente descripción un polipéptido C1qa de mamífero quimérico, en donde el polipéptido C1qa de mamífero quimérico comprende al menos los aminoácidos 23-245 del polipéptido establecido en la SEQ ID NO: 10 (ratón/humano) o al menos los aminoácidos 23-245 del polipéptido establecido en la SEQ ID NO:55 (rata/humano). En un aspecto, el polipéptido C1qa quimérico es o comprende la SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 55.
El roedor de la presente invención también expresa un polipéptido C1qb de mamíferos quiméricos.
El polipéptido C1qb quimérico comprende (i) un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % idéntico al dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qb humano, en donde el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qb humano comprende los aminoácidos 115-251 de la SEQ ID NO: 5, y (ii) una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos un 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qb endógeno de roedor. En una modalidad, el polipéptido es un polipéptido C1qb quimérico que comprende los aminoácidos 125-233 del polipéptido C1qb humano como se expone en la SEQ ID NO: 5 (tal como, por ejemplo, los aminoácidos 120-250 o 118-251 del polipéptido C1qb humano).
El polipéptido C1qb quimérico comprende un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % humano idéntico al dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qb humano en donde el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qb humano comprende los aminoácidos 115-251 de la SEQ ID NO: 5. En una modalidad, un polipéptido C1qb humano comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5 (Figura 3B), y los aminoácidos 115-251 de la SEQ ID NO: 5 constituyen el dominio de cabeza globular del polipéptido C1qb humano de la SEQ ID NO: 5 (Figura 3B). En una modalidad específica, el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qb quimérico está representado por los aminoácidos 115-251 de la SEQ ID NO: 11, dicho dominio difiere del dominio de cabeza globular C1qb humano representado por los aminoácidos 115-251 de la SEQ ID NO: 5 en un aminoácido (el primer residuo de aminoácido es "G" como en C1qb de ratón, en lugar de "K" en C1qb humano). En otra modalidad específica, un polipéptido C1qb quimérico comprende un dominio de cabeza globular que es idéntico al dominio de cabeza globular C1qb humano representado por los aminoácidos 115-251 de la SEQ ID NO: 5.
Un polipéptido C1qb quimérico comprende una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos un 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qb endógeno de roedor. En algunas modalidades, el polipéptido C1qb de mamíferos quiméricos comprende una secuencia de roedor que es una secuencia de ratón que comprende al menos los aminoácidos 32-105, 27-105, 27-110, 26-114 o 26-117 del polipéptido C1qb de ratón expuesto en la SEQ ID NO: 2. En otras modalidades, el polipéptido C1qb de mamíferos quiméricos comprende una secuencia de roedor que es una secuencia de rata que comprende al menos los aminoácidos 32-105, 27-105, 27 110, 26-114 o 26-117 del polipéptido C1qb de rata expuesto en la SEQ ID NO: 8.
En determinadas modalidades, el polipéptido C1qb quimérico comprende una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qb de ratón. En una modalidad, el polipéptido C1qb de ratón comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 (Figura 3B), y los aminoácidos 26-114 de la SEQ ID NO: 2 constituyen la región tallo-pedúnculo N-terminal del polipéptido C1qb de ratón de la SEQ ID NO: 2 (Figura 3B). Por lo tanto, en algunas modalidades, un polipéptido C1qb quimérico comprende una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de C1qb de ratón representada por los aminoácidos 26-114 de la SEQ ID NO: 2. En una modalidad específica, la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qb quimérico se representa por los aminoácidos 26-114 de la SEQ ID NO: 2. En algunas modalidades, el polipéptido C1qb quimérico comprende una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qb de rata. En una modalidad, el polipéptido C1qb de rata que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 (Figura 3B), y los aminoácidos 26-114 de la SEQ ID NO: 8 constituyen la región de tallo-pedúnculo N-terminal del polipéptido C1qb de rata de la SEQ ID NO: 8 (Figura 3B). Por lo tanto, en algunas modalidades, un polipéptido C1qb quimérico comprende una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos 90 % idéntica a la región tallopedúnculo N-terminal de C1qb de rata representada por los aminoácidos 26-114 de la SEQ ID NO: 8. En una modalidad específica, la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qb quimérico se representa por los aminoácidos 26-114 de la SEQ ID NO: 8.
En algunas modalidades, un polipéptido C1qb de mamíferos quiméricos es uno en donde el polipéptido comprende al menos los aminoácidos 26-251 del polipéptido expuesto en la SEQ ID NO: 11 (ratón/humano) o al menos los aminoácidos 26-251 del polipéptido expuesto en la SEQ ID NO: 56 (rata/humano). En un aspecto, el polipéptido C1qb quimérico es o comprende la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 56.
Un roedor de la presente invención también expresa un polipéptido C1qc quimérico.
El polipéptido C1qc quimérico comprende un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % idéntico al dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qc humano en donde el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qc humano comprende los aminoácidos 113-245 de la SEQ ID NO: 6. En una modalidad, el polipéptido es un polipéptido C1qc quimérico que comprende los aminoácidos 114-245 del polipéptido C1qc humano expuesto en la SEQ ID NO: 6).
En una modalidad, el polipéptido C1qc humano comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 (Figura 3C), y los aminoácidos 113-245 de la SEQ ID NO: 6 constituyen el dominio cabeza globular del polipéptido C1qc humano de la SEQ ID NO: 6 (Figura 3C). Por lo tanto, un polipéptido C1qc quimérico comprende un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % idéntico al dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qc humano en donde el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qc humano comprende los aminoácidos 113-245 de la SEQ ID NO: 6. En una modalidad específica, el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qc quimérico es idéntico al dominio de cabeza globular C1qc humano representado por los aminoácidos 113-245 de la SEQ ID NO: 6.
Un polipéptido C1qc quimérico en la presente invención comprende una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos un 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1q endógeno de roedor. Por ejemplo, se describe en la presente descripción un polipéptido C1qc de mamíferos quiméricos en donde la secuencia de roedor es una secuencia de ratón que comprende al menos los aminoácidos 31-111, 30-113 o 30-114 del polipéptido C1qc de ratón expuesto en la SEQ ID NO: 3; o el polipéptido C1qc de mamíferos quiméricos en donde la secuencia de roedor es una secuencia de rata que comprende al menos los aminoácidos 33-113, 32-115 o 32-116 del polipéptido C1qc de rata expuesto en la SEQ ID NO: 9.
En determinadas modalidades, el polipéptido C1qc quimérico comprende una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos un 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qc de ratón. En una modalidad, el polipéptido C1qc de ratón comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 (Figura 3C), y los aminoácidos 30-113 de la SEQ ID NO: 3 constituyen la región tallo-pedúnculo N-terminal del polipéptido C1qc de ratón de la SEQ ID NO: 3 (Figura 3C). Por lo tanto, en algunas modalidades, un polipéptido C1qc quimérico comprende una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos un 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de C1qc de ratón representada por los aminoácidos 30-113 de la SEQ ID NO: 3. En una modalidad específica, la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qc quimérico se representa por los aminoácidos 30-113 de la SEQ ID NO: 3. En algunas modalidades, el polipéptido C1qc quimérico comprende una región tallopedúnculo N-terminal que es al menos un 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qc de rata. En una modalidad, el polipéptido C1qc de rata que comprende la secuencia de aminoácidos de la S<e>Q ID NO: 9 (Figura 3C), y los aminoácidos 32-115 de la S<e>Q ID NO: 9 constituyen la región tallo-pedúnculo N-terminal del polipéptido C1qc de rata de la SEQ ID NO: 9 (Figura 3C). Por lo tanto, en algunas modalidades, un polipéptido C1qc quimérico comprende una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos un 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de C1qc de rata representada por los aminoácidos 32-115 de la SEQ ID NO: 9. En una modalidad específica, la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qc quimérico se representa por los aminoácidos 32-115 de la SEQ ID NO: 9.
En la presente invención, el polipéptido C1qc quimérico comprende (i) un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % idéntico al dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qc humano, en donde el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qc humano comprende los aminoácidos 113-245 de la SEQ ID NO: 6, y (ii) una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos un 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qc endógeno de roedor. Por ejemplo, también se describe en la presente descripción un polipéptido C1qc de mamíferos quiméricos, en donde el polipéptido comprende al menos los aminoácidos 30-246 del polipéptido expuesto en la SEQ ID NO: 12 (ratón/humano) o al menos los aminoácidos 32-248 del polipéptido expuesto en la SEQ ID NO: 57 (rata/humano). En un aspecto, el polipéptido C1qc quimérico es o comprende la SEQ ID NO: 12 o la SEQ ID NO: 57.
En un caso particular, se describe en la presente descripción una proteína C1q quimérica que comprende uno o más de los polipéptidos C1q quiméricos descritos en la presente descripción. Por ejemplo, se describe en la presente descripción una proteína C1q quimérica, en donde la proteína comprende al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis C1qa quiméricos, uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis C1qb quiméricos, y uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis polipéptidos C1qc quiméricos Por lo tanto, en algunas modalidades, la proteína quimérica comprende seis de cada polipéptido C1qa quimérico, polipéptido C1qb quimérico y polipéptido C1qc quimérico.
Los polipéptidos C1q descritos son polipéptidos quiméricos que comprenden una estructura de aminoácidos en parte humana y en parte no humana. Se entiende y contempla en la presente descripción que las porciones humana y de roedor de los polipéptidos quiméricos descritos se unen, fusionan o se unen químicamente de cualquier otra manera para retener la funcionalidad del polipéptido C1q. Como se usa en la presente descripción, "función" y "funcionalidad" se refieren a la capacidad de llevar a cabo las tareas de la molécula nativa. Para C1qa, C1qb y C1qc, la funcionalidad incluye la capacidad de formar dímeros (para heterodímeros C1qa y C1qb y para homodímeros C1qc), la capacidad para que cada porción del polipéptido quimérico asuma un plegado adecuado, la capacidad de ensamblar como un trímero de dímeros (dos heterodímeros C1qa y C1qb y 1 homodímero C1qc por trímero) que forman un complejo C1q, la capacidad de formar un complejo pentámero C1 con C1r y C1s, la capacidad de reconocer un dominio Fc de un anticuerpo o los PAMP, y la capacidad para iniciar la vía clásica del complemento. Se ha descrito el ensamble de una proteína C1q (ver, por ejemplo, Lu y otros (Cellular y Mol. Immunol. 2008, 5(1): 9 21), especialmente la Figura 1). Las cadenas polipeptídicas C1qa y C1qb dimerizan a través de un enlace disulfuro en el extremo N-terminal y dos cadenas C1qc forman homodímeros a través de un enlace disulfuro similar. Un dímero C1qa-C1qb y una sola cadena C1qc forman una triple hélice y la otra cadena C1qc en un dímero C1qc- C1qc se trimeriza con otro dímero C1qa-C1qb formando dos triples hélices enlazadas por el enlace disulfuro entre las dos cadenas C1qc. Tres de tales estructuras forman una molécula de proteína C1q a través de la asociación N-terminal.
En la presente descripción se describe un polipéptido C1qa, C1qb y/o C1qc de mamíferos quiméricos, en donde el polipéptido descrito en la presente descripción comprende además una secuencia señal de C1qa, C1qb y/o C1qc humana, de ratón o de rata, respectivamente. Las secuencias ilustrativas de señales de C1qa, C1qb y C1qc humanas, de ratón y de rata se muestran en las Figuras 3A, 3B y 3C, respectivamente.
Se entiende y se contempla en la presente descripción que cualquiera de los polipéptidos quiméricos descritos puede expresarse en un roedor. Por lo tanto, abarcado por la descripción hay un roedor genéticamente modificado, por ejemplo, ratón o rata, que expresa una(s) proteína(s) C1q quimérica(s) descrita(s) en la presente descripción o proteína(s) C1q quimérica(s) que comprende variantes, por ejemplo, sustituciones conservativas de aminoácidos, de la(s) secuencia(s) de aminoácidos descritas en la presente descripción.
Por lo tanto, el polipéptido quimérico puede ser una de las numerosas variantes del polipéptido C1qa, C1qb y/o C1qc quimérico que se conocen y contemplan en la presente descripción. Además de las especies y variantes de cepas C1qa, C1qb y/o C1qc funcionales conocidas, existen derivados de los polipéptidos C1qa, C1qb y/o C1qc que también funcionan en los métodos y composiciones descritos. Las variantes y derivados de proteínas se entienden bien por los expertos en la técnica y pueden involucrar modificaciones de secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, las modificaciones de la secuencia de aminoácidos típicamente caen en una o más de tres clases: variantes sustitucionales, de inserción o deleciones. Estos tipos de modificaciones y técnicas moleculares para lograrlas se conocen en la técnica. Las sustituciones, deleciones, inserciones o cualquiera de sus combinaciones pueden combinarse para llegar a un constructo final. Estas modificaciones no deben colocar la secuencia fuera del marco de lectura y preferentemente no crearán regiones complementarias que puedan producir una estructura de ARNm secundaria. El término "conservador", cuando se usa para describir una sustitución de aminoácidos conservadora, incluye la sustitución de un residuo de aminoácido por otro residuo de aminoácido que tenga un grupo R de cadena lateral con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). Las sustituciones de aminoácidos conservadoras pueden conseguirse al modificar una secuencia nucleotídica para introducir un cambio nucleotídico que codificará la sustitución conservadora. En general, una sustitución de aminoácidos conservadora no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de interés de una proteína, por ejemplo, la capacidad del complejo C1q para unirse a la inmunoglobulina o activar la vía del complemento. Ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen cadenas laterales alifáticas tales como glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; cadenas laterales alifáticas-hidroxilo tales como serina y treonina; cadenas laterales que contienen amida tales como asparagina y glutamina; cadenas laterales aromáticas, tales como fenilalanina, tirosina y triptófano; cadenas laterales básicas, tales como lisina, arginina e histidina; cadenas laterales ácidas, tales como ácido aspártico y ácido glutámico; y cadenas laterales que contienen azufre, tales como cisteína y metionina. Los grupos de sustitución de aminoácidos conservadora incluyen, por ejemplo, valina/leucina/isoleucina, fenilalanina/tirosina, lisina/arginina, alanina/valina, glutamato/aspartato y asparagina/glutamina. En algunas modalidades, una sustitución de aminoácido conservadora puede ser una sustitución de cualquier residuo nativo en una proteína con alanina, como se usa en, por ejemplo, la mutagénesis por barrido de alanina. En algunas modalidades, se produce una sustitución conservadora que tiene un valor positivo en la matriz de posibilidad logarítmica PAM250 descrita en Gonnet y otros ((1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45). En algunas modalidades, la sustitución es una sustitución moderadamente conservadora en donde la sustitución tiene un valor no negativo en la matriz de posibilidad logarítmica PAM250.
Los cambios sustanciales en la función se realizan al seleccionar sustituciones que son menos conservadoras que las enumeradas anteriormente, es decir, al seleccionar residuos que difieren más significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura de la cadena principal del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo como una lámina o conformación helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo o (c) la mayor parte de la cadena lateral. Las sustituciones que en general se espera que produzcan los mayores cambios en las propiedades de la proteína serán aquellas en las que (a) un residuo hidrófilo, por ejemplo serilo o treonilo, se sustituya por (o mediante) un residuo hidrófobo, por ejemplo leucilo, isoleucilo, fenilalanilo, valilo o alanilo; (b) una cisteína o prolina se sustituya por (o mediante) cualquier otro residuo; (c) un residuo que tenga una cadena lateral electropositiva, por ejemplo, lisilo, arginilo o histidilo, es sustituido por (o mediante) un residuo electronegativo, por ejemplo, glutamilo o aspartilo; o (d) un residuo que tiene una cadena lateral voluminosa, por ejemplo, fenilalanina, es sustituido por (o mediante) uno que no tiene cadena lateral, por ejemplo, glicina, (e) al aumentar el número de sitios de sulfatación y/o glicosilación.
La mutagénesis sustitucional o delecional puede emplearse para insertar sitios para la N-glicosilación (Asn-X-Thr/Ser) u O-glicosilación (Ser o Thr). También pueden ser convenientes las deleciones de cisteína u otros residuos lábiles. Las deleciones o sustituciones de posibles sitios de proteólisis, por ejemplo, Arg se logran, por ejemplo, mediante la deleción de uno de los residuos básicos o la sustitución de uno por residuos de glutaminilo o histidilo.
Se entiende que las variantes y derivados de las proteínas descritas en la presente descripción se definen en términos de homología/identidad a secuencias específicas conocidas. Por ejemplo, la SEQ ID NO: 1 establece una secuencia particular del polipéptido C1qa de ratón, la SEQ ID NO: 2 establece una secuencia particular del polipéptido C1qb de ratón, la SEQ ID NO: 3 establece una secuencia particular del polipéptido C1qc de ratón, la SEQ ID NO: 4 establece una secuencia particular del polipéptido C1qa humano, la Se Q ID NO: 5 establece una secuencia particular del polipéptido C1qb humano, la SEQ ID NO: 6 establece una secuencia particular del polipéptido C1qc humano, la SEQ ID NO: 7 establece una secuencia particular del polipéptido C1qa de rata, la SEQ ID NO: 8 establece una secuencia particular del polipéptido C1qb de rata y la s Eq ID NO: 9 establece una secuencia particular de un polipéptido C1qc de rata. Se describen específicamente variantes de estas y otras proteínas descritas en la presente descripción que tienen al menos 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de homología con la secuencia indicada. En algunas modalidades, las secuencias homólogas son las representadas por los números de acceso de GenBank enumerados en las Tablas 1, 2 y 8. Los expertos en la técnica entienden fácilmente cómo determinar la homología de dos proteínas. Por ejemplo, la homología puede calcularse después de alinear las dos secuencias de manera que la homología esté en su nivel más alto.
Otra forma de calcular la homología puede realizarse mediante algoritmos publicados. La alineación óptima de las secuencias para su comparación puede realizarse mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), por el algoritmo de alineación homológica de Needleman y Wunsch, J. MoL Biol. 48: 443 (1970), por el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444 (1988), mediante implementaciones informáticas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante inspección.
Los mismos tipos de homología pueden obtenerse para ácidos nucleicos mediante, por ejemplo, los algoritmos descritos en Zuker, M. Science 244:48-52, 1989, Jaeger y otros Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7706-7710, 1989, Jaeger y otros Methods Enzymol. 183:281-306, 1989.
Se entiende que la descripción de mutaciones conservadoras y homología puede combinarse entre sí en cualquier combinación, tales como modalidades que tienen al menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de homología con una secuencia particular en donde las variantes son mutaciones conservadoras.
Como esta especificación discute diversas proteínas y secuencias proteicas, se entiende que también se describen los ácidos nucleicos que pueden codificar esas secuencias proteicas. Esto incluiría todas las secuencias degeneradas relacionadas con una secuencia de proteína específica, es decir, todos los ácidos nucleicos que tienen una secuencia que codifica una secuencia de proteína particular, así como también todos los ácidos nucleicos, lo que incluye los ácidos nucleicos degenerados, que codifican las variantes y derivados descritos de las secuencias de proteína. Por lo tanto, aunque cada secuencia de ácido nucleico particular puede no escribirse en la presente descripción, se entiende que cada una de las secuencias se describe y describe en la presente descripción a través de la secuencia de proteína descrita.
Sin perjuicio de la discusión de variantes en la presente descripción, un animal roedor modificado genéticamente de la presente invención es uno que comprende en su genoma
a. un ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qa quimérico, en donde el polipéptido C1qa quimérico comprende (i) un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % idéntico al dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qa humano en donde el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qa humano comprende los aminoácidos 108-245 de la SEQ ID NO: 4, y (ii) una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos un 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qa endógeno de roedor;
b. un ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qb quimérico, en donde el polipéptido C1qb quimérico comprende (i) un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % idéntico al dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qb humano en donde el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qb humano comprende los aminoácidos 115-251 de la SEQ ID NO: 5, y (ii) una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos un 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qb endógeno de roedor; y
c. un ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qc quimérico, en donde el polipéptido C1qc quimérico comprende (i) un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % idéntico al dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qc humano en donde el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qc humano comprende los aminoácidos 113-245 de la SEQ ID NO: 6, y (ii) una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos un 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qc endógeno de roedor;
en donde los polipéptidos C1qa, C1qb y C1qc quiméricos se expresan en el animal roedor y forman un complejo C1q funcional; y
en donde el animal roedor no expresa un polipéptido C1qa endógeno funcional, un polipéptido C1qb endógeno funcional, o un polipéptido C1qc endógeno funcional
D. Ácidos nucleicos
Hay una variedad de moléculas descritas en la presente descripción que se basan en ácido nucleico, que incluyen, por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican, por ejemplo, los roedores quiméricos C1qa, C1qb, C1qc o cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en la presente descripción para fabricar C1qa, C1qb y/o C1qc modificados genéticamente, así como también diversos ácidos nucleicos funcionales.
En la presente descripción se describen ácidos nucleicos aislados que codifican secuencias de ácidos nucleicos de C1qa, C1qb y/o C1qc de mamíferos quiméricos que comprenden secuencias de ácidos nucleicos de roedor y humano. En algunas modalidades, las secuencias de ácido nucleico aisladas descritas en la presente descripción son vectores dirigidos grandes que incluyen regiones completas del genoma, e incluyen exones, intrones y/o secuencias intergénicas. Estos pueden incluir regiones no traducidas 5' y 3', potenciadores, promotores y otras regiones reguladoras. En algunas modalidades, estos elementos reguladores son elementos reguladores no humanos, por ejemplo, elementos reguladores de un gen de C1q endógeno no humano. En otras modalidades, estos elementos reguladores son elementos reguladores humanos, por ejemplo, elementos reguladores de un gen de C1q humano. En otras modalidades, las secuencias de ácido nucleico aisladas descritas en la presente descripción son secuencias de ADNc. En algunas modalidades, los ácidos nucleicos aislados, por ejemplo, un vector dirigido grande, descrito en la presente descripción pueden incluir más de un único gen de C1q, por ejemplo, dos o tres genes (por ejemplo, puede codificar los tres genes quiméricos de C1qa, C1qb y C1qc descritos en la presente descripción).
En un aspecto, se describe en la presente descripción un ácido nucleico aislado que comprende secuencias de ácido nucleico de roedor y humano, en donde el ácido nucleico codifica un polipéptido C1q de mamífero quimérico (por ejemplo, polipéptido C1qa, C1qb o C1qc) descrito en la presente descripción, por ejemplo, un polipéptido C1q quimérico que comprende una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos 90 % idéntica a una tallopedúnculo N-terminal endógena de roedor y un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % idéntico a un dominio de cabeza globular humano.
En algunas modalidades, un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido C1qa quimérico de mamífero comprende secuencias de ácido nucleico humanas y de roedor, en donde la secuencia de ácido nucleico humana codifica un dominio de cabeza globular con al menos un 90 % de identidad de secuencia con la cabeza globular de un polipéptido C1q humano, y la secuencia de ácido nucleico de roedor codifica una región tallo-pedúnculo N-terminal con al menos un 90 % de identidad de secuencia con un polipéptido C1q cognado de roedor.
Por "una secuencia de ácido nucleico de C1q humano que codifica sustancialmente el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1q humano", se entiende un fragmento de un gen C1q humano que codifica el dominio de cabeza globular o un fragmento de polipéptido que es ligeramente más largo o corto que el dominio globular del polipéptido C1q humano. Por "ligeramente más largo o corto" se entiende una diferencia en la longitud de no más de 5, 4, 3, 2 o 1 aminoácido(s). De manera similar, por "una secuencia de ácido nucleico de C1q de roedor que codifica sustancialmente la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1q de roedor", se entiende un fragmento de un gen de C1q de roedor que codifica la región tallo-pedúnculo N-terminal o un fragmento de polipéptido que es ligeramente más largo o corto que la región tallo-pedúnculo N-terminal del polipéptido C1q de roedor.
En circunstancias en las que un polipéptido C1q de roedor y un polipéptido C1q cognado humano comparten aminoácidos comunes cerca de la unión entre la región tallo-pedúnculo y el dominio de cabeza globular, puede que no sea necesario utilizar una secuencia de ácido nucleico de C1q humano que codifica precisamente el dominio de cabeza globular del polipéptido C1q humano. Es posible usar una secuencia de ácido nucleico de un gen de C1q humano que codifica sustancialmente el dominio de cabeza globular del polipéptido C1q humano, en enlace operativo a un ácido nucleico que codifica sustancialmente la región tallo-pedúnculo del polipéptido C1q de un animal no humano, de manera que el polipéptido C1q quimérico incluye un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % o totalmente idéntico al dominio de cabeza globular del polipéptido C1q humano, y una región tallopedúnculo que es al menos 90 % o completamente idéntica a la región tallo-pedúnculo del polipéptido C1q no humano. De manera similar, en circunstancias en las que un polipéptido C1q de roedor y un polipéptido C1q humano comparten aminoácidos comunes cerca del extremo C-terminal del dominio cabeza globular, puede que no sea necesario utilizar un ácido nucleico de C1q humano que codifica precisamente el dominio de cabeza globular del polipéptido C1q humano. Es posible insertar un ácido nucleico ligeramente más corto de un gen de C1q humano que codifica un polipéptido ligeramente más corto que el dominio de cabeza globular del polipéptido C1q humano, en enlace operativo a un ácido nucleico no humano que codifica los aminoácidos restantes en el extremo C-terminal del dominio de cabeza globular, de manera que el polipéptido C1q quimérico incluye un dominio cabeza globular que aún es al menos 90 % o completamente idéntico al dominio de cabeza globular del polipéptido C1q humano.
En un aspecto, se describe en la presente descripción un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido C1qa de mamíferos quiméricos, en donde la secuencia de ácido nucleico humano codifica un dominio de cabeza globular con al menos 90 % de identidad de secuencia con el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qa humano, por ejemplo, codifica el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qa humano o un fragmento de este. Por ejemplo, en un aspecto, se describe en la presente descripción un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido C1qa de mamíferos quiméricos, en donde el ácido nucleico comprende al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica los aminoácidos 122-222 del polipéptido C1qa humano como se expone en la SEQ ID NO: 4. Por ejemplo, el ácido nucleico puede comprender una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, una porción del exón 3 de C1qa humano) que codifica los aminoácidos 122-235 o 112-245 del polipéptido C1qa humano como se expone en la SEQ ID NO: 4.
El ácido nucleico descrito que codifica el polipéptido C1qa de mamíferos quiméricos comprende además secuencias de ácido nucleico de roedor (tales como, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica una región tallopedúnculo N-terminal con al menos 90 % de identidad de secuencia con la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qa de roedor). Por lo tanto, también se describen en la presente descripción ácidos nucleicos aislados, en donde la secuencia de ácido nucleico comprende al menos una secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 33-102, 30-102, 25-105, 23-107 o 23-111 del polipéptido C1qa de ratón expuesto en la SEQ ID NO: 1, o al menos una secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 33-102, 30-102, 25-105, 23-107 o 23-111 del polipéptido C1qa de rata expuesto en la SEQ ID NO: 7. En un aspecto particular, se describe en la presente descripción un ácido nucleico aislado, en donde el ácido nucleico aislado codifica al menos los aminoácidos 23-245 del polipéptido expuesto en la SEQ ID NO: 10 (ratón/humano) o al menos los aminoácidos 23-245 del polipéptido expuesto en la SEQ ID NO: 55 (rata/humano). En un aspecto, el ácido nucleico aislado codifica un polipéptido C1qa de mamíferos quiméricos funcional que es o comprende la SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 55.
También se describe en la presente descripción un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido C1qb de mamíferos quiméricos que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % idéntico al dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qb humano en donde el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qb humano comprende los aminoácidos 115-251 de la SEQ ID NO: 5, por ejemplo, que codifica el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qb humano o un fragmento de este. Por ejemplo, el ácido nucleico que codifica el polipéptido C1qb de mamíferos quiméricos comprende al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica los aminoácidos 125-233 del polipéptido C1qb humano como se expone en la SEQ ID NO: 5. Por ejemplo, el ácido nucleico puede comprender una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, una porción del exón 3 de C1qb humano) que codifica los aminoácidos 118-251 del polipéptido C1qb humano como se expone en la SEQ ID NO: 5.
El ácido nucleico descrito que codifica el polipéptido C1qb de mamíferos quiméricos puede comprender además secuencias de ácido nucleico de roedor (tales como, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica una región tallo-pedúnculo N-terminal con al menos 90 % de identidad con la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qb endógeno de roedor). Por lo tanto, también se describe en la presente descripción un ácido nucleico aislado, en donde la secuencia de ácido nucleico comprende al menos una secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 32-105, 27-105, 27-110, 26-114 o 26-117 del polipéptido C1qb de ratón expuesto en la SEQ ID NO: 2, o en donde la secuencia de ácido nucleico comprende al menos una secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 32-105, 27-105, 27-110, 26-114 o 26-117 del polipéptido C1qb de rata expuesto en la s Eq ID NO: 8. En un aspecto particular, se describe en la presente descripción un ácido nucleico aislado, en donde el ácido nucleico aislado codifica al menos los aminoácidos 26-251 del polipéptido expuesto en la SEQ ID NO: 11 (ratón/humano) o en donde el ácido nucleico aislado codifica al menos los aminoácidos 26-251 del polipéptido expuesto en la SEQ ID NO: 56 (rata/humano). En un aspecto, el ácido nucleico aislado codifica un polipéptido C1qb de mamíferos quiméricos funcional que es o comprende la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 56.
También se describe en la presente descripción un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido C1qc de mamíferos quiméricos que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de cabeza globular con al menos 90 % de identidad con el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qc humano en donde el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qc humano comprende los aminoácidos 113-245 de la SEQ ID NO: 6, por ejemplo, que codifica el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qc humano o un fragmento de este. En un aspecto, el ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido C1qc de mamíferos quiméricos, en donde el ácido nucleico que codifica el polipéptido C1qc de mamíferos quiméricos comprende al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica los aminoácidos 118-234 del polipéptido C1qc humano expuesto en la SEQ ID NO: 6. Por ejemplo, el ácido nucleico puede comprender una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, una porción del exón 3 de C1qa humano) que codifica los aminoácidos 114-245 del polipéptido C1qc humano como se expone en la SEQ ID NO: 6.
Los ácidos nucleicos que codifican el polipéptido C1qc de mamíferos quiméricos pueden comprender además secuencias de ácido nucleico de roedor (tales como, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica una región tallo-pedúnculo N-terminal con al menos 90 % de identidad con la región tallo-caña N-terminal de un polipéptido C1qc de roedor). Por lo tanto, también se describe en la presente descripción un ácido nucleico aislado, en donde la secuencia de ácido nucleico comprende al menos una secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 31-111, 30-113 o 30-114 del polipéptido C1qc de ratón expuesto en la SEQ ID NO: 3, o en donde la secuencia de ácido nucleico comprende al menos una secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 33 113, 32-115 o 32-116 del polipéptido C1qc de rata expuesto en la SEQ ID NO: 9. En un aspecto particular, se describe en la presente descripción un ácido nucleico aislado, en donde el ácido nucleico aislado codifica al menos los aminoácidos 30-246 del polipéptido expuesto en la SEQ ID NO: 12 (ratón/humano) o en donde el ácido nucleico aislado codifica al menos los aminoácidos 32-248 del polipéptido expuesto en la SEQ ID NO: 57 (rata/humano). En un aspecto, el ácido nucleico aislado codifica un polipéptido C1qc de mamíferos quiméricos funcional que es o comprende la SEQ ID NO: 12 o la SEQ ID NO: 57.
En algunas modalidades, la secuencia de ácido nucleico de roedor en un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido C1q quimérico también codifica un péptido señal de roedor, por ejemplo, el péptido señal de un polipéptido C1q endógeno de roedor.
En algunas modalidades, la secuencia de ácido nucleico de roedor en un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido C1q quimérico comprende además una región UTR 5' de roedor, por ejemplo, la región UTR 5' de un gen de C1q endógeno de roedor.
En algunas modalidades, la secuencia de ácido nucleico humano en un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido C1q quimérico comprende además una región UTR 3' humana, por ejemplo, la región UTR 3' de un gen C1q humano.
En algunas modalidades, la secuencia de ácido nucleico de roedor es un fragmento genómico de un gen de C1q de roedor que comprende una porción codificante del exón 2 (por ejemplo, la porción que codifica aminoácidos de la forma madura del polipéptido C1q de roedor) y una porción del exón 3 (por ejemplo, la porción que codifica aminoácidos de la región tallo-pedúnculo N-terminal). En algunas modalidades, la secuencia de ácido nucleico de roedor es un fragmento genómico de un gen de C1q de roedor que comprende toda la porción codificante del exón 2 que codifica tanto el péptido señal como los aminoácidos de la forma madura del polipéptido C1q de roedor, y la porción del exón 3 que codifica los aminoácidos de la región tallo-pedúnculo N-terminal. En algunas modalidades, la secuencia de ácido nucleico de roedor es un fragmento genómico de un gen de C1q de roedor que comprende el exón 1, el exón 2 y la porción del exón 3 que codifica los aminoácidos de la región tallo-pedúnculo N-terminal, que abarca de esta manera la UTR 5' del gen de C1q no humano.
En algunas modalidades, la secuencia de ácido nucleico humano es un fragmento genómico de un gen de C1q humano que comprende una porción del exón 3 que codifica el dominio de cabeza globular o un fragmento del mismo de un polipéptido C1q humano. La secuencia de ácido nucleico humano se une operativamente a la secuencia de ácido nucleico de roedor de manera que el polipéptido C1q quimérico codificado comprende una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos 90 % idéntica a una región tallo-pedúnculo de N-terminal endógeno de roedor y un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % idéntico al dominio de cabeza globular humano y es un polipéptido C1q funcional.
En algunas modalidades, la secuencia de ácido nucleico humano es un fragmento genómico de un gen C1q humano que comprende una porción 3' del exón 3 que codifica el dominio de cabeza globular o un fragmento del mismo e incluye toda la UTR 3' del gen C1q humano.
En un aspecto particular, se describe en la presente descripción un ácido nucleico aislado que codifica una proteína C1q quimérica de roedor, en donde el ácido nucleico comprende una secuencia que codifica una C1qa quimérica, una C1qb quimérica y/o una C1qc quimérica. En algunas modalidades, una o más de las secuencias que codifican C1qa, C1qb y/o C1qc quiméricas comprenden una secuencia que codifica un dominio de cabeza globular humana o un fragmento de esta. En algunas modalidades, una o más de las secuencias que codifican el tallo y/o pedúnculo de C1qa, C1qb y/o C1qc quimérico comprenden una secuencia que codifica un roedor (por ejemplo, rata o ratón). En algunas modalidades, una o más de las secuencias que codifican C1qa, C1qb y/o C1qc quiméricos comprenden una secuencia que codifica un dominio de triple hélice de colágeno de roedor (por ejemplo, rata o ratón).
Por lo tanto, en algunas modalidades, en la presente descripción se describe un ácido nucleico aislado, en donde el ácido nucleico aislado codifica una proteína C1q quimérica de mamífero roedor, que comprende una o más de una primera, segunda o tercera secuencias de nucleótidos, donde la primera secuencia nucleotídica codifica un polipéptido C1qa quimérico de mamífero roedor, la segunda secuencia nucleotídica codifica un polipéptido C1qb quimérico de mamífero roedor, y la tercera secuencia nucleotídica codifica un polipéptido C1qc quimérico de mamífero roedor. En particular, la presente invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica una proteína C1q quimérica de roedor, que comprende una o más de una primera, segunda o tercera secuencias de nucleótidos, en donde:
la primera secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido C1qa quimérico,
la segunda secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido C1qb quimérico, y la tercera secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido C1qc quimérico,
en donde cada una de la primera, segunda y tercera secuencias de nucleótidos comprende una secuencia de ácido nucleico de roedor y una secuencia de ácido nucleico humana,
en donde la secuencia de ácido nucleico humano codifica un polipéptido al menos 90 % idéntico al dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qa, C1qb y C1qc humano, respectivamente, en donde el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qa humano comprende los aminoácidos 108-245 de la SEQ ID NO: 4, en donde el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qb humano comprende los aminoácidos 115-251 de la SEQ ID NO: 5, y el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qc humano comprende los aminoácidos 113-245 de la SEQ ID NO: 6; y
en donde la secuencia de ácido nucleico de roedor codifica un polipéptido al menos 90 % idéntico a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1q cognado de roedor de los polipéptidos C1qa, C1qb y C1qc, respectivamente.
En un caso, los ácidos nucleicos aislados descritos pueden comprender además una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal de C1qa, C1qb y/o C1qc humano, de ratón o de rata como se expone en las Figuras 3<a>, 3B y/o 3C.
También se describe en la presente descripción un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido C1q de mamíferos quiméricos, en donde la secuencia de ácido nucleico de mamíferos de roedor comprende los exones 1 y 2 del gen de C1qa, C1qb y/o C1qc de roedor.
Se entiende y contempla en la presente descripción que los ácidos nucleicos descritos pueden incorporarse en una célula para traducirse y expresarse. Por lo tanto, cualquiera de los ácidos nucleicos descritos puede clonarse en el genoma de una célula para la expresión del polipéptido C1q quimérico. Por lo tanto, se proporciona en la presente descripción una célula modificada genéticamente que comprende uno o más ácidos nucleicos aislados de cualquier aspecto anterior.
El término "célula" incluye cualquier célula que sea adecuada para expresar una secuencia de ácido nucleico recombinante. Las células incluyen las de procariotas y eucariotas (unicelulares o pluricelulares), células bacterianas (por ejemplo, cepas de E. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp., etc.), células de micobacterias, células de hongos, células de levaduras (por ejemplo, S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, etc.), células vegetales, células de insectos (por ejemplo, SF-9, SF-21, células de insectos infectados por baculovirus, Trichoplusia ni, etc.), células de animales no humanos, células humanas o fusiones celulares tales como, por ejemplo, hibridomas o cuadromas. En algunas modalidades, la célula es humana, de mono, simio, hámster, rata o ratón. En algunas modalidades, la célula es eucariota y se selecciona de las siguientes células: CHO (por ejemplo, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (por ejemplo, COS-7), célula de retina, Vero, CV1, renal (por ejemplo, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (por ejemplo, BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidérmica), CV-1, U937, 3T3, célula L, célula C127, SP2/0, NS-0, MMT 060562, célula de Sertoli, célula BRL 3A, célula HT1080, célula de mieloma, célula tumoral, y una línea celular derivada de una célula mencionada anteriormente. En algunas modalidades, la célula comprende uno o más genes virales, por ejemplo, una célula retiniana que expresa un gen viral (por ejemplo, una célula PER.C6™). La presente invención proporciona una célula madre embrionaria (ES) de roedor que comprende el ácido nucleico aislado de la presente invención, en donde la célula ES de roedor es opcionalmente una célula ES de ratón o una célula ES de rata. En otras modalidades, la célula es una célula dendrítica, un fibroblasto, una célula epitelial o una célula primaria. En algunas modalidades, la célula se usa para producir roedores modificados genéticamente. Se entiende además que algunas de dichas células pueden incorporarse y usarse para desarrollar roedores genéticamente modificados que comprenden cualquiera de los ácidos nucleicos descritos que codifican polipéptidos quiméricos C1qa, C1qb y C1qc, y pueden expresar dichos polipéptidos. En algunas modalidades, se obtiene una célula del roedor genéticamente modificado proporcionado en la presente descripción. En algunas de tales modalidades, la célula puede ser una célula primaria. En algunas modalidades, la célula puede ser un macrófago o una célula dendrítica.
Un experto en la técnica comprendería que, además de los residuos de ácidos nucleicos que codifican las proteínas C1q humanizadas descritas en la presente descripción, debido a la degeneración del código genético, otros ácidos nucleicos pueden codificar los polipéptidos de la presente descripción. Por lo tanto, además de un roedor modificado genéticamente que comprende en su genoma secuencias de nucleótidos que codifican proteínas C1q humanizadas descritas en la presente descripción, también se proporciona un roedor que comprende en su genoma nucleótido secuencias que difieren de las descritas en la presente descripción debido a la degenerabilidad del código genético.
Hay una variedad de secuencias relacionadas con la proteína C1q, por ejemplo, los polipéptidos C1qa, C1qb y/o C1qc, así como también los polipéptidos C1qa, C1qb y/o C1qc quiméricos, o cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en la presente descripción para fabricar polipéptidos C1qa, C1qb y/o C1qc quiméricos, todos los cuales están codificados por ácidos nucleicos o son ácidos nucleicos. Las secuencias de los análogos humanos de estos genes, así como también de otros análogos y alelos de estos genes, y las variantes de empalme y otros tipos de variantes, están disponibles en diversas bases de datos de proteínas y genes, que incluye Genbank. Los expertos en la técnica comprenden cómo resolver discrepancias y diferencias de secuencias y ajustar las composiciones y métodos relacionados con una secuencia particular con otras secuencias relacionadas.
E. Animales con C1q humanizada genéticamente modificados
En un aspecto adicional, en la presente descripción se proporciona un roedor genéticamente modificado (tal como ratón o rata) que expresa un polipéptido C1q quimérico humanizado (por ejemplo, un C1qa, C1qb o C1qc ) como se describió anteriormente. Tal animal roedor expresa un complejo C1q humanizado que comprende el polipéptido C1q humanizado. Por lo tanto, la presente invención proporciona un animal roedor modificado genéticamente que comprende en su genoma
a. un ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qa quimérico, en donde el polipéptido C1qa quimérico comprende (i) un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % idéntico al dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qa humano en donde el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qa humano comprende los aminoácidos 108-245 de la SEQ ID NO: 4, y (ii) una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos un 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qa endógeno de roedor;
b. un ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qb quimérico, en donde el polipéptido C1qb quimérico comprende (i) un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % idéntico al dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qb humano en donde el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qb humano comprende los aminoácidos 115-251 de la SEQ ID NO: 5, y (ii) una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos un 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qb endógeno de roedor; y
c. un ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qc quimérico, en donde el polipéptido C1qc quimérico comprende (i) un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % idéntico al dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qc humano en donde el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qc humano comprende los aminoácidos 113-245 de la SEQ ID NO: 6, y (ii) una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos un 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qc endógeno de roedor;
en donde los polipéptidos C1qa, C1qb y C1qc quiméricos se expresan en el animal roedor y forman un complejo C1q funcional; y
en donde el animal roedor no expresa un polipéptido C1qa endógeno funcional, un polipéptido C1qb endógeno funcional, o un polipéptido C1qc endógeno funcional.
Por lo tanto, la invención proporciona roedores (tales como un ratón o rata) que comprenden en su molécula de ácido nucleico del genoma que codifica un polipéptido C1q quimérico descrito anteriormente (C1qa, C1qb o C1qc) que comprende una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos 90 % idéntica a una región de tallopedúnculo N-terminal endógeno de roedor y un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % idéntica a un dominio de cabeza globular humana.
En algunas modalidades, el roedor comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido C1q quimérico (por ejemplo, polipéptido C1qa, C1qb o C1qc) como se describió anteriormente en la presente descripción, en donde la molécula de ácido nucleico comprende secuencias de ácido nucleico de roedor (por ejemplo, endógenas) y humanas.
En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido C1q quimérico incluye una secuencia de ácido nucleico de C1q de roedor (por ejemplo, endógena) y una secuencia de ácido nucleico de C1q cognada humana, unida operativamente entre sí de manera que la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido C1q funcional. El término "cognado" se usa en la presente descripción en el contexto de una molécula quimérica para indicar que las secuencias en la molécula quimérica que son de diferentes orígenes corresponden al mismo gen. Por ejemplo, una secuencia de C1qa de ratón o rata se une a una secuencia de C1qa humana para formar una molécula de C1qa quimérica, una secuencia de C1qb de ratón o rata se une a una secuencia de C1qb humana para formar una molécula de C1qb quimérica, una secuencia de C1qc de ratón o rata se une a una secuencia de C1qc humana para formar una molécula de C1qc quimérica. El polipéptido C1q quimérico comprende una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos un 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1q endógeno de roedor no humano y un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % idéntico al dominio de cabeza globular de un polipéptido C1q humano.
La molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido C1q quimérico en el genoma de un animal roedor modificado genéticamente incluye una secuencia de ácido nucleico de C1q de roedor (por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico de C1q endógena no humana) y una secuencia de ácido nucleico de C1q humana, en donde la secuencia de ácido nucleico de C1q humano codifica un dominio de cabeza globular con al menos 90 % de identidad con el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1q humano.
La molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido C1q quimérico en el genoma de un roedor genéticamente modificado incluye una secuencia de ácido nucleico de C1q de roedor (por ejemplo, endógena) y una secuencia de ácido nucleico de C1q humana, en donde la secuencia de ácido nucleico de C1q no humana codifica una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1q endógeno de roedor.
En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido C1q quimérico se une operativamente a un elemento(s) regulador 5', tal como el promotor y/o potenciador(es), de un gen de C1q no humano (por ejemplo, endógeno).
En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido C1q quimérico en el genoma está en un locus diferente de un locus C1q endógeno.
En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico de C1q quimérica en el genoma está en un locus C1q endógeno. En algunas de tales modalidades, la molécula de ácido nucleico de C1q quimérica en el genoma puede resultar del reemplazo de una secuencia de nucleótidos de un gen de C1q endógeno en su locus endógeno con una secuencia de nucleótidos de un gen de C1q humano cognado.
En algunas modalidades, se ha sustituido una secuencia genómica contigua de un gen C1q de roedor en un locus C1q endógeno por una secuencia genómica contigua de un gen C1q humano cognado para formar un gen C1q humanizado quimérico.
En algunas modalidades, una secuencia genómica contigua de un gen de C1q humano insertado en un gen de C1q endógeno de roedor incluye una porción del exón 3 del gen de C1q humano de manera que el gen de C quimérico humanizado resultante codifica un polipéptido C1q quimérico que comprende un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % idéntico al dominio de cabeza globular de un polipéptido C1q humano. En algunas modalidades, una secuencia genómica contigua de un gen de C humano insertado en un gen de C1q endógeno de roedor incluye una porción del exón 3 del gen de C1q humano que codifica un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % idéntico al dominio cabeza globular de un polipéptido C1q humano.
En algunas modalidades, la secuencia genómica de un gen de C1q endógeno que permanece en un locus endógeno después de la humanización y se une operativamente a la secuencia genómica de C1q contigua humana insertada, incluye una porción 3' del exón 2 y una porción 5' del exón 3, y codifica una región de tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos 90 idéntica a un polipéptido C1q endógeno.
En circunstancias en las que un polipéptido C1q de roedor y un polipéptido C1q cognado humano comparten aminoácidos comunes cerca de la unión entre la región de tallo-pedúnculo y el dominio de cabeza globular, puede que no sea necesario insertar un ácido nucleico de C1q humano que codifica precisamente el dominio de cabeza globular del polipéptido C1q humano. Es posible insertar un ácido nucleico ligeramente más largo o más corto de un gen de C1q humano que codifica sustancialmente el dominio globular del polipéptido C1q humano, en enlace operativo a un ácido nucleico que codifica sustancialmente la región tallo-pedúnculo del polipéptido C1q de animal no humano, de manera que el polipéptido C1q quimérico incluye un dominio globular he que es al menos 90 % idéntico o completamente idéntico al dominio de cabeza globular del polipéptido C1q humano, una región tallopedúnculo que es al menos 90 % idéntica o completamente idéntica a la región tallo-pedúnculo del polipéptido C1q de roedor De manera similar, en circunstancias en las que un polipéptido C1q de roedor y un polipéptido C1q humano comparten aminoácidos comunes cerca del C-terminal del dominio de cabeza globular, puede que no sea necesario utilizar un ácido nucleico de C1q humano que codifica precisamente el dominio de cabeza globular del polipéptido C1q humano. Es posible insertar un ácido nucleico ligeramente corto de un gen de C1q humano que codifica sustancialmente (es decir, ligeramente más corto que) el dominio de cabeza globular del polipéptido C1q t humano, en enlace operativo a un ácido nucleico de roedor que codifica el resto de aminoácidos en el extremo C-terminal t del dominio de cabeza globular, de manera que el polipéptido C1q quimérico incluye un dominio de cabeza globular que es aún al menos 90 % idéntico o completamente idéntico al dominio de cabeza globular del polipéptido C1q humano.
En algunas modalidades, la secuencia de nucleótidos de C1q humano incluida en un gen de C1q quimérico humanizado que incluye la región no traducida 3' ("UTR") del gen de C1q humano, que es la última parte del exón 3 en todos los genes de C1q (es decir, genes de C1qa, C1qb y C1qc). En determinadas modalidades, además de la UTR 3' de un gen C1q humano, también puede incluirse una secuencia genómica humana adicional del locus del gen C1q humano. La secuencia genómica humana adicional puede consistir en al menos 10-200 bp, por ejemplo, 50 bp, 75 bp, 100 bp, 125 bp, 150 bp, 175 bp, 200 bp, o más, que se encuentran en el locus del gen C1q humano inmediatamente aguas abajo de la UTR 3' del gen C1q humano. En otras modalidades, la secuencia de nucleótidos C1q humana incluida en un gen C1q humanizado no incluye la UTR 3' del gen C humano; en su lugar, se incluye la UTR 3' de un gen C1q endógeno y sigue inmediatamente al codón de parada del gen C1q humanizado.
En algunas modalidades, la secuencia de ácido nucleico de C1q endógena no humana incluida en un gen de C1q quimérico humanizado (por ejemplo, la secuencia de C1q genómica endógena que permanece en un locus endógeno después de la humanización incluye la UTR 5' del gen de C1q endógeno (que puede incluir el exón 1 y en la mayoría de los casos una porción 5' del exón 2). algunas modalidades, la secuencia de nucleótidos endógenos de C1q no humana incluida en una el gen de C quimérico también incluye una secuencia de nucleótidos (por ejemplo, una porción 5' del exón 2) que codifica el péptido señal del polipéptido endógeno C1q.
En algunas modalidades, un roedor proporcionado en la presente descripción es heterocigoto para un gen de C1q humanizado en su genoma. Otras modalidades, un roedor proporcionado en la presente descripción es homocigoto para un gen de C1q humanizado en su genoma.
En determinadas modalidades, el roedor incluye los múltiples genes de C1q quiméricos en su genoma, cada uno en un locus C1q endógeno o un locus diferente. En algunas modalidades, los múltiples genes de C1q quiméricos están en un fragmento nucleico contiguo en un locus C1q no endógeno. En algunas modalidades, los múltiples genes de C1q quiméricos están cada uno en el locus C1q endógeno. Por ejemplo, dos o los tres genes de C1q endógenos (C1qa, C1qb y C1qc) en un roedor se han humanizado mediante el uso de secuencias de nucleótidos de genes de C1q humanos cognados.
En diversas modalidades proporcionadas, el roedor genéticamente modificado expresa el/los polipéptido(s) que codifican las moléculas de ácido nucleico de C1q quiméricas de roedor/humanas. En particular, el roedor proporcionado es uno en el que los polipéptidos C1qa, C1qb y C1qc de quima se expresan en el roedor y forman un complejo C1q funcional. En tal caso, los animales roedores modificados genéticamente pueden expresar uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis polipéptidos quiméricos C1 de roedor/humano, uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis polipéptidos quiméricos C1qb de roedor/humano, y uno, dos, tres, cinco o seis polipéptidos quiméricos C1qc de roedor/humano. En diversas modalidades, el polipéptido C1q quimérico expresado son polipéptidos C1q funcionales. En particular, los polipéptidos C1qa, C1qb y C1qc quiméricos se expresan en roedor t y forman un complejo C1q funcional. En diversas modalidades, los polipéptidos C1q proporcionados en la presente descripción disponen una estructura de buqué C1q típica para formar una proteína C1q funcional que comprende 18 cadenas polipeptídicas. El roedor proporcionado no expresa un polipéptido C1qa endógeno funcional, un polipéptido C1qb endógeno funcional, o un polipéptido C1qc endógeno funcional. La falta de expresión de un(os) polipéptido(s) de C1q endógeno funcional puede(n) ser el resultado de la inactivación, deleción y/o humanización del/de los gen(es) de C1q endógenos.
En algunos aspectos, el roedor expresa polipéptidos C1qa, C1qb y C1qc quiméricos que comprenden los dominios de cabeza globulares de los polipéptidos C1qa, C1qb y C1qc humanos. En algunos aspectos, el roedor expresa un polipéptido C1qa quimérico que comprende un dominio de cabeza globular de C1qa humano expuesto en la SEQ ID NO: 4 o un fragmento de este (por ejemplo, los aminoácidos 112-245, 122-235 o 122-222 como se expone en la SEQ ID NO: 4). En algunos aspectos, el roedor expresa un polipéptido C1qb quimérico que comprende un dominio de cabeza globular de C1qb humano expuesto en la SEQ ID NO: 5 o un fragmento de este (por ejemplo, los aminoácidos 118-251, 120-251 o 125-233 como se expone en la SEQ ID NO: 5). En algunos aspectos, el roedor expresa un polipéptido C1qc quimérico que comprende un dominio de cabeza globular de C1qc humano expuesto en la SEQ ID NO: 6 o un fragmento de este (por ejemplo, los aminoácidos 118-234 o los aminoácidos 114-245 como se expone en la SEQ ID NO: 6). En algunos aspectos, el roedor expresa la C1qa quimérica como se expone en las SEQ ID NO: 10 o 55, C1qb como se expone en las SEQ ID NO: 11 o 56, y/o polipéptido C1qc como se expone en las SEQ ID NO: 12 o 57.
En un aspecto, se entiende y contempla en la presente descripción que los roedores genéticamente modificados descritos comprenden ácidos nucleicos que codifican polipéptidos C1q que comprenden secuencias de aminoácidos de roedor y secuencias de aminoácidos humanos. Se entiende además que todo o una porción del dominio de cabeza globular de C1q quimérica se comprende de secuencias de aminoácidos humanos. En un aspecto, se describe en la presente descripción un roedor genéticamente modificado (tal como, por ejemplo, un ratón o rata), en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica la cabeza globular de un polipéptido C1qa humano o un fragmento de este codifica al menos los aminoácidos 122-222 del polipéptido C1qa humano como se expone en la SEQ ID NO: 4 (por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica los aminoácidos 122-235 o 112-245 del polipéptido C1qa humano como se expone en la SEQ ID NO: 4). En un aspecto, el roedor genéticamente modificado es una rata y comprende además, el enlace operativo a la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio de cabeza globular o el fragmento de este del polipéptido C1qa humano, una secuencia de nucleótidos que codifica al menos los aminoácidos 33-102, 30-102, 25-105, 23-107 o 23-111 del polipéptido C1qa de rata expuesto en la SEQ ID NO: 7, o el roedor genéticamente modificado es un ratón y comprende además, el enlace operativo a la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio de cabeza globular o el fragmento de este del polipéptido C1qa humano, una secuencia de nucleótidos que codifica al menos los aminoácidos 33-102, 30-102, 25-105, 23-107 o 23 111 del polipéptido C1qa de ratón expuesto en la SEQ ID NO: 1. En un aspecto, los roedores genéticamente modificados comprenden una o más secuencias de ácido nucleico que codifican al menos los aminoácidos 23-245 de un polipéptido C1qa como se expone en la SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 55. En un aspecto específico, se describen en la presente descripción roedores genéticamente modificados (tales como, por ejemplo, un ratón o rata), en donde el roedor comprende una o más secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido C1qa como se expone en la SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 55. En algunas modalidades, un roedor genéticamente modificado es un ratón que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qa como se expone en la SEQ ID NO: 10. En algunas modalidades, un roedor genéticamente modificado es una rata que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qa como se expone en la SEQ ID NO: 55.
En otro aspecto, se describe en la presente descripción un roedor genéticamente modificado (tal como, por ejemplo, un ratón o rata), en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica la cabeza globular de un polipéptido C1qb humano o un fragmento de este codifica al menos los aminoácidos 125-233 del polipéptido C1qb humano como se expone en la SEQ ID NO: 5 (por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica los aminoácidos 120-250 o 118-251 del polipéptido C1qb humano).
También se describe en la presente descripción un roedor genéticamente modificado (tal como, por ejemplo, un ratón o rata) en donde el roedor modificado genéticamente es una rata y comprende, el enlace operativo a la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio de cabeza globular o el fragmento de este del polipéptido C1qb humano, una secuencia de nucleótidos que codifica al menos los aminoácidos 32-105, 27-105, 27-110, 26-114, o 26-117 del polipéptido C1qb de rata expuesto en la SEQ ID NO: 8, o en donde el roedor modificado genéticamente es un ratón y comprende además, el enlace operativo a la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio de cabeza globular o el fragmento de este del polipéptido C1qb humano, una secuencia de nucleótidos que codifica al menos los aminoácidos 32-105, 27-105, 27-110, 26-114, o 26-117 del polipéptido C1qb de ratón expuesto en la SEQ ID NO: 2.
En un aspecto, el roedor genéticamente modificado comprende una o más secuencias de ácido nucleico que codifican al menos los aminoácidos 26-251 de un polipéptido C1qb como se expone en la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 56. En un aspecto específico, se describe en la presente descripción un roedor genéticamente modificado (tal como, por ejemplo, un ratón o rata), en donde el roedor comprende una o más secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido C1qb como se expone en la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 56. En algunas modalidades, un roedor genéticamente modificado es un ratón que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qb como se expone en la SEQ ID NO: 11. En algunas modalidades, un roedor genéticamente modificado es una rata que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qb como se expone en la SEQ ID NO: 56.
En un aspecto, el roedor genéticamente modificado (tal como, por ejemplo, un ratón o rata) comprende un ácido nucleico, en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica la cabeza globular de un polipéptido C1qc humano o un fragmento de este codifica al menos los aminoácidos 118-234 del polipéptido C1qc humano como se expone en la SEQ ID NO: 6 (por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica los aminoácidos 114-245 del polipéptido C1qc humano).
También se describe en la presente descripción un roedor genéticamente modificado (tal como, por ejemplo, un ratón o una rata), en donde el roedor es una rata y comprende además, el enlace operativo a la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio cabeza de globular o el fragmento de este del polipéptido C1qc humano, una secuencia de nucleótidos que codifica al menos los aminoácidos 33-113, 32-115, o 32-116 del polipéptido C1qc de rata expuesto en la SEQ ID NO: 9, o en donde el roedor es un ratón y comprende además, el enlace operativo a la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio de cabeza globular o el fragmento de este del polipéptido C1qc humano, una secuencia de nucleótidos que codifica al menos los aminoácidos 31-111, 30-113, o 30-114 del polipéptido C1qc de ratón expuesto en la<s>E<q>ID NO: 3.
En un aspecto, el roedor genéticamente modificado comprende una o más secuencias de ácido nucleico que codifican al menos los aminoácidos 30-246 de un polipéptido C1qc como se expone en la SEQ ID NO: 12 o una o más secuencias de ácido nucleico que codifican al menos los aminoácidos 32-248 de un polipéptido C1qc como se expone en la SEQ ID NO: 57. En un aspecto específico, se describe en la presente descripción un roedor genéticamente modificado (tal como, por ejemplo, un ratón o rata), en donde el roedor comprende una o más secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido C1qc como se expone en la SEQ ID NO: 12 o la SEQ ID NO: 57. En algunas modalidades, un roedor genéticamente modificado es un ratón que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qc como se expone en la SEQ ID NO: 12. En algunas modalidades, un roedor genéticamente modificado es una rata que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qb como se expone en la SEQ ID NO: 57.
En algún aspecto, es beneficioso que esté presente la expresión de un polipéptido para una secuencia señal. Los polipéptidos descritos y los ácidos nucleicos descritos que codifican dichos polipéptidos pueden comprender secuencias señal o tener secuencias señal ausentes. Por lo tanto, en un aspecto, se describe en la presente descripción un roedor genéticamente modificado (tal como, por ejemplo, un ratón o rata) en donde el roedor comprende, además, en enlace operativo, una secuencia de nucleótidos que codifica una rata, un ratón o un péptido señal C1qa, C1qb y/o C1qc humano. Los ejemplos de péptidos señal de polipéptidos C1qa, C1qb y C1qc de rata, ratón y humano se muestran en las Figuras 3A-3C. Por ejemplo, se describe en la presente descripción un roedor que comprende, en enlace operativo, una secuencia de ácido nucleico que comprende una porción que codifica el péptido señal de los genes C1qa, C1qb y/o C1qc de rata o ratón, y al menos la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio de cabeza globular o el fragmento de este del polipéptido C1qa, C1qb y/o C1qc humano, respectivamente.
En un aspecto, se describe en la presente descripción un roedor genéticamente modificado (tal como, por ejemplo un ratón o rata) que comprende en su genoma a) en el locus C1qa endógeno una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qa quimérico de rata/humano en donde la secuencia de ácido nucleico comprende, 5'-3' y en enlace operativo una primera secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 1-111 de un polipéptido C1qa de rata de la SEQ ID NO: 7 y una segunda secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 112-245 de un polipéptido C1qa humano de la SEQ ID NO: 4; b) en el locus C1qb endógeno una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qb quimérico de rata/humano en donde la secuencia de ácido nucleico comprende, 5'-3' y en enlace operativo una tercera secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 1-117 de un polipéptido C1qb de rata de la SEQ ID NO: 8 y una cuarta secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 118-251 de un polipéptido C1qb humano de la<s>E<q>ID NO: 5; y c) en el locus C1qc endógeno una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qc quimérico de rata/humano en donde la secuencia de ácido nucleico comprende, 5'-3' y en enlace operativo una quinta secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 1-116 de un polipéptido C1qc de rata de la SEQ ID NO: 9 y una sexta secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 114-245 de un polipéptido C1qc humano de la SEQ ID NO: 6. En una modalidad, tal roedor genéticamente modificado es una rata.
También se describe en la presente descripción un roedor genéticamente modificado (tal como, por ejemplo, un ratón o rata) que comprende en su genoma a) en el locus C1qa endógeno una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qa quimérico de ratón/humano en donde la secuencia de ácido nucleico comprende, 5'-3' y en enlace operativo una primera secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 1-111 de un polipéptido C1qa de ratón de la SEQ ID NO: 1 y una segunda secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 112-245 de un polipéptido C1qa humano de la SEQ ID NO: 4; b) en el locus C1qb endógeno una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qb quimérico de ratón/humano en donde la secuencia de ácido nucleico comprende, 5'-3' y en enlace operativo una tercera secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 1-117 de un polipéptido C1qb de ratón de la SEQ ID NO: 2 y una cuarta secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 118-251 de un polipéptido C1qb humano de la SEQ ID NO: 5; y c) en el locus C1qc endógeno una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qc quimérico de ratón/humano en donde la secuencia de ácido nucleico comprende, 5'-3' y en enlace operativo una quinta secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 1-114 de un polipéptido C1qc de ratón de la SEQ ID NO: 3 y una sexta secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 114-245 de un polipéptido C1qc humano de la SEQ ID NO: 6. En una modalidad, tal roedor modificado genéticamente es un ratón.
El roedor genéticamente modificado es uno en donde el roedor, por ejemplo, la rata o el ratón, no expresa un polipéptido C1qa, C1qb o C1qc endógeno funcional.
En algunas modalidades, el animal no humano es un roedor. En un aspecto, el roedor es de la superfamilia Dipodoidea o Muroidea. En una modalidad, el roedor se selecciona de un ratón, una rata y un hámster. En una modalidad, el roedor se selecciona de la superfamilia Muroidea. En una modalidad, el animal modificado genéticamente es de una familia seleccionada de Calomyscidae (por ejemplo, hámsters parecidos a ratones), Cricetidae (por ejemplo, hámster, ratas y ratones del Nuevo Mundo, topillos), Muridae (ratones y ratas verdaderos, jerbos, ratones espinosos, ratas crestadas), Nesomyidae (ratones trepadores, ratones de roca, ratas de cola blanca, ratas y ratones malgaches), Platacanthomyidae (por ejemplo, lirones espinosos) y Spalacidae (por ejemplo, ratas topo, ratas de bambú y zokors). En una modalidad específica, el roedor modificado genéticamente se selecciona de un ratón verdadero o una rata (familia Muridae), un jerbo, un ratón espinoso y una rata crestada. En una modalidad, el ratón modificado genéticamente es de un miembro de la familia Muridae. En una modalidad específica, el roedor se selecciona de un ratón y una rata. En una modalidad, el animal nonhumano es un ratón.
En una modalidad, el roedor es un ratón de una cepa C57BL seleccionada de C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, y C57BL/Ola. En otra modalidad, el ratón es una cepa 129 seleccionada del grupo que consiste en una cepa 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (e.g., 12951/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 ( ver, por ejemplo, Festing y otros (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836, ver también, Auerbach y otros (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines). En una modalidad específica, el ratón modificado genéticamente es una mezcla de una cepa 129 mencionada anteriormente y una cepa C57BL/6 mencionada anteriormente. En otra modalidad específica, el ratón es una mezcla de las cepas 129 mencionadas anteriormente, o una mezcla de las cepas BL/6 mencionadas anteriormente. En una modalidad específica, la cepa 129 de la mezcla es una cepa 129S6 (129/SvEvTac). En otra modalidad, el ratón es una cepa BALB, por ejemplo, una cepa BALB/c. En aún otra modalidad, el ratón es una mezcla de una cepa BALB y otra cepa mencionada anteriormente.
En una modalidad, el roedor es una rata. En una modalidad, la rata se selecciona de una rata Wistar, una cepa LEA, una cepa Sprague Dawley, una cepa Fischer, F344, F6 y Dark Agouti. En una modalidad, la cepa de rata es una mezcla de dos o más cepas seleccionadas del grupo que consiste en Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6 y Dark Agouti.
En algunas modalidades, un roedor genéticamente modificado descrito en la presente descripción expresa en su suero una proteína C1q humanizada que comprende uno o más polipéptidos C1q quiméricos. En modalidades específicas, el roedor expresa en su suero una proteína C1q compuesta por polipéptidos C1qa, C1qb y C1qc quiméricos, cada uno de los cuales comprende un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % humano. En algunas modalidades, el nivel de una proteína C1q humanizada en el suero de un animal modificado genéticamente es comparable al nivel de la proteína C1q en un animal de control sin la humanización, como se detecta mediante cualquiera de los ensayos convencionales tales como transferencia Western o ELISA. Por "comparable" se entiende que se refiere al nivel y valores dentro de una variación de, por ejemplo, 10 %, 20 %, 30 % o 40 %.
En algunas modalidades, un roedor genéticamente modificado que expresa una proteína C1q humanizada en su suero muestra actividad del complemento. En algunas modalidades, la actividad del complemento es detectable mediante un ensayo de hemólisis clásico, como se ilustra además en los ejemplos más abajo. En modalidades específicas, el roedor modificado genéticamente muestra actividad hemolítica clásica en su suero a un nivel comparable al nivel en un roedor de control sin la humanización. En otras modalidades, la actividad del complemento es detectable en un ensayo de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC)in vitro.En modalidades específicas, el suero de un roedor modificado genéticamente que comprende una proteína C1q humanizada muestra actividad de CDC a un nivel comparable al del suero humano normal.
En un aspecto adicional, en la presente descripción se proporcionan métodos para fabricar el animal no humano modificado genéticamente descrito en la presente descripción. Por lo tanto, la presente invención proporciona un método para fabricar un animal roedor modificado genéticamente, que comprende modificar un genoma de roedor de manera que el genoma de roedor modificado comprende
d) un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico C1qa de roedor y una secuencia de ácido nucleico C1qa humana, y que codifica un polipéptido C1qa quimérico, en donde el polipéptido C1qa quimérico comprende (i) un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % idéntico al dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qa humano, en donde el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qa humano comprende los aminoácidos 108-245 de la SEQ ID NO: 4, y (ii) una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos un 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qa endógeno de roedor;
e) un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico C1qb de roedor y una secuencia de ácido nucleico C1qb humana, y que codifica un polipéptido C1qb quimérico, en donde el polipéptido C1qb quimérico comprende (i) un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % idéntico al dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qb humano, en donde el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qb humano comprende los aminoácidos 115-251 de la SEQ ID NO: 5, y (ii) una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos un 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qb endógeno de roedor; y
f) un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico C1qc de roedor y una secuencia de ácido nucleico C1qc humana, y que codifica un polipéptido C1qc quimérico, en donde el polipéptido C1qc quimérico comprende (i) un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % idéntico al dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qc humano en donde el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qc humano comprende los aminoácidos 113-245 de la SEQ ID NO: 6, y (ii) una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos un 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qc endógeno de roedor;
en donde cada uno de los ácidos nucleicos a) hasta c) se introduce en el locus C1q endógeno de roedor respectivo, y en donde opcionalmente cada uno de los ácidos nucleicos que codifican un polipéptido C1q quimérico reemplaza una secuencia de nucleótidos del gen de C1q endógeno de roedor respectivo en el locus C1q endógeno de roedor; y
en donde opcionalmente el roedor es un ratón o una rata.
En algunas modalidades, el genoma modificado comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido C1q quimérico, en donde el ácido nucleico se ubica en un locus diferente de un locus C1q endógeno. En determinadas modalidades, un fragmento de ácido nucleico contiguo que comprende múltiples moléculas de ácido nucleico que codifican diferentes polipéptidos C1q humanizados se ubica en un locus diferente de un locus C1q endógeno. Por ejemplo, un fragmento de ácido nucleico contiguo que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qa humanizado, una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qb humanizado y una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qc humanizado, se ubica en un locus diferente del locus C1q endógeno.
En algunas modalidades, el genoma modificado comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido C1q quimérico en donde el ácido nucleico se ubica en un locus C1q endógeno. En determinadas modalidades, un fragmento de ácido nucleico contiguo que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qa humanizado, una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qb humanizado y una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qc humanizado, se ubica en un locus C1q endógeno.
La modificación para introducir un ácido nucleico que codifica un polipéptido C1q quimérico en un locus C1q endógeno puede, en algunas modalidades, resultar en el reemplazo de una secuencia de nucleótidos C1q endógeno con una secuencia de nucleótidos C1q humano. En una modalidad, el reemplazo comprende el reemplazo de secuencias de C1qa, C1qb y C1qc.
La humanización puede llevarse a cabo mediante la creación de un vector dirigido grande que incorpora una modificación genética, por ejemplo, una modificación genética en uno, dos o los tres loci de C1q y luego la introducción del vector dirigido grande en células ES de roedor (por ejemplo, ratón o rata) para fabricar un roedor tal como un ratón, por ejemplo, como se describió en el Ejemplo 1, o una rata, por ejemplo, como se describió en el Ejemplo 2.
Por lo tanto, en una modalidad, en la presente descripción se proporciona un vector dirigido grande para fabricar un roedor modificado genéticamente de la presente descripción. En una modalidad ilustrativa, el vector dirigido grande comprende brazos de homología 5' y 3' de ratón; un fragmento de ADN que comprende el gen C1qa que comprende un reemplazo de la secuencia parcial del exón 3 codificante de C1qa de ratón por la secuencia parcial del exón 3 codificante de C1qa humano; un fragmento de ADN que comprende el gen C1qb, que comprende un reemplazo de la secuencia parcial del exón 3 codificante de C1qb de ratón por la secuencia parcial del exón 3 codificante de C1qb humano; un fragmento de ADN que comprende el gen C1qc, que comprende un reemplazo de la secuencia parcial del exón 3 codificante de C1qc de ratón por la secuencia parcial del exón 3 codificante de C1qc humano; y un casete de selección. En otra modalidad ilustrativa, el vector dirigido grande comprende brazos de homología 5' y 3' de rata; un fragmento de ADN que comprende el gen C1qa que comprende un reemplazo de la secuencia parcial del exón 3 codificante de C1qa de rata por la secuencia parcial del exón 3 codificante de C1qa humano; un fragmento de ADN que comprende el gen C1qb, que comprende un reemplazo de la secuencia parcial del exón 3 codificante de C1qb de rata por la secuencia parcial del exón 3 codificante de C1qb humano; un fragmento de ADN que comprende el gen C1qc, que comprende un reemplazo de la secuencia parcial del exón 3 codificante de C1qc de rata por la secuencia parcial del exón 3 codificante de C1qc humano; y un casete de selección.
En algunas modalidades, un vector dirigido grande es un clon de cromosoma artificial bacteriano (BAC) modificado genéticamente. Un clon de BAC portador de uno o varios genes C1qa, C1qb y C1qc de roedores puede modificarse y humanizarse mediante el uso de la recombinación homóloga bacteriana y la tecnología VELOCIGENE® (ver, por ejemplo, los documentos U.S. 6,586,251 y Valenzuela y otros (2003), High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659). En modalidades donde el clon del BAC comprende más de un gen de C1q de roedor (por ejemplo, una combinación de genes de C1qa, C1qb y C1qc de roedor), los múltiples genes de C1q de roedor pueden modificarse secuencialmente a través de la recombinación homóloga en serie bacteriana. Como resultado, se ha eliminado una secuencia de nucleótidos C1q de roedor del clon BAC original y se ha insertado una secuencia de nucleótidos C1q humana, lo que resulta en un clon BAC modificado portador de uno o más genes C1q humanizados, flanqueado por brazos de homología de roedores 5' y 3'.
Un casete de selección es una secuencia de nucleótidos insertada en un constructo de transformación para facilitar la selección de células (por ejemplo, células bacterianas, células ES) que han integrado el constructo de interés. Se conocen en la técnica varios casetes de selección adecuados (Neo, Hyg, Pur, CM, SPEC, etc.). Además, un casete de selección puede estar flanqueado por sitios de recombinación, que permiten la deleción del casete de selección tras el tratamiento con enzimas recombinasas. Los sitios de recombinación usados comúnmente son loxP y Frt, reconocidos por las enzimas Cre y Flp, respectivamente, pero otros se conocen en la técnica. Un casete de selección puede ubicarse en cualquier lugar del constructo fuera de la región codificante. En una modalidad, el casete de selección se inserta aguas arriba de una secuencia de C1qa humana insertada.
El vector dirigido grande, tal como un clon del BAC modificado, puede introducirse en células madre embrionarias (ES) no humanas (por ejemplo, de roedor) mediante técnicas conocidas, por ejemplo, electroporación. En la técnica se han descrito tanto células ES de ratón como células ES de rata. Ver, por ejemplo, los documentos US 7,576,259, US 7,659,442, US 7,294,754, and US 2008-0078000 A1 describen células ES de ratón y el método VELOCIMOUSE® para fabricar un ratón modificado genéticamente; documentos US 2014/0235933 A1, US 2014/0310828 A1, Tong y otros (2010) Nature 467: 211-215 y Tong y otros (2011) Nat Protoc. 6(6): doi:10.1038/nprot.2011.338 describen células ES de rata y métodos para fabricar una rata modificada genéticamente. En algunas modalidades, la célula ES receptora a la que se introduce un clon del BAC modificado comprende una deleción de una secuencia de nucleótidos en un locus C1q endógeno. En algunas modalidades, la deleción comprende la región codificante de uno o más de los genes C1qa, C1qb y C1qc. En modalidades específicas, la deleción comprende las regiones codificantes de todos los genes C1qa, C1qb y C1qc; por ejemplo, una deleción que comprende el codón de inicio de C1qa hasta el codón de parada de C1qb. En algunas modalidades, la célula ES receptora es heterocigota para una deleción en un locus C1q endógeno. En otras modalidades, la célula ES receptora es homocigótica para una deleción en un locus C1q endógeno.
Después de la terminación del direccionamiento génico, se criban células ES o roedores modificados genéticamente para confirmar la incorporación exitosa de la secuencia de nucleótidos exógena de interés o la expresión del polipéptido exógeno. Numerosas técnicas son conocidas por los expertos en la técnica, e incluyen (pero no se limitan a) transferencia Southern, PCR larga, PCR cuantitativa (por ejemplo, PCR en tiempo real mediante el uso de TAQMAN™), hibridación por fluorescencia in situ, transferencia Northern, citometría de flujo, análisis Western, inmunocitoquímica, inmunohistoquímica, etc. En un ejemplo, los roedores (por ejemplo, ratones) que portan la modificación genética de interés pueden identificarse mediante el cribado de la pérdida del alelo de ratón y/o la ganancia del alelo humano mediante el uso de un ensayo de modificación del alelo descrito en Valenzuela y otros (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659. Otros ensayos que identifican una secuencia específica de nucleótidos o aminoácidos en los animales modificados genéticamente son conocidos por los expertos en la técnica. Luego, las células ES seleccionadas se usan como células ES donantes para la inyección en un embrión en etapa de premórula (por ejemplo, embrión en etapa de 8 células) mediante el uso del método VELOCIMOUSE® (ver, por ejemplo, los documentos US 7,576,259, US 7,659,442, US 7,294,754, y US 2008-0078000 A1), o los métodos descritos en los documentos US 2014/0235933 A1 y US 2014/0310828 A1. El embrión que comprende las células madre embrionarias del donante se incuba hasta la etapa de blastocisto y luego se implanta en una madre subrogada para producir un roedor F0. Las crías portadoras del gen C1q humanizado pueden identificarse mediante genotipado del ADN aislado de los cortes de cola mediante el uso de ensayos de pérdida de alelo no humano y/o ganancia de alelo humano. Los roedores heterocigotos para un gen C1q humanizado pueden cruzarse para generar descendencia homocigota.
En un aspecto, se proporciona un método para fabricar una molécula C1q quimérica humana/no humana, que comprende expresar en una única célula una proteína C1q quimérica a partir de una construcción nucleotídica como se describió en la presente descripción. En una modalidad, el constructo de nucleótidos es un vector viral; en una modalidad específica, el vector viral es un vector lentiviral. En una modalidad, la célula se selecciona de una CHO, COS, 293, HeLa, y una célula retinal que expresa una secuencia de ácido nucleico viral (por ejemplo, una célula PERC.6™).
En un aspecto, se proporciona una célula que expresa una proteína C1q quimérica humana/no humana. En una modalidad, la célula comprende un vector de expresión que comprende una secuencia de C1q quimérica como se describió en la presente descripción. En una modalidad, la célula se selecciona de CHO, COS, 293, HeLa y una célula retinal que expresa una secuencia de ácido nucleico viral (por ejemplo, una célula PERC.6™).
También se proporciona una molécula de C1q quimérica producida por un animal no humano como se describió en la presente descripción, en donde, en una modalidad, la molécula de C1q quimérica comprende una secuencia de aminoácidos de la totalidad o de la misma con al menos 90 % de identidad de un dominio de cabeza globular de unos polipéptidos C1qa, C1qb, y/o C1qc humano, y al menos dominios de tallo y/o pedúnculo de una proteína C1q no humana, por ejemplo, proteína C1q de ratón, región tallo-pedúnculo so -terminal que es al menos 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1q endógeno de roedor.
Además de un roedor modificado genéticamente, también se proporciona un embrión de roedor (por ejemplo, un embrión de ratón o de rata), en donde el embrión comprende una célula ES del donante que se produce como se describe anteriormente o se deriva de un roedor (por ejemplo, un ratón o una rata) como se describió en la presente descripción. En un aspecto, el embrión comprende una célula donante de ES que comprende un gen de C1q quimérico y células embrionarias huésped.
También se proporciona un tejido, en donde el tejido se deriva de un roedor (por ejemplo, un ratón o una rata) como se describió en la presente descripción, y expresa una proteína C1q quimérica. En algunas modalidades, un tejido se selecciona de sangre, plasma, suero, médula ósea, bazo, nodos linfáticos, cerebro y sus combinaciones.
Además, se proporciona una célula ES de roedor aislada de un roedor como se describió en la presente descripción. En una modalidad, la célula es una célula ES. En una modalidad, la célula es una célula dendrítica
F. Modelo de roedor para probar tratamientos humanos
Las moléculas de C1q se estudian como objetivos para agentes biespecíficos, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, con un brazo de unión a C1q humana y otro de unión a un antígeno de interés.
Durante la etapa preclínica de desarrollo de fármacos, los agentes candidatos típicamente se estudian en base a su eficacia, toxicidad y otras propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas. Los agentes candidatos, tales como los anticuerpos, se dirigen típicamente a un antígeno humano, ya que el objetivo final de la investigación es desarrollar una terapia humana. Muchos estudios preclínicos se conducen en animales grandes tales como primates, ya que su fisiología y metabolismo de los fármacos son más similares a los humanos. Para llevar a cabo investigaciones preclínicas efectivas relacionadas con la eficacia, la toxicidad y otros parámetros de un candidato a fármaco, primero, debe determinarse que el candidato a fármaco reconoce la molécula de C1q del primate.
Sin embargo, un factor separado que complica el desarrollo de la terapia anti-C1q es que los primates grandes tales como los chimpancés están en peligro y en muchos países se prohíben los estudios en chimpancés; mientras que los estudios en otros primates, por ejemplo, monos Cynomolgus (Macaca fascicularis), pueden plantear inquietudes éticas. Por lo tanto, cualquier dato preliminar sobre un candidato terapéutico específico que pueda obtenerse en un modelo animal más pequeño, tal como un roedor, por ejemplo, un ratón, puede ser útil para determinar el progreso adicional de las investigaciones preclínicas en primates grandes.
El modelo de animal pequeño más útil para llevar a cabo estudios preliminares es un roedor, que expresa una proteína C1q humana o humanizada, y permite la prueba de candidatos a fármacos anti-C1q que también se dirigen, por ejemplo, a un antígeno tumoral, antígeno viral o antígeno bacteriano (tal como, por ejemplo, un antígeno de Staphylococcus).
En consecuencia, en algunos aspectos, el roedor de la presente invención se proporciona como un modelo de roedor (tal como, por ejemplo, un modelo de ratón o rata) para probar agentes terapéuticos C1q-objetivo ("antiC1q"). En algunas modalidades, se proporciona en la presente descripción un modelo de roedor (tal como, por ejemplo, un modelo de ratón o rata) para probar proteínas de unión al antígeno anti-C1q. En algunas modalidades, se proporciona en la presente descripción un modelo de roedor (tal como, por ejemplo, un modelo de ratón o rata) para probar anticuerpos anti-C1q. En algunas de tales modalidades, se proporciona un modelo de roedor para probar proteínas multiespecíficas anti-C1q, por ejemplo, proteínas biespecíficas, de unión a antígeno o anticuerpos biespecíficos antiC1q. Como tal, una proteína de unión a antígeno multiespecífica anti-C1q, por ejemplo, una proteína de unión a antígeno biespecífica anti-C1q, se dirige o se une específicamente a dicho polipéptido C1q humanizado o complejo C1q humanizado y al menos a otro antígeno de interés. En diversos aspectos, el modelo de roedor para probar proteínas de unión a antígeno biespecíficas anti-C1q en donde la proteína de unión a antígeno es capaz de unirse tanto a un complejo C1q humanizado (con uno o más de los polipéptidos C1qa, C1qb, y/o C1qc del complejo que se humaniza) y el antígeno de interés comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un complejo C1q humanizado, en donde el polipéptido C1q humanizado se selecciona del grupo que consiste en C1qa, C1qb, C1qc, y/o sus combinaciones, y una célula que expresa o comprende el antígeno de interés. En una modalidad, el roedor comprende una célula dendrítica que expresa dicha proteína(s) de C1q humanizada.
El término "línea germinal" en referencia a una secuencia de ácido nucleico de inmunoglobulina incluye una secuencia de ácido nucleico que puede pasar a la progenie.
La frase "molécula de inmunoglobulina" incluye dos cadenas pesadas de inmunoglobulina y dos cadenas ligeras de inmunoglobulina. Las cadenas pesadas pueden ser idénticas o diferentes, y las cadenas ligeras pueden ser idénticas o diferentes.
El término "proteína de unión a antígeno" como se usa en la presente descripción incluye anticuerpos y diversas moléculas producidas y modificadas genéticamente de manera natural capaces de unirse al antígeno de interés. Tales incluyen, por ejemplo, anticuerpos de dominio específico, anticuerpos de dominio único (por ejemplo, derivados de camélidos y peces, etc.), anticuerpos de dominio eliminado, anticuerpos quiméricos, anticuerpos injertados con CDR, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos, nanocuerpos (por ejemplo, nanocuerpos monovalentes, nanocuerpos bivalentes, etc.), pequeños inmunofármacos modulares (SMIP), dominios IgNAR variables de tiburón, moléculas de receptores de células T y moléculas que comprenden dominios variables de receptores de células T y fragmentos de los mismos, etc. La proteína de unión a antígeno también puede incluir fragmentos de unión a antígeno tales como, por ejemplo, (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv monocatenarias (scFv); (vi) fragmentos dAb; y (vii) unidades de reconocimiento mínimas que consisten de los residuos de aminoácidos que imitan la región hipervariable de un anticuerpo (por ejemplo, una región de determinación de complementariedad aislada (CDR) tal como un péptido CDR3), etc.
El término "anticuerpo", como se usa en la presente, incluye a las moléculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada comprende un dominio variable de la cadena pesada y una región constante de la cadena pesada (C<h>). La región constante de la cadena pesada comprende tres dominios, C<h>1, C<h>2 y C<h>3. Cada cadena ligera comprende un dominio variable de la cadena ligera y una región constante de la cadena ligera (C<l>). Los dominios variables de cadena pesada y cadena ligera pueden subdividirse en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada dominio variable de cadena pesada y ligera comprende tres CDR y cuatro FR, dispuestos desde el amino-terminal al carboxi-terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (las CDR de cadena pesada pueden abreviarse como HCDR1, HCDR2 y HCDR3; las CDR de cadena ligera pueden abreviarse como LCDR1,<l>C<d>R2 y LCDR3).
Como se usa en la presente, "un anticuerpo que se une a C1q" o un "anticuerpo anti-C1q" incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de estos que reconocen específicamente una única subunidad C1q (por ejemplo, C1qa, C1qb y/o C1qc), así como también anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de estos que reconocen específicamente un complejo dimérico de dos subunidades C1q (por ejemplo, dímeros C1qa/C1qb y C1qc/C1qc) así como también trímeros de dímeros. Los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno también pueden unirse a C1q soluble y/o C1q unida a IgM o IgG.
El término anticuerpo o proteína de unión a antígeno de "alta afinidad" se refiere a un anticuerpo que tiene una K<d>con respecto a su epítopo objetivo de aproximadamente 1°'9 M o inferior (por ejemplo, aproximadamente de 1x1°-9 M, 1x10'1° M, 1x1°'11 M, o aproximadamente de 1x1°'12 M).
La frase "anticuerpo biespecífico" o "proteína de unión a antígeno biespecífica" incluye un anticuerpo o proteína de unión a antígeno capaz de unirse selectivamente a dos epítopos. Los anticuerpos biespecíficos generalmente comprenden dos brazos, cada uno de los cuales se une a un epítopo diferente (por ejemplo, dos cadenas pesadas con diferentes especificidades), ya sea en dos moléculas diferentes (por ejemplo, diferentes epítopos en dos inmunógenos diferentes) o en la misma molécula (por ejemplo, diferentes epítopos en el mismo inmunógeno). Si un anticuerpo biespecífico o una proteína de unión a antígeno es capaz de unir selectivamente dos epítopos diferentes (un primer epítopo y un segundo epítopo), la afinidad del primer brazo del anticuerpo por el primer epítopo será generalmente de al menos uno a dos o tres o cuatro o más órdenes de magnitud inferior a la afinidad del primer brazo del anticuerpo por el segundo epítopo, y viceversa. Los epítopos unidos específicamente por el anticuerpo biespecífico pueden estar en el mismo o en un objetivo diferente (por ejemplo, en la misma o en una proteína diferente). Los anticuerpos biespecíficos ilustrativos incluyen aquellos con un primer grupo de anticuerpos específico para C1q, y un segundo grupo de anticuerpos específico para un antígeno de interés (por ejemplo, un antígeno de un agente infeccioso). Los anticuerpos biespecíficos pueden producirse, por ejemplo, combinando cadenas pesadas que reconocen diferentes epítopos del mismo inmunógeno. Por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico que codifican secuencias variables de cadena pesada que reconocen diferentes epítopos del mismo inmunógeno pueden fusionarse con secuencias de ácido nucleico que codifican la misma o diferentes regiones constantes de cadena pesada, y tales secuencias pueden expresarse en una célula que expresa una cadena ligera de inmunoglobulina. Un anticuerpo biespecífico típico tiene dos cadenas pesadas, cada una con tres CDR de cadena pesada, seguidas de (N-terminal a C-terminal) un dominio C<h>1, una bisagra, un dominio C<h>2 y un dominio C<h>3, y una cadena ligera de inmunoglobulina que o bien no confiere especificidad de unión a epítopo pero que puede asociarse con cada cadena pesada, o que puede asociarse con cada cadena pesada y que puede unirse a uno o más de los epítopos unidos por las regiones de unión a epítopos de la cadena pesada, o que puede asociarse con cada cadena pesada y permitir la unión de una o ambas cadenas pesadas a uno o ambos epítopos De manera similar, la frase "anticuerpo multiespecífico" incluye un anticuerpo capaz de unirse selectivamente a múltiples epítopos (por ejemplo, dos, tres, cuatro epítopos).
La frase "región determinante de complementariedad", o el término "CDR", incluye una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico de los genes de inmunoglobulina de un organismo que normalmente (es decir, en un animal genéticamente intacto) aparece entre dos regiones marco en una región variable de una cadena ligera o pesada de una molécula de inmunoglobulina. Una CDR puede codificarse, por ejemplo, por una secuencia de línea germinal o una secuencia reordenada o no reordenada, y, por ejemplo, por una célula B madura o virgen. Una CDR puede mutarse somáticamente (por ejemplo, variar de una secuencia codificada en la línea germinal de un animal), humanizarse y/o modificarse con sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos. En algunas circunstancias (por ejemplo, para una CDR3), las CDR pueden codificarse por dos o más secuencias (por ejemplo, secuencias de la línea germinal) que no son contiguas (por ejemplo, en una secuencia de ácido nucleico no reordenada) pero son contiguas en una secuencia de ácido nucleico de células B, por ejemplo, como el resultado del empalme o conexión de las secuencias (por ejemplo, recombinación V-D-J para formar una CDR3 de cadena pesada).
La frase "fragmento funcional" incluye fragmentos de proteínas de unión a antígeno tales como anticuerpos que pueden expresarse, secretarse y unirse específicamente a un epítopo con una K<d>en el intervalo micromolar, nanomolar o picomolar. El reconocimiento específico incluye tener una K<d>que está al menos en el intervalo micromolar, el intervalo nanomolar o el intervalo picomolar.
La frase "cadena pesada", como en "cadena pesada de inmunoglobulina", incluye una secuencia de la cadena pesada de inmunoglobulina, que incluye la secuencia de la región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina, de cualquier organismo. Los dominios variables de la cadena pesada incluyen tres CDR de la cadena pesada y cuatro regiones FR, a menos que se especifique de cualquier otra manera. Los fragmentos de las cadenas pesadas incluyen CDR, CDR y FR, y sus combinaciones. Una cadena pesada típica tiene, después del dominio variable (de N-terminal a C-terminal), un dominio C<h>1, una bisagra, un dominio C<h>2 y un dominio C<h>3. Un fragmento funcional de una cadena pesada incluye un fragmento que es capaz de reconocer específicamente un epítopo (por ejemplo, reconocer el epítopo con una K<d>en el intervalo micromolar, nanomolar o picomolar), que es capaz de expresar y secretar de una célula, y que comprende al menos una CDR. Un dominio variable de cadena pesada está codificado por una secuencia génica de región variable, que generalmente comprende segmentos V<h>, D<h>y J<h>derivados de un repertorio de segmentos V<h>, D<h>y J<h>presentes en la línea germinal. Las secuencias, ubicaciones y nomenclatura para los segmentos de cadena pesada V, D y J para diversos organismos pueden encontrarse en el sitio web del Sistema Internacional de Información Inmunogenética (base de datos IMGT).
La frase "cadena ligera", como en "cadena ligera de inmunoglobulina", incluye una secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina de cualquier organismo, y a menos que se especifique de cualquier otra manera incluye cadenas ligeras de kappa y lambda humanas y un VpreB, así como también cadenas ligeras sustitutas. Los dominios variables de cadena ligera incluyen típicamente tres CDR de cadena ligera y cuatro regiones marco (FR), a menos que se especifique de cualquier otra manera. Generalmente, una cadena ligera de longitud completa incluye, desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo, un dominio variable que incluye FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, y una región constante de cadena ligera. Un dominio variable de cadena ligera está codificado por una secuencia génica de región variable de cadena ligera, que generalmente comprende segmentos V<l>y J<l>, derivados de un repertorio de segmentos V y J presentes en la línea germinal. Las secuencias, ubicaciones y nomenclatura para los segmentos de cadena ligera V y J para diversos organismos pueden encontrarse en el sitio web del Sistema Internacional de Información Inmunogenética (base de datos IMGT). Las cadenas ligeras incluyen aquellas, por ejemplo, que no se unen selectivamente a ningún epítopo reconocido por la proteína de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpo) en la que aparecen. Las cadenas ligeras también incluyen aquellas que se unen y reconocen, o ayudan a la cadena pesada con la unión y reconocimiento, de uno o más epítopos unidos selectivamente por la proteína de unión al antígeno (por ejemplo, un anticuerpo) en la que aparecen.
En diversas modalidades, la proteína de unión al antígeno se une tanto a C1q como a un antígeno de interés.
En otra modalidad, el modelo de roedor se usa para determinar si una proteína de unión a antígeno biespecífica candidata es capaz de bloquear o afectar a un antígeno de interés que sea un antígeno asociado a una enfermedad infecciosa. En una modalidad, el roedor se infecta con un agente infeccioso. En una modalidad, el antígeno asociado a enfermedad infecciosa es un antígeno viral.
En otra modalidad, en donde el antígeno de interés es un antígeno asociado a una enfermedad infecciosa, el antígeno de interés es un antígeno bacteriano. En algunos aspectos, el antígeno bacteriano es un antígeno de Staphylococcus.
En algunos aspectos, la proteína de unión a antígeno biespecífico basada en C1q es una proteína de unión a antígeno basada en C1q humana. En una modalidad, la proteína de unión a antígeno es un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo humano, o un fragmento de unión a antígeno de este.
En algunas modalidades, la prueba de un anticuerpo biespecífico con un brazo dirigido a C1q humana y otro brazo dirigido a un antígeno asociado a una enfermedad infecciosa (tal como S.aureus),se realizain vivomediante el uso de un animal modificado genéticamente descrito en la presente descripción, que expresa una C1q humanizada que tiene un dominio de cabeza globular humano o sustancialmente humano en cada una de sus cadenas polipeptídicas C1qa, C1qb y C1qc. El animal puede infectarse con el antígeno asociado a la enfermedad infecciosa (tal como S.aureus),y el anticuerpo biespecífico puede evaluarse en tal animal, por ejemplo, en su capacidad para reducir la carga bacteriana y/o mejorar la supervivencia.
G. Uso de animales no humanos genéticamente modificados
Se describen además diversos métodos para usar los roedores modificados genéticamente descritos en la presente descripción.
En una modalidad, en la presente descripción se proporciona un método para seleccionar candidatos a fármacos terapéuticos que se dirigen a un antígeno de interés que comprende
introducir el antígeno de interés en un animal roedor modificado genéticamente de la presente invención,
poner en contacto a dicho animal roedor con un candidato a fármaco de interés, en donde el candidato a fármaco se dirige contra el C1q humano y el antígeno de interés, y
evaluar si el candidato a fármaco es eficaz para prevenir, reducir o eliminar células caracterizadas por la presencia o expresión del antígeno de interés;
en donde opcionalmente el antígeno de interés es un antígeno asociado a un tumor, una célula bacteriana tal como una célula de Staphylococcus, un antígeno bacteriano tal como un antígeno de Staphylococcus o un antígeno viral; y/o
en donde opcionalmente el animal roedor es un ratón o una rata inmunocompetentes; y/o
en donde opcionalmente el candidato a fármaco es un anticuerpo o una proteína de unión a antígeno tal como un anticuerpo biespecífico o una proteína de unión a antígeno biespecífica que es capaz de unirse tanto a la proteína C1q humana como al antígeno de interés.
(En diversas modalidades, el roedor expresa un complejo C1q humanizado funcional. En una modalidad del método, el roedor genéticamente modificado comprende en el locus C1q endógeno de roedor una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qa quimérico que comprende un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % idéntico a un dominio de cabeza globular del polipéptido C1qa humano, un polipéptido C1qb quimérico que comprende un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % idéntico a un dominio de cabeza globular del polipéptido C1qb humano, y un polipéptido C1qc quimérico que comprende un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % idéntico a un dominio de cabeza globular del polipéptido C1qc humano. En una modalidad del método descrito en la presente descripción, el roedor no comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de cabeza globular funcional de la proteína de roedor correspondiente.
En diversas modalidades del método descrito en la presente descripción, la introducción del antígeno de interés en el roedor modificado genéticamente descrito en la presente descripción puede llevarse a cabo mediante cualquier método conocido por los expertos en la técnica, que puede incluir, sin limitación, transgénesis, inyección, infección, trasplante de tejidos o células. Como tal, la introducción puede lograrse mediante la expresión en el roedor del antígeno de interés, que puede comprender modificar genéticamente dicho roedor para expresar el antígeno de interés. Alternativamente, la introducción puede comprender la introducción en dicho roedor de una célula que expresa el antígeno de interés, por ejemplo, como en el trasplante de células o tejidos. La introducción también puede comprender infectar dicho roedor con el antígeno de interés, por ejemplo, como en la infección bacteriana o viral. En una modalidad, el antígeno de interés puede ser un antígeno humano de interés. En otra modalidad, puede ser un antígeno bacteriano o viral de interés. El antígeno de interés puede ser un antígeno asociado al tumor o un antígeno asociado a una enfermedad infecciosa, por ejemplo, un antígeno bacteriano o viral, como se describió en detalle anteriormente.
En otra modalidad, se proporciona en la presente descripción un método para evaluar o tamizar candidatos a fármacos terapéuticos que se dirigen a un antígeno de interés que comprende mezclar una célula o virus que expresa el antígeno de interés con (i) un candidato a fármaco de interés, en donde el candidato a fármaco se dirige contra la C1q humana y el antígeno de interés, y (ii) una muestra de sangre (por ejemplo, una muestra de sangre completa) de un roedor genéticamente modificado descrito en la presente descripción, y (b) evaluar para determinar si el candidato a fármaco es eficaz para reducir o eliminar la célula o virus caracterizado por la presencia o expresión del antígeno de interés. La determinación puede producirse en base a la medición, por ejemplo, el porcentaje de supervivencia de la célula o virus donde se usa un candidato a fármaco en comparación con un fármaco de control o ningún fármaco en absoluto. El antígeno de interés puede ser un antígeno asociado al tumor o un antígeno asociado a una enfermedad infecciosa, por ejemplo, un antígeno bacteriano o viral, como se describió en detalle anteriormente. En algunas modalidades, el antígeno de interés es un antígeno bacteriano tal como un antígeno de Staphylococcus. En algunas modalidades, la célula es una célula bacteriana tal como una célula de Staphylococcus.
En diversas modalidades de los métodos de cribado de un candidato a fármaco terapéutico, el candidato a fármaco puede ser una proteína de unión a antígeno, por ejemplo, un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico. En diversos aspectos, dicho candidato a fármaco es capaz de unirse tanto a C1q humano como al antígeno de interés. El antígeno de interés puede ser un antígeno humano. El antígeno de interés también puede ser un primate, por ejemplo, un mono, antígeno. Por lo tanto, el candidato a fármaco usado para el tamizaje puede ser capaz de unirse tanto a un antígeno humano como a un antígeno de primate correspondiente, además de unirse a C1q humana. El candidato a fármaco también puede ser capaz de unirse al primate, por ejemplo, mono, C1q. Por lo tanto, el candidato a fármaco puede ser capaz de unirse tanto a humano como a primate, por ejemplo, mono, C1q; y también, en una modalidad, ser capaz de unirse a un antígeno humano de interés. En otra modalidad, el antígeno de interés puede ser un antígeno bacteriano o viral, y el candidato a fármaco puede ser capaz de unirse tanto al ser humano como al primate, por ejemplo, mono, C1q y el antígeno de interés (por ejemplo, un antígeno viral o bacteriano).
En diversas modalidades de los métodos descritos en la presente descripción, el candidato terapéutico es capaz de reducir, eliminar o prevenir una enfermedad. En una modalidad, la enfermedad es un tumor, y el candidato terapéutico es capaz de reducir, eliminar, o prevenir el crecimiento tumoral en comparación con un agente que no se dirige al antígeno de interés.
En tal modalidad del método, la determinación de si el candidato a fármaco es eficaz para prevenir, reducir o eliminar células caracterizadas por la presencia o expresión del antígeno de interés puede realizarse mediante el uso de un ensayo de volumen tumoral, un ensayo de destrucción de células tumorales, inducción de marcadores apoptóticos en tumores, reducción del crecimiento de vasos sanguíneos en tumores, infiltración de células inmunitarias en tumores, etc. En otra modalidad, la enfermedad es una enfermedad infecciosa, y un candidato terapéutico es capaz de reducir, eliminar, o prevenir una infección bacteriana o viral en comparación con un agente que no se dirige al antígeno de interés. En tal modalidad del método, la determinación de si el candidato a fármaco es eficaz para prevenir, reducir o eliminar células o virus caracterizados por la presencia o expresión del antígeno de interés puede realizarse mediante el uso de una medida de títulos bacterianos o virales, inducción de marcadores apoptóticos en células infectadas, etc., o mediante la medición de la supervivencia de células bacterianas o virus mediante el uso de una muestra de sangre (por ejemplo, una muestra de sangre completa).
Además de evaluar anticuerpos biespecíficos con un brazo dirigido a una proteína C1q humanizada y el otro brazo dirigido a un antígeno de interés, los animales no humanos modificados genéticamente que expresan una proteína C1q humanizada descrita en la presente descripción son útiles para evaluar los efectos de otros anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos monoespecíficos que tienen una región Fc humana (tal como un anticuerpo humano). La unión de una C1q humanizada a la región Fc humana de un anticuerpo puede activar la vía clásica del complemento, lo que conduce a la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Hubo una dificultad para evaluar si un anticuerpo tiene un efecto sobre el sistema del complemento de un receptor, o si o cuánta de la eficacia de un anticuerpo terapéutico es atribuible a la acción del sistema del complemento. Los roedores modificados genéticamente que expresan una C1q humanizada descrita en la presente descripción permitirán la evaluación de si un anticuerpo que tiene una región Fc humana (por ejemplo, un anticuerpo humano) será capaz de activar la vía clásica del complemento, y los resultados de dicha evaluación reflejarán con mayor precisión si dicho anticuerpo activará la vía clásica del complemento cuando se administre a pacientes humanos.
Por lo tanto, en un aspecto adicional, en la presente descripción se describe un método para evaluar si un anticuerpo que comprende una región Fc humana puede activar la vía clásica del complemento mediante el uso de un roedor modificado genéticamente (por ejemplo, un ratón o rata) que expresa una proteína C1q humanizada descrita en la presente descripción. Por lo tanto, la presente invención proporciona un método para evaluar si un candidato
el anticuerpo activa la vía del complemento, que comprende
proporcionar una célula que expresa un antígeno de interés en la superficie celular, un anticuerpo candidato que comprende una región Fc humana y dirigida al antígeno de interés, y una muestra de suero de un animal roedor modificado genéticamente de la presente invención;
mezclar la célula con el anticuerpo candidato para permitir que el anticuerpo se una al antígeno de interés expresado en la superficie celular;
añadir la muestra de suero a la mezcla célula-anticuerpo para permitir la unión de las proteínas C1q humanizadas en la muestra de suero a anticuerpos unidos al antígeno de interés en la célula; y medir la citotoxicidad de la célula.
En algunas modalidades, el método usa una célula que expresa un antígeno de interés en la superficie celular, un anticuerpo candidato que comprende una región Fc humana y dirigida al antígeno de interés, y una muestra de suero de un roedor genéticamente modificado que expresa una proteína C1q humanizada, y se diseña para evaluar la citotoxicidad dependiente del complementoin vitrode la célula que expresa el antígeno de interés. En modalidades específicas, la célula se mezcla primero con el anticuerpo candidato para permitir que el anticuerpo se una al antígeno de interés expresado en la superficie celular; luego se añade una muestra de suero a la mezcla de anticuerpo celular para permitir la unión de las proteínas C1q en la muestra de suero a los anticuerpos unidos al antígeno de interés en la célula. La citotoxicidad (es decir, la muerte de dicha célula) puede medirse luego mediante el uso de reactivos fácilmente disponibles, que incluyen los de fuentes comerciales (por ejemplo, el reactivo CytoTox-Glo™ de Promega), mediante el uso de métodos de citometría de flujo o la liberación de radioisótopos precargados de células objetivo. La citotoxicidad mediante el uso de una muestra de suero de un roedor humanizado que expresa una proteína C1q humanizada puede compararse con una muestra de suero de un roedor de control sin la humanización (control negativo) y con una muestra de suero humano (control positivo).
En algunas modalidades, las células adecuadas para su uso en este método incluyen células Raji, células Ramos, células Daudi, células HEK293 y células A431. En algunas modalidades, las células Raji, las células Ramos o las células Daudi se usan en los métodos actuales. Las células pueden expresar naturalmente un antígeno de interés en la superficie celular, o pueden modificarse para expresar recombinantemente un antígeno de interés en la superficie celular.
En algunas modalidades, el anticuerpo candidato es un anticuerpo humano dirigido a un antígeno tumoral, un antígeno bacteriano o viral, etc. Los ejemplos de anticuerpos candidatos incluyen, por ejemplo, anti-CD20, etc. En algunas modalidades, los métodos para evaluar si un anticuerpo que comprende una región Fc humana puede activar la vía clásica del complemento se realizan in vivo al comparar los efectos de un anticuerpo candidato en un roedor humanizado C1q con un roedor C1q genomanipulado. Para descartar que el efecto se deba a la ADCC (como opuesto a la CDC), se pudieron agotar las células NK, neutrófilos y macrófagos en los animales, y dejar intacto el sistema del complemento.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la técnica una explicación y descripción completa de cómo los compuestos, composiciones,
los artículos, dispositivos y/o métodos reivindicados en la presente descripción se producen y evalúan, y se pretende que sean puramente ilustrativos y no se pretende que limiten la descripción. Se ha procurado garantizar la exactitud con respecto a las cifras (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones. A menos que se indique de cualquier otra manera, las partes son partes en peso, la temperatura está en °C o está a temperatura ambiente, y la presión está en o cerca de la atmosférica.
Ejemplo 1. Generación de ratón C1q humanizado
La secuencia genómica de ratón de los genes C1q puede encontrarse bajo el número de acceso NCBI NC_000070.6, y los loci C1q se ubican en el cromosoma de ratón 4D3 (Referencia GRCm38.p4 C57BL /6J). La secuencia genómica humana de los genes C1q puede encontrarse bajo los números de acceso NCBI NG_007281.1, NG_007283.1 y NG_007565.1, y los loci C1q se ubican en el cromosoma humano 1p36.1. Algunos ejemplos de secuencias genómicas y de aminoácidos para C1q humana y de ratón se enumeran a más abajo en las Tablas 1 y 2. Se indican los péptidos señal predichos en los límites de las SEQ ID NO enumerados. Los límites del péptido señal también están encuadrados en las Figuras 3A-3C.
T l 1 m r n B nk r n i 1 r n
T l 2 m r n B nk r n i 1 h m n
Brevemente, para generar ratones C1q quiméricos, el locus C1q de ratón se humanizó mediante la construcción de un vector dirigido único a partir de ADN de cromosomas artificiales bacterianos (BAC) humanos y de ratón mediante el uso de la tecnología VELOCIGENE® (ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 6,586,251 y Valenzuela y otros (2003) High-throughput engineering of the mouse genome couple with high-resolution expression analysis. Nat. Biotech. 21(6): 652-659) mediante el uso de la biblioteca BAC de ratón Mouse BAC ES release 2 (Incyte Genomics, 129/SvJ en pBeloBAC11). El ADN del clon BAC de ratón 302p21 se modificó para reemplazar las porciones codificantes de ADN genómico de C1qa, C1qb y C1qc de ratón (los genes C1q de ratón se ubican muy cerca entre sí en la hebra inversa del cromosoma 4 de ratón) con las porciones correspondientes de C1qa, C1qb y C1qc humano, respectivamente (los genes C1q humanos se ubican muy cerca entre sí en la hebra delantera del cromosoma 1 humano).
El BAC de C1q de ratón se modificó mediante la introducción de secuencias de C1q humanas, para generar un BAC que comprende genes C1qa, C1qb y C1qc humanizados. Las secuencias que codifican sustancialmente los dominios globulares C1qa, C1qb y C1qc de ratón se reemplazaron, respectivamente, con las secuencias correspondientes que codifican sustancialmente los dominios globulares C1qa, C1qb y C1qc humanos. Las alineaciones de las secuencias de proteínas C1q (y rata) humanas y de ratón se representan en las Figuras 3A, B y C, donde los límites para las cabezas globulares son como se indica, y los límites de los genes de ratón/humanos se indican con flechas. Las secuencias de aminoácidos de las proteínas C1qa, C1qb y C1qc de ratón humanizadas se exponen en las SEQ ID NO: 10, 11 y 12, respectivamente, y se enumeran en la Tabla 3 más abajo, con secuencias de ratón en cursiva.
T l n i min i l r ín 1 im ri r nh m n
Ejemplo 1.1. Generación de ratón C1q genomanipulado
En detalle, primero, se modificó un locus C1q de ratón que comprende los tres genes de C1q para eliminar la secuencia de nucleótidos de 17,6 kB que comprende genes que codifican C1q de ratón (ver Figura 1A). Un vector dirigido que comprende el casete LacZ-neo, el brazo de homología 5' de 20 Kb y el brazo de homología 3' de 55 kb se introdujo en el BAC de ratón 302p21 mediante recombinación homóloga bacteriana de manera que se eliminaron 17,6 Kb de secuencia de nucleótidos que comprende los tres genes C1q de ratón de C1qa ATG a codón de parada de C1qb. La deleción atravesó el exón 2 de C1qa justo después del inicio ATG hasta el exón 3 de C1qb más allá del codón de parada que incluye 19 pb en la UTR 3' de C1qb. El casete se insertó de manera que la secuencia codificante LacZ estaba en marco con el codón C1qa ATG. La secuencia codificante de LacZ es seguida por un sitio de poliadenilación de SV40, luego un casete de resistencia a neomicina flanqueado por sitios loxP bajo el control del promotor de la fosfoglicerato cinasa 1 de ratón (Pgkl) con la señal de poliadenilación de Pgkl. El vector resultante se usó para electroporar células ES de ratón para crear células ES modificadas para generar un ratón que carecía del locus C1q endógeno. Las secuencias de las diversas uniones en el locus eliminado se etiquetan en el segundo diagrama esquemático de la Figura 1C, con las secuencias de ácido nucleico correspondientes enumeradas en la Tabla 4 más abajo. Las uniones mostradas en las Tablas en este ejemplo solo enumeran secuencias de nucleótidos cortas, pero dirigen a un experto en la técnica a la ubicación donde las secuencias se insertaron en el genoma del ratón.
Tabla 4: Secuencias de unión del locus C1 enomani ulado de ratón
Las células ES que contienen la deleción de secuencias de C1q de ratón se identificaron mediante un ensayo TAQMAN™ cuantitativo (ver, por ejemplo, Lie y Petropoulos, 1998. Curr. Opin. Biotechnology 9:43-48), ensayo de modificación de alelos (MOA). Se diseñaron conjuntos de cebadores y sondas específicos para detectar la inserción de las secuencias del casete (ganancia de alelo, GOA) y la deleción de secuencias de ratón (pérdida de alelo, LOA). La Tabla 5 identifica los nombres y ubicaciones de cada uno de los conjuntos de cebadores/sondas usados en los ensayos de PCR cuantitativa
T l r n n n n M A r nfirm r l limin i n l l 1 ^ r n
Las células ES objetivo descritas anteriormente se usaron como células ES donantes y se introdujeron en un embrión de ratón en estadio de 8 células mediante el método VELOCIMOUSE® (ver, por ejemplo, la patente de los EE. UU. núm. 7,294,754 y Poueymirou y otros (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25(1):91-99). VELOCIMICE® (ratones F0 derivados completamente de la célula ES donante) que portan independientemente una deleción de C1q de ratón se identificaron mediante el genotipado mediante el uso de un ensayo de modificación de alelos (ver anteriormente) que detecta la ausencia de secuencias del gen de C1q de ratón. Se usaron células ES de ratón modificadas que comprenden el locus C1q de ratón eliminado (células ES C1q KO HET de ratón) para la construcción de C1q humanizada como se describió más abajo.
El casete de selección usado en este método puede retirarse mediante métodos conocidos por el experto en la técnica. Por ejemplo, las células ES que portan el locus genomanipulado C1q pueden transfectarse con un constructo que expresa Cre para retirar el casete flanqueado por sitios loxP. El casete de selección puede retirarse opcionalmente mediante el mejoramiento a ratones que expresan la recombinasa Cre. Opcionalmente, el casete de selección se retiene en los ratones.
Ejemplo 1.2. Generación de ratón C1q humanizado
Para generar C1q de ratón humanizado, los plásmidos donantes se generaron por In-Fusion HD Cloning Kits™ (Clontech) mediante el uso de secuencias para dominios de cabeza globular C1q (las mismas secuencias que se usan para la rata C1q humanizada en el Ejemplo más abajo) y secuencias de ratón solapadas. Para la construcción de humanización de C1qb, se insertó un casete de selección loxP-Ub-Hyg mediante digestión por restricción aguas abajo de la secuencia poliA de C1qb humano. Para ambos constructos C1qa y C1qc, se insertó un casete de selección con espectromicina (Spec) mediante digestión por restricción aguas abajo de cada secuencia de poliA de C1qa y C1qc. Los constructos resultantes se introdujeron secuencialmente en el BAC de C1q de ratón (302p21) mediante recombinación homóloga bacteriana seguido de etapas de selección y/o digestión para eliminar los casetes de selección, como se demostró en la Figura 1B. En esta modalidad particular, la secuencia de ácido nucleico quimérico para C1qb se introdujo primero (1 en la figura), seguido de la introducción de ADN de C1qc quimérico (2 en la figura) y luego ADN de C1qa quimérico (3 en la figura). [0228] El vector dirigido grande que contiene los tres genes quiméricos de C1q se electroporó en células ES C1q KO HET de ratón como se representa en la Figura 1C, y la integración exitosa se confirmó mediante un ensayo de modificación de alelos (MOA) basado en PCT en tiempo real TAQMAN® descrito anteriormente. Los cebadores y sondas usados para el ensayo de MOA, y sus ubicaciones, se describen en la Tabla 6.
Tabla 6: Cebador y sondas usados en el ensayo de MOA para confirmar la presencia de genes quiméricos de C1q de ratón/humano
continuación
R 47 Las secuencias de unión entre diversos componentes modificados genéticamente en el locus quimérico se representan en la Tabla 7 más abajo, y se indican en la parte inferior del diagrama esquemático en la Figura 1C. Las uniones mostradas en las Tablas en este Ejemplo solo enumeran secuencias de nucleótidos cortas, pero dirigen a un experto en la técnica a la ubicación donde las secuencias
Tabla 7: Secuencias de unión del locus de C1 uimérico humano/ratón
Las células ES objetivo descritas anteriormente se usan como células ES donantes y se introducen en un embrión de ratón en etapa de 8 células mediante el método VELOCIMOUSE® descrito anteriormente. VELOCIMICE® que porta independientemente genes de C1q humanizados se identifican por genotipado mediante el uso de un ensayo de modificación de alelos (ver anteriormente) que detecta la presencia de las secuencias únicas del gen de Clq humano. Los ratones que comprenden una modificación heterocigota de los genes C1q se cruzan hasta la homocigosidad.
Para generar células ES sin el casete de resistencia a la higromicina, se electroporó un plásmido que contenía la secuencia codificante de la recombinasa cre en células ES C1q KO HET de ratón y se cribaron los clones de células ES resultantes para detectar la pérdida del casete de resistencia a la higromicina mediante el ensayo TaqMan mediante el uso de los cebadores y la sonda descritos en la Tabla 6. Luego, se microinyectaron clones seleccionados en embriones de ratón en etapa de 8 células como se describió anteriormente y los ratones resultantes se cruzaron hasta la homocigosidad. Las proteínas quiméricas expresadas resultantes se muestran anteriormente en la Tabla 3 y en el Listado de secuencias.
Ejemplo 2. Generación de rata C1q humanizada
La secuencia genómica de rata de los genes C1q puede encontrarse bajo el número de acceso NCBI NC_005104.4, y los loci C1q se ubican en el cromosoma 5 de rata (Referencia Rnor_6.0 Ensamble primario). La secuencia genómica humana de los genes C1q puede encontrarse bajo los números de acceso NCBI NG_007283.1, NG_007282.1 y NG_007565.1, y los loci C1q se ubican en el cromosoma humano 1p36.1. Algunos ejemplos de secuencias genómicas y de aminoácidos para C1q de rata y humano se enumeran en las Tablas 8 y 2, respectivamente. Se indican los límites predichos del péptido señal en las SEQ ID NO enumeradas. Los límites del péptido señal también están encuadrados en las figuras 3A-3C.
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C1qc de rata NC_005104.4 1-31 Para generar rata C1q quimérica, brevemente, el locus C1q de rata se humanizó mediante la construcción de un vector dirigido único a partir de secuencias humanas sintetizadas y ADN de cromosomas artificiales bacterianos (BAC) de rata mediante el uso de la biblioteca de BAC de rata generada para Regeneron por LUCIGEN® a partir de células ES de rata Dark Agouti, y la tecnología de direccionamiento de rata descrita en el documento US 2014/0310828. Las secuencias BAC se confirmaron y actualizaron en base a los datos de la secuenciación de próxima generación. El ADN del BAC de rata (BAC de C1q de rata, LUCIGEN®) se modificó para reemplazar el ADN genómico que codifica porciones de C1qa, C1qb y C1qc de rata (los genes de C1q de rata se ubican muy cerca entre sí en la hebra inversa del cromosoma 5 de rata) con porciones correspondientes de C1qa, C1qb y C1qc humanos, respectivamente (los genes de C1q humanos se ubican muy cerca entre sí en la hebra delantera del cromosoma 1 humano).
El BAC de C1q de rata generado internamente y descrito anteriormente se modificó mediante la introducción de secuencias de C1q humanas, para generar un vector que comprende genes C1qa, C1qb y C1qc humanizados. Las secuencias que codifican la mayoría de los dominios globulares C1qa, C1qb y C1qc de rata se reemplazaron, respectivamente, con las secuencias correspondientes de C1qa, C1qb y C1qc humano. Las alineaciones de las secuencias de proteínas C1q (y ratón) humanas y de rata se representan en las Figuras 3A, B y C, donde los límites para las cabezas globulares son como se indica, y los límites de los genes de rata/humanos se indican con flechas. Las secuencias de aminoácidos de las proteínas C1qa, C1qb y C1qc humanizadas de rata se exponen en las SEQ ID NO: 55, 56 y 57, respectivamente, y se enumeran en la Tabla 9, con secuencias de rata en cursiva.
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Ejemplo 2.1 Generación de la rata C1q genomanipulada
En detalle, primero, se modificó un locus C1q de rata que comprende los tres genes de C1q para eliminar una secuencia de nucleótidos de 17,6 Kb que comprende genes que codifican C1q de rata (ver Figura 2A). Un vector dirigido se sintetizó para comprender un gen LacZ y un casete de selección con higromicina autoeliminable, y el vector contenía brazos de homología 5' y 3' que permitían la deleción de los tres genes C1q de rata de C1qa ATG hasta el codón de parada de C1qb. El vector que comprende la deleción de la secuencia C1q se introdujo en el BAC de C1q de rata mediante recombinación homóloga bacteriana (BHR), y el ADN de BAC resultante se usó para electroporar células ES de rata para crear células ES modificadas para generar una rata que carecía del locus C1q endógeno. Las secuencias de las diversas uniones en el locus eliminado se etiquetan en el segundo diagrama esquemático de la Figura 2C, con las secuencias de ácido nucleico correspondientes enumeradas en la Tabla 10 más abajo. Las uniones mostradas en las Tablas en este ejemplo solo enumeran secuencias de nucleótidos cortas, pero dirigen a un experto en la técnica a la ubicación donde las secuencias se insertaron en el genoma de rata.
Tabla 10: Secuencias de unión de la deleción del locus C1 de rata
Las células ES que contenían deleción de secuencias C1q de rata se identificaron mediante un ensayo TAQMAN™ cuantitativo de modificación del ensayo de alelos (MOA), descrito anteriormente. La Tabla 11 identifica los nombres y ubicaciones de cada uno de los conjuntos de cebadores/sondas usados en los ensayos de PCR cuantitativa. Las mismas células ES se usan para introducir secuencias de C1q humanas para generar una rata quimérica como se describió más abajo.
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Las células ES Dark Agouti C1q quiméricas dirigidas se implantan en embriones de rata Sprague Dawley para generar crías F0 que portan deleción del locus C1q. Las crías quiméricas F0 se cruzan con ratas genéticamente intactas para crear crías F1 que son heterocigotas para la manipulación genética; la presencia del alelo modificado se confirma mediante el ensayo TAQMAN® como se describió anteriormente. Las crías F 1 se cruzan subsecuentemente hasta la homocigosidad.
Ejemplo 2.2. Generación de rata C1q humanizada
Para generar la rata C1q humanizada, los plásmidos se sintetizaron por Blue Heron mediante el uso de secuencias para dominios de cabeza globular C1q humana (las mismas secuencias que se usaron para el ratón C1q humanizado en el Ejemplo 1 anterior) y secuencias de rata solapadas. Para la construcción de humanización de C1qb, se insertó un casete de selección de loxP-puromicina autoeliminable (SDC-loxp-Puro) mediante digestión por restricción aguas abajo de la secuencia poliA de C1qb humano. Para ambos constructos C1qa y C1qc, se insertó un casete de selección con espectromicina (Spec) mediante digestión por restricción aguas abajo de cada secuencia de poliA de C1qa y C1qc. Los constructos resultantes se introducen secuencialmente en el BAC de C1q de rata de LUCIGEN® a través de una combinación de tecnología CRISPR/CAS9 y ensamble Gibson o recombinación homóloga bacteriana (BHR) seguido de etapas de selección y/o digestión para eliminar los casetes de selección, como se demuestra en la Figura 2B. En esta modalidad particular, la secuencia de ácido nucleico quimérico para C1qb se introdujo primero por BHR (1 en la figura), seguido por BHR de ADN de C1qc quimérico (2 en la figura) y luego la introducción por<b>H<r>de ADN de C1qa quimérico (3 en la figura).
El vector dirigido grande que contiene los tres genes quiméricos de C1q se electroporó en células ES C1q KO HET de rata como se representa en la Figura 2C, y la integración exitosa se confirmó mediante un ensayo de modificación de alelos (MOA) basado en PCT en tiempo real TAQMAN®. Los cebadores y sondas usados para el ensayo de MOA se describen en la Tabla 12.
Tabla 12: Cebador y sondas usados en el ensayo de MOA para confirmar la presencia de genes quiméricos de C1q humano/rata
Las secuencias de unión entre diversos componentes modificados genéticamente en el locus quimérico se representan en la Tabla 13 más abajo, y se indican en la parte inferior del diagrama esquemático en la Figura 2C. Las uniones mostradas en las Tablas en este ejemplo solo enumeran secuencias de nucleótidos cortas, pero dirigen a un experto en la técnica a la ubicación donde las secuencias se insertaron en el genoma de rata.
Tabla 13: Secuencias de unión del locus uimérico de C1 humano/rata
Las células ES Dark Agouti de C1q quiméricas dirigidas se implantan en embriones de rata Sprague Dawley para generar crías F0 que portan el locus quimérico de C1q humano/rata. Las crías quiméricas F0 se cruzan con ratas genéticamente intactas para crear crías F1 que son heterocigotas para la manipulación genética; la presencia del alelo modificado se confirma mediante el ensayo TAQMAN® como se describió anteriormente. Las crías F1 se cruzan subsecuentemente hasta la homocigosidad.
Ejemplo 3: Caracterización de ratón C1q humanizado
Ejemplo 3.1: La C1q quimérica está presente y es funcional en suero de ratón
Para determinar si se expresó C1q quimérica y funcional en suero de ratón, los ratones C1q humanizados se fenotiparon mediante ensayo de transferencia Western y de hemólisis clásica del complemento. Todos los ratones se alojaron y se cruzaron en la instalación específica libre de patógenos en Regeneron Pharmaceuticals. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por IACUC y Regeneron Pharmaceuticals.
(1) Transferencia Western:
Las concentraciones séricas de C1q se analizaron en 1615 ratones HO (ratones homocigotos para C1q humanizada como se describió anteriormente) mediante el uso de transferencia Western, de la siguiente manera: el suero humano de ratón o normal (NHS) se diluyó en PBS. Se usó suero humano normal (Quidel) como control positivo. El suero se añadió al tampón de carga de la muestra de electoroforesis que contenía mercaptoetanol y SDS y se corrió sobre un gel de poliacrilamida en condiciones de reducción/desnaturalización, luego se transfirió a la membrana de nitrocelulosa. Las transferencias se bloquearon, luego se sondearon con el anticuerpo primario goat anti-C1q humano (Quidel), seguido de la detección con IgG HRP anti-goat de burro (Santa Cruz). Se usó el sustrato quimioluminiscente ThermoScientific Super Signal West Pico para desarrollar la transferencia. Se usó GE Image Quant LAS4000 para la obtención de imágenes.
(2) Ensayo de hemólisis de la vía clásica:
Se lavó el número deseado de SRBC (glóbulos rojos de oveja) en tampón GVB++, se volvieron a suspender a 1x109 células/ml y se opsonizaron con hemolisina antioveja de conejo. El SRBC sensibilizado se diluyó hasta 2x108 células/ml en tampón GVB++ antes del uso en el ensayo de hemólisis. Se recolectó suero de camadas de ratones WT (n=5) y 1615HO (n=4) de siete a nueve semanas de edad. El suero de ratón se diluyó seriadamente en una serie de dilución doble de 6 puntos de 1/5 a 1/160 con tampón GVB++ (100 ul de suero diluido/pocillo). Inmediatamente, se añadieron 100 ul de SRBC sensibilizados (a 2x108 células/ml), para un volumen total de 200 ul, y se incubaron 1 hora a 37 °C. Después del tiempo de incubación, las células se dividieron mediante centrifugación a 1250 xg a 4 °C. Se transfirió un total de 100 ul del sobrenadante a una nueva placa con parte inferior plana de 96 pocillos y se leyó a 541 nM en un lector de microplacas Molecular Devices Spectramax M5 y el programa informático SoftMax Pro. Se calculó la actividad hemolítica: La OD541 de todas las muestras experimentales se dividió por la OD541 a la lisis celular máxima (células tratadas con 100 ul de agua) y luego se multiplicó por 100. Los datos representados son puntos únicos (no se ejecutan duplicados).
Como se demostró en la Figura 4, el panel superior, las proteínas C1q quiméricas, detectadas por el anticuerpo anti-C1q humano, se detectaron en el suero de ratones C1q humanizados, aunque se detectó menos proteína C1q en el suero de ratón C1q humanizado que en suero humano. La proteína C1q quimérica obtenida a partir del ratón humanizado mostró una actividad de comparación clásica similar a la medida mediante el ensayo de hemólisis a la observada en los ratones que comprenden C1q de ratón genéticamente intacto (Figura 4, parte inferior del panel). También se determinó la concentración de C1q quimérico humano/ratón en suero de ratón mediante el uso de un formato ELISA tipo sándwich con anticuerpos específicos para la cabeza de C1q humana. La curva estándar se generó mediante el uso de una concentración conocida de proteína C1q humana, y se determinó que la concentración de C1q quimérica en suero de ratón estaba en el intervalo de aproximadamente 10-30 ug/ml.
Ejemplo 4: Ratón C1q humanizado como modelo para la prueba de tratamientos humanos
Para confirmar si el ratón C1q humanizado puede servir como modelo para probar agentes terapéuticos humanos, primero desarrollamos un ensayoin vitropara evaluar la capacidad de C1q humanizado para activar la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) de las células Raji (células B que expresan el antígeno CD20 de superficie celular) mediante la unión al anticuerpo anti-CD20 humano. Se ha demostrado que los anticuerpos terapéuticos anti-CD20 contra el antígeno de superficie celular específico de células B CD20 conducen a la CDC de células B (Glennie y otros, 2007, Mechanisms of killing by anti-CD20 monoclonal antibodies, Mol. Immunol., Vol. 44(16) págs.3823-37) y el ensayo de CDC mediante el uso de líneas celulares que expresan CD20 se ha descrito anteriormente (Flieger y otros 2000, Mechanisms of Cytotoxicity Induced by Chimeric Mouse Human Monoclonal Antibody IDEC-C2BB in CD20-Expressing Lymphoma Lines, Cell Immunol., Vol. 204(1) págs. 55-63).
Para el bioensayo de CDC, las células Raji se sembraron en placas de ensayo de 96 pocillos a 10 000 células/pocillo en BSA al 1 % que contenía RPM<i>1640. Para medir la CDC con suero humano o de ratón (de ratones C1q o Wt humanizados), el anticuerpo anti-CD20 humano se diluyó 1:4 de 2 nM a 0,007 nM y se incubó con células durante 10 minutos a 25 °C. Al final de la incubación con el anticuerpo anti-CD20, el suero se añadió a las células a una concentración final del 1 %. La citotoxicidad se midió después de 1 hora de incubación a 37 °C y en CO2 al 5 %, seguido de una incubación de 30 minutos a 25 °C y la adición del reactivo CytoTox-Glo™ (Promega, núm. G9291). CytoTox-Glo™ es un reactivo basado en luminiscencia que mide la destrucción celular de manera que se observa una mayor luminiscencia con un incremento de la citotoxicidad (medida en unidades de luz relativas, RLU). Las células no tratadas en los pocillos de control se lisaron mediante tratamiento con digitonina 10 minutos antes de la adición del reactivo CytoTox-Glo™ para determinar la muerte máxima de las células. Las placas se leyeron para determinar la luminiscencia mediante un instrumento Victor X (Perkin Elmer) 10-15 minutos después de la adición de CytoTox-Glo™. Cuando se calculó, el porcentaje de citotoxicidad se calculó con los valores de RLU mediante el uso de la siguiente ecuación:
%decitotoxicidad =10Ox (Lisiscelularexperimental - Lisiscelulardereferencia)
(Usiscelularmáxima - Lisiscelulardereferencia)
En esta ecuación "lisis celular de referencia" es la luminiscencia de las células tratadas con medio y suero solo sin ningún anticuerpo anti-CD20 y la "lisis celular máxima" es la luminiscencia de las células tratadas con digitonina. Los resultados, expresados como % de citotoxicidad o RLU, se analizaron mediante el uso de regresión no lineal (logística de 4 parámetros) con el programa informático Prism 7 (GraphPad).
La actividad de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) mediada por el anticuerpo anti-CD20 humano 2 nM y el suero humano normal resultó en el 83 % de la lisis máxima, mientras que el CDC mediado por el anticuerpo CD20 humano 2 nM y el suero de ratones C1q humanizados fue del 55-58 % de la lisis máxima (Figura 5). No se detectó lisis celular mediante el uso de suero de ratón genéticamente intacto. Por lo tanto, el suero que contenía la cabeza globular C1q humanizada condujo a una lisis dependiente del complemento más eficiente de las células Raji mediadas por el anticuerpo anti-CD20 humano en comparación con el suero que contenía la proteína C1q de ratón genéticamente intacto.
Para las pruebasin vivo,se eligió el modelo de infección por S.aureus. El S. aureuses una de las principales causas de bacteriemia en los pacientes, y estas infecciones suelen ser mortales. Muchos laboratorios han desarrollado modelos de ratón de bacteriemia mediante el uso de una variedad de aislados deS. aureusadaptados al laboratorio y clínicos y en una variedad de referencias de ratón (O'Keeffe KM, y otros, Infect Immun. septiembre de 2015;83(9):3445-57. Manipulation of Autophagy in Phagocytes FacilitatesStaphylococcus aureusBloodstream Infection.; Rauch y otros, Infect Immun. octubre de 2012;80(10):3721-32. Abscess formation and alpha-hemolysin induced toxicity in a mouse model ofStaphylococcus aureusperitoneal infection) para estudiar la dinámica de la infección y el efecto de posibles agentes terapéuticos. Se estableció un modelo de bacteriemia para evaluar la actividad de los anticuerpos biespecíficos (bisAb), con un grupo dirigido a C1q y otro grupo dirigido a un antígeno expresado en S.aureus,tanto en la reducción de la carga bacteriana como en la mejora de la supervivencia.
Los ratones C1q humanizados y los ratones genéticamente intactos de control se infectaron por vía intraperitoneal con 1,73108 colonias que forman
unidades (CFU) por ratón en un volumen de 200 ul de S.aureusNewman cultivado hasta la fase logarítmica, OD600 < 1, en TSB a 37 °C y lavado 3 veces en PBS. Inmediatamente después de la infección, los ratones recibieron 100 ug de cada bisAb y un anticuerpo de isotipo coincidente en un volumen de 100 ul, por vía intraperitoneal. Los ratones se sacrificaron por eutanasia el Día 3 y se recolectaron los riñones para determinar la carga orgánica. Brevemente, los riñones se homogeneizaron en 5,0 ml de PBS mediante el uso del disociador de octavos gentleMACS (Miltenyi Biotec). El homogeneizado de tejido se diluyó en PBS y se sembraron múltiplos de diluciones en serie de 10 veces en placas de agar LB y se incubó a 37 °C durante toda la noche. Al día siguiente se contaron colonias individuales para determinar la carga bacteriana en ese punto temporal después de la infección y los resultados se informaron como CFU/gramo de tejido.
Los BisAb se probaron junto con un anticuerpo de control de isotipo para determinar su eficacia en la reducción de la carga renal bacteriana en ratones C1q humanizados hembras y ratones WT de control. En comparación con los ratones tratados con el anticuerpo de control del isotipo, el día 3 después del tratamiento se detectó una reducción de 2-4 log de UFC bacterianas en los riñones de los ratones C1q humanizados tratados con bisAbs; sin embargo, de forma similar a los resultados obtenidos con el anticuerpo de control del isotipo, no se observó ninguna reducción de la carga bacteriana en los ratones WT que expresaban C1q endógeno de ratón tratados con BisAbs (datos no mostrados).
Para examinar el efecto de los bisAb sobre la supervivencia, los ratones C1q humanizados se infectaron con 1,53 108 CFU por ratón de S.aureusy se trataron con anticuerpos de prueba como se describió anteriormente. En lugar de sacrificar a los ratones el Día 3, se monitorearon hasta el Día 18. Los ratones que perdieron el 20 % de su peso corporal inicial se sacrificaron y se registraron como una muerte. El porcentaje de animales supervivientes se notificó al final del estudio.
El BisAb se probó junto con un anticuerpo de control de isotipo para determinar la eficacia en un estudio de supervivencia en ratones C1q humanizados hembras (n=9). Como se muestra en la Tabla 14, al final del estudio, el Día 18 después de la infección, el 100 % de los ratones tratados con BisAb sobrevivieron, en comparación con el 78 % de los ratones tratados con el control del isotipo.
Tabla 14: Su ervivencia de Ratones C1 humanizados en el modelo de bacteriemia
En conclusión, este estudio demuestra que los ratones C1q humanizados son un modelo valioso para probar agentes terapéuticos, tales como anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), que se dirigen contra la proteína C1q humana.
Ejemplo 5: Caracterización de la rata C1q humanizada
Para determinar si la C1q quimérica era funcional en suero de rata, las ratas C1q humanizadas descritas en el Ejemplo 2 se fenotiparon mediante un ensayo clásico de hemólisis del complemento. Los resultados se compararon con ratas genomanipuladas (KO) para C1q y suero humano normal. Todas las ratas eran de raza 50% Dark Agouti 50% Sprague Dawley. Todas las ratas se alojaron y se cruzaron en la instalación específica libre de patógenos en Regeneron Pharmaceuticals. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por IACUC y Regeneron Pharmaceuticals.
(1) Ensayo de hemólisis de la vía clásica
El número deseado de SRBC (glóbulos rojos de oveja) se lavó en tampón GVB++ y se volvió a suspender a 1x109 células/ml y se opsonizó con hemolisina antioveja de conejo. Los SRBC sensibilizados se diluyeron a 2x108 células/ml en tampón GVB++ antes del uso en el ensayo de hemólisis. Se recolectó suero de WT (n=3 hembras y n=4 machos), 100015 HO (ratas C1q humanizadas homocigóticas) (n=5 hembras y n=6 machos) y ratas genomanipuladas C1q homocigóticas (n=2 hembras) de diez a diecisiete semanas de edad. Se usó suero humano normal (Quidel) como control positivo, mientras que se usó suero humano empobrecido en C1q (Quidel) como control negativo. El suero de rata y humano se diluyó en serie en una serie de diluciones de 12 puntos y 2 veces de 1/5 a 1/10240 con tampón GVB++ (100 ul de suero/pocillo diluido). Inmediatamente, se añadieron 100 ul de SRBC sensibilizados (a 2x108 células/ml), para un volumen total de 200 ul, y se incubaron 1 hora a 37 °C. Después del tiempo de incubación, las células se dividieron mediante centrifugación a 1250 xg a 4 °C. Se transfirió un total de 100 ul del sobrenadante a una nueva placa con parte inferior plana de 96 pocillos y se leyó a 412 nM en un lector de microplacas Molecular Devices Spectramax M5 y el programa informático SoftMax Pro. Se calculó la actividad hemolítica: La OD541 de todas las muestras experimentales se dividió por la OD541 a la lisis celular máxima (células tratadas con 100 ul de agua) y luego se multiplicó por 100. Los datos representados son puntos únicos (no se ejecutan duplicados).
Como se muestra en la Figura 6, la proteína C1q quimérica obtenida de ratas humanizadas mostró una actividad clásica similar del complemento medida mediante ensayo de hemólisis a la observada en las ratas que comprenden C1q de rata genéticamente intacta, y a la observada con suero humano normal. No se observaron diferencias entre ratas macho y hembras.
Ejemplo 6: Rata C1q humanizada como modelo para probar el tratamiento humano
Para confirmar si una rata C1q humanizada puede servir como modelo para probar agentes terapéuticos humanos, se realizó un ensayo de citotoxicidad dependiente del complementoin vitroy un ensayo de supervivencia bacteriana en sangre completa.
(1) Ensayo de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC)
Para el bioensayo CDC, se usaron células Raji (una línea de células B humanas que expresan CD20), una muestra de suero (suero humano conservado completo, suero de rata WT o suero de una rata humanizada C1q homocigótica como se describió en el Ejemplo 2) y un anticuerpo anti-CD20.
Las células Raji se sembraron en placas de ensayo de 96 pocillos a 10 000 células/pocillo en BSA al 1 % que contenía RPMI 1640. Para medir la CDC con suero humano o de rata, el anticuerpo anti-CD20 se diluyó 1:4 de 20 nM a 0,019 nM (incluida una muestra de control que no contenía anticuerpo) y se incubó con células durante 10 minutos a 25 °C seguido de la adición de suero al 0,5 %. La citotoxicidad se midió después de 1 hora de incubación a 37 °C y en CO2 al 5 %, seguido de 30 minutos de incubación a 25 °C y la adición del reactivo CytoTox-Glo™ (Promega, núm. G9291). CytoTox-Glo™ es un reactivo basado en luminiscencia que mide la destrucción celular de manera que se observa una mayor luminiscencia con un incremento de la citotoxicidad (medida en unidades de luz relativas, RLU). Las células no tratadas en los pocillos de control se lisaron mediante tratamiento con digitonina inmediatamente después de la adición del reactivo CytoTox-Glo™ para determinar la muerte máxima de las células. Las placas se leyeron para determinar la luminiscencia mediante un instrumento Victor X (Perkin Elmer) 10-15 minutos después de la adición de CytoTox-Glo™. Cuando se calculó, el porcentaje de citotoxicidad se calculó con los valores de RLU mediante el uso de la siguiente ecuación:
%decitotoxicidad -100x (Lisiscelularexperimental - Lisiscelulardereferencia)
(Lisiscelularmáxima - Lisiscelulardereferencia)
En esta ecuación "lisis celular de referencia" es la luminiscencia de las células tratadas con medio y suero solo sin ningún anticuerpo anti-CD20 y la "lisis celular máxima" es la luminiscencia de las células tratadas con digitonina. Los resultados, expresados como % de citotoxicidad o RLU, se analizaron mediante el uso de regresión no lineal (logística de 4 parámetros) con el programa informático Prism 7 (GraphPad).
Como se muestra en la Figura 7, la actividad de citotoxicidad dependiente del complemento mediada por el anticuerpo CD2020 nM y el suero de rata C1q humanizado (MAID10015) dio como resultado una lisis máxima del 85-90 % de las células Raji, que fue similar a la lisis mediante el uso de suero de rata genéticamente intacta (lisis del 93-112 %) y suero humano normal (lisis del 83 %). La humanización de la molécula C1q no alteró la lisis dependiente del complemento de las células Raji mediadas por el anticuerpo CD20 en comparación con la C1q de rata.
(2) Supervivencia de S.aureusen sangre de rata C1q humanizada y efectos de un anticuerpo biespecífico
La supervivencia de S.aureusen sangre completa humana puede evaluarse en un ensayoex vivopara explorar el papel de las células efectoras del complemento e inmunitarias en la modulación del crecimiento bacteriano (Thammavongsa y otros, J Exp Med. 26 de octubre de 2009; 206(11):2417-27). En este ensayo, se mide la actividad de un anticuerpo biespecífico dirigido a C1q y un antígeno de S.aureusen la modulación de la supervivencia S.aureusdonde el anticuerpo biespecífico se añade a la sangre completa y la supervivencia se evalúa después de 24 horas. Este ensayo se ha adaptado en este Ejemplo para usar sangre de rata C1q humanizada y examinar la funcionalidad de la proteína C1q quimérica humanizada en la mediación de los efectos de un anticuerpo biespecífico que reconoce específicamente un antígeno de S.aureusy la proteína C1q humana o humanizada pero no la proteína C1q de rata. Se usó como control un anticuerpo monoespecífico bivalente contra el mismo antígeno de S.aureus.
Brevemente, un cultivo de S.aureusNewman se cultivó en RPMI durante toda la noche, se lavó en PBS y se volvió a suspender a una concentración de 1,25 3108 unidades formadoras de colonias (CFU)/ml en PBS y se diluyó en serie a una concentración de 105 CFU/ml. Por duplicado, se mezclaron 104 UFC de la suspensión de S.aureuscon 100 ug/ml de anticuerpo biespecífico, anticuerpo de control o ningún anticuerpo y 100 ul de sangre de rata C1q humanizado o genéticamente intacto (en citrato de sodio como anticoagulante con 500 nM adicionales de dabigatrán para evitar la formación de coágulos). Las muestras se incubaron en placas de 96 pocillos a 37 °C con agitación (100 rpm) durante 24 horas. Después de la incubación, se añadieron a las muestras 100 ul de tampón de lisis de aglutinación (PBS suplementado con 200 U de estreptoquinasa, RNasa 2 ug/ml, DNasa 10 ug/ml, saponina al 0,5 %, tripsina 100 ug por ml de PBS) y se agitaron enérgicamente en el vórtice hasta que el sedimento desapareció. Un total de 50 ul de cada muestra se diluyó en serie en PBS y se sembró en placas de agar LB para la enumeración de las CFU.
En este ensayo, se probaron muestras de sangre recién extraídas de 11 ratas C1q humanizado y 10 WT. Se determinó el porcentaje de supervivencia de S.aureusdespués del tratamiento con los anticuerpos biespecíficos o de control. El crecimiento global en sangre de rata en ausencia del anticuerpo de prueba se normaliza al 100 %. El intervalo de la supervivencia deS. aureusen la sangre de rata WT con el tratamiento con anticuerpos biespecíficos está entre el 58 y el 131 %, mientras que el tratamiento con anticuerpos biespecíficos en sangre de rata C1q humanizada resultó en una supervivencia del 7-49 %. El intervalo de la supervivencia deS. aureusen la sangre de rata WT con el tratamiento con anticuerpos de control está entre el 40-139 %, y el tratamiento con anticuerpos de control en sangre de rata C1q humanizada dio como resultado una supervivencia del 61-114 %.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un animal roedor modificado genéticamente que comprende en su genoma
a. un ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qa quimérico, en donde el polipéptido C1qa quimérico comprende (i) un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % idéntico al dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qa humano en donde el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qa humano comprende los aminoácidos 108-245 de la SEQ ID NO: 4, y (ii) una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos un 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qa endógeno de roedor; b. un ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qb quimérico, en donde el polipéptido C1qb quimérico comprende (i) un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % idéntico al dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qb humano en donde el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qb humano comprende los aminoácidos 115-251 de la SEQ ID NO: 5, y (ii) una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos un 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qb endógeno de roedor; y c. un ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qc quimérico, en donde el polipéptido C1qc quimérico comprende (i) un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % idéntico al dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qc humano en donde el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qc humano comprende los aminoácidos 113-245 de la SEQ ID NO: 6, y (ii) una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos un 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qc endógeno de roedor; en donde los polipéptidos C1qa, C1qb y C1qc quiméricos se expresan en el animal roedor y forman un complejo C1q funcional; y
en donde el animal roedor no expresa un polipéptido C1qa endógeno funcional, un polipéptido C1qb endógeno funcional, o un polipéptido C1qc endógeno funcional.
2. El animal roedor modificado genéticamente de acuerdo con la reivindicación 1,
en donde el animal roedor es un ratón, y en donde (i) la región tallo-pedúnculo N-terminal del polipéptido C1qa endógeno de ratón comprende los aminoácidos 23-107 de la SEQ ID NO: 1; o (ii) el polipéptido C1qa quimérico comprende los aminoácidos 23-245 de la SEQ ID NO: 10;
o
en donde el animal roedor es una rata, y en donde (i) la región tallo-pedúnculo N-terminal del polipéptido C1qa endógeno de rata comprende los aminoácidos 23-107 de la SEQ ID NO: 7, o (ii) en donde el polipéptido C1qa quimérico comprende los aminoácidos 23-245 de la SEQ ID NO: 55.
3. El animal roedor modificado genéticamente de acuerdo con la reivindicación 1,
en donde el animal roedor es un ratón, y en donde (i) la región tallo-pedúnculo N-terminal del polipéptido C1qb endógeno de ratón comprende los aminoácidos 26-114 de la SEQ ID NO: 2, o (ii) el polipéptido C1qb quimérico comprende los aminoácidos 26-251 de la SEQ ID NO: 11;
o
en donde el animal roedor es una rata, y en donde (i) la región tallo-pedúnculo N-terminal del polipéptido C1qb endógeno de rata comprende los aminoácidos 26-114 de la SEQ ID NO: 8, o (ii) en donde el polipéptido C1qb quimérico comprende los aminoácidos 26-251 de la SEQ ID NO: 56.
4. El animal roedor modificado genéticamente de acuerdo con la reivindicación 1,
en donde el animal roedor es un ratón, y en donde (i) la región tallo-pedúnculo N-terminal del polipéptido C1qc endógeno de ratón comprende los aminoácidos 30-113 de la SEQ ID NO: 3, o (ii) el polipéptido C1qc quimérico comprende los aminoácidos 30-246 de la SEQ ID NO: 12;
o
en donde el animal roedor es una rata, y en donde (i) la región tallo-pedúnculo N-terminal del polipéptido C1qc endógeno de rata comprende los aminoácidos 32-115 de la SEQ ID NO: 9, o (ii) el polipéptido C1qc quimérico comprende los aminoácidos 32-248 de la SEQ ID NO: 57.
5. El animal roedor modificado genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el polipéptido C1qa quimérico comprende un péptido señal de C1qa de roedor endógeno, el polipéptido C1qb quimérico comprende un péptido señal de C1qb de roedor endógeno, y el polipéptido C1qc quimérico comprende un péptido señal de C1qc de roedor endógeno.
6. El animal roedor genéticamente modificado de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde (i) el ácido nucleico que codifica al polipéptido C1qa quimérico está en un locus C1qa endógeno de roedor, (ii) el ácido nucleico que codifica el polipéptido C1qb quimérico está en un locus C1qb endógeno de roedor, y (iii) el ácido nucleico que codifica el polipéptido C1qc quimérico está en un locus C1qc endógeno de roedor, y opcionalmente en donde una secuencia genómica endógena en un locus C1q endógeno de roedor se ha reemplazado por una secuencia de ácido nucleico humana, en donde opcionalmente la secuencia de ácido nucleico humana es un fragmento genómico de un gen de C1q humano.
7. El animal roedor modificado genéticamente de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el animal roedor es una rata y comprende en su genoma:
a. en el locus C1qa endógeno, una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qa quimérico de rata/humano en donde la secuencia de ácido nucleico comprende, 5'-3' y en enlace operativo, una primera secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 1-111 de un polipéptido C1qa de rata de la SEQ ID NO: 7 y una segunda secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 112-245 de un polipéptido C1qa humano de la SEQ ID NO: 4;
b. en el locus C1qb endógeno una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qb quimérico de rata/humano en donde la secuencia de ácido nucleico comprende, 5'-3' y en enlace operativo una tercera secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 1-117 de un polipéptido C1qb de rata de la SEQ ID NO: 8 y una cuarta secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 118-251 de un polipéptido C1qb humano de la SEQ ID NO: 5; y
c. en el locus C1qc endógeno, una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qc quimérico de rata/humano en donde la secuencia de ácido nucleico comprende, 5'-3' y en enlace operativo, una quinta secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 1-116 de un polipéptido C1qc de rata de la SEQ ID NO: 9 y una sexta secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 114-245 de un polipéptido C1qc humano de la SEQ ID NO: 6;
o en donde el animal roedor es un ratón y comprende en su genoma:
d. en el locus C1qa endógeno, una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qa quimérico de ratón/humano en donde la secuencia de ácido nucleico comprende, 5'-3' y en la unión operativa, una primera secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 1-111 de un polipéptido C1qa de ratón de la SEQ ID NO: 1 y una segunda secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 112-245 de un polipéptido C1qa humano de la SEQ ID NO: 4;
e. en el locus C1qb endógeno, una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qb quimérico de ratón/humano en donde la secuencia de ácido nucleico comprende, 5'-3' y en enlace operativo, una tercera secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 1-117 de un polipéptido C1qb de ratón de la SEQ ID NO: 2 y una cuarta secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 118-251 de un polipéptido C1qb humano de la SEQ ID NO: 5; y
f. en el locus C1qc endógeno, una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido C1qc quimérico de ratón/humano en donde la secuencia de ácido nucleico comprende, 5'-3' y en enlace operable, una quinta secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 1-114 de un polipéptido C1qc de ratón de la SEQ ID NO: 3 y una sexta secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 114-245 de un polipéptido C1qc humano de la SEQ ID NO: 6.
8. Un método para fabricar un animal roedor modificado genéticamente, que comprende modificar un genoma de roedor de manera que el genoma de roedor modificado comprenda
a) un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico de C1qa de roedor y una secuencia de ácido nucleico de C1qa humano, y codificar un polipéptido C1qa quimérico, en donde el polipéptido C1qa quimérico comprende (i) un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % idéntico al dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qa humano en donde el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qa humano comprende los aminoácidos 108-245 de la SEQ ID NO: 4, y (ii) una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos un 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qa endógeno de roedor;
b) un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico de C1qb de roedor y una secuencia de ácido nucleico de C1qb humano, y codificar un polipéptido C1qb quimérico, en donde el polipéptido C1qb quimérico comprende (i) un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % idéntico al dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qb humano en donde el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qb humano comprende los aminoácidos 115-251 de la SEQ ID NO: 5, y (ii) una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos un 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qb endógeno de roedor; y
c) un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico de C1qc de roedor y una secuencia de ácido nucleico de C1qc humano, y codificar un polipéptido C1qc quimérico, en donde el polipéptido C1qc quimérico comprende (i) un dominio de cabeza globular que es al menos 90 % idéntico al dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qc humano en donde el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qc humano comprende los aminoácidos 113-245 de la SEQ ID NO: 6, y (ii) una región tallo-pedúnculo N-terminal que es al menos un 90 % idéntica a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1qc endógeno de roedor;
en donde cada uno de los ácidos nucleicos a) hasta c) se introduce en el locus C1q endógeno de roedor respectivo, y en donde opcionalmente cada uno de los ácidos nucleicos que codifican un polipéptido C1q quimérico reemplaza una secuencia de nucleótidos del gen de C1q endógeno de roedor respectivo en el locus C1q endógeno de roedor; y
en donde opcionalmente el roedor es un ratón o una rata.
9. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde dicha modificación comprende
introducir (i) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico C1qa humana, (ii) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico C1qb humana, y (iii) una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico C1qc humana en el genoma de una célula madre embrionaria (ES) de roedor,
obtener una célula ES de roedor en la que las secuencias de ácido nucleico humanas estén integradas en los respectivos loci C1q endógenos en un enlace operable con las secuencias de ácido nucleico de roedor endógenas de modo que codifiquen el polipéptido C1qa quimérico, el polipéptido C1qb quimérico y el polipéptido C1qc quimérico; y generar un animal roedor a partir de la célula ES de roedor obtenida.
10. Un ácido nucleico aislado que codifica una proteína C1q quimérica de roedor, que comprende una o más de una primera, segunda o tercera secuencias de nucleótidos, en donde:
la primera secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido C1qa quimérico,
la segunda secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido C1qb quimérico, y
la tercera secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido C1qc quimérico,
en donde cada una de la primera, segunda y tercera secuencias de nucleótidos comprende una secuencia de ácido nucleico de roedor y una secuencia de ácido nucleico humana,
en donde la secuencia de ácido nucleico humano codifica un polipéptido al menos 90 % idéntico al dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qa, C1qb y C1qc humano, respectivamente, en donde el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qa humano comprende los aminoácidos 108-245 de la SEQ ID NO: 4, en donde el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qb humano comprende los aminoácidos 115-251 de la SEQ ID NO: 5, y el dominio de cabeza globular de un polipéptido C1qc humano comprende los aminoácidos 113-245 de la SEQ ID NO: 6; y
en donde la secuencia de ácido nucleico de roedor codifica un polipéptido al menos 90 % idéntico a la región tallo-pedúnculo N-terminal de un polipéptido C1q cognado de roedor de los polipéptidos C1qa, C1qb y C1qc, respectivamente.
11. Una célula madre embrionaria (ES) de roedor que comprende el ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la célula ES de roedor es opcionalmente una célula ES de ratón o una célula ES de rata.
12. Un método para seleccionar al candidato a fármaco que se dirige a un antígeno de interés que comprende introducir el antígeno de interés en un animal roedor modificado genéticamente como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-7,
poner en contacto a dicho animal roedor con un candidato a fármaco de interés, en donde el candidato a fármaco se dirige contra el C1q humano y el antígeno de interés, y
evaluar si el candidato a fármaco es eficaz para prevenir, reducir o eliminar células caracterizadas por la presencia o expresión del antígeno de interés;
en donde opcionalmente el antígeno de interés es un antígeno asociado a un tumor, una célula bacteriana tal como una célula de Staphylococcus, un antígeno bacteriano tal como un antígeno de Staphylococcus o un antígeno viral; y/o
en donde opcionalmente el animal roedor es un ratón o una rata inmunocompetentes; y/o
en donde opcionalmente el candidato a fármaco es un anticuerpo o una proteína de unión a antígeno tal como un anticuerpo biespecífico o una proteína de unión a antígeno biespecífica que es capaz de unirse tanto a la proteína C1q humana como al antígeno de interés.
13. Un método para evaluar si un anticuerpo candidato activa la vía del complemento, que comprende proporcionar una célula que expresa un antígeno de interés en la superficie celular, un anticuerpo candidato que comprende una región Fc humana y dirigida al antígeno de interés, y una muestra de suero de un animal roedor modificado genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 1-7;
mezclar la célula con el anticuerpo candidato para permitir que el anticuerpo se una al antígeno de interés expresado en la superficie celular;
añadir la muestra de suero a la mezcla célula-anticuerpo para permitir la unión de las proteínas C1q humanizadas en la muestra de suero a anticuerpos unidos al antígeno de interés en la célula; y medir la citotoxicidad de la célula.
14. Un método para evaluar un anticuerpo biespecífico candidato dirigido a un antígeno de interés y C1q humana, que comprende
mezclar una célula o virus que expresa el antígeno de interés, el anticuerpo biespecífico candidato y una muestra de sangre de un animal roedor modificado genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, e incubar para permitir que el anticuerpo se una al antígeno de interés expresado por la célula o virus y a las moléculas C1q humanizadas en la muestra de sangre; y medir la supervivencia de la célula o virus, opcionalmente, en donde la célula es una célula bacteriana tal como una célula de Staphylococcus, y el antígeno es un antígeno bacteriano tal como un antígeno de Staphylococcus.
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