KR102554222B1 - 신규한 항-인간 알스폰딘3 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규한 항-인간 알스폰딘3 항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 알스폰딘3 항체는 인간 알스폰딘3 에 특이적으로 결합하여, WNT 신호전달을 효과적으로 차단함으로써 탁월한 중화능을 나타냈으므로, WNT/β-catenin 관련 질환, 예컨대, 암에 대한 진단 수단 뿐만 아니라, 탁월한 항체 치료제로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

신규한 항-인간 알스폰딘3 항체 및 이의 용도{NOVEL ANTI-RSPO3 ANTIBODIES AND USES THEREOF}
본 발명은 신규한 항-인간 알스폰딘3 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.
알스폰딘 (R-spondin, RSPO) 패밀리의 단백질은 척추 동물 간에 보존되고, RSPO1, RSPO3, RSPO3 및 RSPO4의 4개의 구성원을 포함하며, 천장판(roof plate)-특이적 스폰딘, hPWTSR (hRSPO3), THS2D (RSPO3), 크리스틴(Cristin) 1-4, 및 푸트린(Futrin) 1-4 등의 다양한 명칭으로 지칭되었다. 이러한 RSPO 단백질은 Wnt 신호전달의 중심 조절인자인 β-카테닌(catenin) 신호전달을 활성화시키는 것으로 알려져 있으나, RSPO 단백질과 Wnt 신호전달 사이의 관계는 여전히 연구 중이며, RSPO 단백질이 Wnt 리간드에 대한 양성 조절 활성을 지닌다는 것이 보고된 바 있다.
배아 패턴 형성, 배아-후 조직 유지 및 줄기 세포 생물학의 여러 결정적인 조절인자 중 하나인 Wnt 신호전달 경로의 활성화는, 종양 세포를 미분화 상태에서 유지시키거나 증식시키는 발암과 연관되어, 암을 포함한 다양한 질병의 치료를 위한 잠재적인 표적으로 여겨진다.
보다 구체적으로, 세포막 상에 Wnt와 알스폰딘(R-SPONDIN, RSPO) 리간드가 없는 경우, 세포막 상의 LRP5/6와 Frizzled 수용체 complex는 Ubiquitin E3 ligase 인 ZNRF3/RNF43에 의해 Ubiquintination이 되어 lysosome에 의해 분해된다. 동시에 WNT/β-카테닌 신호전달의 중심인자인 β-카테닌은 proteosome에 의해 분해되어 신호전달이 일어나지 않는다. 반면, 세포막 상에 Wnt와 알스폰딘 리간드가 같이 존재하는 경우, 알스폰딘에 의해 ZNRF3/RNF43의 기능이 저해되고 세포막에 축적된 LRP5/6와 Frizzled 수용체 complex를 통해 WNT/β-카테닌 신호전달이 효과적으로 일어나, 세포질내 β-카테닌이 증가되며 핵내로 들어간 β-카테닌에 의해 유전자 발현이 유도된다. 즉, 알스폰딘의 과발현은 Wnt 신호전달의 과활성과 밀접한 관계이다.
따라서, 이러한 Wnt 신호전달 경로를 표적으로 하여 β-카테닌 신호전달을 파괴하는 새로운 생체 분자(예를 들어, 항-RSPO 항체)는, 암 뿐만 아니라 기타 β-카테닌-연관 질환에 대한 이점을 제공할 수 있는, 새로운 치료제가 될 수 있을 것으로 기대된다.
이러한 상황 하에서, 본 발명자들은 알스폰딘3 단백질의 발현여부를 측정함으로 Wnt 신호전달계 과활성으로 인한 질환(예컨대, 암)의 진단과 Wnt 신호전달 차단을 위해 알스폰딘3를 타겟으로 하는 치료제를 개발하고자 예의노력하였다. 그 결과, 인간 알스폰딘3 (R-spondin3, RSPO3)에 특이적으로 결합하는 신규한 항-인간 알스폰딘3 항체를 개발하였고, 본 발명의 신규한 항-인간 알스폰딘3 항체는 인간 알스폰딘3를 타겟으로 하여, 탁월한 중화 효과를 발휘하여 Wnt 신호전달을 효과적으로 차단(억제)한다는 것을 규명함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 일 목적은 인간 알스폰딘3 (R-spondin3, RSPO3)에 특이적으로 결합하는 항-인간 알스폰딘3 항체 또는 이의 항원 결합단편을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 항-인간 알스폰딘3 항체 또는 이의 항원 결합단편을 코딩하는 핵산을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산을 포함하는 재조합 발현벡터를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 발현벡터로 형질감염된 숙주세포를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 인간 알스폰딘3 (R-spondin3, RSPO3)에 특이적으로 결합하는 항-인간 알스폰딘3 항체 또는 이의 항원 결합단편의 제조방법을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 항-인간 알스폰딘3 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는, WNT/β-카테닌 신호 전달 차단용 조성물을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 항-인간 알스폰딘3 항체 또는 이의 항원 결합단편을 유효 성분으로 포함하는 암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 항-인간 알스폰딘3 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 암 진단용 조성물을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 항-인간 알스폰딘3 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 암 진단용 키트를 제공하는 데 있다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
또한, 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 인간 알스폰딘3 (R-spondin3, RSPO3)에 특이적으로 결합하는 항-인간 알스폰딘3 항체 또는 이의 항원 결합단편을 제공한다:
서열번호 1 또는 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
서열번호 2 또는 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2,
서열번호 3 또는 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3,
서열번호 4 또는 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
서열번호 5 또는 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 및
서열번호 6 또는 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 항-인간 알스폰딘3 항체 또는 이의 항원 결합단편은, (i) 서열번호 1의 경쇄 CDR1, 서열번호 2의 경쇄 CDR2 및 서열번호 3의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 및 서열번호 4의 중쇄 CDR1, 서열번호 5의 중쇄 CDR2 및 서열번호 6의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 또는 (ii) 서열번호 7의 경쇄 CDR1, 서열번호 8의 경쇄 CDR2 및 서열번호 9의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 및 서열번호 10의 중쇄 CDR1, 서열번호 11의 중쇄 CDR2 및 서열번호 12의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역;을 포함한다.
또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 항-인간 알스폰딘3 항체 또는 이의 항원 결합단편은, 서열번호 13 또는 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함한다.
또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 항-인간 알스폰딘3 항체 또는 이의 항원 결합단편은, 서열번호 14 또는 16의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함한다.
또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 항-인간 알스폰딘3 항체 또는 이의 항원 결합단편은, 서열번호 13의 경쇄 가변영역 및 서열번호 14의 중쇄 가변영역; 또는 서열번호 15의 경쇄 가변영역 및 서열번호 16의 중쇄 가변영역;을 포함하며, 본 명세서에서 각각 10A3/11A4 및 20H4로 명명한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 10A3/11A4 항체의 경우, 서열번호 13의 경쇄 가변영역(VL) 및 서열번호 14의 중쇄 가변영역(VH)을 포함하고; VL CDR1은 QSIVHSNGNTY(서열번호 1), VL CDR2는 KVS(서열번호 2), VL CDR3은 FQGSHVPLT(서열번호 3), VH CDR1은 GFTFSSYV(서열번호 4), VH CDR2는 ISSGGSYY(서열번호 5), VH CDR3은 ARQGALEGDTSFDY(서열번호 6)이고; 20H4 항체의 경우, 서열번호 15의 경쇄 가변영역(VL) 및 서열번호 16의 중쇄 가변영역(VH)을 포함하고; VL CDR1은 QSIVHSNGNTY(서열번호 7), VL CDR2는 KVS(서열번호 8), VL CDR3은 FQGSHVPLT(서열번호 9), VH CDR1은 GFTFNTYA (서열번호 10), VH CDR2는 ISSGGSHT(서열번호 11), VH CDR3은 ARQGALEGDTSFDY(서열번호 12)이다.
상기 10A3/11A4 및 20H4 항체는 인간 알스폰딘3 (R-spondin3, RSPO3)에 특이적으로 결합하여 우수한 중화능을 나타내는, 탁월한 안타고니스트로 작용하는 길항 항체이다.
본 명세서에서, 상기 항-인간 알스폰딘3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, WNT/β-카테닌의 상호작용을 방해하여, WNT/β-카테닌 신호 전달을 효과적으로 억제할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "항체"란 경쇄 및 중쇄의 가변영역을 통해 다른 분자 (항원)에 결합하는 단백질을 일컫는 것으로, IgG, IgD, IgA 및 IgE 타입을 포함한다. 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 다특이성 항체를 포함한다. 또한 본원의 항체는 다양한 형태의 구조를 갖는 모노클로날 항체를 포함하는 것으로, 예를 들면, 두 개의 전장 중쇄 및 두 개의 전장 경쇄를 포함하는 온전한 항체(intact Ab)는 물론 불변영역을 포함하거나 또는 포함하지 않는 이의 단편, 키메라 항체, 인간항체, 인간화항체, 또는 본원에 따른 특징을 갖는 기타 유전공학적으로 변형된 항체를 일컫는 것이다.
본원에서 사용된 용어 "항원 결합 단편"은 상술한 온전한 항체의 일부를 일컫는 것으로, 길이면에서 온전한 항체의 아미노산 서열보다 하나 이상의 서열이 짧은 서열이다. 기능적인 면에서는 온전한 항체 또는 모(parent) 항체의 적어도 일부 활성 또는 기능을 포함하는 것으로 그 종류는 예를 들면 Fab(Fragment for antigen binding), Fab', F(ab')2, Fv 또는 단쇄항체(Single Chain Antibody, SCA)(예를 들면 scFv 또는 dsFv), bispecific scFv 및 diabody를 들 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다.
본원에서 사용된 용어 "가변영역"은 중쇄와 경쇄의 일부에 의해 형성되는 항원 결합부위로, 각 가변영역은 서열이 보존된 4개의 골격(FR)과 서열의 변이가 심한 3개의 상보성결정부위(CDR, Complementary Determining Region)로 이루어져 있다. 면역글로블린 중쇄 가변영역(VH)의 CDR은 VH CDR1 내지 CDR3, 면역글로블린 경쇄 가변 영역(VL)의 CDR은 VL CDR1 내지 CDR3로 칭한다.
본원에서 사용된 용어 "상보성결정부위"는 항체의 항원에 대한 특이성과 결합력을 결정하는 부위로, 항체간 서열변이가 가장 많이 발견된다. 이들 중 CDR3 부위의 변이가 가장 심하며, 짧게는 2개의 아미노산 많게는 26개 이상을 아미노산 잔기로 구성되어 있다. VH 및 VL에서 CDR 이외의 부분은 골격잔기이다. 본원의 항원 결합 폴리펩타이드의 골격은 자연에 존재하는 인간 항체에서 발견되는 서열, 또는 다양한 항체에서 발견되는 서열을 공통서열로 하여 사용할 수도 있다.
본 발명의 항-인간 알스폰딘3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 인간 알스폰딘3를 특이적으로 인식하여 결합하여 WNT/β-카테닌과의 상호작용을 차단할 수 있는 한, 다양한 형태로 제공될 수 있다.
상기 다양한 형태는 변형을 포함하며, 상기 변형은 항체의 Fc 부분의 변형이 특징인, 효과인자 기능이 감소된 항-인간 알스폰딘3 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다. 상기 Fc-엔지니어링은 Complement에 의한 CDC, 세포독성 세포(cytotoxic Cell)에 의한 ADCC 효과가 미비한 IgG4나 그 변형체에 해당할 수 있다. 즉, IgG4 또는 Fc 부위의 complement binding site나 Fc 수용체 결합부위가 변형되어 CDC나 ADCC 기능이 현저히 저하된 변형체에 해당한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항체는 모노클로날 항체, 키메라 항체, 영장류화 항체, 인간화 항체 및 인간 항체로 이루어진 군으로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 모노클로날 항체이다.
또한, 상기 항-인간 알스폰딘3 항체는 다량체 항체, 이종이량체 항체, 반이량체 항체, 4가 항체, 이중특이적 항체 및 단일 쇄 항체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 항원 결합 단편은 Fab, F(ab)2, Fab', F(ab')2, F(ab')3, Fd, Fv 및 도메인 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
기술분야의 당업자라면 상기와 같은 서열번호 13 내지 16의 서열을 갖는 가변영역을 이용하여 불변영역을 포함하는 항체의 구성요소를 포함하는 항체를 구축할 수 있을 것이다.
또한, 본 발명은 상기 서열번호 1 내지 16에서 아미노산에 보존적 치환이 일어난 것을 포함한다. 본 발명에서는 10개 미만, 9개 미만, 8개 미만, 7개 미만, 6개 미만, 5개 미만, 4개 미만, 3개 미만, 2개 미만 또는 1개의 아미노산에서 치환이 일어난 것일 수 있다.
본원에서 용어 "보전적 치환(conservative substitution)"은 하나의 아미노산이 유사한 특징의 다른 아미노산으로 치환되는 것을 일컫는 당업계에서 널리 통용되는 용어이다. 유사한 특징이란, 예를 들면 크기, 소수성, 또는 전하(Charge)를 포함한다. 아미노산은 통상적으로 측쇄의 전기적 특징에 따라 양으로 하전된 측쇄, 음으로 하전된 측쇄, 비하전 측쇄 또는 소수성 측쇄를 갖는 아미노산으로 분류된다. 예를 들면 보존적 치환은 루이신(Leu)에서 아이소루이신(ile), 알지닌(Arg)에서 라이신(Lys), 페닐알라닌(Phe)에서 트립토판(Trp), 아스파르트산(Asp)에서 글루탐산(Glu), 또는 세린(Ser)에서 트레오닌(Thr), 또는 그 역으로의 치환을 포함한다. 일반적으로 CDR 서열의 보존적 치환은 CDR의 기능에 본질적인 영향을 미치지 않는다.
이러한 서열의 치환 방법은 당업계에 공지된 것으로 예를 들면 Sambrook, Molecular Cloning [0053] A Laboratory Manual (Fourth Edition), Cold Spring Harbor Laboratory (2012) N.Y. 를 참조할 수 있다.
본원에 따른 항체는 항원 결합 단편, 변이체 또는 그 유도체를 포함하는 것으로, 폴리클로날, 모노클로날, 다특이성, 인간, 인간화, 영장류화, 또는 키메라 항체, 단쇄 항체, 에피토프 결합 단편, 예를 들면 Fab, Fab', F(ab')2, F(ab)2, Fd, Fvs, 단쇄 Fvs (scFV), 이황화 연결된 Fvs (sdFv), VL 또는 VH 영역을 포함하는 단편을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다. 본원에 따른 항체는 임의의 유형 예를 들면 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 또는 IgY일 수 있으며, 또한 임의의 클래스 예를 들면 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 또는 IgA2일 수 있거나 또는 그 서브클래스일 수 있다.
본원의 항-인간 알스폰딘3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 키메라 항체일 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "키메라 항체"는 가변영역 즉 항원 결합 부위와 항체의 불변영역 (경쇄의 경우 CL1, 중쇄의 경우, CH1, CH2, 및 CH3 영역을 포함)의 적어도 일부가 다른 종(species)로부터 유래한 것을 말한다. 예를 들면 가변영역은 마우스유래이고, 불변영역은 인간 유래의 것을 포함할 수 있다. 또는 클래스전환(class switch)된 항체, 예를 들면, IgG 유형에서 IgE 유형으로 전환된 항체를 또한 의미한다.
또한, 본원의 항-인간 알스폰딘3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간화 항체일 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "인간화 항체"는 항체의 골격은 인간의 항체이고 CDR 영역의 일부는 원래 항체분자가 유래된 종의 CDR 중 항원에 대한 특이적 결합에 필수적인 부분만을 포함하도록 변형된 것을 의미한다. 예를 들면 원숭이, 또는 마우스 유래 항체의 CDR 중 항원에 대한 특이적 결합에 필수적인 부위를 제외한 나머지 CDR 부위와 경쇄 및 중쇄 골격은 인간의 항체로 대치된다.
또한, 본 발명에 따르면, 본 발명의 항체는 다양한 형태의 항체로 제조될 수 있다. 본 발명의 항체는 서로 다른 기능을 가진 Fab를 융합하여 다기능을 갖는 융합 항체, 또는, Fab 항체에 얻은 경쇄 및 중쇄 가변영역을 이용하여 인간 유래의 불변영역과 재조합함으로써 완전한(whole) 형태의 항체를 제공할 수도 있다.
또한, 본 발명의 항-인간 알스폰딘3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 모노클로날 항체일 수 있다. 용어 "모노클로날 항체" 또는 “단일클론 항체”는, 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체분자를 의미하며, 단일클론 항체는 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.
모노클로날 항체는 골수종 세포를 면역화된 포유류 유래의 비장세포와 융합하여 제조하는 것을 기본으로 하는 것으로 당업계에 다양한 공지된 방법으로 제조될 수 있다. 일 구현예에서, 본원의 항체는 실시예 1에 기재된 하이브리도마에서 생산된 항체의 경쇄유래의 하나 이상의 CDR, 및/또는 중쇄유래의 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체 단편을 포함한다.
본원에 따른 항체는 구체적 목적에 따라, 추가적으로, 치료제, 프로드럭, 펩타이드, 단백질, 효소, 바이러스, 지질, 생물학적 개질제, 약물 및 PEG(polyethylene glycol)로 구성되는 군으로부터 선택되는 기능적 물질과 컨쥬게이션되어 제공될 수 있다. 또한, 컨쥬게이션 되는 물질의 종류에 따라 다양한 방법을 이용하여 제조될 수 있다.
상기 치료제, 프로드럭, 펩타이드, 단백질, 효소, 바이러스, 지질, 생물학적 개질제 및 약물은 목적의 효과를 달성할 수 있는 한, 당업계에서 통상적으로 이용되는 임의의 것들을 이용할 수 있다.
항체의 단편은 펩신 또는 파파인으로 처리하여 수득될 수 있다. F(ab')2 단편은 온전한 항체를 펩신으로 처리하여 수득할 수 있으며, 이를 티올 환원제로 후속 처리하면, 경쇄 및 중쇄 일부를 포함하는 Fab 단편을 수득할 수 있다. Fab 단편은 또한 온전한 항체를 파파인으로 처리하여 수득될 수 있다. 예를 들면 본원 하이브리도마에서 생산된 항체를 펩신 또는 파파인으로 처리하여 F(ab')2 또는 Fab와 같은 알스폰딘을 특이적으로 인식하는 항체 단편을 제작할 수 있다.
Fv 단편은 중쇄 및 경쇄의 가변영역만으로 구성된 항체 단편으로 두 가변영역은 화학적가교제 또는 분자간 이황화결합 같은 비공유 또는 공유 결합으로 연결될 수 있으며 (Inbar et al. (1972) PNAS 69:2659-2662), 예를 들면 본원 하이브리도마에서 생산된 항체를 효소 처리하여 중쇄 및 경쇄의 가변영역만을 분리하거나 또는 재조합 DNA 기술을 사용하여, 알스폰딘을 특이적으로 인식하는 항체를 제작할 수 있다.
SCA 단편은 효소 처리 또는 유전공학적으로 제조될 수 있으며, 경쇄의 가변영역 및 중쇄의 가변영역이 폴리펩타이드와 같은 링커에 의해 연결되어 있는 항체 단편이다. ScFv의 제조방법은 예를 들면 US 특허 제4,936,778호 또는 US 특허 제5,892,019호에 기재된 것을 참조할 수 있으며, 본원 하이브리도마에서 생산된 항체를 효소처리하거나 또는 재조합 DNA 기술 예를 들면 상기 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산서열을 포함하는 벡터를 제작하여, 이를 적절한 세포에서 발현함으로서, 알스폰딘을 특이적으로 인식하는 항체를 제작할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "결합" 또는 "특이적 결합"은 본원 항체 또는 항체 조성물의 항원에 대한 친화도를 나타내는 것이다. 항원 항체 결합에서 "특이적 결합"은 전형적으로 해리상수(dissociation constant, Kd)가 1x10-5M 미만 또는 1x10-6M 미만 또는 1x10-7M 미만인 경우 비특이적인 배경 결합과 구분될 수 있다. 특이적 결합은 당업계의 공지된 방법, 예를 들면 ELISA, SPR(Surface plasmon resonance), 면역침전(immunoprecipitation), 공침전(coprecipitation) 등의 방법으로 검출될 수 있으며, 비특이적 결합과 특이적 결합을 구분할 수 있는 적절한 대조군을 포함한다.
상술한 바와 같은 온전한 항체 또는 그 단편을 포함하는 본원의 항체는 단량체의 항원 결합능의 적어도 일부를 포함하는 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체 등의 다량체로 존재할 수 있다. 이러한 다량체는 또한 동종다량체, 또는 이종다량체를 포함하는 것이다. 항체 다량체는 다수의 항원 결합 부위를 포함하기 때문에 단량체와 비교하여 항원에 대한 결합능이 우수하다. 항체의 다량체는 또한 다기능성(bifunctional, trifunctional, tetrafunctional) 항체 제작에도 용이하다.
본원에서 사용된 용어 "다기능성"이란, 두 가지 이상의 활성 또는 기능 (예를 들면 항원결합능, 효소 활성, 리간드 또는 수용체 결합능)을 갖는 항체 또는 항체 조성물을 일컫는 것으로, 예를 들면 본원의 항체는 효소 활성을 갖는 폴리펩타이드 예를 들면 루시퍼라제, 아세틸트랜스퍼라제, 갈락토시다제 등과 결합될 수 있다. 다기능성 항체는 또한 다가성(multivalent) 또는 다특이성(bispecific, trispecific, 등) 형태의 항체를 포함한다.
"다특이성"이라는 용어는 두 개 이상의 상이한 에피토프에 결합할 수 있는 가변영역을 포함하는 것이다. 상기 두 가지 이상의 에피토프는 한 가지 항원에 존재할 수 있거나 또는 다른 항원에 존재할 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 항-인간 알스폰딘3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자 및 상기 단리된 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
핵산은 예를 DNA, cDNA, RNA, 또는 재조합 또는 합성된 DNA 또는 RNA를 포함한다. 일 구현예에서, 핵산 분자는 cDNA이다. 핵산은 또한 상응하는 유전체(genomic DNA) 또는 그 단편일 수 있다. 본원에 따른 항체 또는 그 일부 또는 그 단편을 코딩하는 핵산 서열을 아미노산을 코딩하는 핵산서열의 중첩성 (redundancy)으로 인하여 상이할 수 있으며, 이러한 서열도 본원에 포함된다.
또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 항-인간 알스폰딘3 항체 를 코딩하는 핵산은, 서열번호 17의 경쇄 가변영역 및 서열번호 18의 중쇄 가변영역; 또는 서열번호 19의 경쇄 가변영역 및 서열번호 20의 중쇄 가변영역을 포함하며, 본 명세서에서 각각 10A3/11A4 및 20H4로 명명한다.
본원에 사용될 수 있는 벡터는 예를 들면, 파이지, 플라즈미드, 복제 가능 또는 복제 불능의 바이러스 또는 레트로바이러스 벡터를 포함한다. 본원에 따른 핵산 분자는 공지된 다양한 벡터에 도입될 수 있다. 예를 들면 원핵세포용 벡터로서 pUC 계열 벡터, pBluescript (Stratagene), pET 계열 벡터(Novagen) 또는 pCRTOPO (Invitrogen) 벡터 등을 포함하며, 진핵세포용 벡터로서, pREP (Invitrogen), pcDNA3 (Invitrogen), pCEP4 (Invitrogen), pMCI neo(Stratagene), pXT1 (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2neo, pBPV-1, pdBPVMMTneo, pRSVgpt, pRSVneo, pSV2-dhfr, plZD35, pLXIN, pSIR (Clontech), pIRES-EGFP (Clontech), pEAK-10 (Edge Biosystems), pTriEx-Hygro (Novagen) 및pCINeo (Promega) 벡터 등을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.
본원에 따른 벡터는 공지된 다양한 원핵 또는 진핵세포에 공지된 형질전환 또는 전달이입 방법으로 도입될 수 있다. 세포에 도입시, 숙주세포의 유전체로 삽입될 수 있거나, 또는 엑스트라 크로모좀 형태로 존재할 수 있다.
사용될 수 있는 원핵 세포로는 Escherichia, Bacillus, Streptomyces 및 Salmonella 계열에 속하는 세포를 포함하며, 진핵 세포로는 포유류 세포 예를 들면 Hela, HEK293, H9, Jurkat, 마우스 NIH3T3, C127, Cos1, Cos7 및 CV1, 마우스 C2C12, BHK, CHO 세포; Saccharomyces cerevisiae 또는 Pichia pastoris 와 같은 진균 세포, 초파리 S2 및 Spodoptera Sf9와 같은 곤충세포를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.
본원의 항체는 재조합 방법을 이용하여 공지된 방법대로 생산될 수 있다. 재조합 방법의 경우 본원에 따른 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산 서열 및 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 항체를 하나 또는 두 개의 발현벡터에 클로닝한후 진핵 숙주세포에 전달이입하여 항체를 발현한 후, 숙주세포 또는 배지로부터 항체를 수득할 수 있다. 이러한 벡터의 제작, 제작된 벡터로부터 세포에서의 단백질의 발현 및 단백질의 분리를 포함하는 재조합 방법은 당업계에 공지되어 있으며 예를 들면 Kaufman,R.J., Mol. (2000) Biotechnol.16:151-160에 기재된 것 등을 참조할 수 있다. 본원의 항체를 코딩하는 벡터는 적절한 숙주세포 예를 들면 CHO 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, HEK293 세포, COS 세포, 이스트 또는 대장균에서 발현될 수 있으며, 항체는 세포의 융해물 또는 배지로부터 수득될 수 있다.
본원의 항체 전부 또는 그 단편을 코딩하는 핵산 서열은 본원에 개시된 하이브리도마 세포로부터 통상의 방법대로 분리된 후 그 서열이 분석될 수 있다. 이어 분리된 핵산 서열을 상술한 바와 같은 적절한 발현벡터에 클로닝한 후 항체를 생산하지 않는 HEK293 세포, CHO 세포 또는 NS0 세포에 전달이입하여 숙주세포에서 재조합 항체를 생산할 수 있다. 본원의 항체 또는 그 단편을 코딩하는 핵산은 프로모터, 번역개시부위, 3' 비번역부위, 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결 신호를 포함하는 발현벡터로 도입된다. 경쇄 및 중쇄는 하나의 벡터 또는 별도의 벡터에 도입될 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 숙주세포를 배양하여 항체를 생성하는 단계; 및 생성된 항체를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 인간 알스폰딘3 (R-spondin3, RSPO3)에 특이적으로 결합하는 항-인간 알스폰딘3 항체 또는 이의 항원 결합단편의 제조방법을 제공한다.
본원의 항체는 하이브리도마를 포함하는 온전한 세포, 또는 그 세포 융해물(lysate)이나 배지에 존재할 수 있으며, 이로부터 일부 또는 실질적으로 순수한 형태로 정제 분리될 수 있다. 정제는 항체 이외의 세포의 다른 부산물 예를 들면 세포구성물, 핵산, 단백질 등을 제거하기 위한 것으로, 알칼라인/SDS 처리, CsCl 분리, 컬럼크로마토그래피, 아가로스전기영동과 같은 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
모노클로날 항체는 예를 들면 본원에 개시된 하이브리도마 세포를 배양한 후, 이의 배지로부터 통상의 방법 예를 들면 단백질 A-세파로즈, 하이드록시아파타이드 크로마토그래피, 투석, 또는 친화 크로마토그래피와 같은 방법을 사용하여 분리될 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 항-인간 알스폰딘3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, WNT/β-카테닌(catenin) 신호 전달 차단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 상술한 항-인간 알스폰딘3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 항-인간 알스폰딘3 항체 또는 이의 항원 결합단편을 유효 성분으로 포함하는 암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 상기 조성물은 목적 효과를 달성하는, 즉, 암의 치료 또는 예방 효과를 나타내는 임의의 치료제, 예컨대, 암치료제와 병용될 수 있는, 항암제의 효능 증진용 항암 보조 치료제로서 제공될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "보조 치료제"는, 당업계에서 일반적으로 사용되는 암 치료제의 효과를 증진시키기 위하여 보조적으로 사용될 수 있는 제재를 말하며, 본 발명에 의한 보조제를 사용함으로써 암 치료제의 효능을 촉진하여 치료제의 효과를 향상시킬 수 있다.
즉, 본 발명에서 제안되는 항-인간 알스폰딘3 항체 또는 이의 항원 결합단편은 알스폰딘3의 기능을 저해함으로써 암의 예방, 경감, 개선 및/또는 치료에 사용 가능하다. 또한, 상기 항-인간 알스폰딘3 항체 또는 이의 항원 결합단편은 WNT/β-카테닌(catenin) 신호 전달을 저해함으로써 항암제의 알스폰딘3 발현 세포로의 전달 효능을 증진시켜, 항암 치료에 있어서, 항암제와 병용 투여되어 항암제에 대한 민감성 (sensitiveness)을 증진시키고 항암제의 효능 증진시키기 위한 항암 보조제로서도 적용 가능하다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 선택적으로 부형제 또는 안정화제와 함께 제형화된다.
본원에서 사용된 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 생리적으로 적합한 물질로, 예를 들면 임의의 용매, 분산매질, 코팅제 항박테리아 및 항진균제, 등장액, 흡수/재흡수 지연제, 등과 같은 물질을 포함한다. 한 구현예에서, 담체는 특히 주사 및 주입에 적합한 물질이 사용된다. 예를 들면 약학적으로 허용 가능한 담체는 멸균수 용액 또는 등장 완충 식염수 또는 분산액 및 멸균 주사액 제조용 멸균 분말을 포함할 수 있으며, 당업자라면 조성물에 포함되는 활성성분의 종류에 따라 적절한 제제를 선택할 수 있을 것이다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등 을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본원의 조성물은 당업계에 공지된 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 목적하는 효과에 따라 투여 방식 및 경로가 상이할 수 있음은 당업자에게 자명한 것이다. 본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 바람직하게는 비경구로 투여된다. 비경구로 투여되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입 및 복강 주입 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 적용되는 질환의 종류에 따라, 투여 경로가 결정되는 것이 바람직하다.
본원에 따른 약학적 조성물의 유효 투여량 및 투여기간은 특정 환자, 조성물에 포함된 항체의 종류 및 투여방식 등을 고려하여 목적하는 치료효과에 따라 변할 수 있으며, 환자에게 독성을 유발하지 않아야 한다. 환자별 실제 투여량은 사용되는 조성물의 활성도, 투여경로, 투여시간, 분비속도, 함께 사용하는 다른 약물, 성별, 나이, 몸무게, 전반적 건강상태, 기저질병 등과 같은 다양한 요인을 고려하여 선별해야 한다. 한 구현예에서 본원의 항체는 질환의 치료 또는 예방을 위해 약 1 내지 100 mg/kg 체중, 예를 들면 약 10, 20, 30, 40, 또는 50 mg/kg 체중의 양으로 투여될 수 있으나, 경우에 따라 많게는 약 100 mg/kg의 양으로 투여될 수 있다.
본원에 따른 약학적 조성물의 투여간격은 투여되는 항체의 반감기를 고려하여 적절한 간격 일단위, 주단위, 달단위로 투여될 수 있다.
또한 본원 조성물은 투여 경로와 상관없이 약학적으로 허용가능한 적절한 투약 형태, 예를 들면, 수화된 형태, 예를 들면 수용액, 또는 동결건조된 형태로 제형화될 수 있다.
본 발명에서, 암은 RSPO3에 의해 과활성화된 Wnt 신호 전달을 갖는 암으로서, 본 발명의 조성물이 효과를 달성하는 한, 임의의 암을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 간암, 대장암, 자궁경부암, 신장암, 위암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암, 혈액암 및 췌장암으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 조성물은 상술한 항-인간 알스폰딘3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이용하므로, 이와 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 항-인간 알스폰딘3 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 암 진단용 조성물 및 암 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 항-인간 알스폰딘3 항체는 알스폰딘3를 타겟으로 하여, 알스폰딘3 -과발현 세포에 특이적으로 결합하는 바, 알스폰딘3 이 과발현된 암을 대상으로 하는 진단용 바이오마커로서 이용할 수 있다.
본 발명의 항체를 이용한 단백질 발현 여부 측정은 단백질 및 항체 간의 항원-항체 복합체를 형성함으로써 측정되며, 다양한 방법에 의해 상기 복합체의 형성량을 측정함으로써 정량적으로 검출할 수 있게 된다.
본 발명에서 용어 항원-항체 복합체란 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨 (detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적인 측정이 가능하다.
또한, 본 발명의 키트는 마커 성분에 특이적으로 결합하는 항체, 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체(conjugate), 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액, 세척액 및 효소반응 정지용액 등을 포함할 수 있으며, 사용되는 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
본 발명의 조성물 및 키트는 상술한 항-인간 알스폰딘3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이용하므로, 이와 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 알스폰딘3 항체는 인간 알스폰딘3에 특이적으로 결합하여, WNT 신호전달을 효과적으로 차단함으로써 탁월한 중화능을 나타냈으므로, WNT/β-카테닌 관련 질환, 예컨대, 암에 대한 진단 수단 뿐만 아니라, 탁월한 항체 치료제로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 신규한 알스폰딘3 특이 단클론항체 개발을 위해 인간 알스폰딘3 재조합 단백질을 항원으로 사용한 방법을 개략적으로 보여준다.
도 2는 본 발명의 5종의 알스폰딘3 항체들의 동종형 판별 결과를 보여준다.
도 3은 항원인 인간 알스폰딘3 단백질과 본 발명의 알스폰딘3 단클론 항체간의 친화성 분석 결과를 보여준다.
도 4는 본 발명자들은 본 발명의 알스폰딘3 특이 단클론 항체들의 특이도 분석 결과를 보여준다.
도 5 및 6은 알스폰딘3에 의한 WNT 신호전달 활성에 대한 본 발명의 5종의 알스폰딘3 항체들의 중화능 분석 결과를 보여준다.
도 7은 본 발명의 항-인간 알스폰딘3 항체에 의한 암 진단 결과를 보여준다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실험 방법
하이브리도마 제작
인간 알스폰딘3 재조합 단백질(Accession NP_116173.2)과 complete Freund's adjuvant를 섞은 후 6주령의 Balb/c 암컷 마우스의 복강에 주사하고 2주 뒤 꼬리정맥에서 채취한 혈액의 혈청에서 항체형성을 ELISA법으로 확인하였다. 항체형성이 확인된 마우스에게 인간 알스폰딘3 재조합 단백질을 Phosphate Buffered Saline (PBS)에 희석해 2차 복강 주사하였다. 3일 뒤 마우스의 Spleen을 적출하고 세포를 분리한 후 Poly Ethylene Glycol (PEG) 8000를 이용하여 myeloma 세포주 (Sp2/0-Ag14)와 세포융합을 유도한 후 융합된 세포를 96 well plate에서 1 X HAT 배양액에서 배양하였다. 총 384개 well에서 자란 독립된 세포 클론들의 세포배양액을 ELISA 법으로 분석하여 인간 알스폰딘3에 대한 결합성을 보이는 48개의 양성 세포 클론들을 선별하여 24 well plate에서 배양하여 각 클론의 일부 세포는 냉동보관하고 일부는 배양을 계속하여 세포배양액을 채취하였다. 세포배양액의 인간 알스폰딘3 항원에 대한 반응성을 ELISA 법과 β-카테닌 활성화 저해정도를 측정하여 최적의 5개의 독립 클론을 선별하였다. 각각의 1차 선택된 클론세포내 혼재할 수 있는 다른 클론세포를 제거하고 완전한 단일 클론세포를 확보하기 위하여 96 well-plate에 well당 1 세포씩 분주하고 배양한 후 ELISA법으로 세포배양액내 항 알스폰딘3 항체의 항원반응성을 측정하여 일차 클로닝을 시행하였다. 일차 클로닝된 세포를 다시 96 well plate에 well 당 1개 세포씩 분주한 후 배양하여 다시 ELISA법으로 최적 2차 클론을 선별하고, 같은 방식으로 3차 클로닝을 시행하여 최종적으로 항-인간 알스폰딘3 항체를 생산하는 하이브리도마 클론을 확정하였다.
ELISA
5ug/ml 농도의 항원단백질 (인간 알스폰딘3 재조합 단백질) 50ul를 96well plate의 각 well에 넣고 4℃에서 overnight하여 코팅하였다. 남아있는 코팅액을 제거하고 2% skim milk/TBST액 200ul를 각 well에 넣어 37℃에서 1시간동안 블록킹을 한 후 TBST 액으로 각 well을 세척하였다. 항체가 포함되어 있는 세포배양액 50ul를 각 well에 각각 넣은 후 37℃에서 2시간 동안 결합반응을 유도하였다. TBST 액으로 3번에 걸쳐 각 well을 세척한 후, HRP 효소가 결합된 마우스 유래 항체에 특이적 결합성을 갖는 이차항체를 50ul 용량으로 각 well에 넣어 37℃에서 1시간동안 결합을 유도하였다. TBST액으로 5번에 걸쳐 각 well을 세척한 후, HRP 효소의 substrate인 TMB (50ul)를 넣어 발색반응을 유도하고, 발색반응이 일어나면 1N H2SO4 액으로 발색반응을 중지시키고 450nm를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
항원-항체 친화성 분석
Octet QK 플랫폼에서 AR2G Bio-sensor를 이용하여 항원 항체간 친화성 분석을 실시하였다. 먼저 3차 증류수로 Bio-sensor를 hydration하고 인간 알스폰딘3 재조합 단백질을 기기에 주입하고 5분간 안정화를 시켜 Bio-sensor에 단백질이 코팅되도록 하였다. 항체를 각각 0.1953nM에서 6.25nM의 농도로 주입하여 결합시간 5분, 분리시간 15분간에 걸쳐 반응성에 대한 optimization을 하였고 가장 반응성이 좋은 농도에서 Ka 값과 Kd 값을 측정하여 KD값을 확인하였다.
형질전환
Cos7 세포주를 48 well-plate에 subconfluent (4 x 104 cells/well)정도로 seeding하고 세포가 well 바닥에 잘 부착되고 안정화되도록 37℃, CO2 세포배양기에서 24시간 정도 배양하였다. 인간 알스폰딘 1, 2, 3, 및 4 유전자(알스폰딘1, GeneID 284654; 알스폰딘2, GeneID 340419; 알스폰딘3, GeneID 84870; 알스폰딘4, GeneID 343637)를 지닌 세포 발현용 plasmid들을 각각 Lipofectamine 2000 형질전환용 시약과 섞은 후 배양 세포에 첨가하고 충분한 발현을 위해 48시간동안 배양하였다. 형질전환된 세포의 배양액을 제거하고 PBS로 세번 씻어 준 후 4% paraformaldehyde/PBS로 고정한 후 면역형광염색에 사용하였다.
면역형광염색
고정된 세포를 PBS/1% NP40액에 5분간 처리하여 세포막을 항체가 투과할 수 있도록한 후 PBS로 2차례 세척하고, 3% BSA/5% Donkey serum/PBS 액으로 30분간 상온에서 블록킹하였다. 블록킹 용액을 제거한 후 일차항체를 3% BSA/PBS에 희석하여 세포시료에 첨가하여 4℃에서 overnight동안 처리하였다. 일차 항체가 포함된 액을 제거하고 PBS/1%NP40액으로 두차례 세척하였다. 형광체가 결합된 이차항체를 3% BSA/PBS액에 희석하여 세포에 상온에서 2시간동안 처리하였다. 이차항체액을 제거한 후 다시 PBS/1%NP40액으로 두차례 세척한 후 핵 염색을 위해 DAPI 액을 처리하고 도립 형광현미경으로 관찰하여 이미지를 획득하였다.
면역조직염색
인간 암조직의 파라핀 절편이 부착된 슬라이드를 100% Xylene에서 5분간 3번 씻어 파라핀을 제거하고, 100%, 95%, 70% EtOH, 그리고 증류수까지 순차적으로 처리하여 조직을 재수화(rehydration)하였다. 슬라이드를 시트릭산 버퍼 용액 (10mM Citric acid, pH 6.0)안에서 80℃에서 20분간 처리한 후 상온까지 서서히 식혀서 항원을 노출시켰다. PBS/0.2% Triton-X 액에 5분간 세번 처리하여 세포막을 항체가 투과할 수 있도록 한 후 PBS로 2차례 세척하고 2.5% normal horse serum/0.2%Triton-X/PBS 액으로 2시간 상온에서 블록킹하였다. 블럭킹액을 제거한 후 일차항체를 1.5% normal horse serum/0.2% Triton-X/PBS에 희석하여 세포시료에 첨가하여 4℃에서 overnight동안 처리하였다. 일차 항체가 포함된 액을 제거하고 PBS/0.2% Triton-X액으로 두차례 세척한 후 biotin이 결합된 이차항체를 1.5% normal horse serum/PBS에 희석하여 10분간 처리하였다. 0.2% Triton-X/PBS용액으로 5분간 세척한 후 streptavidin/horse radish peroxidase 결합체를 상온에서 5분간 처리한 후 다시 PBS/0.2% Triton-X액으로 두차례 세척하였다. Peroxidase의 substrate인 DAB 용액을 처리하여 진갈색의 염색과정을 실시하였다. 광학현미경 하에서 염색정도를 관찰하며 적정한 수준에 도달시 시 증류수로 씻어 염색 반응을 종료시켰다. Gill's hematoxylin (#2)로 핵을 염색한 후, 0.2% ammonium acetate 용액 처리로 핵염색을 진한 청보라색으로 발색시키고, 이후 70%, 95%, 100% EtOH를 순차적으로 처리하여 조직을 탈수한 후 커버글라스 마운팅하였다.
웨스턴 블롯팅
배양한 HEK293 세포를 PBS로 씻어준 후 4℃로 냉각된 hypotonic lysis buffer를 100 ul/well 첨가하였다(24 well 기준). 세포를 긁어 냉각된 tube에 옮긴 뒤 얼음에서 10분 동안 방치하였다. 30초 동안 강하게 vortex한 뒤 얼음에 5분 간 방치 후 다시 20초 동안 강하게 vortex를 한 번 더 실시한 뒤 얼음에 보관하였다. 10x sucrose 용액을 10 ul를 첨가한 뒤 약하게 vortex한 후, slide glass에 세포 sample을 소량 올려 현미경으로 세포막이 잘 터졌는지 확인하였다. 세포 혼합액을 20,000 x g, 1hr, 4℃에서 원심분리한 후, 원심분리 된 샘플의 상층액 (세포질 fraction)을 수거하였다. BCA kit로 단백질 양을 정량한 후, 시료 (35 ug/20 ul)를 10% SDS-polyacrylamide gel을 사용하여 전기영동을 실시하였다. 젤에서 분리된 단백질을 PVDF 필터로 트랜스퍼한 후, 5% skim milk/TBST 액으로 상온에서 1시간 동안 블럭킹하고, 필터를 항 β-카테닌 일차항체를 1% BSA/TBST에 희석한 용액에 4℃에서 overnight동안 처리하여 결합 반응을 유도하였다. TBST액으로 필터를 세척하고, 이어서 Horse radish peroxidase-이차항체를 1% BSA/TBST에 희석한 용액을 상온에서 2시간 처리하여 결합반응을 유도한 후 chemiluminescence 반응을 통해 이차/일차항체와 결합된 β-카테닌 양을 동정하였다.
luciferase reporter 어세이
Wnt 신호전달 리포터 세포주인 HEK293-STF를 배양한 후 Wnt와 알스폰딘3 리간드 단백질과 항체를 16 시간 동안 처리하였다. 세포를 Phosphate-Buffered-Saline으로 씻어준 후 200ul의 1 X Passive Lysis Buffer를 넣고 (24 well plate 기준) 상온에서 15분간 rocking을 해가며 세포 lysis를 일으켰다. 세포 lysates를 새 튜브에 옮기고 vortex한 후, 13,000g에서 1분간 원심분리후 10ul를 효소반응에 사용하였다. Dual Luciferase kit (Promega)에 있는 LAR II substrate 50 ul를 세포질용액 10ul와 섞은 후 GLOWMAX 20/20 luminometer를 이용하여 발광정도를 측정하였다. Stop&Glow 시약을 50ul 첨가한 후 이차로 발광도를 측정하였다.
실시예 1. 본 발명의 항-인간 알스폰딘3 항체를 생산하는 하이브리도마의 제작
본 발명자들은 알스폰딘3를 타겟으로 하여, 알스폰딘3-과발현 암을 진단하고, WNT/β-catenin 신호 전달을 차단할 수 있는 신규한 항-인간 알스폰딘3(Anti-hRSPO3) 항체를 개발하기 위하여, 이를 생산하는 하이브리도마를 제작하였다(도 1).
그 결과, WNT/β-catenin 신호전달을 활성화시키는데 작용하는 인간 알스폰딘계 단백질 4 가지 중, 알스폰딘3 단백질만을 특이적으로 인식하는 5 종의 마우스 유래 단클론 항체 생산 하이브리도마 세포주 (1E3, 9C9, 10A3, 11A4, 20H4)들을 제작하였고, 이로부터 생산되는 단클론 항체 (mAb1E3, mAb9C9, mAb10A3, mAb11A4, mAb20H4)들을 분리하였다.
실시예 2. 본 발명의 항-인간 알스폰딘3 항체의 특성 분석 및 선별
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 생산된 총 5종의 알스폰딘3 특이 단클론항체를 분석하기 위해, ELISA를 실시하여 동종형을 판별하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 4종의 항체는 IgG1/κ형, 1종은 IgG2a/κ형임을 확인하였다.
또한, 본 발명자들은, 항원인 인간 알스폰딘3 단백질과 본 발명의 5종의 알스폰딘3 단클론 항체간의 친화성을 분석하기 위해, ARG2 (Bio-Sensor) 기기를 이용하여 항원 항체간 KD (Equilibrium Dissociation Constant)를 측정하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 5종의 알스폰딘3 단클론 항체들의 KD는 1.36E-9에서 8.81E-12로 측정되어 picomolar 수준의 높은 민감도를 나타냄을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 5종의 알스폰딘3 단클론 항체들은 우수한 친화성을 보여준다.
또한, 본 발명자들은 본 발명의 알스폰딘3 특이 단클론항체들이 다른 인간 알스폰딘 단백질들(hRSP01, hRSP02, 및 hRSP04)에 대해서도 결합하는 지를 확인하기 위해, 다른 알스폰딘 발현용 플라스미드를 Cos7 세포에 형질전환(transfection)시켜 각각 다른 알스폰딘이 과발현된 세포들을 제작한 후, 면역형광염색법으로 확인하였다. 이 때, 알스폰딘 발현을 확인하기 위해 알스폰딘에 Myc을 붙인 재조합 DNA plasmid를 사용하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 5종의 알스폰딘3 항체들은 모두 다른 알스폰딘이 과발현된 세포에는 결합하지 않았다.
따라서, 본 발명의 5종의 알스폰딘3 단클론 항체들은 알스폰딘3에만 특이적임을 입증한다.
또한, 본 발명자들은, 알스폰딘3에 의한 WNT 신호전달 활성에 대한 본 발명의 5종의 알스폰딘3 항체들의 중화능을 분석하기 WNT 위해, WNT 신호전달 활성화의 지표인 세포질 내 베타-카테닌(β-Catenin) 단백질의 축적 수준을 측정하였다. 이 때, 알스폰딘3 단백질과 WNT3A 단백질을 처리한 HEK293 세포의 세포질만을 분리한 후 항 베타-카테닌 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅으로 단백질의 양을 측정하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, WNT3a (10ng/ml)와 RSPO3 (20ng/ml)의 처리에 의해 세포질 베타-카테닌 단백질의 양은 4.5배 이상 증가하였고, 여기에 본 발명의 5종의 알스폰딘3 항체들을 10 ㎍/ml의 농도로 처리했을 때, mAb1E3 및 mAb11A4 항체는 약 50-60% 중화능을 보이고, mAb9C9, mAb10A3 및 mAb20H4 항체는 100%에 가까운 현저한 중화능을 나타내었다.
또한, 본 발명자들은 WNT 신호전달을 통한 전사기능 증가를 표시하는 Topflash repoter의 활성을 측정하였다. 이 때, 알스폰딘3 단백질과 WNT3A 단백질을 처리한 HEK293 STF세포(Topflash reporter를 지닌 세포주)의 lysate를 분리하여 luciferase reporter 효소 활성을 측정하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, WNT3a (10ng/ml)와 RSPO3 (20ng/ml)의 처리에 의해 reporter 활성은 18배 이상 증가하였고, 여기에 본 발명의 5종의 알스폰딘3 항체들을 10 ㎍/ml의 농도로 처리했을 때, mAb1E3 및 mAb9C9 항체는 약 25-30% 중화능을 보인 반면, mAb10A3, mAb11A4 및 mAb20H4 항체들은 약 82-86%의 현저한 중화능을 나타내었다.
이에, 본 발명의 5종의 알스폰딘3 항체들 중 현저한 중화능을 나타낸 mAb10A3, mAb11A4 및 mAb20H4의 3종을 선별하였다.
실시예 3. 본 발명의 항-인간 알스폰딘3 항체의 서열 분석
본 발명자들은 상기 실시예 2에서 선별된 mAb10A3(10A3), mAb11A4(11A4) 및 mAb20H4(20H4) 항체의 가변영역 서열을 분석하기 위하여, 각 항체를 생산하는 하이브리도마로부터의 중쇄 및 경쇄 단편을 암호하는 핵산을 클로닝하였다.
간략하게는, 각 항체 생산 하이브리도마 세포주로부터 total RNA를 분리하고 cDNA 합성을 진행하였다. Mouse Ig-Primer set (Novagen)을 이용하여 각 항체의 가변영역을 Polymerase chain resection (PCR)법으로 증폭하고 TA cloning기법으로 Plasmid DNA에 cloning한 후 DNA 염기서열을 분석하였다.
그 결과, 10A3와 11A4 항체는 중쇄(heavy chain)와 경쇄(light chain) 가변영역의 서열이 동일한 항체로 확인됐으며, 20H4 항체의 경우 중쇄 CDR1, CDR2, FR3과 경쇄 CDR1에 각각 아미노산 1개씩 총 4개의 아미노산 서열이 다른 것으로 확인되었다.
상기 항체들의 VL, VH 및 CDR region 시퀀스 분석 결과는 표 1 및 2에 정리하였다.
10A3/11A4 항체의 경우, 서열번호 13의 경쇄 가변영역(VL) 및 서열번호 14의 중쇄 가변영역(VH)을 포함하고; VL CDR1은 QSIVHSNGNTY(서열번호 1), VL CDR2는 KVS(서열번호 2), VL CDR3은 FQGSHVPLT(서열번호 3), VH CDR1은 GFTFSSYV(서열번호 4), VH CDR2는 ISSGGSYY(서열번호 5), VH CDR3은 ARQGALEGDTSFDY(서열번호 6)이고;
20H4 항체의 경우, 서열번호 15의 경쇄 가변영역(VL) 및 서열번호 16의 중쇄 가변영역(VH)을 포함하고; VL CDR1은 QSIVHSNGNTY(서열번호 7), VL CDR2는 KVS(서열번호 8), VL CDR3은 FQGSHVPLT(서열번호 9), VH CDR1은 GFTFNTYA (서열번호 10), VH CDR2는 ISSGGSHT(서열번호 11), VH CDR3은 ARQGALEGDTSFDY(서열번호 12)이다.
항체 구분 아미노산 서열 서열번호
10A3/11A4 VL DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGAGTKLELK
 13
VH EVMLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYVMSWVRQTPEKRLEWVAIISSGGSYYYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARQGALEGDTSFDYWGQGTTLTVSS
 14
20H4 VL DVLMTQIPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKVLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGAGTKLELK
 15
VH EVMLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYA
MSWVRQTPEKRLEWVAIISSGGSHTYYVDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARQGALEGDTSFDYWGQGTTLTVSS

 16
각 항체의 VL CDR region 및 VH CDR region은 굵은 글씨체로 나타내었다.
염기 서열 서열번호
10A3/11A4-VL GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAAC 17
10A3/11A4-VH GAAGTGATGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATGTCATGTCTTGGGTTCGGCAGACTCCGGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAATCATTAGTAGTGGTGGTAGTTACACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGACAGGGGGCCCTAGAGGGGGACACTAGCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAG 18
20H4-VL GATGTTTTGATGACCCAAATTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGGTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAAC 19
20H4-VH GAAGTGATGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGTTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAATCATTAGTAGTGGTGGTAGTCACACCTACTATGTAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGACAGGGGGCCCTAGAGGGGGACACTAGCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAG 20
실시예 4. 본 발명의 항-인간 알스폰딘3(RSPO3) 항체를 이용한 암 진단 효과
본 발명자들은, 상기 실시예 3에서 서열을 확인한 본 발명의 항-인간 알스폰딘3(RSPO3) 항체 3 종 중 10A3(mAb10A3)를 이용하여 암 진단을 할 수 있는 지 확인하기 위하여, 인간의 악성 유방암 및 전립선암 조직에서의 RSPO3 단백질 발현 수준을 10A3(mAb10A3)로 검출하고 면역조직염색법으로 분석하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 정상 전립선 조직에서는 RSPO3 단백질이 거의 발현되지 않은 반면, 전립선 비대증 및 암 조직에서는 RSPO3 단백질이 과발현되는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 RSPO3 단클론항체는 전립선암을 포함한 다양한 암을 진단할 수 있을 뿐만 아니라, Wnt 신호전달과 RSPO3 발현을 분석할 수 있는 제제로서 이용가능할 것으로 기대된다.
종합하면, WNT 신호전달계 기능의 비정상적 증가를 활성화시키는 알스폰딘3 유전자 및 단백질 과발현, 과발현을 유도하는 유전자 구조 이상이 다양한 종류의 인간의 암에서 발견되고 있다. 따라서, 알스폰딘3 단백질의 발현은 다양한 인간의 암에서 WNT 신호전달계 기능이 과활성화된 암들을 진단하기 위한 중요한 바이오마커이며, 본 발명의 인간 알스폰딘3 특이 항체는 다양한 인간의 암조직에서 이러한 알스폰딘3 단백질의 과발현 여부를 판단할 수 있는 진단제제로 활용될 수 있다. 또한, 알스폰딘3 항체를 이용하여 인간 알스폰딘3 의 기능을 중성화시킴으로 궁극적으로는 알스폰딘3 단백질이 과발현된 암에 특이적인 항체 치료제로도 적용할 수 있다.

Claims (17)

  1. (i) 서열번호 1의 경쇄 CDR1, 서열번호 2의 경쇄 CDR2 및 서열번호 3의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역(VL), 및 서열번호 4의 중쇄 CDR1, 서열번호 5의 중쇄 CDR2 및 서열번호 6의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역(VH); 또는
    (ii) 서열번호 7의 경쇄 CDR1, 서열번호 8의 경쇄 CDR2 및 서열번호 9의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역(VL), 및 서열번호 10의 중쇄 CDR1, 서열번호 11의 중쇄 CDR2 및 서열번호 12의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역(VH); 을 포함하는,
    인간 알스폰딘3 (R-spondin3, RSPO3)에 특이적으로 결합하는 항-인간 알스폰딘3 항체 또는 이의 항원 결합단편.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 항-인간 알스폰딘3 항체 또는 이의 항원 결합단편은,
    서열번호 13의 경쇄 가변영역 및 서열번호 14의 중쇄 가변영역; 또는
    서열번호 15의 경쇄 가변영역 및 서열번호 16의 중쇄 가변영역;
    을 포함하는 것인, 항-인간 알스폰딘3 항체 또는 이의 항원 결합단편.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 항-인간 알스폰딘3 항체 또는 이의 항원 결합단편은 모노클로날 항체, 키메라 항체, 영장류화 항체, 인간화 항체 및 인간 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 항-인간 알스폰딘3 항체 또는 이의 항원 결합단편.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 항-인간 알스폰딘3 항체는 다량체 항체, 이종이량체 항체, 반이량체 항체, 4가 항체, 이중특이적 항체 및 단일 쇄 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 항-인간 알스폰딘3 항체 또는 이의 항원 결합단편.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 항원 결합단편은 Fab, F(ab)2, Fab', F(ab')2, F(ab')3, Fd, Fv 및 도메인 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 항-인간 알스폰딘3 항체 또는 이의 항원 결합단편.
  9. 제1항, 및 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항-인간 알스폰딘3 항체 또는 이의 항원 결합단편을 코딩하는 핵산.
  10. 제9항의 핵산을 포함하는 재조합 발현벡터.
  11. 제10항의 재조합 발현벡터로 형질감염된 숙주세포.
  12. 제11항의 숙주세포를 배양하여 항체를 생성하는 단계; 및 생성된 항체를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 인간 알스폰딘3 (R-spondin3, RSPO3)에 특이적으로 결합하는 항-인간 알스폰딘3 항체 또는 이의 항원 결합단편의 제조방법.
  13. 제1항, 및 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항의 항-인간 알스폰딘3 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는, 시험관(in vitro)에서의 WNT/β-카테닌(catenin) 신호 전달 차단용 조성물.
  14. 제1항, 및 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항의 항-인간 알스폰딘3 항체 또는 이의 항원 결합단편을 유효 성분으로 포함하는 암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 암은 간암, 대장암, 자궁경부암, 신장암, 위암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암, 혈액암 및 췌장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상인 것인, 조성물.
  16. 제1항, 및 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항의 항-인간 알스폰딘3 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 암 진단용 조성물.
  17. 제1항, 및 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항의 항-인간 알스폰딘3 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 암 진단용 키트.
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