TW201906861A - Ｒｓｐｏ３結合劑及彼之用途 - Google Patents

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Abstract

本發明關於RSPO結合劑，特別是RSPO3結合劑及使用該等劑以治療疾病(諸如癌症)之方法。本發明提供與人RSPO3蛋白特異性結合且調節β-連環蛋白活性之抗體。本發明另提供使用能調節RSPO3蛋白之活性且抑制腫瘤生長之劑的方法。本發明亦描述治療癌症之方法，該等方法包含對患有腫瘤或癌症之病患投予治療有效量之本發明之劑或抗體。

Description

RSPO3結合劑及彼之用途 相關申請案的交互參照
本申請案主張於2012年7月13日提出申請之美國臨時專利申請案第61/671,421號、2013年1月16日提出申請之美國臨時申請案第61/753,184號、2013年3月15日提出申請之美國臨時申請案第61/789,156號及2013年5月23日提出申請之美國臨時申請案第61/826,747號之優先權，各案以參照方式整體納入本文。
本發明之領域大抵關於與R-脊椎蛋白(RSPO)-特別是人R-脊椎蛋白RSPO3-結合之抗體及其他劑，以及使用該等抗體或其他劑以治療疾病諸如癌之方法。
R-脊椎蛋白(RSPO)家族之蛋白在脊椎動物之間具保守性，包含四個成員RSPO1、RSPO2、RSPO3及RSPO4。這些蛋白有許多不同的名稱，包括頂板特異性脊 椎蛋白(roof plate-specific spondin)、hPWTSR(hRSPO3)、THS2D(RSPO3)、Cristin 1-4及Futrin 1-4。RSPO為小型分泌蛋白，所有RSPO共享大約40至60%之序列同源性及結構域組織。所有RSPO蛋白包含在N端的二個類似三呋喃基二氫咪唑(furin)之多半胱胺酸區、之後為血小板反應素結構域及鹼性帶電C端尾(Kim et al.,2006,Cell Cycle,5：23-26)。
研究顯示，RSPO蛋白在脊椎動物發育期間(Kamata et al.,2004,Biochim.Biophys Acta,1676：51-62)與爪蟾(Xenopus)的肌肉發育(Kazanskaya et al.,2004,Dev.Cell,7：525-534)方面具有功能。研究也顯示RSPO1為胃腸上皮細胞之強效致裂物質(Kim et al.,2005,Science,309：1256-1259)。報告指出RSPO3主要表現於爪蟾及小鼠的內皮細胞及內皮前驅細胞之中或附近。另外，研究指出RSPO3可能在胚胎發生時作為血管生成因子(Kazanskaya et al.,2008,Development,135：3655-3664)。已知RSPO蛋白活化類似Wnt傳訊之β-連環蛋白傳訊，然而RSPO蛋白與Wnt傳訊之間的關係仍在研究當中。報告指出RSPO蛋白對Wnt配體具有陽性調節活性(Nam et al.,2006,JBC 281：13247-57)。此研究亦指出RSPO蛋白可作為Frizzled8及LRP6受體配體及誘導β-連環蛋白傳訊(Nam et al.,2006,JBC 281：13247-57)。最近研究已發現RSPO蛋白與LGR(富含白胺酸重複之G蛋白偶合受體)蛋白如LGR5之間有交互作用(美國專利 公開號2009/0074782及2009/0191205)，這些資料提出活化β-連環蛋白傳訊之替代途徑。
Wnt傳訊途徑已被認為是有效的癌治療標靶。Wnt傳訊途徑是胚胎模式形成、後胚胎組織維持及幹細胞生物學的重要調節因子之一。更特別地，Wnt傳訊在細胞極性的產生和細胞命運決定包括幹細胞族群自我更新扮演重要角色。未受調節的Wnt途徑活化與許多人癌症有關，一般相信該活化可改變細胞之發育命運。活化Wnt途徑可能使腫瘤細胞維持在未分化狀態及/或導致不受控制之增生。因此癌的發生可藉由超越控制正常發育及組織修復之恆定機轉進行(於Reya & Clevers,2005,Nature,434：843-50；Beachy et al.,2004,Nature,432：324-31中回顧)。
Wnt傳訊途徑首先在果蠅發育突變無翅(wg)以及小鼠原致癌基因int-1(現稱Wnt1)中闡述(Nusse & Varmus,1982,Cell,31：99-109；Van Ooyen & Nusse,1984,Cell,39：233-40；Cabrera et al.,1987,Cell,50：659-63；Rijsewijk et al.,1987,Cell,50：649-57)。Wnt基因編碼分泌型脂肪修飾糖蛋白，其中19種已在哺乳動物中識別。這些分泌型配體活化由捲曲(FZD)受體家族成員及低密度脂蛋白(LDL)受體相關蛋白5或6(LRP5/6)組成之受體複合體。該等FZD受體為G蛋白偶合受體(GPCR)超家族之七個跨膜結構域蛋白，且包含具有10個保守性半胱胺酸之大型胞外N端配體結合結構域，稱為多半胱胺酸區(CRD)或Fri結構域。有十種人FZD受體， FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9及FZD10。不同的FZD CRD對特定Wnt蛋白有不同的結合親和性(Wu & Nusse,2002,J.Biol.Chem.,277：41762-9)，FZD受體已被分成活化典型β-連環蛋白途徑者及活化非典型途徑者(Miller et al.,1999,Oncogene,18：7860-72)。
Wnt傳訊於癌症的角色，首先是因為識別Wnt1(原名int1)為藉由鄰近插入小鼠病毒而轉形之乳房腫瘤的致癌基因而被發現(Nusse & Varmus,1982,Cell,31：99-109)。其他Wnt傳訊在乳癌角色的證據自此開始累積。舉例來說，基因轉殖β-連環蛋白於乳腺中之過度表現導致增生及腺癌(Imbert et al.,2001,J.Cell Biol.,153：555-68；Michaelson & Leder,2001,Oncogene,20：5093-9)，然而喪失Wnt傳訊擾亂正常乳腺發育(Tepera et al.,2003,J.Cell Sci.,116：1137-49；Hatsell et al.,2003,J.Mammary Gland Biol.Neoplasia,8：145-58)。在人乳癌中，β-連環蛋白累積表示超過50%的癌中有經活化之Wnt傳訊，雖然特定突變尚未被識別，但已觀察到捲曲受體表現上調(Brennan & Brown,2004,J.Mammary Gland Biol.Neoplasia,9：119-31；Malovanovic et al.,2004,Int.J.Oncol.,25：1337-42)。
Wnt途徑之活化也和結直腸癌有關。大約5至10%的所有結直腸癌為遺傳性，其中一種主要形式為家族性腺瘤息肉症(FAP)，這是一種體染色體顯性疾病，其 中大約80%的患者包含大腸腺瘤息肉(APC)基因之種系突變。另外也在其他Wnt途徑成分包括Axin及β-連環蛋白發現突變。個別腺瘤為包含第二失活等位基因之上皮細胞的種系過度生長，大量FAP腺瘤無可避免地導致腺癌經由致癌基因及/或抑瘤基因之額外突變發生。另外，Wnt傳訊途徑之活化，包括APC之功能喪失突變及β-連環蛋白之穩定突變，可誘導小鼠模型中之增生發育及腫瘤生長(Oshima et al.,1997,Cancer Res.,57：1644-9；Harada et al.,1999,EMBO J.,18：5931-42)。
黑色素瘤和乳癌及結腸癌類似，通常具有Wnt途徑之組成性活化，如細胞核累積β-連環蛋白所示。一些黑色素瘤及細胞系中的Wnt/β-連環蛋白途徑活化是因為途徑成分之修飾所致，如APC、ICAT、LEF1及β-連環蛋白(見例如Larue et al.2006,Frontiers Biosci.,11：733-742)。然而，文獻中關於Wnt/β-連環蛋白傳訊於黑色素瘤之確切角色有所衝突。舉例來說，一項研究發現細胞核β-連環蛋白濃度上升和黑色素瘤存活改善有關，而經活化之Wnt/β-連環蛋白傳訊卻與細胞增生減少有關(Chien et al.,2009,PNAS,106：1193-1198)。
癌藥物研究之焦點現正轉移至以人癌症相關性基因、蛋白及途徑為目標的標靶治療。需要能提供治療好處給癌病患之以傳訊途徑為標靶之新藥劑及以多重途徑為標靶之新藥劑組合。因此，干擾β-連環蛋白傳訊之生物分子(例如抗RSPO3抗體)是癌及其他β-連環蛋白相 關疾病之新治療藥劑的潛在來源。
本發明提供與RSPO3蛋白結合之結合劑(諸如抗體)以及包含該等結合劑之組成物(諸如醫藥組成物)。本發明也提供與RSPO3及至少一種其他抗原或標靶結合之結合劑以及該結合劑之醫藥組成物。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑係新穎多肽，如抗體、抗體片段及與該等抗體相關之其他多肽。本發明另提供藉由投予該RSPO3結合劑至患有腫瘤之個體以抑制腫瘤生長之方法。本發明另提供藉由投予該RSPO3結合劑至需要該等劑之個體以治療癌之方法。在一些實施態樣中，治療癌或抑制腫瘤生長之方法包含利用該RSPO3結合劑以標靶癌幹細胞。在一些實施態樣中，該等方法包含擾亂β-連環蛋白傳訊。在一些實施態樣中，該等方法包含調節(例如抑制)血管生成。在某些實施態樣中，該等方法包含減少腫瘤中癌幹細胞之頻率、減少腫瘤中癌幹細胞之數量、減少腫瘤之腫瘤發生性及/或藉由減少腫瘤中癌幹細胞之數量或頻率以減少腫瘤之腫瘤發生性。
在一態樣中，本發明提供與人RSPO3特異性結合之結合劑，如抗體。人RSPO3之序列為該領域已知，包含於此處為SEQ ID NO：3。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑與人RSPO3之胺基酸22至272以內結合。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑與人RSPO3之胺基 酸22至207以內結合。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑與人RSPO3之胺基酸35至135以內結合。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑與人RSPO3之胺基酸35至86以內結合。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑與人RSPO3之胺基酸92至135以內結合。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑(如抗體)與選自RSPO1、RSPO2或RSPO4之至少一種其他人RSPO特異性結合。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑或抗體調節β-連環蛋白活性、為β-連環蛋白傳訊之拮抗劑、抑制β-連環蛋白傳訊及/或抑制β-連環蛋白活化。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑抑制RSPO3傳訊。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑抑制、干擾及/或擾亂RSPO3與一或多種LGR蛋白(如LGR4、LGR5及/或LGR6)之結合。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑抑制RSPO3與LGR5之結合。
在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑係與人RSPO3結合之抗體。在一些實施態樣中，該抗體與人RSPO3及小鼠RSPO3結合。在某些實施態樣中，該抗體包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO：9)、KASGYTFTSYTF(SEQ ID NO：34)或DYSIH(SEQ ID NO：78)，該重鏈CDR2包含IYPSNGDS(SEQ ID NO：10)或YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO：79)，且該重鏈CDR3包含ATYFANYFDY(SEQ ID NO：11)、ATYFANNFDY(SEQ ID NO：35)或 TYFANNFD(SEQ ID NO：80)。在一些實施態樣中，該抗體另包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3，該輕鏈CDR1包含QSVDYDGDSYM(SEQ ID NO：12)或KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO：81)，該輕鏈CDR2包含AAS(SEQ ID NO：13)或AASNLES(SEQ ID NO：82)，且該輕鏈CDR3包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO：14)或QQSNEDPLTF(SEQ ID NO：83)。在一些實施態樣中，該抗體包含：包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO：9)之重鏈CDR1、包含IYPSNGDS(SEQ ID NO：10)之重鏈CDR2及包含ATYFANNFDY(SEQ ID NO：35)之重鏈CDR3，及/或包含QSVDYDGDSYM(SEQ ID NO：12)之輕鏈CDR1、包含AAS(SEQ ID NO：13)之輕鏈CDR2及包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO：14)之輕鏈CDR3。在一些實施態樣中，該抗體包含：包含DYSIH(SEQ ID NO：78)之重鏈CDR1、包含YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO：79)之重鏈CDR2及包含TYFANNFD(SEQ ID NO：80)之重鏈CDR3，及/或包含KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO：81)之輕鏈CDR1、包含AASNLES(SEQ ID NO：82)之輕鏈CDR2及包含QQSNEDPLTF(SEQ ID NO：83)之輕鏈CDR3。在一些實施態樣中，該抗體包含：包含DYSIH(SEQ ID NO：78)之重鏈CDR1、包含YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO：79)之重鏈CDR2及包含TYFANNFD(SEQ ID NO：80)之重鏈CDR3，及/或包含KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO：81)之輕鏈 CDR1、包含AASNLES(SEQ ID NO：82)之輕鏈CDR2及包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO：14)之輕鏈CDR3。在一些實施態樣中，該抗體包含：包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO：9)或DYSIH(SEQ ID NO：78)之重鏈CDR1、包含IYPSNGDS(SEQ ID NO：10)之重鏈CDR2及包含TYFANNFD(SEQ ID NO：80)之重鏈CDR3，及/或包含QSVDYDGDSYM(SEQ ID NO：12)之輕鏈CDR1、包含AAS(SEQ ID NO：13)之輕鏈CDR2及包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO：14)之輕鏈CDR3。
在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑係包含下列之抗體：(a)包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO：9)、KASGYTFTSYTF(SEQ ID NO：34)、DYSIH(SEQ ID NO：78)或彼等之包含1、2、3或4個胺基酸取代之變異體之重鏈CDR1；(b)包含IYPSNGDS(SEQ ID NO：10)、YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO：79)或彼等之包含1、2、3或4個胺基酸取代之變異體之重鏈CDR2；(c)包含ATYFANYFDY(SEQ ID NO：11)、ATYFANNFDY(SEQ ID NO：35)、TYFANNFD(SEQ ID NO：80)或彼等之包含1、2、3或4個胺基酸取代之變異體之重鏈CDR3；(d)包含QSVDYDGDSYM(SEQ ID NO：12)、KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO：81)或彼等之包含1、2、3或4個胺基酸取代之變異體之輕鏈CDR1；(e)包含AAS(SEQ ID NO：13)、AASNLES(SEQ ID NO：82)或彼等之包含1、2、3或4個胺基酸取 代之變異體之輕鏈CDR2；及(f)包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO：14)、QQSNEDPLTF(SEQ ID NO：83)或彼等之包含1、2、3或4個胺基酸取代之變異體之輕鏈CDR3。在一些實施態樣中，該等胺基酸取代係保守性胺基酸取代。在一些實施態樣中，該等取代被當作種系人化過程之一部份。
在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑係包含下列之抗體：(a)與SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：62具有至少80%序列一致性之重鏈可變區，及/或(b)與SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：86具有至少80%序列一致性之輕鏈可變區。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑係包含下列之抗體：(a)與SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：62具有至少90%序列一致性之重鏈可變區，及/或(b)與SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：86具有至少90%序列一致性之輕鏈可變區。
在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係單株抗體。在一些實施態樣中，該單株抗體係IgG1抗體。在一些實施態樣中，該單株抗體係IgG2抗體。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係單株抗體131R002或單株抗體131R003。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係單株抗體131R002或單株抗體131R003之親和性成熟變異 體。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑為包含源自抗體131R002或抗體131R003之抗原結合部位的嵌合抗體。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體131R002或抗體131R003之人化形式。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體h131R006A、h131R006B、h131R005/131R007、h131R008、h131R010或h131R011。
在另一態樣中，本發明提供與本發明之抗體競爭與人RSPO3特異性結合之結合劑(例如抗體)。在一些實施態樣中，該結合劑(例如抗體)與包含重鏈可變區及輕鏈可變區之抗體競爭與人RSPO3之特異性結合，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：62，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：86。在一些實施態樣中，與該RSPO3結合劑競爭之抗體係抗體131R002或抗體131R003。在一些實施態樣中，與該RSPO3結合劑競爭之抗體係抗體131R002或抗體131R003之人化形式。在一些實施態樣中，與該RSPO3結合劑競爭之抗體係抗體h131R006A、h131R006B、h131R005/131R007、h131R008、h131R010或h131R011。在一些實施態樣中，該結合劑在試管內競爭性結合測定中與本發明之抗體競爭與RSPO3之特異性結合。
在某些實施態樣中，該結合劑係與本發明之抗體(例如131R002、131R003或彼等之人化形式/變異 體)所結合之RSPO3上的相同表位或實質上相同之表位結合之抗體。在某些實施態樣中，該結合劑係與抗體h131R005/131R007、h131R008、h131R010或h131R011所結合之RSPO3上的相同表位或實質上相同之表位結合之抗體。
在另一態樣中，該結合劑係與RSPO3上之表位結合之抗體，該表位與本發明之抗體(例如131R002、131R003或彼等之人化形式/變異體)所結合之RSPO3上的表位重疊。在一些實施態樣中，該結合劑係與RSPO3上之表位結合之抗體，該表位與抗體h131R005/131R007、h131R008、h131R010或h131R011所結合之RSPO3上的表位重疊。
在前述各種態樣或實施態樣之特定實施態樣以及本說明書中他處所述之其他態樣及/或實施態樣中，該結合劑係雙特異性抗體。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體與人RSPO3及第二標靶特異性結合。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體與人RSPO3及人RSPO1特異性結合。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體與人RSPO3及人RSPO2特異性結合。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體與人RSPO3及人RSPO4特異性結合。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體調節β-連環蛋白活性。在某些實施態樣中，該雙特異性抗體抑制β-連環蛋白活性。在某些實施態樣中，該雙特異性抗體抑制β-連環蛋白傳訊。在某些實施態樣中，該雙特異性抗體抑制β-連環蛋 白之活化。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體減少癌幹細胞之數量或頻率。在某些實施態樣中，該雙特異性抗體包含二個完全相同之輕鏈。在某些實施態樣中，該雙特異性抗體係IgG抗體。在某些實施態樣中，該雙特異性抗體係IgG1抗體。在某些實施態樣中，該雙特異性抗體係IgG2抗體。
在一些實施態樣中，該雙特異性抗體包含：與人RSPO3特異性結合之第一抗原結合部位，其中該第一抗原結合部位包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO：9)、KASGYTFTSYTF(SEQ ID NO：34)或DYSIH(SEQ ID NO：78)，該重鏈CDR2包含IYPSNGDS(SEQ ID NO：10)或YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO：79)，且該重鏈CDR3包含ATYFANYFDY(SEQ ID NO：11)、ATYFANNFDY(SEQ ID NO：35)或TYFANNFD(SEQ ID NO：80)。在一些實施態樣中，該第一抗原結合部位包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3，該輕鏈CDR1包含QSVDYDGDSYM(SEQ ID NO：12)或KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO：81)，該輕鏈CDR2包含AAS(SEQ ID NO：13)或AASNLES(SEQ ID NO：82)，且該輕鏈CDR3包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO：14)或QQSNEDPLTF(SEQ ID NO：83)。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體另包含與人RSPO1特異性結合之第二抗原結合部位。在一些實施態樣中，該雙特異性抗 體另包含與人RSPO2特異性結合之第二抗原結合部位。抗RSPO1抗體或抗RSPO2抗體之非限制性實例已於例如國際專利申請案公開號WO 2013/012747描述。在一些實施態樣中，該第一及第二結合位點包含共同(例如相同)輕鏈。
在一些實施態樣中，該雙特異性抗體包含：a)與人RSPO3特異性結合之第一抗原結合部位，及b)與人RSPO1特異性結合之第二抗原結合部位，其中該第一抗原結合部位包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO：9)、KASGYTFTSYTF(SEQ ID NO：34)或DYSIH(SEQ ID NO：78)，該重鏈CDR2包含IYPSNGDS(SEQ ID NO：10)或YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO：79)，且該重鏈CDR3包含ATYFANYFDY(SEQ ID NO：11)、ATYFANNFDY(SEQ ID NO：35)或TYFANNFD(SEQ ID NO：80)。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體包含：a)與人RSPO3特異性結合之第一抗原結合部位，及b)與人RSPO2特異性結合之第二抗原結合部位，其中該第一抗原結合部位包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO：9)、KASGYTFTSYTF(SEQ ID NO：34)或DYSIH(SEQ ID NO：78)，該重鏈CDR2包含IYPSNGDS(SEQ ID NO：10)或YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO：79)，且該重鏈CDR3包含ATYFANYFDY(SEQ ID NO：11)、 ATYFANNFDY(SEQ ID NO：35)或TYFANNFD(SEQ ID NO：80)。在一些實施態樣中，該第一抗原結合部位包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3，該輕鏈CDR1包含QSVDYDGDSYM(SEQ ID NO：12)或KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO：81)，該輕鏈CDR2包含AAS(SEQ ID NO：13)或AASNLES(SEQ ID NO：82)，且該輕鏈CDR3包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO：14)或QQSNEDPLTF(SEQ ID NO：83)。
在一些實施態樣中，該雙特異性抗體與人RSPO3特異性結合，且包含與SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：62具有至少90%之序列一致性之重鏈可變區。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體與人RSPO3特異性結合，且包含與SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：62具有至少95%之序列一致性之重鏈可變區。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體包含第一及第二結合部位，其中該第一及第二結合部位包含共同(例如相同)輕鏈。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體包含與SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：86具有至少95%序列一致性之輕鏈可變區。
在前述各種態樣之某些實施態樣以及本說明書中他處所述之其他態樣及/或實施態樣中，該RSPO3結合劑或抗體係經分離。在一些實施態樣中，該RSPO3 結合劑或抗體係實質上純的。
在另一態樣中，本發明提供多肽。在一些實施態樣中，該多肽包含選自下列之序列：SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：87及SEQ ID NO：88。在一些實施態樣中，該多肽包含SEQ ID NO：15及/或SEQ ID NO：17。在一些實施態樣中，該多肽包含SEQ ID NO：16及/或SEQ ID NO：17。在一些實施態樣中，該多肽包含SEQ ID NO：36及/或SEQ ID NO：17。在一些實施態樣中，該多肽包含SEQ ID NO：37及/或SEQ ID NO：17。在一些實施態樣中，該多肽包含SEQ ID NO：44及/或SEQ ID NO：17。在一些實施態樣中，該多肽包含SEQ ID NO：45及/或SEQ ID NO：17。在一些實施態樣中，該多肽包含SEQ ID NO：62及/或SEQ ID NO：17。在一些實施態樣中，該多肽包含SEQ ID NO：44及/或SEQ ID NO：72。在一些實施態樣中，該多肽包含SEQ ID NO：45及/或SEQ ID NO：72。在一些實施態樣中，該多肽包含 SEQ ID NO：62及/或SEQ ID NO：72。在一些實施態樣中，該多肽包含SEQ ID NO：44及/或SEQ ID NO：86。在一些實施態樣中，該多肽包含SEQ ID NO：45及/或SEQ ID NO：86。在一些實施態樣中，該多肽包含SEQ ID NO：62及/或SEQ ID NO：86。
在一些實施態樣中，該多肽包含SEQ ID NO：21及/或SEQ ID NO：23。在一些實施態樣中，該多肽包含SEQ ID NO：22及/或SEQ ID NO：23。在一些實施態樣中，該多肽包含SEQ ID NO：38及/或SEQ ID NO：23。在一些實施態樣中，該多肽包含SEQ ID NO：41及/或SEQ ID NO：23。在一些實施態樣中，該多肽包含SEQ ID NO：46及/或SEQ ID NO：23。在一些實施態樣中，該多肽包含SEQ ID NO：47及/或SEQ ID NO：23。在一些實施態樣中，該多肽包含SEQ ID NO：63及/或SEQ ID NO：23。在一些實施態樣中，該多肽包含SEQ ID NO：68及/或SEQ ID NO：23。在一些實施態樣中，該多肽包含SEQ ID NO：46及/或SEQ ID NO：73。在一些實施態樣中，該多肽包含SEQ ID NO：47及/或SEQ ID NO：73。在一些實施態樣中，該多肽包含SEQ ID NO：63及/或SEQ ID NO：73。在一些實施態樣中，該多肽包含SEQ ID NO：68及/或SEQ ID NO：73。在一些實施態樣中，該多肽包含SEQ ID NO：46及/或SEQ ID NO：87。在一些實施態樣中，該多肽包含SEQ ID NO：47及/或SEQ ID NO：87。在一些實施態樣中，該多肽包含SEQ ID NO：63及/或SEQ ID NO：87。在一些實施態樣中，該多肽包含SEQ ID NO：68及/或SEQ ID NO：87。
在一些實施態樣中，該多肽包含SEQ ID NO：27及/或SEQ ID NO：29。在一些實施態樣中，該多肽包含SEQ ID NO：28及/或SEQ ID NO：29。在一些實施態樣中，該多肽包含SEQ ID NO：39及/或SEQ ID NO：29。在一些實施態樣中，該多肽包含SEQ ID NO：42及/或SEQ ID NO：29。在一些實施態樣中，該多肽包含SEQ ID NO：48及/或SEQ ID NO：29。在一些實施態樣中，該多肽包含SEQ ID NO：49及/或SEQ ID NO：29。在一些實施態樣中，該多肽包含SEQ ID NO：64及/或SEQ ID NO：29。在一些實施態樣中，該多肽包含SEQ ID NO：69及/或SEQ ID NO：29。在一些實施態樣中，該多肽包含SEQ ID NO：48及/或SEQ ID NO：74。在一些實施態樣中，該多肽包含SEQ ID NO：49及/或SEQ ID NO：74。在一些實施態樣中，該多肽包含SEQ ID NO：64及/或SEQ ID NO：74。在一些實施態樣中，該多肽包含SEQ ID NO：69及/或SEQ ID NO：74。在一些實施態樣中，該多肽包含SEQ ID NO：48及/或SEQ ID NO：88。在一些實施態樣中，該多肽包含SEQ ID NO：49及/或SEQ ID NO：88。在一些實施態樣中，該多肽包含SEQ ID NO：64及/或SEQ ID NO：88。在一些實施態樣中，該多肽包含SEQ ID NO：69及/或SEQ ID NO：88。
在一些實施態樣中，該多肽係經分離。在某 些實施態樣中，該多肽係實質上純的。在某些實施態樣中，該多肽係抗體或任何抗體之部分，諸如抗體片段。
在另一態樣中，本發明提供經分離之多核苷酸分子，該經分離之多核苷酸分子包含編碼前述各種態樣以及本說明書中之其他態樣及/或實施態樣中之抗體及/或多肽之多核苷酸。在一些實施態樣中，該多核苷酸包含選自下列之序列：SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94及SEQ ID NO：95。在一些實施態樣中，該多核苷酸包含編碼選自下列之多肽之多核苷酸：SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、 SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：87及SEQ ID NO：88。
本發明另提供包含該等多核苷酸之表現載體，以及包含該等表現載體及/或該等多核苷酸之細胞。在一些實施態樣中，該細胞係雜交瘤細胞系。在一些實施態樣中，該細胞係單株細胞系。在一些實施態樣中，該細胞係原核細胞。在一些實施態樣中，該細胞係真核細胞。
在其他態樣中，本發明提供抑制腫瘤生長之方法，該方法包含使該腫瘤與有效量之RSPO3結合劑或抗體(包括該些於本說明書中所述之各者)接觸。
在另一態樣中，本發明提供抑制個體體內腫瘤生長之方法，該方法包含對該個體投予治療有效量之RSPO3結合劑或抗體(包括該些於本說明書中所述之各者)。
在另一態樣中，本發明提供抑制細胞中β-連環蛋白傳訊之方法，該方法包含使該細胞與有效量之RSPO3結合劑或抗體(包括該些於本說明書中所述之各者)接觸。在一些實施態樣中，該細胞係腫瘤細胞。在一些實施態樣中，該腫瘤係結直腸腫瘤。在一些實施態樣中，該腫瘤係卵巢腫瘤。在一些實施態樣中，該腫瘤係胰臟腫瘤。在一些實施態樣中，該腫瘤係肺腫瘤。在一些實施態樣中，該腫瘤係乳房腫瘤。在一些實施態樣中，該腫瘤表現升高量之至少一種RSPO蛋白。在一些實施態樣 中，該腫瘤表現升高量之RSPO1。在一些實施態樣中，該腫瘤表現升高量之RSPO2。在一些實施態樣中，該腫瘤表現升高量之RSPO3。在一些實施態樣中，該腫瘤表現高量之至少一種RSPO蛋白。在一些實施態樣中，該腫瘤表現高量之RSPO1。在一些實施態樣中，該腫瘤表現高量之RSPO2。在一些實施態樣中，該腫瘤表現高量之RSPO3。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑舉例來說藉由減少腫瘤中癌幹細胞之數量及/或頻率以抑制該腫瘤生長。在一些實施態樣中，該腫瘤包含RSPO基因融合。在一些實施態樣中，該腫瘤包含RSPO2基因融合。在一些實施態樣中，該腫瘤包含RSPO3基因融合。
在另一態樣中，本發明提供治療個體之癌的方法。在一些實施態樣中，該方法包含對個體投予治療有效量之如上述之RSPO3結合劑或抗體以及本說明書他處所述者之任一者。在一些實施態樣中，該癌係胰癌。在一些實施態樣中，該癌係結直腸癌。在一些實施態樣中，該結直腸癌包含大腸腺瘤息肉(APC)基因中之失活突變。在一些實施態樣中，該結直腸癌不包含APC基因中之失活突變。在一些實施態樣中，該結直腸癌包含野生型APC基因。在一些實施態樣中，該結直腸癌包含RSPO基因融合。在一些實施態樣中，該結直腸癌包含RSPO2基因融合。在一些實施態樣中，該結直腸癌包含RSPO3基因融合。在一些實施態樣中，該癌係卵巢癌。在一些實施態樣中，該癌係肺癌。在一些實施態樣中，該癌係乳癌。在一 些實施態樣中，該癌表現升高量之至少一種RSPO蛋白。在一些實施態樣中，該癌係表現升高量之RSPO3之卵巢癌。在一些實施態樣中，該癌係表現升高量之RSPO3之肺癌。在一些實施態樣中，該癌係表現升高量之RSPO3之乳癌。在一些實施態樣中，該癌係表現升高量之RSPO3之胰癌。
在另一態樣中，本發明提供治療個體之疾病之方法，其中該疾病係與β-連環蛋白活化、β-連環蛋白傳訊增加及/或β-連環蛋白傳訊異常有關，其中該方法包含對該個體投予治療有效量之RSPO3結合劑或抗體，包括此處所述之各者。
在前述各種態樣之某些實施態樣以及本說明書他處所述之其他態樣及/或實施態樣中，該治療方法另包含測定至少一種RSPO蛋白於腫瘤或癌中之表現量之步驟。
在另一態樣中，本發明提供識別或選擇適用於以RSPO3結合劑或抗體(包括但不限於此處所述之各者)治療之人個體之方法。在一些實施態樣中，該方法包含測定該個體是否具有相較於正常組織中特定RSPO(如RSPO3)之表現或預先決定之該相同RSPO蛋白之量為上升之該相同RSPO蛋白表現量的腫瘤。在一些實施態樣中，該方法包含識別適合治療之個體或選擇適合治療之個體，若該腫瘤具有升高量之RSPO表現。在一些實施態樣中，該方法包含測定該個體是否具有包含APC基因失活 突變之腫瘤。在一些實施態樣中，該方法包含識別適合治療之個體或選擇適合治療之個體，若該腫瘤包含APC基因失活突變。在一些實施態樣中，該方法包含測定該個體是否具有包含RSPO基因融合(例如RSPO3基因融合)之腫瘤。在一些實施態樣中，該方法包含識別適合治療之個體或選擇適合治療之個體，若該腫瘤包含RSPO基因融合(如RSPO3基因融合)。
在前述各種態樣之某些實施態樣以及本說明書他處所述之其他態樣及/或實施態樣中，該治療方法包含對該個體投予該RSPO3結合劑及至少一種其他治療劑。
本發明另提供包含此處所述之RSPO3結合劑或抗體及醫藥上可接受之載劑之醫藥組成物，及產生該RSPO3結合劑之細胞系。本發明亦提供於個體(例如人)體內治療癌及/或抑制腫瘤生長之方法，該方法包含對該個體投予有效量之包含該RSPO3結合劑之醫藥組成物。
本發明之態樣或實施態樣係以馬庫西群組或其他選擇性形式之群組描述，本發明不僅包含被標示為整體之整個群組，但亦包含該群組之個別成員及該主要群組中所有可能之亞群，且亦包含不含其中一或多個群組成員之主要群組。本發明亦設想明確排除該申請專利之發明中任何群組成員之一或多者。
圖1：RSPO於腫瘤及正常組織中之表現。圖中顯示來自正常、良性及惡性組織人樣本之微陣列資料概述。個別打勾記號顯示RSPO mRNA之表現量。(A)RSPO1(B)RSPO2(C)RSPO3
圖2：RSPO蛋白與LGR5之結合試驗。表現LGR5之HEK-293細胞的FACS分析。HEK-293細胞經編碼FLAG-LGR5-CD4TM-GFP之cDNA表現載體過渡性轉染，然後與可溶性RSPO1-Fc、RSPO2-Fc、RSPO3-Fc或RSPO4-Fc融合蛋白混合。抗FLAG抗體被用來做為陽性對照，可溶性FZD8-Fc被用來作為陰性對照。特異性結合係由各FACS圖之黑色線框內有信號存在表示。
圖3：抗RSPO3抗體抑制由RSPO3及WNT3A誘導之β-連環蛋白傳訊。TOPflash螢光素酶報告基因試驗被用來測量在暴露於WNT3a(5ng/ml)與RSPO3(10ng/ml)之組合後且在漸增濃度之抗RSPO3抗體(131R002或131R003)存在下HEK-293細胞中的β-連環蛋白傳訊。使用經4倍連續稀釋20μg/ml至0.02μg/ml之抗體。對照組包括在無抗體存在下暴露於對照培養基(無WNT3a且無RSPO)、僅WNT3a或WNT3a與RSPO3之組合。
圖4：親和性成熟131R003抗體變異體抑制由RSPO3及WNT3A誘導之β-連環蛋白傳訊。TOPflash螢光素酶報告基因試驗被用來測量在暴露於WNT3a與RSPO3之組合後且在漸增濃度之抗RSPO3抗體(131R003 (-▲-)、131R003CDR1變異體(-■-)或131R003CDR3變異體(-●-))存在下HEK-293細胞中的β-連環蛋白傳訊。使用經5倍連續稀釋20μg/ml至0.006μg/ml之抗體。對照組包括在無抗體存在下暴露於對照培養基(無WNT3a且無RSPO)/僅細胞(-△-)、對照抗體(-▼-)、僅WNT3a(-◆-)或WNT3a與RSPO3之組合(-□-)。
圖5：抗RSPO抗體抑制腫瘤生長。OV38卵巢腫瘤細胞係經皮下注射至NOD/SCID小鼠。小鼠利用抗RSPO1抗體89M5與抗RSPO3抗體131R003之組合(-●-)；紫杉醇(taxol)(-▲-)；抗RSPO1抗體89M5、抗RSPO3抗體131R003與紫杉醇之組合(-▼-)；或對照抗體(-■-)治療。資料以治療後天數之腫瘤體積(mm3)顯示。
圖6：抗RSPO抗體抑制腫瘤生長。OV38卵巢腫瘤細胞係經皮下注射至NOD/SCID小鼠。小鼠利用抗RSPO1抗體89M5與抗RSPO3抗體131R002之組合(-▲-)；抗RSPO1抗體89M5與紫杉醇之組合(-○-)；抗RSPO3抗體131R002與紫杉醇之組合(-□-)；抗RSPO1抗體89M5、抗RSPO3抗體131R002與紫杉醇之組合(-△-)；僅紫杉醇(-▼-)或對照抗體(-■-)治療。資料以治療後天數之腫瘤體積(mm3)顯示。
圖7：抗RSPO3抗體抑制腫瘤生長。(A)LU45肺腫瘤細胞係經皮下注射至NOD/SCID小鼠。小鼠 利用抗RSPO3抗體131R002(-○-)或對照抗體(-■-)治療。(B)LU25肺腫瘤細胞係經皮下注射至NOD/SCID小鼠。小鼠利用抗RSPO3抗體131R002(-○-)或對照抗體(-■-)治療。資料以治療後天數之腫瘤體積(mm3)顯示。
圖8：親和性成熟抗體變異體抑制由RSPO3及WNT3A誘導之β-連環蛋白傳訊。TOPflash螢光素酶報告基因試驗被用來測量在暴露於WNT3a與人RSPO3之組合後且在漸增濃度之抗RSPO3抗體131R002(-▲-)、131R006(-●-)或131R007(-■-))存在下HEK-293T細胞中的β-連環蛋白傳訊。使用經5倍連續稀釋20μg/ml至0.0064μg/ml之抗體。對照組包括在無抗體存在下暴露於對照培養基(無WNT3a且無RSPO/細胞(-○-))、僅WNT3a(-▼-)或WNT3a與人RSPO3之組合(-◆-)。
圖9：抗RSPO3抗體抑制RSPO3與LGR5之交互作用。表現LGR5之HEK-293T細胞的FACS分析。HEK-293T細胞係經編碼人LGR5之胞外域(FLAG-LGR5-CD4TM-GFP)的cDNA表現載體過渡性轉染，然後與RSPO3-生物素融合蛋白及抗RSPO3抗體131R006或131R007混合。結合利用PE共軛之鏈黴抗生物素蛋白檢測。相對RSPO3-生物素結合係顯示於y軸，FLAG-LGR5-CD4TM-GFP融合蛋白之表現係顯示於x軸。陽性結合係由各FACS圖之黑色線框內有信號存在表示。
圖10：抗RSPO抗體抑制腫瘤生長。NCI-H2030細胞係經皮下注射至NOD/SCID小鼠。小鼠利用抗RSPO3抗體131R002(-●-)、僅卡鉑(-△-)、抗RSPO3抗體131R002與卡鉑之組合(-○-)或對照抗體(-■-)處理。資料以治療後天數之腫瘤體積(mm3)顯示。
圖11：抗RSPO抗體抑制腫瘤生長。LU102肺腫瘤細胞係經皮下注射至NOD/SCID小鼠。小鼠利用抗RSPO3抗體131R002(-●-)、僅卡鉑(-△-)、抗RSPO3抗體131R002與卡鉑之組合(-○-)或對照抗體(-■-)處理。(A)資料以治療後天數之腫瘤體積(mm3)顯示。(B)基因組富集分析結果。
圖12：抗RSPO抗體抑制腫瘤生長。PN35胰腫瘤細胞係經皮下注射至NOD/SCID小鼠。小鼠利用抗RSPO3抗體131R002(-●-)、吉西他濱與白蛋白結合型太平洋紫杉醇(ABRAXANE)之組合(-△-)、抗RSPO3抗體131R002與吉西他濱與白蛋白結合型太平洋紫杉醇(ABRAXANE)之組合(-○-)或對照抗體(-■-)處理。資料以治療後天數之腫瘤體積(mm3)顯示。(A)所有四個治療組；(B)吉西他濱與白蛋白結合型太平洋紫杉醇治療組，以及抗RSPO3抗體、吉西他濱與白蛋白結合型太平洋紫杉醇治療組之放大圖。
圖13：抑制由RSPO3及WNT3A誘導之β-連環蛋白傳訊。TOPflash螢光素酶報告基因試驗被用來測量 在暴露於WNT3a與人RSPO3之組合後且在漸增濃度之抗RSPO3抗體131R007(-□-)或131R010(-●-)存在下HEK-293T細胞中的β-連環蛋白傳訊。使用經5倍連續稀釋20μg/ml至0.0064μg/ml之抗體。對照組包括在無抗體存在下暴露於對照培養基(無WNT3a且無RSPO/細胞(-▲-))、僅WNT3a(-▼-)或WNT3a與人RSPO3之組合(-◆-)。
圖14：抗RSPO抗體抑制腫瘤生長。LU25NSCLC肺腫瘤細胞係經皮下注射至NOD/SCID小鼠。小鼠利用抗RSPO3抗體131R008(-▲-)、僅太平洋紫杉醇(-○-)、抗RSPO3抗體131R008與太平洋紫杉醇之組合(-●-)或對照抗體(-■-)處理。資料以治療後天數之腫瘤體積(mm3)顯示。
本發明之詳細說明
本發明提供新穎之劑，包括但不限於與RSPO蛋白(特別是人RSPO3)結合之多肽，像是抗體。該RSPO3結合劑包括但不限於β-連環蛋白傳訊之拮抗劑。該RSPO3結合劑包括但不限於RSPO3與LGR蛋白交互作用之抑制劑。本發明亦提供相關之多肽及多核苷酸、包含該RSPO3結合劑之組成物，及製備該RSPO3結合劑之方法。本發明另提供使用該新穎之RSPO3結合劑之方法，諸如抑制腫瘤生長之方法、治療癌之方法、調節血管生成 之方法、減少腫瘤中癌幹細胞之頻率之方法、抑制β-連環蛋白傳訊之方法，及/或識別及/或選擇適合治療之個體之方法。
與人RSPO3特異性結合之單株抗體已被識別，即單株抗體131R002及131R003(實施例3)。抗RSPO3抗體131R002及131R003與人RSPO3之結合親和性小於10nM(實施例3)。抗RSPO3抗體131R002及131R003抑制RSPO3誘導之β-連環蛋白傳訊(實施例4，圖3)。131R003之親和性成熟變異體抑制RSPO3誘導之β-連環蛋白傳訊且具有比母體131R003更高之活性(實施例5，圖4)。抗RSPO3抗體當以單一劑作用、與抗RSPO1抗體組合以及與一或多種化學治療劑組合時，皆抑制腫瘤生長(實施例6、7、11、12及14；圖5至7、10至12及14)。人化抗RSPO3抗體h131R006及h131R007比起抗體131R002，是更強的β-連環蛋白活性抑制劑(實施例8，圖8)。抗RSPO3抗體h131R006及h131R007阻斷RSPO3與LGR5之結合(實施例9，圖9)。人化抗RSPO3抗體h131R010同型IgG1抑制β-連環蛋白活性，與IgG2同型抗體h131R007類似(實施例13，圖13)。
I. 定義
為了促進對本發明之了解，以下定義一些用語及用詞。
此處所使用之用語「拮抗劑」及「拮抗性」 係指部分或完全阻斷、抑制、減少或中和標靶之生物活性及/或傳訊途徑(例如β-連環蛋白傳訊)之任何分子。此處所使用之用語「拮抗劑」包括部分或完全阻斷、抑制、減少或中和蛋白(例如RSPO蛋白)之活性的任何分子。適當之拮抗劑分子特別包括但不限於拮抗抗體或抗體片段。
此處所使用之用語「調節」係指生物活性之改變或變化。調節包括但不限於刺激或抑制活性。調節可為增加或減少活性(例如減少RSPO傳訊、減少β-連環蛋白傳訊)、改變結合特性，或與蛋白質、途徑或其他生物性關注點之活性有關之生物性、功能性或免疫特性之任何其他改變。
此處所使用之用語「抗體」係指免疫球蛋白分子，該免疫球蛋白分子藉由彼之可變區內之至少一個抗原結合位置辨識標靶且與之特異性結合，像是蛋白質、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂質或前述組合之標靶。此處所使用之該用語包含完整多株抗體、完整單株抗體、單鏈抗體、抗體片段(諸如Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段)、單鏈Fv(scFv)抗體、多特異性抗體諸如雙特異性抗體、單特異性抗體、單價抗體、嵌合抗體、人化抗體、人抗體、包含抗體之抗原結合部位之融合蛋白質，及任何其他包含抗原辨認區(即抗原結合部位)之經修飾之免疫球蛋白分子只要該抗體展現所欲之生物活性。抗體可為下列五種主要免疫球蛋白類型中之任一者：IgA、 IgD、IgE、IgG及IgM，或彼等之亞型(同型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)，根據彼等之分別被稱為α、δ、ε、γ及μ之重鏈恆定結構域之形式。不同類型之免疫球蛋白具有不同且廣為周知之次單位結構及三維構型。抗體可為未經修飾(naked)或與其他分子共軛，該等其他分子包括但不限於毒素及放射性同位素。
用語「抗體片段」係指完整抗體之部分且係指完整抗體之抗原性決定可變區。抗原片段之實例包括但不限於Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段、線性抗體、單鏈抗體及自抗體片段形成之多特異性抗體。此處所使用之「抗體片段」包含抗原結合部位或表位結合部位。
抗體之「可變區」用語係指抗體輕鏈之可變區或抗體重鏈之可變區(不論單獨或組合指稱)。重鏈及輕鏈之可變區各由四個架構區(FR)及連接該四個架構區之三個互補決定區(CDR)組成，該三個CDR又名「超變異區」。各鏈中之CDR被架構區拉近，並與來自其他鏈中之CDR一起形成該抗體之抗原結合部位。至少有兩種技術用於測定CDR：(1)基於跨種序列變異性之方法(即Kabat et al.,1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Edition,National Institutes of Health,Bethesda,MD)；及(2)基於抗原-抗體複合物之結晶學研究之方法(Al-Lazikani et al.,1997,J.Mol.Biol.,273：927-948)。此外，有時該領域使用這兩種技術之組 合以測定CDR。
此處所使用之用語「單株抗體」係指同源性抗體群，其高度特異性辨認及結合單一抗原性決定簇或表位。此與多株抗體相反，多株抗體通常包括多種以不同抗原決定簇為目標之不同抗體之混合。用語「單株抗體」包含完整及全長單株抗體，也包含抗體片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、單鏈(scFv)抗體、雙特異性抗體、包含抗體部分之融合蛋白質、及任何其他包含抗原辨認區(抗原結合部位)之經修飾之免疫球蛋白分子。另外，「單株抗體」係指由多種技術包括但不限於雜交瘤產製、噬菌體選擇、重組表現及基因轉殖動物製備之該等抗體。
此處所使用之用語「人化抗體」係指非人(例如小鼠)抗體之形式，該形式係包含最少非人序列之特定免疫球蛋白鏈、嵌合性免疫球蛋白或彼等之片段。通常，人化抗體係其中CDR之殘基經非人物種(例如小鼠、大鼠、兔或倉鼠)之CDR殘基取代之人免疫球蛋白，其具有所欲之特異性、親和性及/或結合能力(Jones et al.,1986,Nature,321：522-525；Riechmann et al.,1988,Nature,332：323-327；Verhoeyen et al.,1988,Science,239：1534-1536)。在一些情況中，人免疫球蛋白之Fv架構區殘基係由具有所欲特異性、親和性、結構及/或結合能力之非人物種之抗體的對應殘基取代。該人化抗體可進一步藉由取代Fv架構區及/或該經取代之非人 殘基內之額外殘基加以修飾，以精進優化抗體特異性、親和性、結構及/或結合能力。通常，該人化抗體將包含實質上所有之至少一個且通常兩或三個對應該非人免疫球蛋白之CDR，然而所有或實質上所有之架構區係具有人免疫球蛋白共同序列之架構區。該人化抗體亦可包含至少部分之免疫球蛋白恆定區或恆定結構域(Fc)，通常為人免疫球蛋白之該部分。用於產製人化抗體之方法的實例係描述於例如美國專利第5,225,539號。
此處所使用之用語「人抗體」係指由人產製之抗體或具有對應由人產製之抗體的胺基酸序列之抗體。人抗體可利用任何該領域已知之技術製備。此人抗體之定義特別排除包含非人CDR之人化抗體。
此處所使用之用語「嵌合抗體」係指其中該免疫球蛋白分子之胺基酸序列係源自二或多個物種之抗體。通常，輕鏈及重鏈之可變區皆對應源自一哺乳動物物種(例如小鼠、大鼠、兔等)之具有所欲特異性、親和性及/或結合能力之抗體的可變區，然而該恆定區對應源自另一物種(通常是人)之抗體中的序列。
此處所使用之用詞「親和性成熟抗體」係指在彼之一或多個CDR中具有一或多個改變之抗體，該等改變導致該抗體對抗原之親和性增加，相較於不具有該等改變之母體抗體。該定義亦包括與CDR殘基改變一起發生之非CDR殘基之改變。較佳之親和性成熟抗體將具有奈莫耳或甚至皮莫耳程度之對標靶抗原之親和性。親和性 成熟抗體係藉由該領域已知之方法產製。舉例來說，Marks et al.,1992,Bio/Technology 10：779-783描述藉由VH及VL結構域替換產生之親和性成熟。CDR及/或架構殘基之隨機突變形成係由Barbas et al.,1994,PNAS,91：3809-3813；Schier et al.,1995,Gene,169：147-155；Yelton et al.,1995,J.Immunol.155：1994-2004；Jackson et al.,1995,J.Immunol.,154：3310-9及Hawkins et al.,1992,J.Mol.Biol.,226：889-896描述。定點突變形成亦可被用來獲得親和性成熟抗體。
用語「表位」及「抗原決定簇」在此處可交換使用，係指可被特定抗體辨識且特異性結合之抗原部分。當抗原係多肽時，表位可自連續胺基酸或藉由蛋白質之三級摺疊並列之非連續胺基酸形成。自連續胺基酸形成之表位(又稱為線性表位)通常在蛋白質變性時仍被保留，然而藉由三級摺疊形成之表位(又稱為構形表位)通常在蛋白質變性時喪失。表位通常包括至少3個及更常地至少5或8至10個呈獨特空間構形之胺基酸。
用語「異多聚分子」或「異多聚體」或「異多聚複合物」或「異多聚多肽」在此處可被交換使用，係指包含至少第一多肽及第二多肽之分子，其中該第二多肽與第一多肽之胺基酸序列有至少一個胺基酸殘基不同。該異多聚分子可包含由第一及第二多肽形成之「異二聚體」，或可形成其中存在額外多肽之更高階之三級結構。
用語「選擇性結合」或「特異性結合」係指 結合劑或抗體以更頻繁、更快速、更長時間、更高親和性或上述條件之某些組合與表位、蛋白質或標靶分子反應或結合，相較於可供選擇之物質包括非相關蛋白質。在某些實施態樣中，「特異性結合」係指例如抗體以大約0.1mM或更低，但通常低於大約1μM之KD與蛋白質結合。在某些實施態樣中，「特異性結合」係指抗體有時以至少約0.1μM或更低，有時以至少約0.01μM或更低，且有時以至少約1nM或更低之KD與標靶結合。由於不同物種之間的同源性蛋白質具有序列一致性，因此特異性結合可包括辨識超過一個物種之蛋白質之抗體(例如人RSPO3及小鼠RSPO3)。同樣地，由於不同蛋白之多肽序列的某些區域內具有同源性，因此特異性結合可包括辨識超過一種蛋白(例如人RSPO3及RSPO1)之抗體(或其他多肽或結合劑)。應了解的是，在某些實施態樣中，與第一標靶特異性結合之抗體或結合基團可能或可能不與第二標靶特異性結合。因此，「特異性結合」不一定表示(雖然可包括)排他性結合(即與單一標靶結合)。因此，在某些實施態樣中，抗體與一種以上之標靶特異性結合。在某些實施態樣中，多重標靶可能由抗體上之相同的抗原結合部位結合。舉例來說，在某些情況下，抗體可能包含二個完全相同之抗原結合部位，該二個抗原結合部位各自與二或多個蛋白(例如RSPO3及RSPO1)上之相同表位特異性結合。在某些可供選擇之實施態樣中，抗體可能為多特異性且包含至少二個具有不同特異性之抗原結合部位。以非限 制性實例而言，雙特異性抗體可包含一個辨識第一蛋白(例如人RSPO3)上之表位的抗原結合部位，另包含第二個辨識第二蛋白(例如人RSPO2)上之不同表位的不同抗原結合部位。一般來說(但不必然)，所謂的結合係指特異性結合。
用語「多肽」和「肽」以及「蛋白」在此處可交換使用，這些用語係指任何長度之胺基酸的聚合物。該聚合物可為線性或分支，其可能包含經修飾之胺基酸，且其可能被非胺基酸中斷。該等用語亦包含經天然或人為干預修飾之胺基酸聚合物；例如雙硫鍵形成、糖基化、脂化、乙醯化、磷酸化或任何其他操縱或修飾，諸如與標記成份共軛。該定義亦包括例如包含一或多個胺基酸類似物(包括例如非天然胺基酸)以及該領域習知之其他修飾之多肽。應了解的是，由於本發明之多肽可能以抗體為主，因此在某些實施態樣中，該多肽可能為單鏈或相連之多個鏈。
用語「多核苷酸」及「核酸」在此處可交換使用，係指任何長度之核苷酸之聚合物，包括DNA及RNA。該核苷酸可為去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之核苷酸或鹼基及/或彼等之類似物，或任何可藉由DNA或RNA聚合酶被納入聚合物中之底物。
「高度嚴謹度之條件」可識別為下列條件：(1)採用低離子張力及高溫清洗，例如於50℃之15mM NaCl/1.5mM檸檬酸鈉/0.1%十二基硫酸鈉；(2)在雜 交期間採用變性劑，諸如甲醯胺，例如42℃之具有0.1%牛血清白蛋白/0.1% Ficoll/0.1%聚乙烯基吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩衝液之於pH 6.5之5x SSC(0.75M NaCl，75mM檸檬酸鈉)中之50%(體積/體積)甲醯胺；或(3)於雜交期間採用42℃於5x SSC中之50%甲醯胺、50mM磷酸鈉(pH 6.8)、0.1%焦磷酸鈉、5x丹哈德(Denhardt’s)溶液、經超音波化之鮭魚精子DNA(50μg/ml)、0.1% SDS及10%硫酸葡聚糖，於42℃以0.2x SSC及50%甲醯胺清洗，之後於55℃以含有EDTA之0.1x SSC進行高嚴謹度清洗。
在提及二或多個核酸或多肽時，用語「一致」或百分比「一致性」係指當二或多個序列或子序列經比較及排比(需要時導入間格)以達最高對應性且不把任何保守性胺基酸取代當作序列一致性之部分時，該二或多個序列或子序列係相同或具有相同之特定百分比之核苷酸或胺基酸殘基。該百分比一致性可利用序列比較軟體或演算法測量，或藉由目視檢查測量。多種可被用於取得胺基酸或核苷酸序列排比之演算法及軟體係該領域所廣為周知。該等演算法及軟體包括但不限於BLAST、ALIGN、Megalign、BestFit、GCG Wisconsin套裝軟體及彼等之變化性產品。在一些實施態樣中，本發明之二個核酸或多肽係實質上一致表示當彼等經比較或排比以達最高對應性時，利用序列比較演算法或目視檢查得知彼等具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%且在一 些實施態樣中至少95%、96%、97%、98%、99%之核苷酸或胺基酸殘基一致性。在一些實施態樣中，一致性存在於至少約10、至少約20、至少約40至60殘基、至少約60至80殘基長度或介於之間的任何整數長度之序列區域。在一些實施態樣中，一致性存在於60至80殘基以上之更長區域，諸如至少約80至100殘基，且在一些實施態樣中該等序列係與經比較之全長序列諸如核苷酸序列之編碼區域實質上一致。
「保守性胺基酸取代」係指其中一個胺基酸殘基被另一個具有類似側鏈之胺基酸殘基取代之取代。具有類似側鏈之胺基酸殘基群係於該領域中定義，包括鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β-分支側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳香族側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。舉例來說，以苯丙胺酸取代酪胺酸係保守性取代。較佳地，本發明之多肽及抗體之序列中的保守性取代不廢除含有該胺基酸序列之多肽或抗體與該多肽或抗體原本所結合之抗原(即該一或多種RSPO蛋白)之結合。識別不消除抗原結合性之核苷酸及胺基酸保守性取代之方法係該領域所廣為周知。
此處所使用之用語「載體」係指建構物，該建構物能在宿主細胞中遞送及通常表現一或多種感興趣之基因或序列。載體之實例包括但不限於病毒性載體、裸DNA或RNA表現載體、質體載體、黏質體載體、噬菌體載體、與陽離子縮合劑有關之DNA或RNA表現載體，及包封於脂質體中之DNA或RNA表現載體。
經「分離」之多肽、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組成物係呈現未見於天然中之形式之多肽、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組成物。經分離之多肽、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組成物包括該些經純化至一定程度而使彼等不再以見於天然中之形式存在者。在一些實施態樣中，經純化之多肽、抗體、多核苷酸、載體、細胞或組成物係實質上純的。
此處所使用之用語「實質上純的」係指其為至少50%純的(即不含汙染物)、至少90%純的、至少95%純的、至少98%純的或至少99%純的之物質。
此處所使用之用語「癌」及「癌性」係指稱或描述哺乳動物之生理狀況，其中細胞群具有未受調節之細胞生長之特徵。癌之實例包括但不限於癌(carcinoma)、胚細胞瘤、肉瘤及血液性癌諸如淋巴瘤及白血病。
此處所使用之用語「腫瘤」及「瘤(neoplasm)」係指任何由過度細胞生長或增生所導致之組織團塊，不論是良性(非癌性)或包括癌前性病灶之惡 性(癌性)。
此處所使用之用語「轉移」係指癌藉以自原發部位擴散或轉移至身體其他區域且在新位置發展類似癌性病灶之過程。「轉移」或「轉移性」細胞係指與鄰近細胞喪失黏著接觸且經由血流或淋巴自疾病之原發部位移動以入侵鄰近身體結構之細胞。
用語「癌幹細胞」、「CSC」、「腫瘤幹細胞」及「腫瘤起始細胞」在此處可交換使用，係指源自癌或腫瘤且具有下列特性之細胞：(1)具有廣泛增生能力，(2)能進行不對稱細胞分裂以產生一或多種類型之經分化之細胞後代，其中該經分化之細胞具有減少之增生或發育能力，及(3)能進行對稱細胞分裂以自我更新或自我維持。這些特性授予癌幹細胞在連續移植至免疫不全之宿主(例如小鼠)時能形成或建立腫瘤或癌之能力，相對於大部分無法形成腫瘤之腫瘤細胞。癌幹細胞以混亂之方式進行自我更新及分化以形成具有異常且可在將來突變發生時改變之細胞類型之腫瘤。
用語「癌細胞」及「腫瘤細胞」係指源自癌或腫瘤或癌前病灶之細胞的整體族群，包括非腫瘤發生性細胞(其包含大部分之癌細胞族群)及腫瘤發生性幹細胞(癌幹細胞)。此處所使用之用語「癌細胞」或「腫瘤細胞」當僅用於指稱該些缺乏更新及分化能力之細胞時將由用語「非腫瘤發生性」修飾，以區別該些腫瘤細胞與癌幹細胞。
此處所使用之用語「腫瘤發生性」係指癌幹細胞之功能特性，包括自我更新(導致額外之腫瘤發生性癌幹細胞)及增生以產生所有其他腫瘤細胞(導致經分化及因此非腫瘤發生性腫瘤細胞)之特性。
此處所使用之用語「腫瘤發生性」係指源自腫瘤之隨機細胞樣本在連續移植至免疫不全宿主(例如小鼠)時形成明顯腫瘤之能力。此定義亦包括當連續移植至免疫不全宿主(例如小鼠)時形成明顯腫瘤之經富集及/或經分離之癌幹細胞族群。
用語「個體」係指任何動物(例如哺乳動物)，包括但不限於人、非人靈長動物、犬、貓、囓齒動物及該類似動物，該動物將成為特定治療之接受者。通常，關於人個體之用語「個體」及「病患」在此處可交換使用。
用語「醫藥上可接受」係指經美國聯邦政府之管理機關或州政府核准(或可核准)或經明列於美國藥典或其他普遍公認之藥典中以用於動物(包括人)之產品或化合物。
用語「醫藥上可接受之賦形劑、載劑或佐劑」或「可接受之醫藥載劑」係指可與本發明之至少一種結合劑(例如抗體)一起投予至個體之賦形劑、載劑或佐劑，且該賦形劑、載劑或佐劑不破壞該結合劑之活性。該賦形劑、載劑或佐劑當與足以達到治療效應之劑量之結合劑一起投予時應不具毒性。
用語「有效量」或「治療有效量」或「治療效應」係指有效「治療」個體或哺乳動物之疾病或疾患之結合劑、抗體、多肽、多核苷酸、小型有機分子或其他藥物之量。以癌為例，藥物(例如抗體)之治療有效量具有治療效應且因此可減少癌細胞之數量；降低腫瘤發生性、腫瘤發生頻率或腫瘤發生能力；減少癌幹細胞之數量或頻率；減少腫瘤大小；減少癌細胞群；抑制及/或停止癌細胞浸潤至週邊器官包括例如癌擴散至軟組織及骨；抑制及/或停止腫瘤或癌細胞轉移；抑制及/或停止腫瘤或癌細胞生長；緩解一或多種與癌相關之症狀之嚴重程度；減少發病率及死亡率；促進生活品質；或該等效應之組合。以該劑舉例來說抗體預防現存癌細胞生長及/或殺死現存癌細胞之方面而言，其可被稱為細胞靜止性及/或細胞毒性。
用語「治療」或「緩和」係指1)治療性措施，該措施治癒、減緩、減輕經診斷之病理狀況或疾患之症狀及/或停止該經診斷之病理狀況或疾患之進展及2)預防性或防範性措施，該措施預防或減緩標靶病理狀況或疾患之發展。因此該些需要治療者包括該些已罹患該疾患者、該些易於罹患該疾患者，以及該些欲預防該疾患者。在一些實施態樣中，個體係經本發明之方法成功「治療」，若該病患顯示下列一或多項：癌細胞之數量減少或完全消失；腫瘤大小減少；抑制或缺乏癌細胞浸潤至週邊器官包括癌細胞擴散至軟組織及骨；抑制或缺乏腫瘤或癌 細胞轉移；抑制或缺乏癌生長；緩解一或多種與該特定癌相關之症狀；減少發病率及死亡率；改善生活品質；減少腫瘤發生性；減少癌幹細胞之數量或頻率；或一些效應之組合。
如本揭示內容及申請專利範圍中所使用者，單數形式之「一」(a,an)及「該」(the)包含複數形式除非上下文另外清楚地說明。
應了解的是，只要此處之實施態樣係以用語「包含」描述，其亦提供其他以「由...組成」及/或「實質上由...組成」之用語所描述之類似實施態樣。也應了解的是，只要此處之實施態樣係以用語「實質上由...組成」描述，其亦提供其他以「由...組成」之用語所描述之類似實施態樣。
當使用於此處諸如「A及/或B」之片語中，用語「及/或」係意圖包括A及B兩者、A或B、A(單獨)及B(單獨)。同樣地，使用於片語諸如「A、B及/或C」中之用語「及/或」係意圖包含下列實施態樣中之各者：A、B及C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A(單獨)；B(單獨)；及C(單獨)。
II. RSPO結合劑
本發明提供與人RSPO蛋白特異性結合之劑。該等劑在此處被稱為「RSPO結合劑」。在一些實施 態樣中，該RSPO結合劑係抗體。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑係多肽。在某些實施態樣中，該RSPO結合劑與RSPO3結合(「RSPO3結合劑」)。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑與至少一種其他人RSPO特異性結合。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑所結合之至少一種其他人RSPO係選自RSPO1、RSPO2或RSPO4。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係與RSPO1、RSPO2及/或RSPO4上之相同表位結合之抗體。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係與RSPO3上之第一表位結合且與RSPO1、RSPO2及/或RSPO4上之第二不同表位結合之雙特異性抗體。人RSPO1、RSPO2、RSPO3及RSPO4之全長胺基酸(aa)序列係該領域已知，在此處以SEQ ID NO：1(RSPO1)、SEQ ID NO：2(RSPO2)、SEQ ID NO：3(RSPO3)及SEQ ID NO：4(RSPO4)表示。
在某些實施態樣中，此處所述之RSPO結合劑(例如抗體或雙特異性抗體)的抗原結合部位能結合一、二、三或四個RSPO。在某些實施態樣中，此處所述之RSPO結合劑(例如抗體或雙特異性抗體)的抗原結合部位能結合RSPO3以及一、二或三個其他RSPO。舉例來說，在某些實施態樣中，RSPO3結合劑之抗原結合部位能與RSPO3以及選自RSPO1、RSPO2或RSPO4之至少一種其他RSPO特異性結合。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑與RSPO3及RSPO1特異性結合。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑與RSPO3及RSPO2特異性結合。在 某些實施態樣中，該RSPO3結合劑與RSPO3及RSPO4特異性結合。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑與RSPO3、RSPO1及RSPO2特異性結合。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑與RSPO3、RSPO1及RSPO4特異性結合。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑與RSPO3、RSPO2及RSPO4特異性結合。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑與人RSPO3特異性結合。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑(例如抗體)與人RSPO3及小鼠RSPO3特異性結合。
在某些實施態樣中，該抗原結合劑係與人RSPO3之胺基酸22至272以內特異性結合之抗體。在某些實施態樣中，該抗原結合劑係與人RSPO3之胺基酸22至207以內特異性結合之抗體。在某些實施態樣中，該抗原結合劑係與人RSPO3之胺基酸35至135以內特異性結合之抗體。在某些實施態樣中，該抗原結合劑係與人RSPO3之胺基酸35至86以內特異性結合之抗體。在某些實施態樣中，該抗原結合劑係與人RSPO3之胺基酸92至135以內特異性結合之抗體。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑與SEQ ID NO：5以內結合。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑或抗體與RSPO3之三呋喃基二氫咪唑樣之多半胱胺酸區結合。在一些實施態樣中，該劑或抗體與RSPO3之三呋喃基二氫咪唑樣之多半胱胺酸區內的至少一個胺基酸結合。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑或抗體與序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7以內 結合。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑或抗體與序列SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：7以內結合。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑與RSPO3之血小板反應素結構域結合。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑或抗體與RSPO3之血小板反應素結構域內的至少一個胺基酸結合。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑或抗體與SEQ ID NO：8以內結合。
在某些實施態樣中，該RSPO結合劑或抗體以大約1μM或更低、大約100nM或更低、大約40nM或更低、大約20nM或更低、大約10nM或更低、大約1nM或更低、或大約0.1nM或更低之解離常數(KD)與至少一種RSPO蛋白結合。在某些實施態樣中，RSPO結合劑或抗體以大約1μM或更低、大約100nM或更低、大約40nM或更低、大約20nM或更低、大約10nM或更低、大約1nM或更低、或大約0.1nM或更低之解離常數(KD)與RSPO3結合。在一些實施態樣中，RSPO3結合劑或抗體以大約20nM或更低之KD與RSPO3結合。在一些實施態樣中，RSPO3結合劑或抗體以大約10nM或更低之KD與RSPO3結合。在一些實施態樣中，RSPO3結合劑或抗體以大約1nM或更低之KD與RSPO3結合。在一些實施態樣中，RSPO3結合劑或抗體以大約0.5nM或更低之KD與RSPO3結合。在一些實施態樣中，RSPO3結合劑或抗體以大約0.1nM或更低之KD與RSPO3結合。在某些實施態樣中，此處所述之RSPO3結合劑或抗體與至少一種其 他RSPO結合。在某些實施態樣中，此處所述之與至少一種其他RSPO結合之RSPO3結合劑或抗體以大約100nM或更低、大約20nM或更低、大約10nM或更低、大約1nM或更低、或大約0.1nM或更低之KD與至少一種其他RSPO結合。舉例來說，在一些實施態樣中，RSPO3結合劑或抗體也以大約10nM或更低之KD與RSPO1、RSPO2及/或RSPO4結合。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑以大約10nM或更低之KD與人RSPO及小鼠RSPO結合。在一些實施態樣中，RSPO3結合劑以大約1nM或更低之KD與人RSPO3及小鼠RSPO3結合。在一些實施態樣中，RSPO3結合劑以大約0.1nM或更低之KD與人RSPO3及小鼠RSPO3結合。在一些實施態樣中，該結合劑(例如抗體)與RSPO3蛋白之解離常數係利用RSPO3融合蛋白測得之解離常數，該RSPO3融合蛋白包含至少部分之固定於Biacore晶片上之RSPO3蛋白。在一些實施態樣中，該結合劑(例如抗體)與RSPO3蛋白之解離常數係利用被Biacore晶片上之抗人IgG抗體所捕捉之結合劑及RSPO3蛋白所測定之解離常數。
在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係雙特異性抗體，其包含與RSPO3特異性結合之第一抗原結合部位及與第二標靶特異性結合之第二抗原結合部位。在一些實施態樣中，RSPO3結合劑或抗體以大約100nM或更低之KD與RSPO3及該第二標靶結合。在一些實施態樣中，RSPO3結合劑或抗體以大約50nM或更低之KD與 RSPO3及該第二標靶結合。在一些實施態樣中，RSPO3結合劑或抗體以大約20nM或更低之KD與RSPO3及該第二標靶結合。在一些實施態樣中，RSPO3結合劑或抗體以大約10nM或更低之KD與RSPO3及該第二標靶結合。在一些實施態樣中，RSPO3結合劑或抗體以大約1nM或更低之KD與RSPO3及該第二標靶結合。在一些實施態樣中，該抗原結合部位之一的親和性可能低於另一抗原結合部位之親和性。舉例來說，一抗原結合部位之KD可能為大約1nM，第二抗原結合部位之KD可能為大約10nM。在一些實施態樣中，該二個抗原結合部位之間的親和性差異可能為大約2倍或2倍以上、大約3倍或3倍以上、大約5倍或5倍以上、大約8倍或8倍以上、大約10倍或10倍以上、大約15倍或15倍以上、大約20倍或20倍以上、大約30倍或30倍以上、大約50倍或50倍以上、或大約100倍或100倍以上。調整二個抗原結合部位之親和性可能影響該雙特異性抗體之生物活性。舉例來說，降低該抗原結合部位對RSPO3或該第二標靶之親和性可能具有所欲效應，例如降低該結合劑之毒性及/或增加治療指數。
以非限制性實例說明，該雙特異性抗體可能包含(a)以約0.1nM至約10nM之KD與人RSPO3結合之第一抗原結合部位，及(b)以約0.1nM至約20nM、約0.5nM至約20nM或約1.0nM至10nM之KD與第二標靶(例如人RSPO2)特異性結合之第二抗原結合部位。
在某些實施態樣中，該RSPO結合劑(例如抗體)以大約1μM或更低、大約100nM或更低、大約40nM或更低、大約20nM或更低、大約10nM或更低、大約1nM或更低、或大約0.1nM或更低之半數最高有效濃度(EC50)與至少一種人RSPO蛋白結合。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑(例如抗體)以大約1μM或更低、大約100nM或更低、大約40nM或更低、大約20nM或更低、大約10nM或更低、大約1nM或更低、或大約0.1nM或更低之半數最高有效濃度(EC50)與人RSPO3結合。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑(例如抗體)也以大約40nM或更低、大約20nM或更低、大約10nM或更低、大約1nM或更低、或大約0.1nM或更低之EC50與人RSPO1、RSPO2及/或RSPO4結合。
在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體。在一些實施態樣中，該抗體係重組抗體。在一些實施態樣中，該抗體係單株抗體。在一些實施態樣中，該抗體係嵌合抗體。在一些實施態樣中，該抗體係人化抗體。在一些實施態樣中，該抗體係人抗體。在一些實施態樣中，該抗體係IgA、IgD、IgE、IgG或IgM抗體。在某些實施態樣中，該抗體係IgG1抗體。在某些實施態樣中，該抗體係IgG2抗體。在某些實施態樣中，該抗體係包含抗原結合部位之抗體片段。在一些實施態樣中，該抗體係雙特異性抗體或多特異性抗體。在一些實施態樣中，該抗體係單價抗體。在一些實施態樣中，該抗體係單特異性抗體。 在一些實施態樣中，該抗體係雙價抗體。在一些實施態樣中，該抗體係與細胞毒性基團共軛。在一些實施態樣中，該抗體係經分離。在一些實施態樣中，該抗體係實質上純的。
本發明之RSPO3結合劑(例如抗體)之特異性結合可使用該領域已知之任何方法檢測。可使用之免疫檢測包括但不限於競爭性及非競爭性檢測系統，該等系統利用諸如Biacore分析、FACS分析、免疫螢光、免疫細胞化學、西方墨點分析、放射性免疫測定、ELISA、「三明治式」免疫測定、免疫沉澱分析、沉澱反應、膠體擴散沉澱反應、免疫擴散分析、凝集測定、補體固定測定、免疫放射分析、螢光免疫分析及蛋白質A免疫分析之技術。該等檢測係例行性檢測且為該領域中廣為周知(見例如Ausubel et al.,Editors,1994-present,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,New York,NY)。
舉例來說，抗體與人RSPO3之特異性結合可利用ELISA測定。ELISA測定包含準備抗原，以抗原包覆96孔微量板之孔槽，添加與可檢測之化合物諸如酶受質(例如辣根過氧化酶或鹼性磷酸酶)共軛之RSPO3結合抗體或其他RSPO3結合劑至孔槽，培養一段時間後，檢測與該抗原結合之抗體之存在。在一些實施態樣中，該RSPO3結合抗體或結合劑不與可檢測之化合物共軛，而是將辨識該RSPO3結合劑或抗體且與可檢測之化合物共軛 之第二共軛抗體(例如抗Fc抗體)加入孔槽中。在一些實施態樣中，不以抗原包覆孔槽，反而是以RSPO3結合劑或抗體包覆孔槽，並於添加抗原至該經包覆之孔槽後加入與可檢測之化合物共軛之第二抗體。該領域之技藝人士將了解可經修改以增加經檢測之信號之參數以及該領域所知之ELISA之其他變數。
在另一實例中，抗體與人RSPO3之特異性結合可利用FACS測定。FACS篩選測定可包含產製cDNA建構物以表現抗原為融合蛋白(例如RSPO3-Fc或RSPO3-CD4TM)，將該建構物轉染至細胞中，使該抗原表現在細胞表面，使該RSPO3結合劑與該經轉染之細胞混合，並培養一段時間。被RSPO3結合劑結合之細胞可利用與可檢測之化合物共軛之二級抗體(例如與PE共軛之抗Fc抗體)及流式細胞分析識別。該領域之技藝人士將了解可經修改以優化經檢測之信號之參數以及其他可增進篩選(例如篩選阻斷抗體)之FACS變數。
抗體或其他結合劑與抗原(例如RSPO3)之結合親和性及抗體-抗原交互反應之解離速率可藉由競爭性結合測定決定。競爭性結合測定之一實例係放射性免疫測定，其包含在漸增量之未經標記之抗原存在下，培養經標記之抗原(例如3H或125I)或彼之片段或變異體與感興趣之抗體，之後檢測與該經標記之抗原結合之抗體。該抗體與抗原之親和性及結合解離速率可由斯卡查德(Scatchard)圖分析之資料測定。在一些實施態樣中， Biacore動力學分析係用於測定與抗原(例如RSPO3)結合之抗體或劑之結合及解離速率。在一些實施態樣中，Biacore動力學分析包含分析抗體與晶片表面上經固定之抗原(例如RSPO3)之結合及解離。在一些實施態樣中，Biacore動力學分析包含分析抗原(例如RSPO3)與晶片表面上經固定之抗體(例如抗RSPO3抗體)之結合及解離。
在某些實施態樣中，本發明提供與人RSPO3特異性結合之RSPO3結合劑(例如抗體)，其中該RSPO3結合劑(例如抗體)包含抗體131R002、抗體131R003或彼等之人化變異體包括h131R005/131R007、h131R006A、h131R006B、h131R008、h131R010或h131R011之1、2、3、4、5及/或6個CDR(見表1)。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含131R002、131R003或彼等之人化變異體包括h131R005/131R007、h131R006A、h131R006B、h131R008、h131R010或h131R011之一或多個CDR；131R002、131R003或彼等之人化變異體包括h131R005/131R007、h131R006A、h131R006B、h131R008、h131R010或h131R011之二或多個CDR；131R002、131R003或彼等之人化變異體包括h131R005/131R007、h131R006A、h131R006B、h131R008、h131R010或h131R011之三或多個CDR；131R002、131R003或彼等之人化變異體包括 h131R005/131R007、h131R006A、h131R006B、h131R008、h131R010或h131R011之四或多個CDR；131R002、131R003或彼等之人化變異體包括h131R005/131R007、h131R006A、h131R006B、h131R008、h131R010或h131R011之五或多個CDR；或131R002、131R003或彼等之人化變異體包括h131R005/131R007、h131R006A、h131R006B、h131R008、h131R010或h131R011之所有六個CDR。
在某些實施態樣中，本發明提供與人RSPO3特異性結合之RSPO3結合劑(例如抗體)，其中該RSPO3結合劑包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO：9)、KASGYTFTSYTF(SEQ ID NO：34)或DYSIH (SEQ ID NO：78)，該重鏈CDR2包含IYPSNGDS(SEQ ID NO：10)或YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO：79)，且該重鏈CDR3包含ATYFANYFDY(SEQ ID NO：11)、ATYFANNFDY(SEQ ID NO：35)或TYFANNFD(SEQ ID NO：80)。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑另包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3，該輕鏈CDR1包含QSVDYDGDSYM(SEQ ID NO：12)或KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO：81)，該輕鏈CDR2包含AAS(SEQ ID NO：13)或AASNLES(SEQ ID NO：82)，且該輕鏈CDR3包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO：14)或QQSNEDPLTF(SEQ ID NO：83)。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3，該輕鏈CDR1包含QSVDYDGDSYM(SEQ ID NO：12)或KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO：81)，該輕鏈CDR2包含AAS(SEQ ID NO：13)或AASNLES(SEQ ID NO：82)，且該輕鏈CDR3包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO：14)或QQSNEDPLTF(SEQ ID NO：83)。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含：(a)包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO：9)之重鏈CDR1，包含IYPSNGDS(SEQ ID NO：10)之重鏈CDR2及包含ATYFANYFDY(SEQ ID NO：11)之重鏈CDR3，及(b)包含QSVDYDGDSYM(SEQ ID NO：12)之輕鏈CDR1，包含AAS(SEQ ID NO：13)之輕鏈CDR2及包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO：14)之輕鏈CDR3。在 某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含：(a)包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO：9)之重鏈CDR1，包含IYPSNGDS(SEQ ID NO：10)之重鏈CDR2及包含ATYFANNFDY(SEQ ID NO：35)之重鏈CDR3，及(b)包含QSVDYDGDSYM(SEQ ID NO：12)之輕鏈CDR1，包含AAS(SEQ ID NO：13)之輕鏈CDR2及包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO：14)之輕鏈CDR3。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含：(a)包含KASGYTFTSYTF(SEQ ID NO：34)之重鏈CDR1，包含IYPSNGDS(SEQ ID NO：10)之重鏈CDR2及包含ATYFANYFDY(SEQ ID NO：11)之重鏈CDR3，及(b)包含QSVDYDGDSYM(SEQ ID NO：12)之輕鏈CDR1，包含AAS(SEQ ID NO：13)之輕鏈CDR2及包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO：14)之輕鏈CDR3。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含：(a)包含KASGYTFTSYTF(SEQ ID NO：34)之重鏈CDR1，包含IYPSNGDS(SEQ ID NO：10)之重鏈CDR2及包含ATYFANNFDY(SEQ ID NO：35)之重鏈CDR3，及(b)包含QSVDYDGDSYM(SEQ ID NO：12)之輕鏈CDR1，包含AAS(SEQ ID NO：13)之輕鏈CDR2及包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO：14)之輕鏈CDR3。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含：(a)包含DYSIH(SEQ ID NO：78)之重鏈CDR1，包含YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO：79)之重鏈CDR2及包含TYFANNFD(SEQ ID NO：80)之重鏈CDR3，及(b)包含KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO：81)之輕鏈CDR1，包含AASNLES(SEQ ID NO：82)之輕鏈CDR2及包含QQSNEDPLTF(SEQ ID NO：83)之輕鏈CDR3。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含：(a)包含DYSIH(SEQ ID NO：78)之重鏈CDR1，包含YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO：79)之重鏈CDR2及包含TYFANNFD(SEQ ID NO：80)之重鏈CDR3，及(b)包含KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO：81)之輕鏈CDR1，包含AASNLES(SEQ ID NO：82)之輕鏈CDR2及包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO：14)之輕鏈CDR3。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含：(a)包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO：9)或DYSIH(SEQ ID NO：78)之重鏈CDR1、包含IYPSNGDS(SEQ ID NO：10)之重鏈CDR2及包含TYFANNFD(SEQ ID NO：80)之重鏈CDR3，及(b)包含QSVDYDGDSYM(SEQ ID NO：12)之輕鏈CDR1、包含AAS(SEQ ID NO：13)之輕鏈CDR2及包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO：14)之輕鏈CDR3。
在某些實施態樣中，本發明提供與人RSPO3特異性結合之RSPO3結合劑(例如抗體或雙特異性抗體)，其中該RSPO3結合劑包含：(a)包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO：9)、KASGYTFTSYTF(SEQ ID NO：34)、DYSIH(SEQ ID NO：78)或彼等之包含1、2、3或4個胺基酸取代之變異體之重鏈CDR1；(b)包 含IYPSNGDS(SEQ ID NO：10)、YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO：79)或彼等之包含1、2、3或4個胺基酸取代之變異體之重鏈CDR2；(c)包含ATYFANYFDY(SEQ ID NO：11)、ATYFANNFDY(SEQ ID NO：35)、TYFANNFD(SEQ ID NO：80)或彼等之包含1、2、3或4個胺基酸取代之變異體之重鏈CDR3；(d)包含QSVDYDGDSYM(SEQ ID NO：12)、KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO：81)或彼等之包含1、2、3或4個胺基酸取代之變異體之輕鏈CDR1；(e)包含AAS(SEQ ID NO：13)、AASNLES(SEQ ID NO：82)或彼等之包含1、2、3或4個胺基酸取代之變異體之輕鏈CDR2；及(f)包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO：14)、QQSNEDPLTF(SEQ ID NO：83)或彼等之包含1、2、3或4個胺基酸取代之變異體之輕鏈CDR3。在某些實施態樣中，該胺基酸取代係保守性取代。在一些實施態樣中，該等取代被當作種系人化過程之一部份。
在某些實施態樣中，本發明提供與RSPO3特異性結合之RSPO3結合劑(例如抗體)，其中該RSPO3結合劑包含重鏈可變區及/或輕鏈可變區，該重鏈可變區與SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：62具有至少約80%之序列一致性，該輕鏈可變區與SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：86具有至少80%之序列一致性。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑 包含與SEQ ID NO：15具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約99%之序列一致性之重鏈可變區。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含與SEQ ID NO：16具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約99%之序列一致性之重鏈可變區。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含與SEQ ID NO：36具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約99%之序列一致性之重鏈可變區。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含與SEQ ID NO：37具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約99%之序列一致性之重鏈可變區。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含與SEQ ID NO：44具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約99%之序列一致性之重鏈可變區。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含與SEQ ID NO：45具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約99%之序列一致性之重鏈可變區。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含與SEQ ID NO：62具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約99%之序列一致性之重鏈可變區。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含與SEQ ID NO：17具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約99%之序列一致性之輕鏈可變區。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含與SEQ ID NO：72具有至少約85%、至少約90%、至少約 95%、至少約97%或至少約99%之序列一致性之輕鏈可變區。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含與SEQ ID NO：86具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約99%之序列一致性之輕鏈可變區。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含與SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：62具有至少約95%序列一致性之重鏈可變區，及/或與SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：86具有至少約95%序列一致性之輕鏈可變區。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈可變區及/或輕鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：62，且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：86。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：62，且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：86。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區實質上由SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：62組成，且該輕鏈可變區實質上由SEQ ID NO：17、 SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：86組成。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區由SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：62組成，且該輕鏈可變區由SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：86組成。
在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：44，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：17。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：45，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：17。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：62，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：17。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區實質上由SEQ ID NO：44組成，該輕鏈可變區實質上由SEQ ID NO：17組成。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區實質上由SEQ ID NO：45組成，該輕鏈可變區實質上由SEQ ID NO：17組成。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區實質上由SEQ ID NO：62組成，該輕鏈可變區實質上由SEQ ID NO：17組成。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區由SEQ ID NO：44組成，該輕鏈可變區由SEQ ID NO：17組成。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區由SEQ ID NO：45組成，該輕鏈可變區由SEQ ID NO：17組成。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區由SEQ ID NO：62組成，該輕鏈可變區由SEQ ID NO：17組成。
在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：44，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：72。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：45，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：72。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：62，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：72。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區實質上由SEQ ID NO：44組成，該輕鏈可變區實質上由SEQ ID NO：72組成。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區實質上由SEQ ID NO：45組成，該輕鏈可變區實質上由SEQ ID NO：72組成。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區實質上由SEQ ID NO：62組成，該輕鏈可變區實質上由SEQ ID NO：72組成。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含 重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區由SEQ ID NO：44組成，該輕鏈可變區由SEQ ID NO：72組成。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區由SEQ ID NO：45組成，該輕鏈可變區由SEQ ID NO：72組成。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區由SEQ ID NO：62組成，該輕鏈可變區由SEQ ID NO：72組成。
在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：44，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：86。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：45，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：86。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：62，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：86。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區實質上由SEQ ID NO：44組成，該輕鏈可變區實質上由SEQ ID NO：86組成。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區實質上由SEQ ID NO：45組成，該輕鏈可變區實質上由SEQ ID NO：86組成。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區實質上由SEQ ID NO：62組成，該輕鏈可變區實質上由SEQ ID NO：86組成。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區由SEQ ID NO：44組成，該輕鏈可變區由SEQ ID NO：86組成。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區由SEQ ID NO：45組成，該輕鏈可變區由SEQ ID NO：86組成。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區由SEQ ID NO：62組成，該輕鏈可變區由SEQ ID NO：86組成。
在某些實施態樣中，本發明提供與RSPO3特異性結合之RSPO3結合劑(例如抗體)，其中該RSPO3結合劑包含：(a)與SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：69具有至少90%序列一致性之重鏈，及/或(b)與SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：74或SEQ ID NO：88具有至少90%序列一致性之輕鏈。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含：(a)與SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：69具有至少95%序列一致性之重鏈，及/或(b)與SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：74或SEQ ID NO：88具有至少95%序列一致性之輕鏈。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及/或輕鏈，該重鏈含有SEQ ID NO：27且該輕鏈含有SEQ ID NO：29。在一些實施 態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及/或輕鏈，該重鏈含有SEQ ID NO：28且該輕鏈含有SEQ ID NO：29。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及/或輕鏈，該重鏈含有SEQ ID NO：39且該輕鏈含有SEQ ID NO：29。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及/或輕鏈，該重鏈含有SEQ ID NO：42且該輕鏈含有SEQ ID NO：29。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及/或輕鏈，該重鏈含有SEQ ID NO：48且該輕鏈含有SEQ ID NO：29。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及/或輕鏈，該重鏈含有SEQ ID NO：49且該輕鏈含有SEQ ID NO：29。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及/或輕鏈，該重鏈含有SEQ ID NO：64且該輕鏈含有SEQ ID NO：29。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及/或輕鏈，該重鏈含有SEQ ID NO：69且該輕鏈含有SEQ ID NO：29。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及/或輕鏈，該重鏈含有SEQ ID NO：48且該輕鏈含有SEQ ID NO：88。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及/或輕鏈，該重鏈含有SEQ ID NO：49且該輕鏈含有SEQ ID NO：88。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及/或輕鏈，該重鏈含有SEQ ID NO：64且該輕鏈含有SEQ ID NO：88。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及/或輕鏈，該重鏈含有SEQ ID NO：69且該輕鏈含有SEQ ID NO：88。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及輕鏈，該重鏈 實質上由SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：69組成，且該輕鏈實質上由SEQ ID NO：29組成。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及輕鏈，該重鏈由SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：69組成，且該輕鏈由SEQ ID NO：29組成。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及輕鏈，該重鏈由SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：69組成，且該輕鏈由SEQ ID NO：88組成。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及/或輕鏈，該重鏈含有SEQ ID NO：27且該輕鏈含有SEQ ID NO：74。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及/或輕鏈，該重鏈含有SEQ ID NO：28且該輕鏈含有SEQ ID NO：74。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及/或輕鏈，該重鏈含有SEQ ID NO：39且該輕鏈含有SEQ ID NO：74。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及/或輕鏈，該重鏈含有SEQ ID NO：42且該輕鏈含有SEQ ID NO：74。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及/或輕鏈，該重鏈含有SEQ ID NO：48且該輕鏈含有SEQ ID NO：74。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及/或輕鏈，該重鏈含有SEQ ID NO：49且該輕鏈 含有SEQ ID NO：74。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及/或輕鏈，該重鏈含有SEQ ID NO：64且該輕鏈含有SEQ ID NO：74。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及/或輕鏈，該重鏈含有SEQ ID NO：69且該輕鏈含有SEQ ID NO：74。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及/或輕鏈，該重鏈含有SEQ ID NO：48且該輕鏈含有SEQ ID NO：88。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及/或輕鏈，該重鏈含有SEQ ID NO：49且該輕鏈含有SEQ ID NO：88。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及/或輕鏈，該重鏈含有SEQ ID NO：64且該輕鏈含有SEQ ID NO：88。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及/或輕鏈，該重鏈含有SEQ ID NO：69且該輕鏈含有SEQ ID NO：88。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及輕鏈，該重鏈實質上由SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：69組成，且該輕鏈實質上由SEQ ID NO：74組成。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及輕鏈，該重鏈由SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：69組成，且該輕鏈由SEQ ID NO：74組成。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及輕鏈，該重鏈實質上由SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：69 組成，且該輕鏈實質上由SEQ ID NO：88組成。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及輕鏈，該重鏈由SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：69組成，且該輕鏈由SEQ ID NO：88組成。
在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及輕鏈，該重鏈含有SEQ ID NO：48且該輕鏈含有SEQ ID NO：29。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及輕鏈可變區，該重鏈包含SEQ ID NO：49，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：29。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及輕鏈可變區，該重鏈包含SEQ ID NO：64，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：29。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及輕鏈可變區，該重鏈包含SEQ ID NO：69，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：29。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及輕鏈，該重鏈實質上由SEQ ID NO：48組成，該輕鏈實質上由SEQ ID NO：29組成。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及輕鏈，該重鏈實質上由SEQ ID NO：49組成，該輕鏈實質上由SEQ ID NO：29組成。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及輕鏈，該重鏈實質上由SEQ ID NO：64組成，該輕鏈實質上由SEQ ID NO：29組成。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及輕鏈，該重鏈實質上由SEQ ID NO：69組成，該輕鏈實質上由SEQ ID NO：29組成。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及輕鏈，該重鏈由SEQ ID NO：48組成， 該輕鏈由SEQ ID NO：29組成。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及輕鏈，該重鏈由SEQ ID NO：49組成，該輕鏈由SEQ ID NO：29組成。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及輕鏈，該重鏈由SEQ ID NO：64組成，該輕鏈由SEQ ID NO：29組成。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及輕鏈，該重鏈由SEQ ID NO：69組成，該輕鏈由SEQ ID NO：29組成。
在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及輕鏈，該重鏈含有SEQ ID NO：48且該輕鏈含有SEQ ID NO：74。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及輕鏈可變區，該重鏈包含SEQ ID NO：49，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：74。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及輕鏈可變區，該重鏈包含SEQ ID NO：64，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：74。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及輕鏈可變區，該重鏈包含SEQ ID NO：69，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：74。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及輕鏈，該重鏈實質上由SEQ ID NO：48組成，該輕鏈實質上由SEQ ID NO：74組成。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及輕鏈，該重鏈實質上由SEQ ID NO：49組成，該輕鏈實質上由SEQ ID NO：74組成。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及輕鏈，該重鏈實質上由SEQ ID NO：64組成，該輕鏈實質上由SEQ ID NO：74組成。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及 輕鏈，該重鏈實質上由SEQ ID NO：69組成，該輕鏈實質上由SEQ ID NO：74組成。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及輕鏈，該重鏈由SEQ ID NO：48組成，該輕鏈由SEQ ID NO：74組成。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及輕鏈，該重鏈由SEQ ID NO：49組成，該輕鏈由SEQ ID NO：74組成。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及輕鏈，該重鏈由SEQ ID NO：64組成，該輕鏈由SEQ ID NO：74組成。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及輕鏈，該重鏈由SEQ ID NO：69組成，該輕鏈由SEQ ID NO：74組成。
在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及輕鏈，該重鏈含有SEQ ID NO：48且該輕鏈含有SEQ ID NO：88。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及輕鏈可變區，該重鏈包含SEQ ID NO：49，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：88。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及輕鏈可變區，該重鏈包含SEQ ID NO：64，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：88。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及輕鏈可變區，該重鏈包含SEQ ID NO：69，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：88。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及輕鏈，該重鏈實質上由SEQ ID NO：48組成，該輕鏈實質上由SEQ ID NO：88組成。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及輕鏈，該重鏈實質上由SEQ ID NO：49組成，該輕鏈實質上由SEQ ID NO：88組成。在某些實施態 樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及輕鏈，該重鏈實質上由SEQ ID NO：64組成，該輕鏈實質上由SEQ ID NO：88組成。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及輕鏈，該重鏈實質上由SEQ ID NO：69組成，該輕鏈實質上由SEQ ID NO：88組成。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及輕鏈，該重鏈由SEQ ID NO：48組成，該輕鏈由SEQ ID NO：88組成。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及輕鏈，該重鏈由SEQ ID NO：49組成，該輕鏈由SEQ ID NO：88組成。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及輕鏈，該重鏈由SEQ ID NO：64組成，該輕鏈由SEQ ID NO：88組成。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含重鏈及輕鏈，該重鏈由SEQ ID NO：69組成，該輕鏈由SEQ ID NO：88組成。
在某些實施態樣中，RSPO3結合劑包含131R002抗體之重鏈可變區及輕鏈可變區。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑包含(有或無前導序列之)131R002抗體之重鏈及輕鏈。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑係131R002抗體。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑包含呈嵌合抗體形式之131R002抗體的重鏈可變區及/或輕鏈可變區。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑包含呈人化抗體形式之131R002抗體的重鏈可變區及/或輕鏈可變區。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑包含呈人化抗體形式之131R002抗體的重鏈CDR及/或輕鏈CDR。在一些實施態樣中，該人化版本之131R002係IgG1抗體。在一些實 施態樣中，該人化版本之131R002係IgG2抗體。
在某些實施態樣中，RSPO3結合劑包含抗體131R002、實質上由抗體131R002組成或由抗體131R002組成。
在某些實施態樣中，RSPO3結合劑包含131R003抗體之重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含131R003抗體之重鏈可變區，其中該源自131R003之重鏈可變區已經親和性成熟。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含131R003抗體之重鏈可變區，其中該重鏈可變區相較於該親代131R003抗體包含至少一個經修飾或改變之CDR。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑包含131R003抗體之重鏈可變區，其中該重鏈可變區相較於該親代131R003抗體包含經修飾之CDR1。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑包含131R003抗體之重鏈可變區，其中該重鏈可變區相較於該親代131R003抗體包含經修飾之CDR2。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑包含131R003抗體之重鏈可變區，其中該重鏈可變區相較於該親代131R003抗體包含經修飾之CDR3。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑包含131R003抗體之重鏈可變區，其中該重鏈可變區相較於該親代131R003抗體包含經修飾之CDR1及CDR3。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑包含(有或無前導序列之)131R003抗體之重鏈及輕鏈。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑係131R003抗體。在某些實施態樣中，RSPO3結 合劑係131R003抗體之變異體，其相較於該親代131R003抗體包含不同的重鏈CDR1。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑係131R003抗體之變異體，其相較於該親代131R003抗體包含不同的重鏈CDR3。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑係131R003抗體之變異體，其相較於該親代131R003抗體包含不同的重鏈CDR1及不同的重鏈CDR3。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑包含呈嵌合抗體形式之131R003抗體或131R003之任何變異體的重鏈可變區及/或輕鏈可變區。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑包含呈人化抗體形式之131R003抗體或131R003之任何變異體的重鏈可變區及/或輕鏈可變區。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑包含呈人化抗體形式之131R003抗體或131R003之任何變異體的重鏈CDR及/或輕鏈CDR。在一些實施態樣中，該人化版本之131R003或131R003之變異體係IgG1抗體。在一些實施態樣中，該人化版本之131R003或131R003之變異體係IgG2抗體。
在某些實施態樣中，RSPO3結合劑包含抗體131R003、實質上由抗體131R003組成或由抗體131R003組成。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑包含抗體131R003之變異體、實質上由抗體131R003之變異體組成或由抗體131R003之變異體組成。
在某些實施態樣中，RSPO3結合劑包含131R006B抗體之重鏈可變區及輕鏈可變區。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑包含(有或無前導序列之) 131R006B抗體之重鏈及輕鏈。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑係131R006B抗體。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑包含呈嵌合抗體形式之131R006B抗體的重鏈可變區及/或輕鏈可變區。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑包含呈人化抗體形式之131R006B抗體的重鏈可變區及/或輕鏈可變區。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑包含呈人化抗體形式之131R006B抗體的重鏈CDR及/或輕鏈CDR。在一些實施態樣中，該人化版本之131R006B係IgG1抗體。在一些實施態樣中，該人化版本之131R006B係IgG2抗體。
在某些實施態樣中，RSPO3結合劑包含抗體131R006B、實質上由抗體131R006B組成或由抗體131R006B組成。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑包含抗體131R006B之變異體、實質上由抗體131R006B之變異體組成或由抗體131R006B之變異體組成。
在某些實施態樣中，RSPO3結合劑包含131R005/131R007抗體之重鏈可變區及輕鏈可變區。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑包含(有或無前導序列之)131R005/131R007抗體之重鏈及輕鏈。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑係131R005/131R007抗體。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑包含呈嵌合抗體形式之131R005/131R007抗體的重鏈可變區及/或輕鏈可變區。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑包含呈人化抗體形式之131R005/131R007抗體的重鏈可變區及/或輕鏈可變區。 在某些實施態樣中，RSPO3結合劑包含呈人化抗體形式之131R005/131R007抗體的重鏈CDR及/或輕鏈CDR。在一些實施態樣中，該人化版本之131R005/131R007係IgG1抗體。在一些實施態樣中，該人化版本之131R005/131R007係IgG2抗體。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係131R008。
在某些實施態樣中，RSPO3結合劑包含抗體131R005/131R007、實質上由抗體131R005/131R007組成或由抗體131R005/131R007組成。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑包含抗體131R005/131R007之變異體、實質上由抗體131R005/131R007之變異體組成或由抗體131R005/131R007之變異體組成。
在某些實施態樣中，RSPO3結合劑包含抗體131R008、實質上由抗體131R008組成或由抗體131R008組成。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑包含抗體131R008之變異體、實質上由抗體131R008之變異體組成或由抗體131R008之變異體組成。
在某些實施態樣中，RSPO3結合劑包含h131R010或h131R011抗體之重鏈可變區及輕鏈可變區。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑包含(有或無前導序列之)h131R010或131R011抗體之重鏈及輕鏈。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑係h131R010抗體。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑係h131R011抗體。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑包含呈嵌合抗體形式之h131R010或 h131R011抗體的重鏈可變區及/或輕鏈可變區。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑包含h131R010或h131R011抗體之重鏈CDR及/或輕鏈CDR。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係h131R010。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係h131R011。
在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含由寄存於美國菌種保存中心(ATCC)之質體PTA-120420所編碼之重鏈可變區。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含由寄存於ATCC之質體PTA-120421所編碼之輕鏈可變區。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含由寄存於ATCC之質體PTA-120420所編碼之重鏈可變區，及由寄存於ATCC之質體PTA-120421所編碼之輕鏈可變區。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含由寄存於ATCC之質體PTA-120420所編碼之重鏈。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含由寄存於ATCC之質體PTA-120421所編碼之輕鏈。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含由寄存於ATCC之質體PTA-120420所編碼之重鏈，及由寄存於ATCC之質體PTA-120421所編碼之輕鏈。
在某些實施態樣中，RSPO3結合劑包含抗體h131R010、實質上由抗體h131R010組成或由抗體h131R010組成。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑包含抗體h131R010之變異體、實質上由抗體h131R010之變異體組成或由抗體h131R010之變異體組成。
在某些實施態樣中，RSPO3結合劑包含抗體h131R011、實質上由抗體h131R011組成或由抗體h131R011組成。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑包含抗體h131R011之變異體、實質上由抗體h131R011之變異體組成或由抗體h131R011之變異體組成。
在某些實施態樣中，本發明提供其係雙特異性抗體之RSPO3結合劑。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係雙特異性抗體，其包含與人RSPO3特異性結合之第一抗原結合部位。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係雙特異性抗體，其包含與人RSPO3特異性結合之第一抗原結合部位及與第二標靶結合之第二抗原結合部位。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係雙特異性抗體，其包含：與人RSPO3特異性結合之第一抗原結合部位，其中該第一抗原結合部位包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO：9)、KASGYTFTSYTF(SEQ ID NO：34)或DYSIH(SEQ ID NO：78)，該重鏈CDR2包含IYPSNGDS(SEQ ID NO：10)或YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO：79)，且該重鏈CDR3包含ATYFANYFDY(SEQ ID NO：11)、ATYFANNFDY(SEQ ID NO：35)或TYFANNFD(SEQ ID NO：80)。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係雙特異性抗體，其包含與人RSPO3特異性結合之第一抗原結合部位，其中該第一抗原結合部位包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1 包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO：9)，該重鏈CDR2包含IYPSNGDS(SEQ ID NO：10)且該重鏈CDR3包含ATYFANNFDY(SEQ ID NO：35)。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係雙特異性抗體，其包含與人RSPO3特異性結合之第一抗原結合部位，其中該第一抗原結合部位包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含KASGYTFTSYTF(SEQ ID NO：34)，該重鏈CDR2包含IYPSNGDS(SEQ ID NO：10)，該重鏈CDR3包含ATYFANNFDY(SEQ ID NO：35)。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係雙特異性抗體，其包含與人RSPO3特異性結合之第一抗原結合部位，其中該第一抗原結合部位包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含KASGYTFTSYTF(SEQ ID NO：34)，該重鏈CDR2包含IYPSNGDS(SEQ ID NO：10)，該重鏈CDR3包含ATYFANYFDY(SEQ ID NO：11)。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係雙特異性抗體，其包含與人RSPO3特異性結合之第一抗原結合部位，其中該第一抗原結合部位包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含DYSIH(SEQ ID NO：80)，該重鏈CDR2包含YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO：79)且該重鏈CDR3包含TYFANNFD(SEQ ID NO：80)。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係雙特異性抗體，其包含與人RSPO3特異性結合之第一抗原結合部位，其中該第一抗原結合部位包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該 重鏈CDR1包含DYSIH(SEQ ID NO：80)或KASGYTFTDYS(SEQ ID NO：9)，該重鏈CDR2包含IYPSNGDS(SEQ ID NO：10)且該重鏈CDR3包含TYFANNFD(SEQ ID NO：80)。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係雙特異性抗體，其包含與人RSPO3特異性結合之第一抗原結合部位，其中該第一抗原結合部位包含(a)包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO：9)、KASGYTFTSYTF(SEQ ID NO：34)或DYSIH(SEQ ID NO：78)之重鏈CDR1，包含IYPSNGDS(SEQ ID NO：10)或YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO：79)之重鏈CDR2，及包含ATYFANYFDY(SEQ ID NO：11)、ATYFANNFDY(SEQ ID NO：35)或TYFANNFD(SEQ ID NO：80)之重鏈CDR3，及第二抗原結合部位，其中該第一抗原結合部位及該第二抗原結合部位包含共同(相同)輕鏈。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體包含第一抗原結合部位，該第一抗原結合部位包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3，該輕鏈CDR1包含QSVDYDGDSYM(SEQ ID NO：12)或KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO：81)，該輕鏈CDR2包含AAS(SEQ ID NO：13)或AASNLES(SEQ ID NO：82)，且該輕鏈CDR3包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO：14)或QQSNEDPLTF(SEQ ID NO：83)。
在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係雙特異性抗體，其包含與SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、 SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：62具有至少約80%之序列一致性之第一重鏈可變區。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑係雙特異性抗體，其包含與SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：62具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約99%之序列一致性之第一重鏈可變區。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體包含與SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：86具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約99%之序列一致性之輕鏈可變區。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係包含第一重鏈可變區之雙特異性抗體，該第一重鏈可變區包含SEQ ID NO：44。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係包含第一重鏈可變區之雙特異性抗體，該第一重鏈可變區包含SEQ ID NO：45。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係包含第一重鏈可變區之雙特異性抗體，該第一重鏈可變區包含SEQ ID NO：62。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係包含第一輕鏈可變區之雙特異性抗體，該第一輕鏈可變區包含SEQ ID NO：17。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係包含第一輕鏈可變區之雙特異性抗體，該第一輕鏈可變區包含SEQ ID NO：72。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係包含第一輕鏈可變區之雙特異性抗體，該第一輕鏈可變區包含SEQ ID NO：86。
在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係包含第一重鏈可變區及第一重鏈恆定區之雙特異性抗體，該第一重鏈可變區包含SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：62，且該第一重鏈恆定區包含SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：61。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係包含第一重鏈可變區及第一重鏈恆定區之雙特異性抗體，該第一重鏈可變區包含SEQ ID NO：44，且該第一重鏈恆定區包含SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：61。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係包含第一重鏈可變區及第一重鏈恆定區之雙特異性抗體，該第一重鏈可變區包含SEQ ID NO：45，且該第一重鏈恆定區包含SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：61。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係包含第一重鏈可變區及第一重鏈恆定區之雙特異性抗體，該第一重鏈可變區包含SEQ ID NO：62，且該第一重鏈恆定區包含SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：61。
在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑係與人RSPO3及第二標靶特異性結合之雙特異性抗體。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係與人RSPO3及第二人RSPO特異性結合之雙特異性抗體。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係與人RSPO3及選自RSPO1、RSPO2或RSPO4之第二人RSPO特異性結合之雙特異性抗體。抗人RSPO之抗體的非限制性實例已於例如國際專利公開號 WO 2013/012747描述。
在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係與人RSPO3及人RSPO1特異性結合之雙特異性抗體。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體包含：a)與人RSPO3特異性結合之第一抗原結合部位，及b)與人RSPO1特異性結合之第二抗原結合部位，其中該第一抗原結合部位包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO：9)、KASGYTFTSYTF(SEQ ID NO：34)或DYSIH(SEQ ID NO：78)，該重鏈CDR2包含IYPSNGDS(SEQ ID NO：10)或YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO：79)，且該重鏈CDR3包含ATYFANYFDY(SEQ ID NO：11)、ATYFANNFDY(SEQ ID NO：35)或TYFANNFD(SEQ ID NO：80)，且其中該第一及第二抗原結合部位皆包含共同輕鏈。
在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係與人RSPO3及人RSPO2特異性結合之雙特異性抗體。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體包含：a)與人RSPO3特異性結合之第一抗原結合部位，及b)與人RSPO2特異性結合之第二抗原結合部位，其中該第一抗原結合部位包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO：9)、KASGYTFTSYTF(SEQ ID NO：34)或DYSIH(SEQ ID NO：78)，該重鏈CDR2包含IYPSNGDS(SEQ ID NO：10)或 YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO：79)，且該重鏈CDR3包含ATYFANYFDY(SEQ ID NO：11)、ATYFANNFDY(SEQ ID NO：35)或TYFANNFD(SEQ ID NO：80)，且其中該第一及第二抗原結合部位皆包含共同輕鏈。
在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係雙特異性抗體，其包含源自抗RSPO3抗體131R003之重鏈可變區。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係雙特異性抗體，其包含源自抗RSPO3抗體131R003之變異體的重鏈可變區。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係雙特異性抗體，其包含源自抗RSPO3抗體131R006B之重鏈可變區。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係雙特異性抗體，其包含源自抗RSPO3抗體h131R005/131R007之重鏈可變區。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係雙特異性抗體，其包含源自抗RSPO3抗體h131R010或h131R011之重鏈可變區。
在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係雙特異性抗體，其包含第一CH3結構域及第二CH3結構域，該第一CH3結構域及第二CH3結構域各自經改質以促進異多聚體之形成。在一些實施態樣中，該第一及第二CH3結構域係利用突點對應孔洞技術加以改質。在一些實施態樣中，該第一及第二CH3結構域包含胺基酸之改變，該等胺基酸之改變導致不同之靜電交互作用。在一些實施態樣中，該第一及第二CH3結構域包含胺基酸之改變，該 等胺基酸之改變導致不同之疏水性/親水性交互作用。
在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係雙特異性抗體，其包含選自下列之重鏈恆定區：(a)第一人IgG1恆定區，其中對應IgG1(SEQ ID NO：56)之位置253及292之胺基酸係經麩胺酸或天冬胺酸取代，及第二人IgG1恆定區，其中對應IgG1(SEQ ID NO：56)之位置240及282之胺基酸係經離胺酸取代；(b)第一人IgG2恆定區，其中對應IgG2(SEQ ID NO：57)之位置249及288之胺基酸係經麩胺酸或天冬胺酸取代，及第二人IgG2恆定區，其中對應IgG2(SEQ ID NO：57)之位置236及278之胺基酸係經離胺酸取代；(c)第一人IgG3恆定區，其中對應IgG3(SEQ ID NO：58)之位置300及339之胺基酸係經麩胺酸或天冬胺酸取代，及第二人IgG3恆定區，其中對應IgG3(SEQ ID NO：58)之位置287及329之胺基酸係經離胺酸取代；及(d)第一人IgG4恆定區，其中對應IgG4(SEQ ID NO：59)之位置250及289之胺基酸係經麩胺酸或天冬胺酸取代，及第二IgG4恆定區，其中對應IgG4(SEQ ID NO：59)之位置237及279之胺基酸係經離胺酸取代。
在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係雙特異性抗體，其包含在對應IgG1(SEQ ID NO：56)之位置253及292的位置具有胺基酸取代之第一人IgG1恆定區(其中對應IgG1(SEQ ID NO：56)之位置253及292的位置之胺基酸係經麩胺酸或天冬胺酸取代)，及在對應 IgG1(SEQ ID NO：56)之位置240及282的位置具有胺基酸取代之第二人IgG1恆定區(其中對應IgG1(SEQ ID NO：56)之位置240及282的位置之胺基酸係經離胺酸取代)。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係雙特異性抗體，其包含在對應IgG2(SEQ ID NO：57)之位置249及288的位置具有胺基酸取代之第一人IgG2恆定區(其中對應IgG2(SEQ ID NO：57)之位置249及288的位置之胺基酸係經麩胺酸或天冬胺酸取代)，及在對應IgG2(SEQ ID NO：57)之位置236及278的位置具有胺基酸取代之第二人IgG2恆定區(其中對應IgG2(SEQ ID NO：57)之位置236及278的位置之胺基酸係經離胺酸取代)。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑係雙特異性抗體，其包含在對應IgG3(SEQ ID NO：58)之位置300及339的位置具有胺基酸取代之第一人IgG3恆定區(其中對應IgG3(SEQ ID NO：58)之位置300及339的位置之胺基酸係經麩胺酸或天冬胺酸取代)，及在對應IgG3(SEQ ID NO：58)之位置287及329的位置具有胺基酸取代之第二人IgG3恆定區(其中對應IgG3(SEQ ID NO：58)之位置287及329的位置之胺基酸係經離胺酸取代)。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑係雙特異性抗體，其包含在對應IgG4(SEQ ID NO：59)之位置250及289的位置具有胺基酸取代之第一人IgG4恆定區(其中對應IgG4(SEQ ID NO：59)之位置250及289的位置之胺基酸係經麩胺酸或天冬胺酸取代)，及在對應IgG4 (SEQ ID NO：59)之位置237及279的位置具有胺基酸取代之第二人IgG4恆定區(其中對應IgG4(SEQ ID NO：59)之位置237及279的位置之胺基酸係經離胺酸取代)。
在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係雙特異性抗體，其包含在對應IgG1(SEQ ID NO：56)之位置253及292的位置具有胺基酸取代之第一人IgG1恆定區(其中該等胺基酸係經麩胺酸取代)，及在對應IgG1(SEQ ID NO：56)之位置240及282的位置具有胺基酸取代之第二人IgG1恆定區(其中該等胺基酸係經離胺酸取代)。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係雙特異性抗體，其包含在對應IgG1(SEQ ID NO：56)之位置253及292的位置具有胺基酸取代之第一人IgG1恆定區(其中該等胺基酸係經天冬胺酸取代)，及在對應IgG1(SEQ ID NO：56)之位置240及282的位置具有胺基酸取代之第二人IgG1恆定區(其中該等胺基酸係經離胺酸取代)。
在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係雙特異性抗體，其包含在對應IgG2(SEQ ID NO：57)之位置249及288的位置具有胺基酸取代之第一人IgG2恆定區(其中該等胺基酸係經麩胺酸取代)，及在對應IgG2(SEQ ID NO：57)之位置236及278的位置具有胺基酸取代之第二人IgG2恆定區(其中該等胺基酸係經離胺酸取代)。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係雙特異性抗體，其包含在對應IgG2(SEQ ID NO：57)之位置249 及288的位置具有胺基酸取代之第一人IgG2恆定區(其中該等胺基酸係經天冬胺酸取代)，及在對應IgG2(SEQ ID NO：57)之位置236及278的位置具有胺基酸取代之第二人IgG2恆定區(其中該等胺基酸係經離胺酸取代)。
在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係雙特異性抗體，其包含SEQ ID NO：60之重鏈恆定區。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑係雙特異性抗體，其包含SEQ ID NO：61之重鏈恆定區。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係雙特異性抗體，其包含SEQ ID NO：60之第一重鏈恆定區及SEQ ID NO：61之第二重鏈恆定區。
在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係雙特異性抗體，其以約50nM或更低、約25nM或更低、約10nM或更低、約1nM或更低、或約0.1nM或更低之KD與RSPO3結合。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係雙特異性抗體，其以約50nM或更低、約25nM或更低、約10nM或更低、約1nM或更低、或約0.1nM或更低之KD與第二標靶(如RSPO2)結合。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係雙特異性抗體，其以約50nM或更低之KD與RSPO3結合，且以約50nM或更低之KD與第二標靶(如RSPO2)結合。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係雙特異性抗體，其以約25nM或更低之KD與RSPO3結合，且以約25nM或更低之KD與第二標靶(如RSPO2)結合。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係雙特異性抗體，其以約10nM或更低之KD與RSPO3結 合，且以約10nM或更低之KD與第二標靶(如RSPO2)結合。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係雙特異性抗體，其以約1nM或更低之KD與RSPO3結合，且以約1nM或更低之KD與第二標靶(如RSPO2)結合。
在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係雙特異性抗體，其包含一個結合親和性相較於第二抗原結合部位之結合親和性為弱之抗原結合部位。舉例來說，在一些實施態樣中，該雙特異性抗體可能以約0.1nM至1nM之KD與RSPO3結合，且可能以約1nM至10nM之KD與第二標靶(如RSPO2)結合。或者，該雙特異性抗體可能以約1nM至10nM之KD與RSPO3結合，且可能以約0.1nM至1nM之KD與第二標靶(如RSPO2)結合。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體可能以約0.1nM至1nM之KD與RSPO3結合，且可能以約1nM至10nM之KD與第二標靶(如RSPO2)結合。或者，該雙特異性抗體可能以約1nM至10nM之KD與RSPO3結合，且可能以約0.1nM至1nM之KD與第二標靶(如RSPO2)結合。在一些實施態樣中，該二個抗原結合部位之間的親和性差異可能為大約2倍或2倍以上、大約3倍或3倍以上、大約5倍或5倍以上、大約8倍或8倍以上、大約10倍或10倍以上、大約15倍或15倍以上、大約30倍或30倍以上、大約50倍或50倍以上或大約100倍或100倍以上。在一些實施態樣中，該RSPO3抗原結合部位之至少一個CDR中之至少一個胺基酸殘基係經不同之胺基酸取代，以使該RSPO3 結合部位之親和性改變。在一些實施態樣中，該RSPO3結合部位之親和性係增加。在一些實施態樣中，該RSPO3結合部位之親和性係減少。在一些實施態樣中，該第二標靶(如RSPO2)之抗原結合部位的至少一個CDR中之至少一個胺基酸殘基係經不同的胺基酸取代，以使該第二抗原結合部位之親和性改變。在一些實施態樣中，該第二抗原結合部位之親和性係增加。在一些實施態樣中，該第二抗原結合部位之親和性係減少。在一些實施態樣中，該RSPO3及該第二抗原結合部位的親和性皆經改變。
本發明提供與人RSPO蛋白特異性結合之多肽，包括但不限於抗體。在一些實施態樣中，該多肽與人RSPO3結合。在一些實施態樣中，該多肽與人RSPO3及選自RSPO1、RSPO2或RSPO4之至少一種其他人RSPO結合。
在某些實施態樣中，該多肽包含抗體131R002、131R003或131R003之變異體包括h131R005/131R007、h131R006A、h131R006B、h131R010及h131R011之一、二、三、四、五及/或六個CDR(見此處表1)。在一些實施態樣中，該多肽包含每個CDR最多有四個(即0、1、2、3或4個)胺基酸取代之CDR。在某些實施態樣中，該重鏈CDR被包含於重鏈可變區之內。在某些實施態樣中，該輕鏈CDR被包含於輕鏈可變區之內。
在一些實施態樣中，本發明提供與人RSPO3 特異性結合之多肽，其中該多肽包含與SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：62具有至少約80%之序列一致性的胺基酸序列，及/或與SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：86具有至少約80%之序列一致性的胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含與SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：62具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約99%之序列一致性的胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含與SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：86具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約99%之序列一致性的胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含與SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：62具有至少約95%之序列一致性的胺基酸序列，及/或與SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：86具有至少95%之序列一致性的胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列及/或包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列及/或包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列及/或包含SEQ ID NO：17之胺基酸 序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列及/或包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列及/或包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列及/或包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列及/或包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列及/或包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列及/或包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列及/或包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列及/或包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列及/或包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列及/或包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：包含SEQ ID NO：62之按基酸序列及/或包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列及/或包含SEQ ID NO：86之胺基酸 序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列及/或包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列及/或包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列。
在一些實施態樣中，本發明提供與人RSPO3特異性結合之多肽，其中該多肽包含與SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：68具有至少約80%之序列一致性的胺基酸序列，及/或與SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：73或SEQ ID NO：87具有至少約80%之序列一致性的胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含與SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：68具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約99%之序列一致性的胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含與SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：73或SEQ ID NO：87具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約99%之序列一致性的胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含與SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：68具有至少約95%之序列一致性的胺基酸序列，及/或與SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：73或SEQ ID NO：87具有至少95%之序列一致性的胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：包含SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：68之胺基酸序列，及/或包含SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：73或SEQ ID NO：87之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽實質上由SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：68，及/或SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：73或SEQ ID NO：87組成。
在某些實施態樣中，該多肽包含：包含SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：69之胺基酸序列，及/或包含SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：74或SEQ ID NO：88之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列及/或包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列及/或包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列及/或包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列及/或包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列。在某些實 施態樣中，該多肽包含：包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列及/或包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列及/或包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列及/或包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列及/或包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列及/或包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列及/或包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列及/或包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列及/或包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含實質上由SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：69組成之胺基酸序列，及/或實質上由SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：74或SEQ ID NO：88組成之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含實質上由SEQ ID NO：48組成之胺基酸序列及/或實質上由SEQ ID NO：29組成之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含實質上由SEQ ID NO：49組成之胺基酸序列及/或實質上由SEQ ID NO：29組成之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含實質上由SEQ ID NO：64組成之胺基酸序列及/或實質上由SEQ ID NO：29組成之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含實質上由SEQ ID NO：69組成之胺基酸序列及/或實質上由SEQ ID NO：29組成之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含實質上由SEQ ID NO：48組成之胺基酸序列及/或實質上由SEQ ID NO：74組成之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含實質上由SEQ ID NO：49組成之胺基酸序列及/或實質上由SEQ ID NO：74組成之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含實質上由SEQ ID NO：64組成之胺基酸序列及/或實質上由SEQ ID NO：74組成之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含實質上由SEQ ID NO：69組成之胺基酸序列及/或實質上由SEQ ID NO：74組成之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含實質上由SEQ ID NO：48組成之胺基酸序列及/或實質上由SEQ ID NO：88組成之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含實質上由SEQ ID NO：49組成之胺基酸序列及/或實質上由SEQ ID NO：88組成之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含實質上由SEQ ID NO：64組成之胺基酸序列及/或實質上由SEQ ID NO：88組成之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含實質上由SEQ ID NO：69組成之胺基酸序列及/或實質上由SEQ ID NO：88組成之胺基酸序列。
在一些實施態樣中，本發明提供與人RSPO3特異性結合之多肽，其中該多肽包含與SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：69具有至少約80%之序列一致性的胺基酸序列，及/或與SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：74或SEQ ID NO：88具有至少約80%之序列一致性的胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含與SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：69具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約99%之序列一致性的胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含與SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：74或SEQ ID NO：88具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約99%之序列一致性的胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含與SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：69具有至少約95%之序列一致性的胺基酸序列，及/或與SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：74或SEQ ID NO：88具有至少95%之序列一致性的胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：包含SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：69之胺基酸序列，及/或包含SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：74或SEQ ID NO：88之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列及/或包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列及/或包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列及/或包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列及/或包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽實質上由SEQ ID NO：27及/或SEQ ID NO：29組成。在某些實施態樣中，該多肽實質上由SEQ ID NO：28及/或SEQ ID NO：29組成。在某些實施態樣中，該多肽實質上由SEQ ID NO：48及/或SEQ ID NO：29組成。在某些實施態樣中，該多肽實質上由SEQ ID NO：49及/或SEQ ID NO：29組成。在某些實施態樣中，該多肽實質上由SEQ ID NO：64及/或SEQ ID NO：29組成。在某些實施態樣中，該多肽實質上由SEQ ID NO：69及/或SEQ ID NO：29組成。在某些實施態樣中，該多肽包含：包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列及/或包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列及/或包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列及/或包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含： 包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列及/或包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽實質上由SEQ ID NO：27及/或SEQ ID NO：74組成。在某些實施態樣中，該多肽實質上由SEQ ID NO：28及/或SEQ ID NO：74組成。在某些實施態樣中，該多肽實質上由SEQ ID NO：48及/或SEQ ID NO：74組成。在某些實施態樣中，該多肽實質上由SEQ ID NO：49及/或SEQ ID NO：74組成。在某些實施態樣中，該多肽實質上由SEQ ID NO：64及/或SEQ ID NO：74組成。在某些實施態樣中，該多肽實質上由SEQ ID NO：69及/或SEQ ID NO：74組成。在某些實施態樣中，該多肽包含：包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列及/或包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列及/或包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列及/或包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽包含：包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列及/或包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列。在某些實施態樣中，該多肽實質上由SEQ ID NO：48及/或SEQ ID NO：88組成。在某些實施態樣中，該多肽實質上由SEQ ID NO：49及/或SEQ ID NO：88組成。在某些實施態樣中，該多肽實質上由SEQ ID NO：64及/或SEQ ID NO：88組成。在某些實施態樣中，該多肽實質上由SEQ ID NO：69及/或SEQ ID NO：88組成。
在一些實施態樣中，RSPO3結合劑包含多肽，該多肽包含選自下列之序列：SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：87及SEQ ID NO：88。
許多蛋白(包括抗體)包含引導該蛋白運輸至各處之信號序列。信號序列(又稱信號肽或前導序列)位於新生多肽之N端。它們引導該多肽至內質網且該等蛋白被分類至彼等應該去的地方，例如胞器之內部空間、細胞內部之膜、細胞之外膜或經分泌至細胞外部。大部分信號序列在蛋白被運送至內質網後，藉由信號肽酶與該蛋白切割。自該多肽切割該信號序列通常發生於胺基酸序列的特定位點，且取決於該信號序列內之胺基酸殘基。雖然通常有一個特定的切割位點，但信號肽酶可能識別及/或使用一個以上之切割位點，導致該多肽不相同之N端。舉例來說，使用信號序列內之不同的切割位點可導致具有不同N端胺基酸之多肽的表現。因此，在一些實施態樣中，此處所述之多肽可能包含具有不同N端之多肽的混合物。在 一些實施態樣中，該N端之長度相差1、2、3、4、5個胺基酸。在一些實施態樣中，該多肽為實質上相同，即該多肽具有相同之N端。在一些實施態樣中，該多肽之信號序列相較於「天然」或「親代」信號序列包含一或多個(例如一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、等等)胺基酸取代及/或刪除。在一些實施態樣中，該多肽之信號序列包含讓一個切割位點變成主要切割位點之胺基酸取代及/或刪除，藉此導致具有一種N端之實質上相同之多肽。在一些實施態樣中，該多肽之信號序列影響該多肽之表現程度，例如增加表現或減少表現。
在某些實施態樣中，RSPO3結合劑(例如抗體)與抗體競爭與RSPO3之特異性結合，該抗體包含：包含SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：62之重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：86之輕鏈可變區。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑(例如抗體)與抗體競爭與RSPO3之特異性結合，該抗體包含：包含SEQ ID NO：44之重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：17之輕鏈可變區。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑(例如抗體)與抗體競爭與RSPO3之特異性結合，該抗體包含：包含SEQ ID NO：45之重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：17之輕鏈可變區。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑(例如抗體)與抗體競爭與RSPO3之特異性結合，該抗體包含：包含SEQ ID NO：62之重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：17之輕鏈可變區。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑(例如抗體)與抗體競爭與RSPO3之特異性結合，該抗體包含：包含SEQ ID NO：44之重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：72之輕鏈可變區。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑(例如抗體)與抗體競爭與RSPO3之特異性結合，該抗體包含：包含SEQ ID NO：45之重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：72之輕鏈可變區。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑(例如抗體)與抗體競爭與RSPO3之特異性結合，該抗體包含：包含SEQ ID NO：62之重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：72之輕鏈可變區。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑(例如抗體)與抗體競爭與RSPO3之特異性結合，該抗體包含：包含SEQ ID NO：44之重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：86之輕鏈可變區。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑(例如抗體)與抗體競爭與RSPO3之特異性結合，該抗體包含：包含SEQ ID NO：45之重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：86之輕鏈可變區。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑(例如抗體)與抗體競爭與RSPO3之特異性結合，該抗體包含：包含SEQ ID NO：62之重鏈可變區，及包含SEQ ID NO：86之輕鏈可變區。
在某些實施態樣中，RSPO3結合劑(例如抗體)與抗體競爭與RSPO3之特異性結合，該抗體包含：包含SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：69之重鏈，及包含SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：74或SEQ ID NO：88之輕鏈。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑(例如抗體)與抗體競爭與RSPO3之特異性結合，該抗體包含：包含SEQ ID NO：48之重鏈及包含SEQ ID NO：29之輕鏈。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑(例如抗體)與抗體競爭與RSPO3之特異性結合，該抗體包含：包含SEQ ID NO：49之重鏈及包含SEQ ID NO：29之輕鏈。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑(例如抗體)與抗體競爭與RSPO3之特異性結合，該抗體包含：包含SEQ ID NO：64之重鏈及包含SEQ ID NO：29之輕鏈。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑(例如抗體)與抗體競爭與RSPO3之特異性結合，該抗體包含：包含SEQ ID NO：69之重鏈及包含SEQ ID NO：29之輕鏈。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑(例如抗體)與抗體競爭與RSPO3之特異性結合，該抗體包含：包含SEQ ID NO：48之重鏈及包含SEQ ID NO：74之輕鏈。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑(例如抗體)與抗體競爭與RSPO3之特異性結合，該抗體包含：包含SEQ ID NO：49之重鏈及包含SEQ ID NO：74之輕鏈。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑(例如抗體)與抗體競爭與RSPO3之特異性結合，該抗體包含：包含SEQ ID NO：64之重鏈及包含SEQ ID NO：74之輕鏈。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑(例如抗體)與抗體競爭與RSPO3之特異性結合，該抗體包含：包含SEQ ID NO：69之重鏈及包含SEQ ID NO：74 之輕鏈。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑(例如抗體)與抗體競爭與RSPO3之特異性結合，該抗體包含：包含SEQ ID NO：48之重鏈及包含SEQ ID NO：88之輕鏈。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑(例如抗體)與抗體競爭與RSPO3之特異性結合，該抗體包含：包含SEQ ID NO：49之重鏈及包含SEQ ID NO：88之輕鏈。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑(例如抗體)與抗體競爭與RSPO3之特異性結合，該抗體包含：包含SEQ ID NO：64之重鏈及包含SEQ ID NO：88之輕鏈。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑(例如抗體)與抗體競爭與RSPO3之特異性結合，該抗體包含：包含SEQ ID NO：69之重鏈及包含SEQ ID NO：88之輕鏈。
在某些實施態樣中，RSPO3結合劑與抗體131R002或抗體131R003競爭與人RSPO3之特異性結合。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑與抗體131R003之變異體競爭與人RSPO3之特異性結合。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑與抗體131R003之人化版本競爭與人RSPO3之特異性結合。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑與抗體h131R005/131R007競爭與人RSPO3之特異性結合。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑與抗體h131R008競爭與人RSPO3之特異性結合。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑與抗體h131R006A或抗體h131R006B競爭與人RSPO3之特異性結合。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑與抗體h131R010競爭與人RSPO3 之特異性結合。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑與抗體h131R011競爭與人RSPO3之特異性結合。在一些實施態樣中，RSPO3結合劑或抗體於試管內競爭性結合測定中競爭與RSPO3之特異性結合。在一些實施態樣中，該RSPO3係人RSPO3。在一些實施態樣中，該RSPO3係小鼠RSPO3。
在某些實施態樣中，RSPO3結合劑(例如抗體)與RSPO3上由本發明之抗體所結合之相同表位或實質上相同之表位結合。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑(例如抗體)與RSPO3上由抗體131R002或抗體131R003所結合之相同表位或實質上相同之表位結合。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑(例如抗體)與RSPO3上由抗體131R003之變異體所結合之相同表位或實質上相同之表位結合。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑(例如抗體)與RSPO3上由抗體131R003之人化版本所結合之相同表位或實質上相同之表位結合。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑(例如抗體)與RSPO3上由抗體h131R006A或抗體h131R006B所結合之相同表位或實質上相同之表位結合。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑(例如抗體)與RSPO3上由抗體h131R005/131R007所結合之相同表位或實質上相同之表位結合。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑(例如抗體)與RSPO3上由抗體h131R008所結合之相同表位或實質上相同之表位結合。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑(例如抗體)與 RSPO3上由抗體h131R010所結合之相同表位或實質上相同之表位結合。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑(例如抗體)與RSPO3上由抗體h131R011所結合之相同表位或實質上相同之表位結合。
在另一實施態樣中，RSPO3結合劑係與RSPO3上之表位結合之抗體，該表位與由本發明之抗體所結合之RSPO3上之表位重疊。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係與RSPO3上之表位結合之抗體，該表位與由抗體131R002或抗體131R003所結合之RSPO3上之表位重疊。在另一實施態樣中，該RSPO3結合劑係與RSPO3上之表位結合之抗體，該表位與由抗體131R003之變異體所結合之RSPO3上之表位重疊。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係與RSPO3上之表位結合之抗體，該表位與由抗體131R003之人化版本所結合之RSPO3上之表位重疊。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑係與RSPO3上之表位結合之抗體，該表位與由抗體h131R006A或抗體h131R006B所結合之RSPO3上之表位重疊。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑係與RSPO3上之表位結合之抗體，該表位與由抗體h131R005/131R007所結合之RSPO3上之表位重疊。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑係與RSPO3上之表位結合之抗體，該表位與由抗體h131R008所結合之RSPO3上之表位重疊。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑係與RSPO3上之表位結合之抗體，該表位與由抗體h131R010 所結合之RSPO3上之表位重疊。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑係與RSPO3上之表位結合之抗體，該表位與由抗體h131R011所結合之RSPO3上之表位重疊。
在某些實施態樣中，此處所描述之RSPO結合劑(例如抗體)與至少一種人RSPO蛋白結合且調節RSPO活性。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑係RSPO拮抗劑且降低RSPO活性。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑係RSPO拮抗劑且降低β-連環蛋白活性。
在某些實施態樣中，此處所描述之RSPO3結合劑(例如抗體)與人RSPO3結合且調節RSPO3活性。在一些實施態樣中，RSPO3結合劑係RSPO3拮抗劑且降低RSPO3活性。在一些實施態樣中，RSPO3結合劑係RSPO3拮抗劑且降低β-連環蛋白活性。
在某些實施態樣中，該RSPO結合劑(例如抗體)係至少一種人RSPO蛋白之拮抗劑。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑係至少一種RSPO之拮抗劑且抑制RSPO活性。在某些實施態樣中，該RSPO結合劑抑制至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約50%、至少約75%、至少約90%或約100%之RSPO活性。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑抑制一、二、三或四種RSPO蛋白之活性。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑抑制人RSPO1、RSPO2、RSPO3及/或RSPO4之活性。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑係RSPO3結合劑。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑抑制RSPO3活性。在某些 實施態樣中，抑制人RSPO3活性之RSPO3結合劑係抗體131R002、抗體131R003或131R003之變異體。在某些實施態樣中，抑制人RSPO3活性之RSPO3結合劑係人化版本之抗體131R002、抗體131R003或131R003之變異體。在某些實施態樣中，抑制人RSPO3活性之RSPO3結合劑係抗體h131R006A或抗體h131R006B。在某些實施態樣中，抑制人RSPO3活性之RSPO3結合劑係抗體h131R005/131R007。在某些實施態樣中，抑制人RSPO3活性之RSPO3結合劑係抗體h131R008。在某些實施態樣中，抑制人RSPO3活性之RSPO3結合劑係抗體h131R010。在某些實施態樣中，抑制人RSPO3活性之RSPO3結合劑係抗體h131R011。
在某些實施態樣中，該RSPO結合劑(例如抗體)係至少一種人RSPO蛋白之拮抗劑。在某些實施態樣中，該RSPO結合劑抑制至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約50%、至少約75%、至少約90%或約100%之RSPO傳訊。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑抑制一、二、三或四種RSPO蛋白之傳訊。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑抑制人RSPO1、RSPO2、RSPO3及/或RSPO4之傳訊。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑係RSPO3結合劑。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑抑制人RSPO3傳訊。在某些實施態樣中，抑制RSPO3傳訊之RSPO3結合劑係抗體131R002、抗體131R003或131R003之變異體。在某些實施態樣中，抑制RSPO3傳 訊之RSPO3結合劑係人化版本之抗體131R002、抗體131R003或131R003之變異體。在某些實施態樣中，抑制人RSPO3傳訊之RSPO3結合劑係抗體h131R006A或抗體h131R006B。在某些實施態樣中，抑制人RSPO3傳訊之RSPO3結合劑係抗體h131R005/131R007。在某些實施態樣中，抑制人RSPO3傳訊之RSPO3結合劑係抗體h131R008。在某些實施態樣中，抑制人RSPO3傳訊之RSPO3結合劑係抗體h131R010。在某些實施態樣中，抑制人RSPO3傳訊之RSPO3結合劑係抗體h131R011。
在某些實施態樣中，該RSPO結合劑(例如抗體)係β-連環蛋白傳訊之拮抗劑。在某些實施態樣中，該RSPO結合劑抑制至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約50%、至少約75%、至少約90%或約100%之β-連環蛋白傳訊。在一些實施態樣中，該抑制β-連環蛋白傳訊之RSPO結合劑係RSPO3結合劑。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑抑制β-連環蛋白傳訊。在某些實施態樣中，抑制β-連環蛋白傳訊之RSPO3結合劑係抗體131R002、抗體131R003或131R003之變異體。在某些實施態樣中，抑制β-連環蛋白傳訊之RSPO3結合劑係人化版本之抗體131R002、抗體131R003或131R003之變異體。在某些實施態樣中，抑制β-連環蛋白傳訊之RSPO3結合劑係抗體h131R006A或抗體h131R006B。在某些實施態樣中，抑制β-連環蛋白傳訊之RSPO3結合劑係抗體h131R005/131R007。在某些實施態樣中，抑制β- 連環蛋白傳訊之RSPO3結合劑係抗體h131R008。在某些實施態樣中，抑制β-連環蛋白傳訊之RSPO3結合劑係抗體h131R010。在某些實施態樣中，抑制β-連環蛋白傳訊之RSPO3結合劑係抗體h131R011。
在某些實施態樣中，該RSPO結合劑(例如抗體)抑制至少一種RSPO蛋白與受體之結合。在某些實施態樣中，該RSPO結合劑抑制人RSPO蛋白與彼之一或多種受體之結合。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑抑制RSPO蛋白與至少一種LGR蛋白之結合。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑抑制RSPO蛋白與LGR4、LGR5及/或LGR6之結合。在一些實施態樣中，RSPO3結合劑抑制RSPO3與LGR4之結合。在一些實施態樣中，RSPO3結合劑抑制RSPO3與LGR5之結合。在一些實施態樣中，RSPO3結合劑抑制RSPO3與LGR6之結合。在某些實施態樣中，該RSPO結合劑與至少一種LGR蛋白之結合係經抑制至少約10%、至少約25%、至少約50%、至少約75%、至少約90%或至少約95%。在某些實施態樣中，抑制至少一種RSPO與至少一種LGR蛋白結合之RSPO結合劑另抑制β-連環蛋白傳訊。在某些實施態樣中，抑制人RSPO3與至少一種LGR蛋白結合之RSPO3結合劑係抗體131R002、抗體131R003或131R003之變異體。在某些實施態樣中，抑制人RSPO3與至少一種LGR蛋白結合之RSPO3結合劑係人化版本之抗體131R002、抗體131R003或131R003之變異體。在某些實施態樣中，抑制人 RSPO3與至少一種LGR蛋白結合之RSPO3結合劑係抗體h131R006A或抗體h131R006B。在某些實施態樣中，抑制人RSPO3與至少一種LGR蛋白結合之RSPO3結合劑係抗體h131R005/131R007。在某些實施態樣中，抑制人RSPO3與至少一種LGR蛋白結合之RSPO3結合劑係抗體h131R008。在某些實施態樣中，抑制人RSPO3與至少一種LGR蛋白結合之RSPO3結合劑係抗體h131R010。在某些實施態樣中，抑制人RSPO3與至少一種LGR蛋白結合之RSPO3結合劑係抗體h131R011。
在某些實施態樣中，該RSPO結合劑(例如抗體)阻斷至少一種RSPO與受體之結合。在某些實施態樣中，該RSPO結合劑阻斷人RSPO蛋白與彼之一或多種受體之結合。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑阻斷RSPO與至少一種LGR蛋白之結合。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑阻斷至少一種RSPO蛋白與LGR4、LGR5及/或LGR6之結合。在一些實施態樣中，RSPO3結合劑阻斷RSPO3與LGR4之結合。在一些實施態樣中，RSPO3結合劑阻斷RSPO3與LGR5之結合。在一些實施態樣中，RSPO3結合劑阻斷RSPO3與LGR6之結合。在某些實施態樣中，該RSPO結合劑與至少一種LGR蛋白之結合係經阻斷至少約10%、至少約25%、至少約50%、至少約75%、至少約90%或至少約95%。在某些實施態樣中，阻斷至少一種RSPO蛋白與至少一種LGR蛋白結合之RSPO結合劑另抑制β-連環蛋白傳訊。在某些實施態樣 中，阻斷人RSPO3與至少一種LGR蛋白結合之RSPO3結合劑係抗體131R002、抗體131R003或131R003之變異體。在某些實施態樣中，阻斷人RSPO3與至少一種LGR蛋白結合之RSPO3結合劑係人化版本之抗體131R002、抗體131R003或131R003之變異體。在某些實施態樣中，阻斷人RSPO3與至少一種LGR蛋白結合之RSPO3結合劑係抗體h131R006A或抗體h131R006B。在某些實施態樣中，阻斷人RSPO3與至少一種LGR蛋白結合之RSPO3結合劑係抗體h131R005/131R007。在某些實施態樣中，阻斷人RSPO3與至少一種LGR蛋白結合之RSPO3結合劑係抗體h131R008。在某些實施態樣中，阻斷人RSPO3與至少一種LGR蛋白結合之RSPO3結合劑係抗體h131R010。在某些實施態樣中，阻斷人RSPO3與至少一種LGR蛋白結合之RSPO3結合劑係抗體h131R011。
在某些實施態樣中，該RSPO結合劑(例如抗體)抑制β-連環蛋白傳訊。應了解的是，抑制β-連環蛋白傳訊之RSPO結合劑在某些實施態樣中可能抑制β-連環蛋白傳訊途徑中藉由一或多種受體之傳訊，但不一定抑制藉由所有受體之傳訊。在某些選擇性實施態樣中，藉由所有人受體之β-連環蛋白傳訊可能皆被抑制。在某些實施態樣中，藉由選自LGR4、LGR5及LGR6之一或多種受體的β-連環蛋白傳訊係經抑制。在某些實施態樣中，該RSPO結合劑對β-連環蛋白傳訊之抑制係指減少β-連環蛋白傳訊量至少約10%、至少約25%、至少約50%、至 少約75%、至少約90%或至少約95%。在一些實施態樣中，抑制β-連環蛋白傳訊之RSPO3結合劑係抗體131R002、抗體131R003或131R003之變異體。在一些實施態樣中，抑制β-連環蛋白傳訊之RSPO3結合劑係人化版本之抗體131R002、抗體131R003或131R003之變異體。在一些實施態樣中，抑制β-連環蛋白傳訊之RSPO3結合劑係抗體h131R006A或抗體h131R006B。在一些實施態樣中，抑制β-連環蛋白傳訊之RSPO3結合劑係抗體h131R005/131R007。在一些實施態樣中，抑制β-連環蛋白傳訊之RSPO3結合劑係抗體h131R008。在一些實施態樣中，抑制β-連環蛋白傳訊之RSPO3結合劑係抗體h131R010。在一些實施態樣中，抑制β-連環蛋白傳訊之RSPO3結合劑係抗體h131R011。
在某些實施態樣中，該RSPO結合劑(例如抗體)抑制β-連環蛋白之活化。應了解的是，抑制β-連環蛋白之活化的RSPO結合劑在某些實施態樣中可能抑制藉由一或多種受體之β-連環蛋白之活化，但不一定抑制藉由所有受體之β-連環蛋白之活化。在某些選擇性實施態樣中，藉由所有人受體之β-連環蛋白活化可能皆被抑制。在某些實施態樣中，藉由選自LGR4、LGR5及LGR6之一或多種受體的β-連環蛋白活化係經抑制。在某些實施態樣中，該RSPO結合劑對β-連環蛋白活化之抑制係指減少β-連環蛋白活化量至少約10%、至少約25%、至少約50%、至少約75%、至少約90%或至少約95%。在一 些實施態樣中，抑制β-連環蛋白活化之RSPO3結合劑係抗體131R002、抗體131R003或131R003之變異體。在一些實施態樣中，抑制β-連環蛋白活化之RSPO3結合劑係人化版本之抗體131R002、抗體131R003或131R003之變異體。在一些實施態樣中，抑制β-連環蛋白活化之RSPO3結合劑係抗體h131R006A或抗體h131R006B。在一些實施態樣中，抑制β-連環蛋白活化之RSPO3結合劑係抗體h131R005/131R007。在一些實施態樣中，抑制β-連環蛋白活化之RSPO3結合劑係抗體h131R008。在一些實施態樣中，抑制β-連環蛋白活化之RSPO3結合劑係抗體h131R010。在一些實施態樣中，抑制β-連環蛋白活化之RSPO3結合劑係抗體h131R011。
用於測定RSPO結合劑(或候選RSPO結合劑)是否抑制β-連環蛋白傳訊之體內及試管內測定係該領域所知。舉例來說，可使用以細胞為基底之螢光素酶報告試驗測量試管內之β-連環蛋白傳訊量，其利用含有多份TCF結合結構域與下游螢火蟲螢光素酶報告基因之TCF/Luc報告載體(Gazit et al.,1999,Oncogene,18；5959-66；TOPflash,Millipore,Billerica MA)。在一或多種Wnt(例如由轉染細胞表現或由Wnt條件培養基提供之Wnt)存在且有或沒有RSPO蛋白或RSPO條件培養基下，RSPO結合劑存在時之β-連環蛋白傳訊量係與無RSPO結合劑存在時之傳訊量比較。除了TCF/Luc報告子測定之外，RSPO結合劑(或候選劑)對β-連環蛋白傳訊 之影響可於試管內或活體內藉由測量該劑對β-連環蛋白調節基因表現量之影響加以測定，如c-myc(He et al.,1998,Science,281：1509-12)、細胞週期素D1(Tetsu et al.,1999,Nature,398：422-6)及/或纖維粘連蛋白(Gradl et al.1999,Mol.Cell Biol.,19：5576-87)。在某些實施態樣中，RSPO結合劑對β-連環蛋白傳訊之影響亦可能藉由測量該劑對Dishevelled-1、Dishevelled-2、Dishevelled-3、LRP5、LRP6及/或β-連環蛋白之磷酸化狀態的影響檢測。
在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑具有一或多種下列影響：抑制腫瘤細胞增生、抑制腫瘤生長、減少腫瘤之腫瘤發生性、藉由減少腫瘤中癌幹細胞之頻率減少腫瘤之腫瘤發生性、抑制腫瘤生長、刺激腫瘤細胞之細胞死亡、誘導腫瘤中之細胞分化、使致癌細胞分化成非致癌狀態、誘導腫瘤細胞分化標誌之表現、防止腫瘤細胞轉移、減少腫瘤細胞之存活或調節血管生成。
在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑可抑制腫瘤生長。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑可抑制活體內(例如異種移植小鼠模型及/或於罹患癌之人體內)之腫瘤生長。在某些實施態樣中，相較於未經治療之腫瘤，腫瘤生長係經抑制至少約二倍、約三倍、約五倍、約十倍、約50倍、約100倍、或約1000倍。
在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑可減少腫瘤之腫瘤發生性。在某些實施態樣中，該RSPO3結合 劑或抗體可於動物模型諸如小鼠異種移植模型中減少包含癌幹細胞之腫瘤的腫瘤發生性。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑或抗體可藉由減少腫瘤中癌幹細胞之數量或頻率以減少腫瘤之腫瘤發生性。在某些實施態樣中，腫瘤中癌幹細胞之數量或頻率係減少至少約二倍、約三倍、約五倍、約十倍、約50倍、約100倍、或約1000倍。在某些實施態樣中，癌幹細胞之數量或頻率減少係藉由使用動物模型之限制稀釋試驗測定。有關使用限制稀釋試驗以測定腫瘤中癌幹細胞之數量或頻率減少之其他實例及指南可見例如國際公開號WO 2008/042236、美國專利公開號2008/0064049及美國專利公開號2008/0178305。
在某些實施態樣中，此處描述之RSPO3結合劑於小鼠、長尾獼猴(cynomolgus monkey)或人體內具有至少約2小時、至少約5小時、至少約10小時、至少約24小時、至少約3天、至少約1週、或至少約2週之循環半衰期。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑係於小鼠、長尾獼猴或人體內具有至少約2小時、至少約5小時、至少約10小時、至少約24小時、至少約3天、至少約1週、或至少約2週之循環半衰期的IgG(例如IgG1或IgG2)抗體。增加(或減少)劑諸如多肽及抗體之半衰期之方法係該領域所知。舉例來說，增加IgG抗體循環半衰期之已知方法包括導入突變至Fc區，此增加pH 6.0時抗體對新生兒Fc受體(FcRn)之pH依賴性結合(見例如美國專利公開號2005/0276799、2007/0148164及 2007/0122403)。增加缺乏Fc區之抗體片段的循環半衰期之已知方法包括像是PEG化之技術。
在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係多株抗體。多株抗體可利用任何已知之方法製備。在一些實施態樣中，多株抗體係藉由以感興趣之抗原(例如經純化之肽片段、全長重組蛋白或融合蛋白)藉由多重皮下或腹腔內注射之方式免疫動物(例如兔、大鼠、小鼠、山羊、驢)產製。該抗原可任意選擇地與載劑共軛，諸如鑰孔狀帽貝血藍素(KLH)或血清白蛋白。該抗原(不論有無載劑蛋白質)係經無菌鹽水稀釋，且通常與佐劑(例如完全或不完全弗氏(Freund’s)佐劑)組合以形成穩定乳液。在經過足夠時間後，自經免疫之動物(通常是血液或腹水中)回收多株抗體。該多株抗體可根據該領域之標準方法自血清或腹水純化，該等方法包括但不限於親和性層析、離子交換層析、膠體電泳及透析。
在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係單株抗體。單株抗體可利用該領域之技藝人士已知之雜交瘤方法製備(見例如Kohler and Milstein,1975,Nature,256：495-497)。在一些實施態樣中，使用雜交瘤方法係將小鼠、倉鼠或其他適當之宿主動物經上述方法免疫，以誘發產製與該免疫抗原特異性結合之抗體之淋巴細胞。在一些實施態樣中，淋巴細胞可於試管內免疫。在一些實施態樣中，該免疫抗原可為人蛋白質或彼之部分。在一些實施態樣中，該免疫抗原可為小鼠蛋白質或彼之部分。
在免疫後，淋巴細胞係經分離，然後利用例如聚乙二醇與適當之骨髓瘤細胞系融合。該雜交瘤細胞係利用該領域已知之特殊培養基篩選，未融合之淋巴細胞及骨髓瘤細胞在篩選後不會存活。產製特異性拮抗選定抗原之單株抗體之雜交瘤可利用多種方法識別，該等方法包括但不限於免疫沉澱、免疫轉漬及試管內結合試驗(例如流式細胞分析、FACS、ELISA及放射性免疫測定)。該雜交瘤可利用標準方法於試管內增殖(J.W.Goding,1996,Monoclonal Antibodies：Principles and Practice,3 rd Edition,Academic Press,San Diego,CA)，或於動物活體內以腹水腫瘤方式增殖。該單株抗體可根據該領域之標準方法自培養基或腹水液體純化，該等方法包括但不限於親和性層析、離子交換層析、膠體電泳及透析。
在某些實施態樣中，單株抗體可利用該領域之技藝人士已知之重組DNA技術製備。編碼單株抗體之多核苷酸係自成熟B細胞或雜交瘤細胞分離，像是藉由RT-PCR使用寡核苷酸引子以特異性擴增編碼該抗體之重鏈及輕鏈之基因，該等多核苷酸之序列係利用標準技術測定。該經分離之編碼重鏈及輕鏈之多核苷酸接著被選殖至適當表現載體，該載體在轉染至原本不產製免疫球蛋白之宿主細胞諸如大腸桿菌(E.coli)、類人猿COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞後產製單株抗體。
在某些其他實施態樣中，重組單株抗體或彼之片段可自表現所欲物種之可變結構域或CDR之噬菌體 展示庫分離(見例如McCafferty et al.,1990,Nature,348：552-554、Clackson et al.,1991,Nature,352：624-628及Marks et al.,1991,J.Mol.Biol.,222：581-597)。
編碼單株抗體之多核苷酸可藉由例如使用重組DNA技術改質以產製可供選擇之抗體。在一些實施態樣中，例如小鼠單株抗體之輕鏈及重鏈之恆定結構域可被例如人抗體之該些區域取代以產製嵌合抗體，或以非免疫球蛋白多肽取代以產製融合抗體。在一些實施態樣中，該等恆定區係經截短或移除以產製所欲之單株抗體之抗體片段。可變區之定點或高密度突變形成可被用於最佳化單株抗體之特異性、親和性等。
在一些實施態樣中，拮抗人RSPO3之單株抗體係人化抗體。通常，人化抗體係其中源自CDR之殘基經源自具有所欲特異性、親和性及/或結合能力之非人物種(例如小鼠、大鼠、兔、倉鼠等)之CDR的殘基取代之人免疫球蛋白，該取代係利用該領域之技藝人士已知之方法進行。在一些實施態樣中，人免疫球蛋白之Fv架構區殘基係由具有所欲特異性、親和性及/或結合能力之非人物種之抗體的對應殘基取代。在一些實施態樣中，人化抗體可進一步藉由取代Fv架構區及/或該經取代之非人殘基內之額外殘基加以修飾，以精進優化抗體特異性、親和性及/或能力。通常，人化抗體將包含實質上所有之至少一個且通常兩或三個可變結構域，該可變結構域包含所有或實質上所有之對應該非人免疫球蛋白之CDR，然而所 有或實質上所有之架構區係具有人免疫球蛋白共同序列之架構區。在一些實施態樣中，人化抗體亦可包含至少部分之免疫球蛋白恆定區或恆定結構域(Fc)，通常為人免疫球蛋白之該部分。在某些實施態樣中，該等人化抗體係用於治療用途，因為當投予至人個體時它們可能減少抗原性及HAMA(人抗小鼠抗體)反應。該領域之技藝人士將能遵循已知技術獲得具有減少免疫原性之功能性人化抗體(見例如美國專利第5,225,539、5,585,089、5,693,761及5,693,762號)。
在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑係人抗體。人抗體可利用該領域已知之多種技術直接製備。在一些實施態樣中，人抗體可自試管內免疫之永生化人B淋巴細胞產製或自經免疫之個體分離之淋巴細胞產製。不論何種情況，產製直接拮抗標靶抗原之抗體的細胞可被製造及分離(見例如Cole et al.,1985,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77；Boemer et al.,1991,J.Immunol.,147：86-95；及美國專利第5,750,373、5,567,610及5,229,275號)。在一些實施態樣中，該人抗體可選自噬菌體分子庫，其中該噬菌體分子庫表現人抗體(Vaughan et al.,1996,Nature Biotechnology,14：309-314；Sheets et al.,1998,PNAS,95：6157-6162；Hoogenboom and Winter,1991,J.Mol.Biol.,227：381；Marks et al.,1991,J.Mol.Biol.,222：581)。或者，噬菌體展示技術可被用來自未經免疫接種之捐贈者的免疫球蛋白 可變區結構域基因庫試管內產製人抗體及抗體片段。產製及使用抗體噬菌體庫之技術亦描述於美國專利第5,969,108、6,172,197、5,885,793、6,521,404、6,544,731、6,555,313、6,582,915、6,593,081、6,300,064、6,653,068、6,706,484及7,264,963號，及Rothe et al.,2008,J.Mol.Bio.,376：1182-1200。一旦抗體係經識別，該領域已知之親和性成熟策略包括但不限於鏈洗牌(chain shuffling)(Marks et al.,1992,Bio/Technology,10：779-783)及定點突變形成可被用於產製高親和性人抗體。
在一些實施態樣中，人抗體可於包含人免疫球蛋白基因座之基因轉殖小鼠中製備。經免疫後，這些小鼠可產製整套人抗體而不產製內源性免疫球蛋白。此方法係於美國專利第5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425及5,661,016號中描述。
本發明亦包含特異性識別至少一種人RSPO蛋白之雙特異性抗體。雙特異性抗體可特異性辨識及結合至少二種不同抗原或表位。該等不同的表位可位於相同分子內(例如二個表位位於人RSPO3上)或位於不同分子上(例如一表位位於RSPO3上，一表位位於RSPO2上)。在一些實施態樣中，雙特異性抗體相較於個別抗體或超過一種抗體之組合具有增強之效力。在一些實施態樣中，雙特異性抗體相較於個別抗體或超過一種抗體之組合具有減少之毒性。該領域之技藝人士已知的是任何結合劑 (例如抗體)可能具有獨特之藥物動力學(PK)(例如循環半衰期)。在一些實施態樣中，雙特異性抗體具有同步兩種活性結合劑之PK之能力，其中該兩種個別結合劑具有不同PK特性。在一些實施態樣中，雙特異性抗體具有集中兩種結合劑(例如抗體)之作用於相同區域(例如腫瘤及/或腫瘤微環境)之能力。在一些實施態樣中，雙特異性抗體具有集中兩種結合劑(例如抗體)之作用於相同標靶(例如腫瘤及/或腫瘤細胞)之能力。在一些實施態樣中，雙特異性抗體具有使兩種結合劑(例如抗體)之作用以超過一種生物途徑或功能為標靶之能力。
在某些實施態樣中，該雙特異性抗體與RSPO3及第二標靶特異性結合。在某些實施態樣中，該雙特異性抗體與RSPO3及第二人RSPO(例如RSPO1、RSPO2或RSPO4)特異性結合。在某些實施態樣中，該雙特異性抗體與RSPO3及RSPO2特異性結合。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體係單株抗體。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體係人化抗體。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體係人抗體。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體係IgG1抗體。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體係IgG2抗體。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體具有減少之毒性及/或不良反應。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體相較於二種個別抗體之混合物或作為單一劑之抗體具有減少之毒性及/或不良反應。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體具有增加之治療指數。在一些實施態樣 中，該雙特異性抗體相較於二種個別抗體之混合物或作為單一劑之抗體具有增加之治療指數。
在一些實施態樣中，該等抗體可特異性辨識及結合第一抗原標靶(例如RSPO3)及第二抗原標靶，像是在淋巴細胞上之效應分子(例如CD2、CD3、CD28、CTLA-4、CD80或CD86)或Fc受體(例如CD64、CD32或CD16)以使細胞性防禦機制集中於表現及/或產製第一抗原標靶之細胞。在一些實施態樣中，該等抗體可被用於引導細胞毒性劑至表現特定標靶抗原之細胞。這些抗體具有抗原結合臂及與細胞毒性劑或放射性核種螯合劑諸如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA結合之臂。
用於製備雙特異性抗體之技術係該領域之技藝人士所知，見例如Millstein et al.,1983,Nature,305：537-539；Brennan et al.,1985,Science,229：81；Suresh et al.,1986,Methods in Enzymol.,121：120；Traunecker et al.,1991,EMBO J.,10：3655-3659；Shalaby et al.,1992,J.Exp.Med.,175：217-225；Kostelny et al.,1992,J.Immunol.,148：1547-1553；Gruber et al.,1994,J.Immunol.,152：5368；美國專利第5,731,168號；國際公開號WO 2009/089004及美國專利公開號2011/0123532。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體包含在兩個重鏈之間的介面部分具有胺基酸修飾之重鏈恆定區。在一些實施態樣中，該等雙特異性抗體可利用「突點對應孔洞」策略產製(見例如美國專利第5,731,168號；Ridgway et.al.,1996, Prot.Engin.,9：617-621)。有時候，「突點」及「孔洞」之用語係以「隆突」及「空腔」取代。在一些實施態樣中，該雙特異性抗體可能包含無法在重鏈之間形成雙硫鍵接之變異絞鏈區(見例如WO 2006/028936)。在一些實施態樣中，該等修飾可能包含胺基酸之改變，該等胺基酸之改變導致不同之靜電交互作用。在一些實施態樣中，該等修飾可能包含胺基酸之改變，該等胺基酸之改變導致不同之疏水性/親水性交互作用。
雙特異性抗體可為完整抗體或包含抗原結合部位之抗體片段。本發明亦考慮超過兩價之抗體。例如，可製備三特異性抗體(Tutt et al.,1991,J.Immunol.,147：60)。因此，在某些實施態樣中，拮抗RSPO3之抗體係多特異性。
在某些實施態樣中，此處描述之抗體(或其他多肽)可為單特異性。在某些實施態樣中，抗體所包含之一或多個抗原結合部位之各者係能結合RSPO蛋白上之同源性表位。在某些實施態樣中，此處所述之單特異性抗體的抗原結合部位能結合例如RSPO3及RSPO2(即在RSPO3及RSPO2蛋白上皆能發現的相同表位)。
在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體片段。抗體片段可具有與完整抗體不同之功能或能力，例如抗體片段可具有增加之腫瘤穿透。已知用於產製抗體片段之各種技術包括但不限於完整抗體之蛋白水解消化。在一些實施態樣中，抗體片段包括由胃蛋白酶消化抗體分子 所產製之F(ab')2片段。在一些實施態樣中，抗體片段包括藉由減少F(ab')2片段之雙硫鍵所產製之Fab片段。在其他實施態樣中，抗體片段包括藉由以木瓜酶及還原劑處理抗體分子所產製之Fab片段。在某些實施態樣中，抗體片段係經重組產製。在一些實施態樣中，抗體片段包括Fv或單鏈Fv(scFv)片段。Fab、Fv及scFv抗體片段可在大腸桿菌或其他宿主細胞中表現及分泌，允許大量產製這些片段。在一些實施態樣中，抗體片段係自如此處討論之抗體噬菌體庫分離。舉例來說，可利用方法建構Fab表現庫(Huse et al.,1989,Science,246：1275-1281)以允許快速有效地識別對RSPO蛋白或彼之衍生物、片段、類似物或同源物具有所欲特異性之單株Fab片段。在一些實施態樣中，抗體片段係線性抗體片段。在某些實施態樣中，抗體片段係單特異性或雙特異性。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑係scFv。各種技術可被用於產製對一或多種人RSPO具有特異性之單鏈抗體(見例如美國專利第4,946,778號)。
另外尤其以抗體片段來說所欲的是，修飾抗體以改變(例如增加或減少)彼之血清半衰期。此可藉由例如使抗體片段中之適當區域發生突變以納入救援受體結合表位至抗體片段中達成，或藉由將該表位納入肽標籤中然後使該肽標籤與抗體片段之末端或中間融合(例如藉由DNA或肽合成)達成。
異源共軛抗體亦屬於本發明之範圍內。異源 共軛抗體係由二個共價連接之抗體組成。該等抗體被計劃用於例如使免疫細胞以非所欲之細胞為標靶(見例如美國專利第4,676,980號)。亦考慮到該等異源共軛抗體可利用已知之合成蛋白質化學方法於試管內製備，包括該些涉及交聯劑之方法。舉例來說，免疫毒素可利用雙硫交換反應或藉由形成硫醚鍵加以建構。為達此目的之適當試劑實例包括亞胺基硫醇鹽及甲基-4-巰基丁亞胺酸酯。
就本發明之目的而言，應了解的是經改質之抗體可包含任何類型之提供該抗體與標靶(即人RSPO3)連接之可變區。在這方面，該可變區可包含或衍生自任何種類之可被誘導以啟動體液性反應及產製拮抗該所欲抗原之免疫球蛋白之哺乳動物。因此，該經改質之抗體之可變區可為例如人、小鼠、非人靈長動物(例如長尾獼猴(cynomolgus monkey)、獼猴等)或兔來源。在一些實施態樣中，該經改質之免疫球蛋白之可變區及恆定區皆為人來源。在其他實施態樣中，相容性抗體之可變區(通常源自非人來源)可經工程化或特別改質以促進該分子之結合特性或減少免疫原性。在這方面，可用於本發明之可變區可經人化或藉由納入輸入胺基酸序列以另行改變。
在某些實施態樣中，重鏈及輕鏈之可變結構域係藉由至少部分取代一或多個CDR及(若需要的話)部分取代架構區及序列修飾及/或改變加以改變。雖然CDR可能源自與架構區來源之抗體相同類型或甚至相同亞型之抗體，一般設想CDR可能源自不同類型之抗體且通 常源自不同物種之抗體。要轉移一可變結構域之抗原結合能力至另一可變結構域不一定需要將所有CDR取代成捐贈者可變區之所有CDR。相反地，可能只需要轉移該些維持抗原結合部位之活性所需之殘基即可。
儘管對可變區進行改變，該領域之技藝人士將了解，本發明之經改質之抗體將包含其中至少部分之一或多個恆定結構域已被刪除或以其他方式改變之抗體(例如全長抗體或彼之免疫反應性片段)以提供所欲之生化特徵，像是相較於包含原始或未經改變之恆定區之大約相同免疫原性之抗體具有增加之腫瘤定位或增加之血清半衰期。在一些實施態樣中，該經改質之抗體之恆定區將包含人恆定區。與本發明相容之恆定區修飾包含添加、刪除或取代一或多個結構域中之一或多個胺基酸。此處所揭示之經改質之抗體可能包含對三個重鏈恆定結構域之一或多者(CH1、CH2或CH3)及/或對輕鏈恆定結構域(CL)之改變或修飾。在一些實施態樣中，一或多個結構域係自該經改質之抗體的恆定區部分或全部刪除。在一些實施態樣中，該經改質之抗體將包含其中整個CH2結構域被移除之結構域刪除建構體或變異體(△CH2建構體)。在一些實施態樣中，該缺少之恆定區結構域係由短胺基酸間隔子(例如10個胺基酸殘基)取代，以提供通常由該缺少恆定區授予之一些分子柔韌性。
在一些實施態樣中，該經改質之抗體係經工程化以直接融合CH3結構域與該抗體之絞鏈區。在其他 實施態樣中，肽間隔子被插入絞鏈區與經修飾之CH2及/或CH3結構域之間。舉例來說，其中CH2結構域被刪除且剩餘之CH3結構域(經修飾或未經修飾)係以5至20個胺基酸間隔子與絞鏈區連接之建構體可被表現。該間隔子可被添加以確保恆定區之調節元件維持自由及可接近，或該絞鏈區維持可彎折。然而，應注意胺基酸間隔子在一些情況中可能證實具有免疫原性，且誘發拮抗該建構體之非所欲免疫反應。因此，在某些實施態樣中，任何添加至建構體之間隔子將為相對非免疫原性，以維持該經改質之抗體之所欲生物性質。
在一些實施態樣中，該經改質之抗體可能僅具有部分建構體結構域刪除或取代少數或甚至單一個胺基酸。舉例來說，在CH2結構域之選擇區域中之單一胺基酸突變可能足以實質上減少Fc結合，因此增加癌細胞定位及/或腫瘤穿透。類似地，可能可行的是單純刪除該一或多個恆定區結構域中控制所欲調節之特定效應功能(例如補體C1q結合)之部分。該恆定區之部分刪除可增進該抗體之選擇特性(血清半衰期)，同時保留其他與該主題恆定區結構域完整有關之所欲功能。另外，如上所述，該揭示抗體之恆定區可經由一或多個胺基酸之突變或取代改質以增進該形成建構物之特性。在這方面可能擾亂由保守性結合位點所提供之活性(例如Fc結合)，然而實質上維持該經改質之抗體的構造及免疫原性特性。在某些實施態樣中，該經改質之抗體包含添加一或多個胺基酸至恆定 區以增進所欲特徵諸如減少或增加效應功能或提供更多細胞毒素或碳水化合物連接位點。
該領域已知的是恆定區媒介數種效應功能。舉例來說，補體之C1成分與(結合至抗原之)IgG或IgM抗體之Fc區結合活化該補體系統。補體活化於細胞病原體之調理作用及溶解中至為重要。補體活化亦刺激發炎反應，且亦與自體免疫超敏性有關。此外，抗體之Fc區可與表現Fc受體(FcR)之細胞結合。有一些Fc受體對不同類型之抗體具有特異性，包括IgG(γ受體)、IgE(ε受體)、IgA(α受體)及IgM(μ受體)。抗體與細胞表面上之Fc受體結合引發多種重要且多變之生物反應，包括吞噬及破壞抗體包覆顆粒、清空免疫複合物、藉由殺手細胞溶解經抗體包覆之標靶細胞(稱為抗體依賴性細胞細胞毒性或ADCC)、釋放發炎介質、胚胎轉移及控制免疫球蛋白之產製。
在某些實施態樣中，該經改質之抗體具有經改變之效應功能，該經改變之效應功能因此影響該投予抗體之生物特性。舉例來說，在一些實施態樣中，刪除或不活化(經由點突變或其他方法)恆定區結構域可能減少循環中經改質之抗體與Fc受體結合，因此增加癌細胞定位及/或腫瘤穿透。在其他實施態樣中，恆定區修飾增加抗體之血清半衰期。在其他實施態樣中，恆定區修飾減少抗體之血清半衰期。在一些實施態樣中，恆定區係經修飾以消除雙硫鍵或寡糖基團。根據本發明之恆定區修飾可利用 廣為周知之生化或分子工程技術輕易進行。
在某些實施態樣中，屬於抗體之RSPO3結合劑不具有一或多種效應功能。例如在一些實施態樣中，該抗體不具ADCC活性及/或不具補體依賴性細胞毒性(CDC)活性。在某些實施態樣中，該抗體不與Fc受體及/或補體因子結合。在某些實施態樣中，該抗體不具效應功能。
本發明另包含實質上與此處前述之嵌合抗體、人化抗體、人抗體或彼等之抗體片段同源之變異體及相等物。這些可包含例如保守性取代突變，即以類似胺基酸取代一或多個胺基酸。例如，保守性取代係指以同一大類之胺基酸取代另一胺基酸，像是例如以一酸性胺基酸取代另一酸性胺基酸、以一鹼性胺基酸取代另一鹼性胺基酸或以一中性胺基酸取代另一中性胺基酸。保守性胺基酸取代之目的係該領域廣為周知並於此處描述。
因此，本發明提供產製與RSPO3結合之抗體之方法，包括與RSPO3及第二標靶(如人RSPO)特異性結合之雙特異性抗體。在一些實施態樣中，用於產製與RSPO3結合之抗體之方法包含利用雜交瘤技術。在一些實施態樣中，提供用於產製與人RSPO3結合之抗體之方法。在一些實施態樣中，該方法包含使用人RSPO3之胺基酸22至272。在一些實施態樣中，該方法包含使用SEQ ID NO：3之胺基酸22至272。在一些實施態樣中，用於產製與RSPO3結合之抗體之方法包含篩選人噬菌體 庫。本發明另提供識別與RSPO3結合之抗體之方法。在一些實施態樣中，該抗體係藉由FACS篩選與RSPO3或彼之部分之結合加以識別。在一些實施態樣中，該抗體係藉由FACS篩選與RSPO3及第二RSPO或彼等之部分之結合加以識別。在一些實施態樣中，該抗體係藉由FACS篩選與RSPO3及RSPO2或彼等之部分之結合加以識別。在一些實施態樣中，該抗體係藉由利用ELISA篩選與RSPO3之結合加以識別。在一些實施態樣中，該抗體係藉由利用ELISA篩選與RSPO3及第二RSPO之結合加以識別。在一些實施態樣中，該抗體係藉由利用ELISA篩選與RSPO3及RSPO2結合加以識別。在一些實施態樣中，該抗體係藉由FACS篩選RSPO3與人LGR蛋白結合之阻斷加以識別。在一些實施態樣中，該抗體係藉由篩選對β-連環蛋白傳訊之抑制或阻斷加以識別。
在一些實施態樣中，產製抗人RSPO3蛋白之抗體之方法包含以包含人RSPO3之胺基酸22至272之多肽免疫哺乳動物。在一些實施態樣中，產製抗人RSPO3蛋白之抗體之方法包含以包含至少部分之人RSPO3之胺基酸22至272的多肽免疫哺乳動物。在一些實施態樣中，該方法另包含自該哺乳動物分離抗體或抗體產製細胞。在一些實施態樣中，產製與RSPO3蛋白結合之單株抗體之方法包含：(a)以包含至少部分之人RSPO3之胺基酸22至272的多肽免疫哺乳動物；(b)自該免疫哺乳動物分離抗體產製細胞；(c)融合該抗體產製細胞與骨 髓瘤細胞系之細胞以形成雜交瘤細胞。在一些實施態樣中，該方法另包含(d)篩選表現與RSPO3蛋白結合之抗體之雜交瘤細胞。在一些實施態樣中，該至少部分之人RSPO3之胺基酸22至272係選自SEQ ID NO：5至8。在一些實施態樣中，該至少部分之人RSPO3之胺基酸22至272係SEQ ID NO：5。在一些實施態樣中，該至少部分之人RSPO3之胺基酸22至272係SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7。在一些實施態樣中，該至少部分之人RSPO3之胺基酸22至272係SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：7。在某些實施態樣中，該哺乳動物係小鼠。在一些實施態樣中，該抗體係利用包含至少部分之人RSPO3之胺基酸22至272的多肽篩選。在某些實施態樣中，包含至少部分之人RSPO3之胺基酸22至272的用於篩選之多肽係選自SEQ ID NO：5至8。在一些實施態樣中，該抗體與RSPO3及至少一種其他RSPO蛋白結合。在某些實施態樣中，該至少一種其他RSPO蛋白係選自RSPO1、RSPO2及RSPO4。在某些實施態樣中，該抗體與RSPO3及RSPO1結合。在某些實施態樣中，該抗體與RSPO3及RSPO2結合。在某些實施態樣中，該抗體與RSPO3及RSPO4結合。在某些實施態樣中，該抗體與RSPO3、RSPO1及RSPO2結合。在某些實施態樣中，該抗體與RSPO3、RSPO1及RSPO4結合。在某些實施態樣中，該抗體與RSPO3、RSPO2及RSPO4結合。在一些實施態樣中，該抗體與人RSPO3及小鼠RSPO3兩者結合。
在一些實施態樣中，由此處所述之方法產製之抗體係RSPO拮抗劑，特別是RSPO3拮抗劑。在一些實施態樣中，由此處所述之方法產製之抗體抑制β-連環蛋白傳訊。
在一些實施態樣中，產製抗至少一種人RSPO蛋白之抗體的方法包含利用包含單一抗原結合部位之膜結合性異二聚體分子識別抗體。在一些非限制性實施態樣中，該抗體係利用國際專利公開號WO 2011/100566所述之方法及多肽識別。
在一些實施態樣中，產製抗至少一種人RSPO蛋白之抗體的方法包含在抗體表現庫中篩選與人RSPO蛋白結合之抗體。在一些實施態樣中，該抗體表現庫係噬菌體庫。在一些實施態樣中，該篩選包含篩選(panning)。在一些實施態樣中，該抗體表現庫係噬菌體庫。在一些實施態樣中，該抗體表現庫係哺乳動物細胞庫。在一些實施態樣中，該抗體表現庫係利用至少部分之人RSPO3之胺基酸22至272篩選。在一些實施態樣中，在第一次篩選中被識別之抗體，再次利用不同的RSPO蛋白篩選，藉以識別與RSPO3及第二RSPO蛋白結合之抗體。在某些實施態樣中，包含至少部分之人RSPO3之胺基酸22至272的用於篩選之多肽係選自SEQ ID NO：5至8。在一些實施態樣中，在篩選中識別之抗體與RSPO3及至少一種其他RSPO蛋白結合。在某些實施態樣中，該至少一種其他RSPO蛋白係選自RSPO1、RSPO2及 RSPO4。在某些實施態樣中，在篩選中識別之抗體與RSPO3及RSPO1結合。在某些實施態樣中，在篩選中識別之抗體與RSPO3及RSPO2結合。在某些實施態樣中，在篩選中識別之抗體與RSPO3及RSPO4結合。在一些實施態樣中，在篩選中識別之抗體與人RSPO3及小鼠RSPO3兩者結合。在一些實施態樣中，在篩選中被識別之抗體係RSPO3拮抗劑。在一些實施態樣中，在篩選中被識別之抗體抑制由RSPO3誘導之β-連環蛋白傳訊。
在某些實施態樣中，此處所述之抗體係經分離。在某些實施態樣中，此處所述之抗體係實質上純的。
在本發明之一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係多肽。該多肽可為包含與RSPO3結合之抗體或彼之片段之重組多肽、天然多肽或合成多肽。該領域將同意本發明的一些胺基酸序列可變化而不會對該蛋白質之結構或功能造成顯著影響。因此，本發明另包括多肽之變異體，該變異體顯示拮抗人RSPO3之抗體或彼之片段的實質活性或包括該抗體或彼之片段的區域。在一些實施態樣中，RSPO結合多肽之胺基酸序列變異體包括刪除、插入、倒位、重複及/或其他類型之取代。
在某些實施態樣中，此處所述之多肽係經分離。在某些實施態樣中，此處所述之多肽係實質上純的。
該多肽、類似物及彼等之變異體可另經改質以包含正常非該多肽之部分的額外化學基團。該等衍生化基團可增進或以其他方式調節該多肽之溶解性、生物半衰 期及/或吸收。該等基團亦可減少或消除該多肽及變異體之非所欲之不良反應。有關化學基團之介紹可見Remington：The Science and Practice of Pharmacy,22 st Edition,2012,Pharmaceutical Press,London。
此處所述之多肽可藉由該領域已知之任何適當方法產製。該等方法從直接蛋白質合成方法至建構編碼多肽序列之DNA序列及在適當宿主中表現該等序列皆可。在一些實施態樣中，DNA序列係利用重組技術建構，其藉由分離或合成編碼感興趣之野生型蛋白質之DNA序列。可任意選擇地，該序列可藉由定點突變形成突變以提供彼之功能性類似物。見例如Zoeller et al.,1984,PNAS,81：5662-5066及美國專利第4,588,585號。
在一些實施態樣中，編碼感興趣之多肽之DNA序列可藉由化學合成利用寡核苷酸合成器建構。寡核苷酸可根據該所欲多肽之胺基酸序列設計，並選擇該些將產製感興趣重組多肽之宿主細胞所偏好之密碼子。標準方法可被用於合成編碼經分離之感興趣多肽之多核苷酸序列。舉例來說，完全胺基酸序列可被用於建構反轉譯基因。另外，可合成包含編碼經分離之特定多肽之核苷酸序列之DNA寡聚體。例如，多個編碼該所欲多肽之部分的小型寡核苷酸可被合成然後連接。個別寡核苷酸通常包含5'或3'懸端以用於互補組裝。
一經組裝(藉由合成、定點突變形成或其他方法)，該編碼感興趣之特定多肽之多核苷酸序列可被插 入表現載體並可操作性連接適合該蛋白質於所欲宿主內表現之表現控制序列。適當組裝可藉由核苷酸定序、限制酶定位及/或於適當宿主內表現生物活性多肽證實。如該領域所廣為周知，為了在宿主內獲得高表現量之經轉染之基因，該基因必須可操作性連接在選定之表現宿主內具功能性之轉錄及轉譯表現控制序列。
在某些實施態樣中，重組表現載體被用於擴增及表現拮抗人RSPO3之DNA編碼抗體或彼之片段。舉例來說，重組表現載體可為可複製之DNA建構體，其具有與適當轉錄及/或轉譯調節元件可操作性連接之編碼RSPO結合劑(諸如抗RSPO抗體或彼之片段)之多肽鏈的合成性或cDNA衍生性DNA片段，該調節元件係源自哺乳動物、微生物、病毒或昆蟲基因。轉錄單位通常包含下列之組合：(1)於基因表現中具有調節作用之基因元件，例如轉錄啟動子或增強子，(2)經轉錄成mRNA然後轉譯成蛋白質之結構或編碼序列，及(3)適當之轉錄及轉譯啟動及終止序列。調節元件可包括操作子序列以控制轉錄。通常由複製起點授予之於宿主內複製之能力及有利轉形物辨識之選擇基因可被額外納入。DNA區係「可操作性連接」當它們彼此之間係功能性相關。舉例來說，信號肽之DNA(分泌前導序列)係可操作性連接多肽之DNA，若其被表現為參與該多肽分泌之前體；啟動子係可操作性連接編碼序列，若其控制該序列之轉錄；或核糖體結合位點係可操作性連接編碼序列，若其位置係為了允許 轉譯。在一些實施態樣中，適用於酵母菌表現系統之結構元件包括使宿主細胞得以胞外分泌經轉譯之蛋白質之前導序列。在其他實施態樣中，當重組蛋白質係於無前導或轉運序列存在時表現之情況中，其可包括N端甲硫胺酸殘基。此殘基之後可任意選擇地與該經表現之重組蛋白質切開以提供最終產物。
表現控制序列及表現載體之選擇取決於宿主選擇。多樣化之表現宿主/載體組合可被採用。可用於真核宿主之表現載體包括例如包含源自SV40、牛乳頭狀瘤病毒、腺病毒及巨細胞病毒之表現控制序列之載體。可用於細菌宿主之表現載體包括已知之細菌質體，像是源自大腸桿菌之質體(包括pCR1、pBR322、pMB9及彼等之衍生物)，及廣泛宿主範圍質體像是M13及其他絲狀單股DNA噬菌體。
本發明之RSPO結合劑(例如多肽或抗體)可由一或多個載體表現。例如在一些實施態樣中，一重鏈多肽係由一載體表現，第二重鏈多肽係由第二載體表現，且輕鏈多肽係由第三載體表現。在一些實施態樣中，第一重鏈多肽及輕鏈多肽係由一載體表現，且第二重鏈多肽係由第二載體表現。在一些實施態樣中，二條重鏈多肽係由一載體表現，且輕鏈多肽係由第二載體表現。在一些實施態樣中，三條多肽係由一載體表現。因此，在一些實施態樣中，第一重鏈多肽、第二重鏈多肽及輕鏈多肽係由單一載體表現。
用於表現RSPO3結合多肽或抗體(或用來作為抗原之RSPO蛋白)之適當宿主細胞包括原核生物、酵母菌細胞、昆蟲細胞或在適當啟動子控制下之高級真核細胞。原核生物包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性有機體，例如大腸桿菌(E.coli)或桿菌(Bacillus)。高級真核細胞包括如下所述之哺乳動物來源之株化細胞系。不含細胞之轉譯系統亦可被採用。用於細菌性、真菌性、酵母菌性及哺乳動物細胞性宿主之適當選殖及表現載體係描述於Pouwels et al.,1985,Cloning Vectors：A Laboratory Manual,Elsevier,New York,NY。有關蛋白質產製(包括抗體產製)方法之額外資訊可見於例如美國專利公開號2008/0187954；美國專利第6,413,746、6,660,501號；及國際專利公開號WO 04/009823。
多種哺乳動物細胞培養系統可被用於表現重組多肽。於哺乳動物細胞中表現重組蛋白質係為所欲，因為這些蛋白質通常經過正確折疊、適當改質且具生物功能性。適當哺乳動物宿主細胞系之實例包括但不限於COS-7(猴腎來源)、L-929(小鼠纖維母細胞來源)、C127(小鼠乳房腫瘤來源)、3T3(小鼠纖維母細胞來源)、CHO(中國倉鼠卵巢來源)、HeLa(人子宮頸癌來源)、BHK(倉鼠腎纖維母細胞來源)、HEK-293(人胚胎腎來源)細胞系及彼等之變異株。哺乳動物表現載體可包含非轉錄元件(諸如複製起點、與所欲表現之基因相連之適當啟動子及增強子，及其他5'或3'側翼非轉錄序列)及5'或 3'非轉譯序列(諸如必要之核糖體結合位點、聚腺苷酸化位點、剪接供點及受點，及轉錄終止序列)。
於昆蟲細胞培養系統(例如桿狀病毒)中表現重組蛋白質亦提供產製正確摺疊及具生物功能之蛋白質之有效方法。用於在昆蟲細胞中產製異源性蛋白質之桿狀病毒系統係該領域之技藝人士所廣為周知(見例如Luckow and Summers,1988,Bio/Technology,6：47)。
因此，本發明提供包含此處所述之RSPO3結合劑之細胞。在一些實施態樣中，該等細胞產製此處所述之RSPO3結合劑。在某些實施態樣中，該等細胞產製抗體。在一些實施態樣中，該等細胞產製與人RSPO3結合之抗體。在某些實施態樣中，該等細胞產製抗體131R002。在某些實施態樣中，該等細胞產製抗體131R003。在某些實施態樣中，該等細胞產製抗體131R003之變異體。在某些實施態樣中，該等細胞產製人化版本之抗體131R002、抗體131R003或抗體131R003之變異體。在一些實施態樣中，該等細胞產製嵌合版本之抗體131R002、抗體131R003或抗體131R003之變異體。在一些實施態樣中，該等細胞產製抗體h131R006A或抗體h131R006B。在一些實施態樣中，該等細胞產製抗體h131R005/131R007。在一些實施態樣中，該等細胞產製抗體h131R008。在一些實施態樣中，該等細胞產製抗體h131R010。在一些實施態樣中，該等細胞產製抗體h131R011。在一些實施態樣中，該等細胞產製與RSPO3 結合之雙特異性抗體。在一些實施態樣中，該等細胞產製與RSPO3及RSPO2結合之雙特異性抗體。在一些實施態樣中，該細胞係雜交瘤細胞。在一些實施態樣中，該細胞係哺乳動物細胞。在一些實施態樣中，該細胞係原核細胞。在一些實施態樣中，該細胞係真核細胞。
由經轉形之宿主產製之蛋白質可根據任何適當方法純化。標準方法包括層析(例如離子交換、親和性及尺寸柱層析)、離心、差別溶解或藉由任何其他用於蛋白質純化之標準技術。親和性標籤諸如六組胺酸、麥芽糖結合結構域、流感外套序列及麩胱甘肽-S-轉移酶可被連接至該蛋白質以允許藉由通過適當親和性管柱之輕易純化。用於純化免疫球蛋白之親和性層析可包括蛋白質A、蛋白質G及蛋白質L層析。經分離之蛋白質可經物理特徵化，使用像是蛋白水解、大小排除層析(SEC)、質譜分析(MS)、核磁共振(NMR)、等電點沉澱(IEF)、高效液相層析(HPLC)及x光結晶之技術。經分離之蛋白質之純度可利用該領域之技藝人士已知之技術測定，該等技術包括但不限於SDS-PAGE、SEC、毛細管膠體電泳、IEF及毛細管等電點沉澱(cIEF)。
在一些實施態樣中，源自分泌重組蛋白質至培養基之表現系統的上清液可利用商用蛋白質濃縮過濾器先行濃縮，例如使用阿密康(Amicon)或密里博(Millipore)Pellicon超過濾單位濃縮。在濃縮步驟之後，該濃縮液可被加至適當純化基材。在一些實施態樣 中，可採用陰離子交換樹脂，例如具有二乙基胺基乙基(DEAE)懸掛基團之基材或基質。該基材可為丙烯醯胺、洋菜糖、葡聚糖、纖維素或其他常用於蛋白質純化之基材。在一些實施態樣中，可採用陽離子交換步驟。適當之陽離子交換基材包括包含磺丙基或羧甲基之各種不可溶基材。在一些實施態樣中，可採用羥磷灰石基質，包括但不限於陶瓷羥磷灰石(CHT)。在某些實施態樣中，一或多種應用疏水性逆相HPLC基質(例如具有懸掛甲基或其他脂肪族基團之矽膠)之逆相HPLC步驟可被採用以進一步純化重組蛋白質(例如RSPO3結合劑)。上述之一些或所有純化步驟之各種組合可被應用以提供均質性重組蛋白質。
在一些實施態樣中，異二聚體蛋白質諸如雙特異性抗體係根據此處所述之任何方法純化。在一些實施態樣中，抗RSPO雙特異性抗體係利用至少一種層析步驟分離及/或純化。在一些實施態樣中，該至少一種層析步驟包含親和性層析。在一些實施態樣中，該至少一種層析步驟另包含陰離子交換層析。在一些實施態樣中，該經分離及/或純化之抗體產物包含至少90%之異二聚抗體。在一些實施態樣中，該經分離及/或純化之抗體產物包含至少95%、96%、97%、98%或99%之異二聚抗體。在一些實施態樣中，該經分離及/或純化之抗體產物包含大約100%之異二聚抗體。
在一些實施態樣中，於細菌培養中生產之重 組蛋白質可被分離，例如藉由自細胞團塊初步萃取，接著進行一或多次濃縮、鹽析、水性離子交換或大小排除層析步驟。HPLC可被使用於最終純化步驟。用於表現重組蛋白質之微生物細胞可藉由任何方便方法破碎，包括冷凍解凍循環、超音波震盪、機械破碎或使用細胞溶解劑。
該領域已知之用於純化抗體及其他蛋白質之方法亦包括例如該些於美國專利公開號2008/0312425、2008/0177048及2009/0187005所述者。
在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑係非抗體之多肽。用於識別及產製以高親和性與蛋白質標靶結合之非抗體多肽之各種方法係該領域所知。見例如Skerra,2007,Curr.Opin.Biotechnol.,18：295-304；Hosse et al.,2006,Protein Science,15：14-27；Gill et al.,2006,Curr.Opin.Biotechnol.,17：653-658；Nygren,2008,FEBS J.,275：2668-76；及Skerra,2008,FEBS J.,275：2677-83。在某些實施態樣中，噬菌體或哺乳動物細胞展示技術可被用於生產及/或識別RSPO3結合多肽。在某些實施態樣中，該多肽包含選自蛋白A、蛋白G、脂質運載蛋白(lipocalin)、纖維粘連蛋白結構域、錨蛋白(ankyrin)共同重複結構域或硫氧還蛋白類型之蛋白質支架。
在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑或抗體可以數種共軛(即免疫共軛物或放射共軛物)或非共軛形式之任一者被使用。在某些實施態樣中，該等抗體可以非共軛形式被使用以駕馭個體之天然防禦機制，包括補體依 賴性細胞毒性及抗體依賴性細胞毒性，以消滅惡性或癌細胞。
在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑(例如抗體或多肽)係與細胞毒性劑共軛。在一些實施態樣中，該細胞毒性劑係化學治療劑，包括但不限於甲胺喋呤(methotrexate)、甲烯土黴素(adriamicin)、多柔比星(doxorubicin)、黴法蘭(melphalan)、絲裂黴素C(mitomycin C)、氯芥苯丁酸(chlorambucil)、正定黴素(daunorubicin)或其他插入劑。在一些實施態樣中，該細胞毒性劑係細菌、真菌、植物或動物來源之酶活性毒素及彼等之片段，包括但不限於白喉毒素A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒素(abrin)A鏈、莫迪素(modeccin)A鏈、α-次黃嘌呤(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、美洲商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、瀉果素(curcin)、巴豆素(crotin)、肥皂草(saponaria officinalis)抑制劑、白樹毒素(gelonin)、絲裂膠素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、伊諾黴素(enomycin)及新月毒素(trichothecene)。在一些實施態樣中，該細胞毒性劑係放射性同位素以產製放射共軛物或經放射共軛之抗體。多種放射性核種可用於產製經放射共軛之抗體，包括但不限於90Y、125I、131I、123I、111In、 131In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re、188Re及212Bi。本發明亦可使用抗體與一或多種小分子毒素之共軛物，該等毒素諸如卡利奇黴素(calicheamicins)、類美坦素(maytansinoids)、新月毒素(trichothenes)、CC1065及具有毒素活性之該些毒素之衍生物。抗體與細胞毒性劑之共軛物可利用各種雙官能性蛋白偶合劑製備，例如N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)、二亞胺環硫丁烷(IT)、亞胺酸酯之雙官能基衍生物(諸如己二亞胺二甲酯HCl)、活性酯之雙官能基衍生物(諸如辛二酸二琥珀醯亞胺)、醛之雙官能基衍生物(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對-疊氮苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙-(對-重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如2,6-二異氰酸甲苯酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝苯)。
III. 多核苷酸
在某些實施態樣中，本發明包含多核苷酸，該等多核苷酸包含編碼與RSPO3特異性結合之多肽(或多肽之片段)的多核苷酸。用語「編碼多肽之多核苷酸」包含僅包括該多肽之編碼序列之多核苷酸，以及包括額外之編碼及/或非編碼序列之多核苷酸。舉例來說，在一些實施態樣中，本發明提供包含編碼抗人RSPO3之抗體或編碼該種抗體之片段(例如包含該抗原結合部位之片段) 的多核苷酸序列之多核苷酸。本發明之多核苷酸可為RNA之形式或DNA之形式。DNA包括cDNA、基因組DNA及合成性DNA；可為雙股或單股，若單股可為編碼股或非編碼(反義)股。
在某些實施態樣中，該多核苷酸包含編碼包含選自下列之胺基酸序列之多肽的多核苷酸：SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：87及SEQ ID NO：88。在某些實施態樣中，該多核苷酸包含選自下列之多核苷酸序列：SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、 SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94及SEQ ID NO：95。
在一些實施態樣中，該質體包含含有SEQ ID NO：18之多核苷酸。在一些實施態樣中，該質體包含含有SEQ ID NO：19之多核苷酸。在一些實施態樣中，該質體包含含有SEQ ID NO：20之多核苷酸。在一些實施態樣中，該質體包含含有SEQ ID NO：24之多核苷酸。在一些實施態樣中，該質體包含含有SEQ ID NO：25之多核苷酸。在一些實施態樣中，該質體包含含有SEQ ID NO：26之多核苷酸。在一些實施態樣中，該質體包含含有SEQ ID NO：30之多核苷酸。在一些實施態樣中，該質體包含含有SEQ ID NO：31之多核苷酸。在一些實施態樣中，該質體包含含有SEQ ID NO：32之多核苷酸。在一些實施態樣中，該質體包含含有SEQ ID NO：40之多核苷酸。在一些實施態樣中，該質體包含含有SEQ ID NO：43之多核苷酸。在一些實施態樣中，該質體包含含有SEQ ID NO：50之多核苷酸。在一些實施態樣中，該質體包含含有SEQ ID NO：51之多核苷酸。在一些實施態樣中，該質體包含含有SEQ ID NO：52之多核苷酸。在一些實施態樣中，該質體包含含有SEQ ID NO：53之多核苷酸。在一些實施態樣中，該質體包含含有SEQ ID NO：54之多核苷酸。在一些實施態樣中，該質體包含含有SEQ ID NO：55之多核苷酸。在一些實施態樣中，該質體包含含有SEQ ID NO：65 之多核苷酸。在一些實施態樣中，該質體包含含有SEQ ID NO：66之多核苷酸。在一些實施態樣中，該質體包含含有SEQ ID NO：67之多核苷酸。在一些實施態樣中，該質體包含含有SEQ ID NO：70之多核苷酸。在一些實施態樣中，該質體包含含有SEQ ID NO：71之多核苷酸。在一些實施態樣中，該質體包含含有SEQ ID NO：75之多核苷酸。在一些實施態樣中，該質體包含含有SEQ ID NO：76之多核苷酸。在一些實施態樣中，該質體包含含有SEQ ID NO：77之多核苷酸。在一些實施態樣中，該質體包含含有SEQ ID NO：84之多核苷酸。在一些實施態樣中，該質體包含含有SEQ ID NO：85之多核苷酸。在一些實施態樣中，該質體包含含有SEQ ID NO：89之多核苷酸。在一些實施態樣中，該質體包含含有SEQ ID NO：90之多核苷酸。在一些實施態樣中，該質體包含含有SEQ ID NO：91之多核苷酸。在一些實施態樣中，該質體包含含有SEQ ID NO：92之多核苷酸。在一些實施態樣中，該質體包含含有SEQ ID NO：93之多核苷酸。在一些實施態樣中，該質體包含含有SEQ ID NO：94之多核苷酸。在一些實施態樣中，該質體包含含有SEQ ID NO：95之多核苷酸。
在某些實施態樣中，該多核苷酸包含具有核苷酸序列之多核苷酸，該核苷酸序列與包含選自下列序列之多核苷酸具有至少約80%一致性、至少約85%一致性、至少約90%一致性、至少約95%一致性，且在一些實施態樣中至少約96%、97%、98%或99%一致性：SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94及SEQ ID NO：95。本發明亦提供包含與下列序列雜交之多核苷酸的多核苷酸：SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：990、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94及SEQ ID NO：95。本發明亦提供包含與下列序列之互補序列雜交之多核苷酸的多核苷酸：SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：30、 SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94及SEQ ID NO：95。在某些實施態樣中，該雜交係於高度嚴謹度條件下發生。
在一些實施態樣中，該抗體係由包含SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：20之多核苷酸編碼。在一些實施態樣中，該抗體係由包含SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20之多核苷酸編碼。在一些實施態樣中，該抗體係由包含SEQ ID NO：50及SEQ ID NO：20之多核苷酸編碼。在一些實施態樣中，該抗體係由包含SEQ ID NO：51及SEQ ID NO：20之多核苷酸編碼。在一些實施態樣中，該抗體係由包含SEQ ID NO：65及SEQ ID NO：20之多核苷酸編碼。在一些實施態樣中，該抗體係由包含SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：75之多核苷酸編碼。在一些實施態樣中，該抗體係由包含SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：75之多核苷酸編碼。在一些實施態樣中，該抗體係由包含SEQ ID NO：50及SEQ ID NO：75之多核苷酸編碼。在一些實施態樣中，該抗體係由包含SEQ ID NO：51及SEQ ID NO：75 之多核苷酸編碼。在一些實施態樣中，該抗體係由包含SEQ ID NO：65及SEQ ID NO：75之多核苷酸編碼。在一些實施態樣中，該抗體係由包含SEQ ID NO：95及SEQ ID NO：89之多核苷酸編碼。在一些實施態樣中，該抗體係由包含SEQ ID NO：92及SEQ ID NO：89之多核苷酸編碼。
在一些實施態樣中，該抗體係由包含SEQ ID NO：24及SEQ ID NO：26之多核苷酸編碼。在一些實施態樣中，該抗體係由包含SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26之多核苷酸編碼。在一些實施態樣中，該抗體係由包含SEQ ID NO：40及SEQ ID NO：26之多核苷酸編碼。在一些實施態樣中，該抗體係由包含SEQ ID NO：43及SEQ ID NO：26之多核苷酸編碼。在一些實施態樣中，該抗體係由包含SEQ ID NO：52及SEQ ID NO：26之多核苷酸編碼。在一些實施態樣中，該抗體係由包含SEQ ID NO：53及SEQ ID NO：26之多核苷酸編碼。在一些實施態樣中，該抗體係由包含SEQ ID NO：66及SEQ ID NO：26之多核苷酸編碼。在一些實施態樣中，該抗體係由包含SEQ ID NO：70及SEQ ID NO：26之多核苷酸編碼。在一些實施態樣中，該抗體係由包含SEQ ID NO：24及SEQ ID NO：76之多核苷酸編碼。在一些實施態樣中，該抗體係由包含SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：76之多核苷酸編碼。在一些實施態樣中，該抗體係由包含SEQ ID NO：40及SEQ ID NO：76之多核苷酸編碼。在一些實施態樣中，該抗體係由包含SEQ ID NO：43及SEQ ID NO：76之多核苷酸編碼。 在一些實施態樣中，該抗體係由包含SEQ ID NO：52及SEQ ID NO：76之多核苷酸編碼。在一些實施態樣中，該抗體係由包含SEQ ID NO：53及SEQ ID NO：76之多核苷酸編碼。在一些實施態樣中，該抗體係由包含SEQ ID NO：66及SEQ ID NO：76之多核苷酸編碼。在一些實施態樣中，該抗體係由包含SEQ ID NO：70及SEQ ID NO：76之多核苷酸編碼。在一些實施態樣中，該抗體係由包含SEQ ID NO：84及SEQ ID NO：90之多核苷酸編碼。在一些實施態樣中，該抗體係由包含SEQ ID NO：93及SEQ ID NO：90之多核苷酸編碼。
在一些實施態樣中，該抗體係由包含SEQ ID NO：30及SEQ ID NO：32之多核苷酸編碼。在一些實施態樣中，該抗體係由包含SEQ ID NO：31及SEQ ID NO：32之多核苷酸編碼。在一些實施態樣中，該抗體係由包含SEQ ID NO：54及SEQ ID NO：32之多核苷酸編碼。在一些實施態樣中，該抗體係由包含SEQ ID NO：55及SEQ ID NO：32之多核苷酸編碼。在一些實施態樣中，該抗體係由包含SEQ ID NO：67及SEQ ID NO：32之多核苷酸編碼。在一些實施態樣中，該抗體係由包含SEQ ID NO：71及SEQ ID NO：32之多核苷酸編碼。在一些實施態樣中，該抗體係由包含SEQ ID NO：30及SEQ ID NO：77之多核苷酸編碼。在一些實施態樣中，該抗體係由包含SEQ ID NO：31及SEQ ID NO：77之多核苷酸編碼。在一些實施態樣中，該抗體係由包含SEQ ID NO：54及SEQ ID NO：77 之多核苷酸編碼。在一些實施態樣中，該抗體係由包含SEQ ID NO：55及SEQ ID NO：77之多核苷酸編碼。在一些實施態樣中，該抗體係由包含SEQ ID NO：67及SEQ ID NO：77之多核苷酸編碼。在一些實施態樣中，該抗體係由包含SEQ ID NO：71及SEQ ID NO：77之多核苷酸編碼。在一些實施態樣中，該抗體係由包含SEQ ID NO：85及SEQ ID NO：91之多核苷酸編碼。在一些實施態樣中，該抗體係由包含SEQ ID NO：94及SEQ ID NO：91之多核苷酸編碼。
在某些實施態樣中，該等多核苷酸包含融合至多核苷酸之相同閱讀框的成熟多肽之編碼序列，該編碼序列有助於例如多肽自宿主細胞之表現及分泌(例如作為分泌序列以控制源自細胞之多肽之運輸的前導序列)。具有前導序列之多肽係前體蛋白，該前導序列可由宿主細胞切割以形成成熟形式之多肽。該等多核苷酸亦可編碼蛋白原，蛋白原係成熟蛋白質加上額外之5'胺基酸殘基。具有原序列(prosequence)之成熟蛋白質係蛋白原，其係不活化形式之蛋白質。一旦原序列被切割後，剩下即為活性成熟蛋白質。
在某些實施態樣中，該多核苷酸包含融合至標誌序列之相同閱讀框的成熟多肽之編碼序列，以允許例如用於純化該經編碼之多肽。舉例來說，該標誌序列可為由pQE-9載體供應之六組胺酸標籤以提供在細菌宿主之例中用於純化與該標記融合之成熟多肽，或當使用哺乳動物 宿主(例如COS-7細胞)時該標誌序列可為源自流感血球凝集素蛋白質之血球凝集素(HA)標籤。在一些實施態樣中，該標誌序列係FLAG標籤，即可與其他親和性標籤搭配使用之序列DYKDDDDK之肽(SEQ ID NO：33)。
本發明另關於上述多核苷酸編碼片段、類似物及/或衍生物之變異體。
在某些實施態樣中，本發明提供多核苷酸，該等多核苷酸包含具有與編碼包含此處所述之RSPO3結合劑(例如抗體)或彼之片段之多肽的多核苷酸至少約80%一致性、至少約85%一致性、至少約90%一致性、至少約95%一致性，及在一些實施態樣中至少約96%、97%、98%或99%一致性的核苷酸序列之多核苷酸。
如此處所使用之用語，具有與參考核苷酸序列至少例如95%「一致性」之核苷酸序列之多核苷酸係意圖表示該多核苷酸之核苷酸序列係與該參考序列相同，除了該多核苷酸序列可在該參考核苷酸序列之每100個核苷酸中包括最多五個點突變。換言之，為了獲得具有與參考核苷酸序列至少95%一致性之核苷酸序列之多核苷酸，在參考序列中最多5%之核苷酸可被刪除或以另一核苷酸取代，或參考序列中總核苷酸數量之最多5%之核苷酸可被插入該參考序列中。這些參考序列之突變可發生在該參考核苷酸序列之5'或3'端位置或該些末端位置之間的任何位置，這些位置個自分散在參考序列之核苷酸之中或在參考序列內以一或多個連續族群存在。
多核苷酸變異體可包含編碼區、非編碼區或兩區中之改變。在一些實施態樣中，多核苷酸變異體包含產生靜默取代、添加或刪除之改變，但不改變該經編碼之多肽的性質或活性。在一些實施態樣中，多核苷酸變異體包含導致該多肽之胺基酸序列無改變之靜默取代(由於基因密碼之簡併)。在一些實施態樣中，核苷酸變異體包含在轉錄層級導致表現差異(例如增加或減少表現)之核苷酸序列。多核苷酸變異體可為了多種原因產製，例如為了最佳化密碼子於特定宿主之表現(例如將人mRNA中之密碼子改變成該些細菌宿主諸如大腸桿菌所偏好之密碼子)。在一些實施態樣中，多核苷酸變異體在序列之非編碼或編碼區包含至少一個靜默突變。
在一些實施態樣中，多核苷酸變異體係經產製以調節或改變該經編碼之多肽的表現(或表現量)。在一些實施態樣中，多核苷酸變異體係經產製以增加該經編碼之多肽的表現。在一些實施態樣中，多核苷酸變異體係經產製以減少該經編碼之多肽的表現。在一些實施態樣中，多核苷酸變異體相較於親代多核苷酸序列增加該經編碼之多肽之表現。在一些實施態樣中，多核苷酸變異體相較於親代多核苷酸序列減少該經編碼之多肽之表現。
在一些實施態樣中，至少一種多核苷酸變異體係經產製(不改變該經編碼之多肽的胺基酸序列)以增加異多聚分子之產製。在一些實施態樣中，至少一種多核苷酸變異體係經產製(不改變該經編碼之多肽的胺基酸序 列)以增加雙特異性抗體之產製。
在某些實施態樣中，多核苷酸係經分離。在某些實施態樣中，多核苷酸係實質上純的。
本發明亦提供此處所述之包含該多核苷酸之載體。本發明亦提供此處所述之包含該多核苷酸之細胞。在一些實施態樣中，表現載體包含多核苷酸分子。在一些實施態樣中，宿主細胞包含表現載體，該表現載體包含該多核苷酸分子。在一些實施態樣中，宿主細胞包含多核苷酸分子。
IV. 使用方法及醫藥組成物
本發明之RSPO3結合劑(包括多肽及抗體)可用於各種應用，包括但不限於治療性處理方法諸如癌之治療。在某些實施態樣中，該劑可用於抑制β-連環蛋白傳訊、抑制腫瘤生長、調節血管生成、抑制血管生成、誘導分化、減少腫瘤體積、減少腫瘤中癌幹細胞之頻率及/或減少腫瘤之腫瘤發生性。使用方法可為試管內、體外或體內方法。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑或多肽或抗體係人RSPO3之拮抗劑。
在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑係用於治療與β-連環蛋白活化、β-連環蛋白傳訊增加及/或β-連環蛋白傳訊異常有關之疾病。在某些實施態樣中，該疾病係依賴β-連環蛋白傳訊之疾病。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑係用於治療特徵為血管生成增加之疾 病。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑係用於治療特徵為幹細胞及/或祖細胞之量增加之疾病。在一些實施態樣中，該等方法包含對個體投予治療有效量之RSPO3結合劑(例如抗體)。在一些實施態樣中，該個體係人。
本發明提供利用此處所述之RSPO3結合劑或抗體抑制腫瘤生長之方法。在某些實施態樣中，該抑制腫瘤生長之方法包含於試管內使細胞與RSPO3結合劑(例如抗體)接觸。舉例來說，永生化細胞系或癌細胞系係於培養基中培養，其中添加抗RSPO3抗體或其他劑以抑制腫瘤細胞生長。在一些實施態樣中，腫瘤細胞係自病患樣本諸如像是組織活體檢查、胸膜滲液或血液樣本分離，並於其中添加RSPO3結合劑以抑制腫瘤生長之培養基中培養。
在一些實施態樣中，該抑制腫瘤生長之方法包含於體內使腫瘤或腫瘤細胞與RSPO3結合劑(例如抗體)接觸。在某些實施態樣中，使腫瘤或腫瘤細胞接觸RSPO3結合劑係於動物模型中進行。舉例來說，RSPO3結合劑可被投予至具有異種移植之免疫不全小鼠(例如NOD/SCID小鼠)。在一些實施態樣中，癌細胞或癌幹細胞係自病患樣本諸如像是組織活體檢查、胸膜滲液或血液樣本分離，並注射至免疫不全小鼠，該小鼠接著被投予RSPO3結合劑以抑制腫瘤細胞生長。在一些實施態樣中，RSPO3結合劑係經投予至該動物。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係於導入腫瘤發生細胞至動物之同時或短時 間內投予以預防腫瘤生長(「預防模型」)。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係於腫瘤生長至特定大小後投予以作為治療之用(「治療模型」)。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗RSPO3抗體。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體131R002。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係人化版本之抗體131R002。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體131R003。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體131R003之變異體。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係人化版本之抗體131R003。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體131R003之變異體之人化版本。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體h131R006A或抗體h131R006B。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體h131R005/131R007。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體h131R008。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體h131R010。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體h131R011。
在某些實施態樣中，抑制腫瘤生長之方法包含對個體投予治療有效量之RSPO3結合劑，其中該RSPO3結合劑包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO：9)、KASGYTFTSYTF(SEQ ID NO：34)或DYSIH(SEQ ID NO：78)，該重鏈CDR2包含IYPSNGDS(SEQ ID NO：10)或YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO：79)，且該重鏈CDR3包含ATYFANYFDY(SEQ ID NO：11)、ATYFANNFDY(SEQ ID NO：35)或TYFANNFD(SEQ ID NO：80)。在該方法之一些實施態樣中，該RSPO3結合劑另包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3，該輕鏈CDR1包含QSVDYDGDSYM(SEQ ID NO：12)或KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO：81)，該輕鏈CDR2包含AAS(SEQ ID NO：13)或AASNLES(SEQ ID NO：82)，且該輕鏈CDR3包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO：14)或QQSNEDPLTF(SEQ ID NO：83)。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含：包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO：9)之重鏈CDR1、包含IYPSNGDS(SEQ ID NO：10)之重鏈CDR2及包含ATYFANYFDY(SEQ ID NO：11)之重鏈CDR3，及/或包含QSVDYDGDSYM(SEQ ID NO：12)之輕鏈CDR1、包含AAS(SEQ ID NO：13)之輕鏈CDR2及包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO：14)之輕鏈CDR3。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含：包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO：9)之重鏈CDR1、包含IYPSNGDS(SEQ ID NO：10)之重鏈CDR2及包含ATYFANNFDY(SEQ ID NO：35)之重鏈CDR3，及/或包含QSVDYDGDSYM(SEQ ID NO：12)之輕鏈CDR1、包含AAS(SEQ ID NO：13)之輕鏈CDR2及包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO：14)之輕鏈CDR3。在一些實施態樣中，該RSPO3結 合劑包含：包含KASGYTFTSYTF(SEQ ID NO：34)之重鏈CDR1、包含IYPSNGDS(SEQ ID NO：10)之重鏈CDR2及包含ATYFANNFDY(SEQ ID NO：35)之重鏈CDR3，及/或包含QSVDYDGDSYM(SEQ ID NO：12)之輕鏈CDR1、包含AAS(SEQ ID NO：13)之輕鏈CDR2及包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO：14)之輕鏈CDR3。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含：包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO：9)或DYSIH(SEQ ID NO：78)之重鏈CDR1、包含YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO：79)之重鏈CDR2及包含TYFANNFD(SEQ ID NO：80)之重鏈CDR3，及/或包含KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO：81)之輕鏈CDR1、包含AASNLES(SEQ ID NO：82)之輕鏈CDR2及包含QQSNEDPLTF(SEQ ID NO：83)之輕鏈CDR3。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含：包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO：9)或DYSIH(SEQ ID NO：78)之重鏈CDR1、包含YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO：79)之重鏈CDR2及包含TYFANNFD(SEQ ID NO：80)之重鏈CDR3，及/或包含KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO：81)之輕鏈CDR1、包含AASNLES(SEQ ID NO：82)之輕鏈CDR2及包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO：14)之輕鏈CDR3。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含：包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO：9)或DYSIH(SEQ ID NO：78)之重鏈CDR1、包含IYPSNGDS(SEQ ID NO：10)之重鏈CDR2及包含TYFANNFD(SEQ ID NO：80)之重鏈CDR3，及/或包含QSVDYDGDSYM(SEQ ID NO：12)之輕鏈CDR1、包含AAS(SEQ ID NO：13)之輕鏈CDR2及包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO：14)之輕鏈CDR3。
在某些實施態樣中，抑制腫瘤生長之方法包含對個體投予治療有效量之RSPO3結合劑。在某些實施態樣中，該個體係人。在某些實施態樣中，該個體具有腫瘤或腫瘤已被移除。在一些實施態樣中，該個體具有至少一種RSPO蛋白(如RSPO1、RSPO2、RSPO3或RSPO4)之表現量上升之腫瘤。在一些實施態樣中，該個體具有至少一種RSPO蛋白(如RSPO1、RSPO2、RSPO3或RSPO4)之表現量高之腫瘤。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑係RSPO3結合劑。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體131R002。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體131R003。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體131R003之變異體。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係人化版本之抗體131R003。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體131R003之變異體之人化版本。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體h131R006A或抗體h131R006B。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體h131R005/131R007。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體h131R008。在一些實施態 樣中，該RSPO3結合劑係抗體h131R010。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體h131R01。
在某些實施態樣中，該腫瘤係其中β-連環蛋白傳訊活躍之腫瘤。在一些實施態樣中，該腫瘤係其中β-連環蛋白傳訊異常之腫瘤。在某些實施態樣中，該腫瘤包含APC抑瘤基因之不活化突變(例如截短突變)。在某些實施態樣中，該腫瘤不包含APC抑瘤基因之不活化突變。在一些實施態樣中，該腫瘤包含野生型APC基因。在一些實施態樣中，該腫瘤不包含β-連環蛋白基因之活化突變。在某些實施態樣中，接受治療之個體的癌涉及該腫瘤。
在一些實施態樣中，該腫瘤包含RSPO基因融合。在一些實施態樣中，該腫瘤包含RSPO2基因融合。在一些實施態樣中，該腫瘤包含RSPO3基因融合。
在某些實施態樣中，該腫瘤表現被RSPO3結合劑或抗體結合之RSPO3。在某些實施態樣中，該腫瘤具有上升表現量之RSPO1或過度表現RSPO1。在某些實施態樣中，該腫瘤具有上升表現量之RSPO2或過度表現RSPO2。在某些實施態樣中，該腫瘤具有上升表現量之RSPO3或過度表現RSPO3。用語「腫瘤具有上升表現量」係指蛋白之表現量或核酸之表現量。一般來說，用語「腫瘤具有上升表現量」之蛋白或基因(或類似用語)係指腫瘤中之蛋白或基因的表現量相較於參考樣本中之該相同蛋白或相同基因的表現量或預先決定之表現量。在一些 實施態樣中，該參考樣本係相同組織類型之正常組織。在一些實施態樣中，該參考樣本係一群組織類型之正常組織。在一些實施態樣中，該參考樣本係相同組織類型之腫瘤或腫瘤群。在一些實施態樣中，該參考樣本係不同組織類型之腫瘤或腫瘤群。因此在一些實施態樣中，腫瘤中之蛋白或基因的表現量相較於一群組織類型內之該蛋白或基因的平均表現量為「上升」或「高」。在一些實施態樣中，腫瘤中之蛋白或基因的表現量相較於該相同組織類型或不同組織類型之其他腫瘤中之該蛋白或基因的表現量為「上升」或「高」。在一些實施態樣中，該腫瘤相較於該相同組織類型之正常組織中所表現之RSPO量表現「上升」或「高」量之RSPO1、RSPO2、RSPO3及/或RSPO4。在一些實施態樣中，該腫瘤相較於預先決定之量表現「上升」或「高」量之RSPO1、RSPO2、RSPO3及/或RSPO4。
此外，本發明提供抑制個體體內腫瘤生長之方法，該方法包含對該個體投予治療有效量之RSPO3結合劑。在某些實施態樣中，該腫瘤包含癌幹細胞。在某些實施態樣中，該腫瘤中癌幹細胞之頻率係藉由投予RSPO3結合劑而減少。本發明亦提供減少腫瘤中癌幹細胞之頻率之方法，該方法包含使該腫瘤接觸有效量之RSPO3結合劑(例如抗RSPO3抗體)。在一些實施態樣中，提供減少個體之腫瘤中癌幹細胞之頻率之方法，該方法包含對該個體投予治療有效量之RSPO3結合劑(例如抗RSPO3抗 體)。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗RSPO3抗體。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係131R002。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體131R003。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體131R003之變異體。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係人化版本之抗體131R003。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體131R003之變異體之人化版本。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體h131R006A或抗體h131R006B。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體h131R005/131R007。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體h131R008。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體h131R010。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體h131R011。
在一些實施態樣中，該腫瘤係實質腫瘤。在某些實施態樣中，該腫瘤係選自結直腸腫瘤、胰腫瘤、肺腫瘤、卵巢腫瘤、肝腫瘤、乳房腫瘤、腎腫瘤、前列腺腫瘤、胃腸道腫瘤、黑色素瘤、子宮頸腫瘤、膀胱腫瘤、神經膠母細胞瘤或頭頸腫瘤之腫瘤。此處所使用之「肺癌」包括但不限於小細胞肺癌及非小細胞肺癌(NSCLC)。在某些實施態樣中，該腫瘤係結直腸腫瘤。在某些實施態樣中，該腫瘤係卵巢腫瘤。在一些實施態樣中，該腫瘤係肺腫瘤。在某些實施態樣中，該腫瘤係胰腫瘤。在一些實施態樣中，該腫瘤係包含APC基因中之失活突變的結直腸 腫瘤。在一些實施態樣中，該腫瘤係不包含APC基因中之失活突變的結直腸腫瘤。在一些實施態樣中，該腫瘤係包含RSPO基因融合之結直腸腫瘤。在一些實施態樣中，該腫瘤係包含RSPO2基因融合之結直腸腫瘤。在一些實施態樣中，該腫瘤係包含RSPO3基因融合之結直腸腫瘤。在一些實施態樣中，該腫瘤係具有上升表現量之RSPO1之卵巢腫瘤。在一些實施態樣中，該腫瘤係具有上升表現量之RSPO2之胰臟腫瘤。在一些實施態樣中，該腫瘤係具有上升表現量之RSPO2之結腸腫瘤。在一些實施態樣中，該腫瘤係具有上升表現量之RSPO2之肺臟腫瘤。在一些實施態樣中，該腫瘤係具有上升表現量之RSPO3之肺臟腫瘤。在一些實施態樣中，該腫瘤係具有上升表現量之RSPO3之卵巢腫瘤。在一些實施態樣中，該腫瘤係具有上升表現量之RSPO3之乳房腫瘤。在一些實施態樣中，該腫瘤係具有上升表現量之RSPO3之結直腸腫瘤。
本發明另提供治療癌之方法，該方法包含對個體投予治療有效量之RSPO3結合劑。在某些實施態樣中，該癌之特徵為表現上升量之至少一種RSPO蛋白的細胞，相較於參考樣本中之該相同RSPO蛋白的表現量。此處所使用之「參考樣本」包括但不限於正常組織、該相同組織類型之非癌性組織、該相同組織類型之腫瘤組織及不同組織類型之腫瘤組織。在某些實施態樣中，該癌之特徵為表現上升量之至少一種RSPO蛋白的細胞，相較於預先 決定之該相同RSPO蛋白的量。在一些實施態樣中，決定至少一種RSPO之表現量係於治療前進行。在一些實施態樣中，決定至少一種RSPO之表現量係由免疫組織化學進行。因此在某些實施態樣中，該癌之特徵為表現上升量之至少一種RSPO蛋白的細胞，相較於正常組織中之該相同RSPO蛋白的表現量。在某些實施態樣中，該癌之特徵為過度表現RSPO1之細胞。在某些實施態樣中，該癌之特徵為過度表現RSPO2之細胞。在某些實施態樣中，該癌之特徵為過度表現RSPO3之細胞。在某些實施態樣中，該癌過度表現至少一種選自RSPO1、RSPO2、RSPO3及/或RSPO4之RSPO蛋白。在某些實施態樣中，該癌之特徵為表現β-連環蛋白之細胞，其中該RSPO3結合劑(例如抗體)干擾RSPO3誘導之β-連環蛋白傳訊及/或活化。
在一些實施態樣中，該RSPO結合劑與RSPO3結合且抑制或減少癌之生長。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑與RSPO3結合、干擾RSPO3/LGR交互作用且抑制或減少癌之生長。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑與RSPO3結合、抑制β-連環蛋白活化且抑制或減少癌之生長。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑與RSPO3結合且減少癌中癌幹細胞之頻率。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑係抗體。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑係抗RSPO3抗體。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體131R002。在一些實施態樣中，該抗 RSPO3抗體係抗體131R003。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體131R003之變異體。在一些實施態樣中，該抗RSPO抗體係人化版本之抗體131R002。在一些實施態樣中，該抗RSPO抗體係人化版本之抗體131R003。在一些實施態樣中，該抗RSPO抗體係抗體131R003之變異體之人化版本。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體h131R006A或抗體h131R006B。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體h131R005/131R007。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體h131R008。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體h131R010。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體h131R011。
本發明提供治療癌之方法，該方法包含對個體(例如需要治療之個體)投予治療有效量之RSPO3結合劑。在某些實施態樣中，該治療癌之方法包含對個體投予治療有效量之RSPO3結合劑，其中該RSPO3結合劑包含重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3，該重鏈CDR1包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO：9)、KASGYTFTSYTF(SEQ ID NO：34)或DYSIH(SEQ ID NO：78)，該重鏈CDR2包含IYPSNGDS(SEQ ID NO：10)或YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO：79)，且該重鏈CDR3包含ATYFANYFDY(SEQ ID NO：11)、ATYFANNFDY(SEQ ID NO：35)或TYFANNFD(SEQ ID NO：80)。在該方法之一些實施態樣中，該RSPO3結合劑 另包含輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3，該輕鏈CDR1包含QSVDYDGDSYM(SEQ ID NO：12)或KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO：81)，該輕鏈CDR2包含AAS(SEQ ID NO：13)或AASNLES(SEQ ID NO：82)，且該輕鏈CDR3包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO：14)或QQSNEDPLTF(SEQ ID NO：83)。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含：包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO：9)之重鏈CDR1、包含IYPSNGDS(SEQ ID NO：10)之重鏈CDR2及包含ATYFANYFDY(SEQ ID NO：11)之重鏈CDR3，及/或包含QSVDYDGDSYM(SEQ ID NO：12)之輕鏈CDR1、包含AAS(SEQ ID NO：13)之輕鏈CDR2及包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO：14)之輕鏈CDR3。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含：包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO：9)之重鏈CDR1、包含IYPSNGDS(SEQ ID NO：10)之重鏈CDR2及包含ATYFANNFDY(SEQ ID NO：35)之重鏈CDR3，及/或包含QSVDYDGDSYM(SEQ ID NO：12)之輕鏈CDR1、包含AAS(SEQ ID NO：13)之輕鏈CDR2及包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO：14)之輕鏈CDR3。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含：包含KASGYTFTSYTF(SEQ ID NO：34)之重鏈CDR1、包含IYPSNGDS(SEQ ID NO：10)之重鏈CDR2及包含ATYFANNFDY(SEQ ID NO：35)之重鏈CDR3，及/或包含QSVDYDGDSYM(SEQ ID NO：12)之輕鏈CDR1、包含AAS(SEQ ID NO：13)之輕鏈CDR2及包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO：14)之輕鏈CDR3。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含：包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO：9)或DYSIH(SEQ ID NO：78)之重鏈CDR1、包含YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO：79)之重鏈CDR2及包含TYFANNFD(SEQ ID NO：80)之重鏈CDR3，及/或包含KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO：81)之輕鏈CDR1、包含AASNLES(SEQ ID NO：82)之輕鏈CDR2及包含QQSNEDPLTF(SEQ ID NO：83)之輕鏈CDR3。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含：包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO：9)或DYSIH(SEQ ID NO：78)之重鏈CDR1、包含YIYPSNGDSGYNQKFK(SEQ ID NO：79)之重鏈CDR2及包含TYFANNFD(SEQ ID NO：80)之重鏈CDR3，及/或包含KASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO：81)之輕鏈CDR1、包含AASNLES(SEQ ID NO：82)之輕鏈CDR2及包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO：14)之輕鏈CDR3。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑包含：包含KASGYTFTDYS(SEQ ID NO：9)或DYSIH(SEQ ID NO：78)之重鏈CDR1、包含IYPSNGDS(SEQ ID NO：10)之重鏈CDR2及包含TYFANNFD(SEQ ID NO：80)之重鏈CDR3，及/或包含QSVDYDGDSYM(SEQ ID NO：12)之輕鏈CDR1、包含AAS(SEQ ID NO：13)之輕鏈CDR2及包含QQSNEDPLT(SEQ ID NO：14)之輕鏈CDR3。在某些實 施態樣中，該個體係人。在某些實施態樣中，該個體罹患癌性腫瘤。在某些實施態樣中，該個體罹患之腫瘤已經移除。在一些實施態樣中，治療癌之方法包含對個體投予治療有效量之RSPO3結合劑，其中該個體具有相較於參考樣本或預先決定之量升高表現至少一種RSPO蛋白之腫瘤。在一些實施態樣中，該個體具有升高表現RSPO3之肺腫瘤且經投予抗RSPO3抗體。
本發明亦提供用於治療癌之方法中之RSPO3結合劑，其中該RSPO3結合劑係此處所述之抗體。本發明亦提供此處所述之RSPO3結合劑(例如抗體)於製造用於治療癌之藥物之用途。
在某些實施態樣中，該癌係選自結直腸癌、胰癌、肺癌、卵巢癌、肝癌、乳癌、腎癌、前列腺癌、胃腸癌、黑色素瘤、子宮頸癌、膀胱癌、神經膠母細胞瘤或頭頸癌之癌。在某些實施態樣中，該癌係胰癌。在某些實施態樣中，該癌係卵巢癌。在某些實施態樣中，該癌係結直腸癌。在某些實施態樣中，該癌係乳癌。在某些實施態樣中，該癌係前列腺癌。在某些實施態樣中，該癌係肺癌。
此外，本發明提供減少個體體內腫瘤之腫瘤發生性的方法，該方法包含對該個體投予治療有效量之RSPO3結合劑。在某些實施態樣中，該腫瘤包含癌幹細胞。在一些實施態樣中，該腫瘤之腫瘤發生性藉由減少腫瘤中癌幹細胞之頻率降低。在一些實施態樣中，該方法包 含使用此處所述之RSPO3結合劑。在某些實施態樣中，該腫瘤中癌幹細胞之頻率藉由投予RSPO3結合劑而減少。
在某些實施態樣中，該方法另包含測定腫瘤或癌中至少一種RSPO(即蛋白或核酸)之表現量的步驟。在一些實施態樣中，該測定腫瘤或癌中RSPO之表現量的步驟包含測定RSPO1、RSPO2、RSPO3及/或RSPO4之表現量。在一些實施態樣中，腫瘤或癌中RSPO1、RSPO2、RSPO3及/或RSPO4之表現量係與參考樣本中RSPO1、RSPO2、RSPO3及/或RSPO4之表現量比較。在一些實施態樣中，腫瘤或癌中RSPO1、RSPO2、RSPO3及/或RSPO4之表現量係與正常組織中RSPO1、RSPO2、RSPO3及/或RSPO4之表現量比較。在一些實施態樣中，腫瘤或癌中RSPO1、RSPO2、RSPO3及/或RSPO4之表現量係與預先測定之RSPO1、RSPO2、RSPO3及/或RSPO4之表現量比較。在一些實施態樣中，腫瘤或癌中RSPO1、RSPO2、RSPO3及/或RSPO4之表現量係與正常組織中預先測定之RSPO1、RSPO2、RSPO3及/或RSPO4之表現量比較。在一些實施態樣中，該腫瘤具有高表現量之RSPO1。在一些實施態樣中，該腫瘤具有高表現量之RSPO3。通常，RSPO(即蛋白或核酸)之表現量係與該相同組織類型之正常組織中的RSPO(即蛋白或核酸)之表現量比較。然而在一些實施態樣中，RSPO(即蛋白或核酸)之表現量係與一群組 織類型內的RSPO(即蛋白或核酸)之平均表現量比較。在一些實施態樣中，腫瘤中RSPO(即蛋白或核酸)之表現量係與該相同組織類型或不同組織類型之其他腫瘤中的RSPO(即蛋白或核酸)之表現量比較。
在一些實施態樣中，測定RSPO之表現量係於治療前進行。在一些實施態樣中，若該腫瘤或癌相較於參考樣本(例如正常組織)中相同RSPO之表現量或預先決定之量具有升高表現量之RSPO，則對該個體投予此處所述之RSPO3結合劑或抗體。舉例來說，在一些實施態樣中，若該腫瘤或癌相較於正常或對照組織中RSPO3之表現量具有升高表現量之RSPO3(即蛋白或核酸)，則對該個體投予RSPO3結合劑(例如抗RSPO3抗體)。
在某些實施態樣中，該方法另包含測定腫瘤或癌是否具有APC基因之失活突變之步驟。在一些實施態樣中，該方法另包含測定腫瘤或癌是否具有β-連環蛋白基因之活化突變之步驟。在一些實施態樣中，該方法另包含測定腫瘤或癌是否具有RSPO基因融合之步驟。
此外，本發明提供調節血管生成之方法，該方法包含對個體投予治療有效量之RSPO3結合劑。在一些實施態樣中，該血管生成調節包含抑制血管生成。在一些實施態樣中，該方法包含使用此處所述之RSPO3結合劑。在某些實施態樣中，該RSPO3結合劑與RSPO3結合且抑制或減少血管生成。在某些實施態樣中，抑制及/或減少血管生成抑制或減少腫瘤或癌之生長。在一些實施態 樣中，該RSPO3結合劑與RSPO3結合且促進異常血管生成。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑與RSPO3結合且促進非生產性血管生成。在某些實施態樣中，該異常血管生成或非生產性血管生成抑制或減少腫瘤或癌之生長。
此外，本發明提供識別適用於以RSPO結合劑治療人個體之方法，該方法包含測定該個體是否具有相較於正常組織、參考樣本之該相同RSPO(即蛋白或核酸)的表現或預先決定之該RSPO蛋白的量為上升之RSPO(即蛋白或核酸)表現量的腫瘤。在一些實施態樣中，識別適用於以RSPO3結合劑治療之人個體的方法包含：測定該個體是否具有相較於參考樣本或預先決定之RSPO3的量為上升之RSPO3表現量的腫瘤。在一些實施態樣中，識別適用於以RSPO3結合劑治療之人個體的方法包含：自該個體獲得腫瘤樣本並測定該腫瘤是否具有相較於參考樣本或預先決定之RSPO3的量為上升之RSPO3表現量。在一些實施態樣中，若該腫瘤具有上升之RSPO3表現量，則選擇該個體為適用於以與RSPO3特異性結合之抗體治療。在一些實施態樣中，若經選擇為適合治療，則對該個體投予此處所述之RSPO3結合劑或抗體。在一些實施態樣中，若該腫瘤具有上升表現量之超過一種RSPO(即蛋白或核酸)，則對該個體投予與最高表現量之RSPO結合之RSPO結合劑。在某些實施態樣中，該個體罹患之腫瘤已經移除。舉例來說，在一些實施態樣中，測定腫瘤中RSPO1、RSPO2、RSPO3及/或RSPO4之表 現量，若該腫瘤相較於正常組織中RSPO3之量具有上升之RSPO3表現量，則選擇該個體為適用於以與RSPO3特異性結合之抗體治療。若經選擇為適合治療，則對該個體投予如此處所述之抗RSPO3抗體。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體131R002。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體131R003。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體131R003之變異體。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體131R003之人化形式。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體131R003之變異體之人化形式。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體h131R006A或抗體h131R006B。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體h131R005/131R007。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體h131R008。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體h131R010。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體h131R011。
本發明提供選擇適用於以RSPO結合劑治療之人個體的方法，該方法包含測定該個體是否具有相較於正常組織中該相同RSPO之表現或相較於預先決定之量為上升之至少一種RSPO(即蛋白或核酸)表現量的腫瘤，其中若該腫瘤具有上升之至少一種RSPO表現量，則選擇該個體為適用於以該與上升表現量之RSPO特異性結合之抗體治療。在一些實施態樣中，若經選擇為適合治療，則對該個體投予此處所述之RSPO結合劑或抗體。在一些實施態樣中，選擇適用於以RSPO3特異性結合性抗體治療 之人個體的方法包含：測定該個體是否具有相較於參考樣本或預先決定之RSPO3的量為上升之RSPO3表現量的腫瘤。在一些實施態樣中，選擇適用於以RSPO3特異性結合性抗體治療之人個體的方法包含：自該個體獲得腫瘤樣本並測定該腫瘤是否具有相較於參考樣本或預先決定之RSPO3的量為上升之RSPO3表現量。在一些實施態樣中，選擇適用於以RSPO3特異性結合性抗體治療之人個體的方法包含：測定該個體是否具有相較於參考樣本或預先決定之RSPO3的量為上升之RSPO3表現量的腫瘤，其中若該腫瘤具有上升之RSPO3表現量，則選擇該個體為適用於以該抗體治療。在一些實施態樣中，選擇適用於以RSPO3特異性結合性抗體治療之人個體的方法包含：自該個體獲得腫瘤樣本，及測定該腫瘤是否具有相較於參考樣本或預先決定之RSPO3的量為上升之RSPO3表現量，其中若該腫瘤具有上升之RSPO3表現量，則選擇該個體為適用於以該抗體治療。在某些實施態樣中，該個體的腫瘤已移除。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑係RSPO3結合劑。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗RSPO3抗體。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體131R002。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體131R003。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體131R003之變異體。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係人化版本之抗體131R002。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係人化版本之抗體131R003。在一些實施 態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體131R003之變異體之人化版本。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體h131R006A或h131R006B。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體h131R005/131R007。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體h131R008。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體h131R010。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體h131R011。
本發明亦提供治療人個體之癌之方法，該方法包含：(a)選擇適合治療之個體，該選擇係根據(至少部分根據)該個體具有上升量之RSPO的癌，及(b)對該個體投予如此處所述之治療有效量之RSPO3結合劑。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體131R002。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體131R003。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體131R003之變異體。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係人化版本之抗體131R002。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係人化版本之抗體131R003。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體131R003之變異體之人化版本。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體h131R006A或h131R006B。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體h131R005/131R007。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體h131R008。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體h131R010。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體h131R011。
用於測定細胞、腫瘤或癌中之RSPO表現量之方法係該領域之技藝人士所知。以核酸表現而言，該等方法包括但不限於PCR基底試驗、微陣列分析及核苷酸定序(例如NextGen定序)。以蛋白表現而言，該等方法包括但不限於西方墨點分析、蛋白陣列、ELISA、免疫組織化學(IHC)試驗及FACS。
本發明提供識別適用於以RSPO3結合劑治療之人個體的方法，該方法包含自該個體獲得腫瘤樣本，及測定該腫瘤是否具有RSPO基因融合。在一些實施態樣中，識別適用於以RSPO3結合劑治療之人個體的方法包含：測定該個體是否具有RSPO基因融合之腫瘤，其中若該腫瘤具有RSPO基因融合，則選擇該個體為適用於以該抗體治療。在一些實施態樣中，識別適用於以RSPO3結合劑治療之人個體的方法包含：(a)自該個體獲得腫瘤樣本，及(b)測定該腫瘤是否具有RSPO基因融合，其中若該腫瘤具有RSPO基因融合，則選擇該個體為適用於以該抗體治療。在一些實施態樣中，選擇適用於以RSPO3特異性結合性抗體治療之人個體的方法包含測定該個體是否具有RSPO基因融合之腫瘤。
本發明亦提供選擇適用於以RSPO結合劑治療之人個體的方法，該方法包含：測定該個體是否具有RSPO基因融合之腫瘤，其中若該腫瘤具有RSPO基因融合，則選擇該個體為適用於以該與RSPO蛋白特異性結合之抗體治療。在一些實施態樣中，選擇適用於以RSPO3 特異性結合性抗體治療之人個體的方法包含測定該個體是否具有RSPO基因融合之腫瘤。在一些實施態樣中，選擇適用於以RSPO3特異性結合性抗體治療之人個體的方法包含：自該個體獲得腫瘤樣本，及測定該腫瘤是否具有RSPO基因融合。在一些實施態樣中，選擇適用於以RSPO3特異性結合性抗體治療之人個體的方法包含：測定該個體是否具有RSPO基因融合之腫瘤，其中若該腫瘤具有RSPO基因融合，則選擇該個體為適用於以該抗體治療。在一些實施態樣中，選擇適用於以RSPO3特異性結合性抗體治療之人個體的方法包含：自該個體獲得腫瘤樣本，及測定該腫瘤是否具有RSPO基因融合，其中若該腫瘤具有RSPO基因融合，則選擇該個體為適用於以該抗體治療。在一些實施態樣中，該RSPO基因融合係RSPO2基因融合。在一些實施態樣中，該RSPO基因融合係RSPO3基因融合。在一些實施態樣中，若經選擇為適合治療，則對該個體投予此處所述之RSPO結合劑或抗體。在某些實施態樣中，該個體罹患之腫瘤已經移除。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑係RSPO3結合劑。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗RSPO3抗體。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體131R002。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體131R003。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體131R003之變異體。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係人化版本之抗體131R002。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係人化版 本之抗體131R003。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體131R003之變異體之人化版本。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體h131R006A或h131R006B。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體h131R005/131R007。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體h131R008。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體h131R010。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體h131R011。
本發明亦提供治療人個體之癌之方法，該方法包含：(a)選擇適合治療之個體，該選擇係根據(至少部分根據)該個體具有RSPO基因融合之癌，及(b)對該個體投予如此處所述之治療有效量之RSPO3結合劑。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體131R002。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體131R003。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體131R003之變異體。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係人化版本之抗體131R002。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係人化版本之抗體131R003。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體131R003之變異體之人化版本。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體h131R006A或h131R006B。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體h131R005/131R007。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體h131R008。在一些實施態樣中，該抗RSPO3抗體係抗體h131R010。在一些實施態樣 中，該抗RSPO3抗體係抗體h131R011。
用於測定腫瘤是否具有RSPO基因融合之方法係該領域之技藝人士所知。該等方法可能包括但不限於PCR基底試驗、微陣列分析及核苷酸定序(例如NextGen定序、全基因組定序(WGS))。
測定腫瘤或癌是否具有上升之RSPO表現量或具有RSPO基因融合之方法可使用各種樣本。在一些實施態樣中，該樣本係取自具有腫瘤或癌之個體。在一些實施態樣中，該樣本係新鮮腫瘤/癌樣本。在一些實施態樣中，該樣本係冷凍腫瘤/癌樣本。在一些實施態樣中，該樣本係經福馬林固定之石蠟包埋樣本。在一些實施態樣中，該樣本係處理成細胞溶解物。在一些實施態樣中，該樣本係處理成DNA或RNA。
本發明另提供治療個體之疾病或病狀之方法，其中該疾病或病狀係與β-連環蛋白傳訊異常(例如增加量)有關。本發明另提供治療個體之疾病或病狀之方法，其中該疾病或病狀之特徵為幹細胞及/或祖細胞之量增加。在一些實施態樣中，該治療方法包含對該個體投予治療有效量之RSPO結合劑、多肽或抗體。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑係RSPO3結合劑。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體131R002。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體131R003。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體131R003之變異體。在一些實施態 樣中，該RSPO3結合劑係人化版本之抗體131R002。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係人化版本之抗體131R003。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體131R003之變異體之人化版本。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體h131R006A或抗體h131R006B。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體h131R005/131R007。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體h131R008。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體h131R010。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體h131R011。
本發明亦提供抑制細胞中β-連環蛋白傳訊之方法，該方法包含使該細胞與有效量之RSPO結合劑接觸。在某些實施態樣中，該細胞係腫瘤細胞。在某些實施態樣中，該方法係活體內方法，其中使該細胞與該RSPO3結合劑接觸之步驟包含對該個體投予治療有效量之該RSPO3結合劑。在一些實施態樣中，該方法係試管內方法或活體外方法。在某些實施態樣中，該RSPO結合劑抑制β-連環蛋白傳訊。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑抑制β-連環蛋白之活化。在某些實施態樣中，該RSPO結合劑干擾RSPO/LGR交互作用。在某些實施態樣中，該LGR係LGR4、LGR5及/或LGR6。在某些實施態樣中，該LGR係LGR4。在某些實施態樣中，該LGR係LGR5。在某些實施態樣中，該LGR係LGR6。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑係RSPO3結合劑。在一些實 施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體131R002。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體131R003。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體131R003之變異體。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係人化版本之抗體131R002。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係人化版本之抗體131R003。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體131R003之變異體之人化版本。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體h131R006A或抗體h131R006B。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體h131R005/131R007。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體h131R008。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體h131R010。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體h131R011。
本發明亦提供如此處所述之RSPO結合劑、多肽或抗體於誘導細胞分化之用途，該細胞包括但不限於腫瘤細胞。在一些實施態樣中，誘導細胞分化之方法包含使該細胞與有效量之如此處所述之RSPO結合劑(例如抗RSPO抗體)接觸。在某些實施態樣中，誘導個體體內之腫瘤中的細胞分化之方法包含對該個體投予治療有效量之RSPO結合劑、多肽或抗體。在一些實施態樣中，誘導腫瘤細胞之分化標誌之方法包含投予治療有效量之RSPO結合劑、多肽或抗體。在一些實施態樣中，該腫瘤係實質腫瘤。在一些實施態樣中，該腫瘤選自結直腸腫瘤、胰腫 瘤、肺腫瘤、卵巢腫瘤、肝腫瘤、乳房腫瘤、腎腫瘤、前列腺腫瘤、胃腸道腫瘤、黑色素瘤、子宮頸腫瘤、膀胱腫瘤、神經膠母細胞瘤或頭頸腫瘤。在某些實施態樣中，該腫瘤係卵巢腫瘤。在某些其他實施態樣中，該腫瘤係結腸腫瘤。在一些實施態樣中，該腫瘤係肺腫瘤。在某些實施態樣中，該方法係活體內方法。在某些實施態樣中，該方法係活體外方法。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑係RSPO3結合劑。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體131R002。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體131R003。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體131R003之變異體。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係人化版本之抗體131R002。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係人化版本之抗體131R003。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體131R003之變異體之人化版本。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體h131R006A或抗體h131R006B。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體h131R005/131R007。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體h131R008。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體h131R010。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體h131R011。
本發明另提供使腫瘤發生細胞分化成非腫瘤發生細胞之方法，該方法包含使該腫瘤發生細胞與RSPO結合劑接觸。在一些實施態樣中，該方法包含對個體投予 該RSPO結合劑，該個體具有包含腫瘤發生細胞之腫瘤或該包含腫瘤發生細胞之腫瘤已被移除。在某些實施態樣中，該腫瘤發生細胞係卵巢腫瘤細胞。在某些實施態樣中，該腫瘤發生細胞係結腸腫瘤細胞。在一些實施態樣中，該腫瘤發生細胞係肺腫瘤細胞。在一些實施態樣中，該RSPO結合劑係RSPO3結合劑。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體131R002。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體131R003。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體131R003之變異體。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係人化版本之抗體131R002。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係人化版本之抗體131R003。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體131R003之變異體之人化版本。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體h131R006A或抗體h131R006B。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體h131R005/131R007。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體h131R008。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體h131R010。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑係抗體h131R011。
在某些實施態樣中，由此處所述之RSPO3結合劑治療之疾病不是癌。舉例來說，該疾病可能是代謝性疾病如肥胖或糖尿病(例如第二型糖尿病)(Jin T.,2008,Diabetologia,51：1771-80)。或者，該疾病可能是骨骼疾病如骨質疏鬆症、骨關節炎或類風濕性關節炎 (Corr M.,2008,Nat.Clin.Pract.Rheumatol.,4：550-6；Day et al.,2008,Bone Joint Surg.Am.,90 Suppl 1：19-24)。該疾病也可能是腎病如多囊性腎病(Harris et al.,2009,Ann.Rev.Med.,60：321-337；Schmidt-Ott et al.,2008,Kidney Int.,74：1004-8；Benzing et al.,2007,J.Am.Soc.Nephrol.,18：1389-98)。或者，可治療眼睛疾病包括但不限於黃斑變性及家族性滲出性玻璃體視網膜病(Lad et al.,2009,Stem Cells Dev.,18：7-16)。也可治療心血管疾病，包括心肌梗塞、動脈粥樣硬化及瓣膜疾病(Al-Aly Z.,2008,Transl.Res.,151：233-9；Kobayashi et al.,2009,Nat.Cell Biol.,11：46-55；van Gijn et al.,2002,Cardiovasc.Res.,55：16-24；Christman et al.,2008,Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.,294：H2864-70)。在一些實施態樣中，該疾病係肺疾病如自發性肺動脈性高血壓或肺纖維化(Laumanns et al.,2008,Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.,2009,40：683-691；Königshoff et al.,2008,PLoS ONE,3：e2142)。在一些實施態樣中，以RSPO3結合劑治療之疾病是肝病，如肝硬化或肝纖維化(Cheng et al.,2008,Am.J.Physiol.Gastrointest.Liver Physiol.,294：G39-49)。
本發明另提供包含此處所述之RSPO3結合劑之醫藥組成物。在某些實施態樣中，該醫藥組成物另包含醫藥上可接受之載具。在一些實施態樣中，該等醫藥組成物於個體(例如人病患)中具有抑制腫瘤生長及治療癌之 用途。
在某些實施態樣中，供儲存及使用之調製劑係藉由組合本發明之經純化之抗體或劑與醫藥上可接受之載具(例如載劑或賦形劑)加以製備。適當之醫藥上可接受之載具包括但不限於非毒性緩衝劑諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；鹽諸如氯化鈉；抗氧化劑包括抗壞血酸及甲硫胺酸；保存劑諸如十八基二甲基苄基氯化銨、六甲氯胺、氯化苯甲烴銨、氯化苄乙氧銨、酚醇、丁醇、苄醇、烷基對羥苯甲酸酯類諸如對羥苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環己醇、3-戊醇及間甲酚；低分子量多肽(例如少於約10個胺基酸殘基)；蛋白質諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物諸如聚乙烯基吡咯烷酮；胺基酸諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；碳水化合物諸如單醣、雙醣、葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合劑諸如EDTA；糖類諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；鹽形成反離子諸如鈉；金屬複合物(例如鋅蛋白質複合物)；及非離子性界面活性劑諸如TWEEN或聚乙二醇(PEG)。(Remington：The Science and Practice of Pharmacy,22 st Edition,2012,Pharmaceutical Press,London.)
本發明之醫藥組成物可以任何數量之方式經局部或系統投予。投予可為藉由表皮貼片、經皮貼片、軟膏、乳液、乳膏、膠劑、滴劑、栓劑、噴劑、液劑及粉劑之局部投予；藉由吸入或噴入粉劑或氣霧劑之經肺投予， 包括藉由噴霧器、氣管內或鼻內投予；經口；或非經腸投予包括靜脈內、動脈內、腫瘤內、皮下、腹膜內、肌肉內(例如注射或輸注)或顱內(例如脊椎鞘內或心室內)投予。
該治療調製劑可呈單位劑量形式。該等調製劑包括錠劑、丸劑、膠囊、粉劑、顆粒劑、水或非水性介質之溶液或懸浮液、或栓劑。在固態組成物諸如錠劑中，該主要活性成分係與醫藥載劑混合。習用之製錠成分包括玉米澱粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂、磷酸二鈣或膠、及稀釋劑(例如水)。這些可被用來形成含有本發明之化合物或彼之無毒性、醫藥上可接受之鹽的均質混合物之固體預調製組成物。該固體預調製組成物接著被分成上述種類之單位劑量形式。錠劑、丸劑等調製劑或組成物可經包覆或經其他方式複合以提供提供具有長效優點之劑型。舉例來說，錠劑或丸劑可包含由外部成份包覆之內部組成物。另外，該兩種成份可以腸溶層分開，該腸溶層用來抵抗崩解，以使該內部成份完整通過胃或被延遲釋放。多種物質可被用於該腸溶層或包覆層，該等物質包括多種聚合酸及聚合酸與諸如蟲膠、鯨臘醇及醋酸纖維素之物質之混合物。
此處所述之RSPO3結合劑或抗體亦可被包封於微膠囊中。該等微膠囊藉由例如凝聚技術或藉由界面聚合化製備，例如分別於於膠體藥物遞送系統中(例如脂質體、白蛋白微球、微乳化液、奈米微粒及奈米微囊)或於 巨乳化液中之羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚-(異丁烯酸甲酯)微膠囊，如The Science and Practice of Pharmacy,22 st Edition,2012,Pharmaceutical Press,London所述。
在某些實施態樣中，醫藥調製劑包括與脂質體複合之本發明之RSPO3結合劑(例如抗體)。產製脂質體之方法係該領域之技藝人士所知。舉例來說，有些脂質體可利藉由逆相蒸發含有磷脂醯膽鹼、膽固醇及PEG-衍生性磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)之脂質組成物加以產製。脂質體可被擠壓通過定義孔徑大小之濾網以產生具有所欲直徑之脂質體。
在某些實施態樣中，持續釋放之製劑可被產製。持續釋放製劑之適當實例包括含有RSPO3結合劑(例如抗體)之固相疏水性聚合物之半透性基體，其中該基體係呈形狀物件之形式(例如膜或微膠囊)。持續釋放基體之實例包括聚酯、水凝膠(諸如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚乙烯醇)、聚交酯、L-麩胺酸及7乙基-L-麩胺酸鹽之共聚物、不可降解之乙烯-乙酸乙烯酯、可降解之乳酸-乙醇酸共聚物諸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物及柳菩林(leuprolide acetate)所組成之注射型微球)、蔗糖乙酸異丁酸酯及聚-D-(-)-3-羥丁酸。
在某些實施態樣中，除了投予RSPO3結合劑(例如抗體)之外，該方法或治療另包含投予至少一種額 外之治療劑。額外之治療劑可於投予該RSPO3結合劑之前、之同時及/或之後投予。本發明亦提供包含RSPO3結合劑與該額外治療劑之醫藥組成物。在一些實施態樣中，該至少一種額外治療劑包含1、2、3或更多種額外之治療劑。
含有二種或二種以上治療劑之組合療法通常使用具有不同作用機轉之劑，雖然並非必要。使用不同作用機轉之劑的組合療法可能導致加成或協同效應。組合療法可能允許相較於單一療法使用較低劑量之各劑，藉以減少該(等)劑之毒性不良反應及/或增加治療指數。組合療法可能減少抗藥性癌細胞發生之可能性。在一些實施態樣中，組合療法包含影響(例如抑制或殺滅)非腫瘤發生性細胞之治療劑及影響(例如抑制或殺滅)腫瘤發生性CSC之治療劑。
在一些實施態樣中，RSPO3結合劑與至少一種額外治療劑之組合導致加成或協同效果。在一些實施態樣中，該組合療法導致該RSPO3結合劑之治療指數增加。在一些實施態樣中，該組合療法導致該額外劑之治療指數增加。在一些實施態樣中，該組合療法導致該RSPO3結合劑之毒性及/或不良反應減少。在一些實施態樣中，該組合療法導致該額外劑之毒性及/或不良反應減少。
有用類別之治療劑包括例如抗微管蛋白劑、耳抑素、DNA次要凹槽結合劑、DNA複製抑制劑、烷化劑(例如鉑複合物諸如順鉑(cisplatin)、單(鉑)、二 (鉑)及三核鉑複合物及卡鉑(carboplatin))、蒽環類(anthracycline)、抗生素、抗葉酸劑、抗代謝物、化學療法致敏劑、雙聯黴素(duocarmycin)、依托泊苷(etoposide)、氟化嘧啶、離子載體、萊克西托素(lexitropsin)、亞硝基尿素、普拉汀諾(platinol)、嘌呤抗代謝物、嘌呤黴素(puromycin)、放射線致敏劑、類固醇、紫杉烷、拓撲異構酶抑制劑、長春花生物鹼或該類似物。在某些實施態樣中，第二治療劑係烷化劑、抗代謝物、抗有絲分裂劑、拓撲異構酶抑制劑或血管生成抑制劑。在一些實施態樣中，第二治療劑係鉑複合物諸如卡鉑或順鉑。在一些實施態樣中，該額外之治療劑係鉑複合物與紫杉烷之組合。
可與RSPO3結合劑組合投予之治療劑包括化學治療劑。因此，在一些實施態樣中，該方法或治療牽涉投予本發明之RSPO3結合劑或抗體與化學治療劑或多種不同化學治療劑之雞尾酒組合之組合。RSPO3結合劑(例如抗體)之治療可發生於投予化學治療之前、之同時或之後。組合投予可包括於單一醫藥調製劑中共投或利用分開之調製劑共投，或以任何順序連續投予但通常在一段期間內以使所有活性劑可同步展現彼等之生物活性。該等化學治療劑之準備及投予計畫可根據製造商之說明使用或由經驗豐富之醫生憑經驗決定。該等化學治療之準備及投予計畫亦描述於The Chemotherapy Source Book,4 th Edition,2008,M.C.Perry,Editor,Lippincott,Williams & Wilkins, Philadelphia,PA。
可用於本發明之化學治療劑包括但不限於：烷化劑諸如噻替派(thiotepa)及環磷醯胺(cyclophosphamide)(CYTOXAN)；烷基磺酸鹽諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶諸如苯多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、甲基優瑞多巴(meturedopa)及優瑞多巴(uredopa)；伸乙亞胺(ethylenimines)及甲基三聚氰胺(methylmelamines)包括阿草特胺(altretamine)、三亞乙基三聚氰胺(triethylenemelamine)、三乙烯磷醯胺(trietylenephosphoramide)、三乙烯硫磷醯胺(triethylenethiophosphoramide)及三羥甲基三聚氰胺(trimethylolmelamime)；氮芥子氣諸如氯芥苯丁酸(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯膦醯胺(cholophosphamide)、雌二醇氮芥(estramustine)、異環磷酸胺(ifosfamide)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、黴法蘭(melphalan)、新氮芥(novembichin)、膽甾醇苯乙酸氮芥(phenesterine)、松龍苯芥(prednimustine)、氯乙環磷醯胺(trofosfamide)、尿嘧啶芥(uracil mustard)；亞硝基脲(nitrosourea)諸如卡氮芥(carmustine)、吡葡亞硝脲(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、羅氮芥(lomustine)、尼氮芥(nimustine)、雷諾氮芥 (ranimustine)；抗生素諸如阿克拉黴素(aclacinomycin)、放線菌素(actinomycin)、安曲黴素(anthramycin)、氮絲胺酸(azaserine)、博來黴素(bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、卡利奇黴素(calicheamicin)、卡拉比辛(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌素(carzinophilin)、色黴素(chromomycin)、達克黴素(dactinomycin)、正定黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-羰基-L-正白胺酸、多柔比星(doxorubicin)、表阿黴素(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycins)、黴酚酸、諾加黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、波弗黴素(porfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、三鐵阿黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黴黑素(streptonigrin)、鏈脲佐菌素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、鳥苯美司(ubenimex)、新制癌菌素(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝劑諸如甲胺喋呤(methotrexate)及5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物諸如二甲葉酸(denopterin)、甲胺喋呤、蝶羅呤(pteropterin)、三甲蝶呤(trimetrexate)；嘌呤類似物諸如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物諸如安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷 (azacitidine)、6-硫唑脲嘧啶(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、胞嘧啶阿拉伯糖苷、二去氧尿苷、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、5-FU；雄性素諸如卡魯睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、硫雄甾醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪內酮(testolactone)；抗腎上腺劑諸如胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑諸如亞葉酸；醋葡醛內酯(aceglatone)；醛磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；胺基酮戊酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；貝斯特氮芥(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依達曲沙(edatrexate)；度弗胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾弗密素(elformithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸鎵(gallium nitrate)；羥基脲；香菇糖(lentinan)；氯尼達明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；噴司他丁(pentostatin)；蛋胺氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基醯肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK；雷佐生(razoxane)；西佐喃(sizofuran)；鍺螺 胺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺(2,2',2"-trichlorotriethylamine)；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(Ara-C)；類紫杉醇(taxoids)例如太平洋紫杉醇(TAXOL)及多西紫杉醇(TAXOTERE)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他濱(gemcitabine)；6-硫鳥嘌呤；巰嘌呤(mercaptopurine)；鉑類似物諸如順鉑(cisplatin)及卡鉑(carboplatin)；長春鹼(vinblastine)；鉑(platinum)；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；異環磷醯胺(ifosfamide)；絲裂黴素C；米托蒽醌(mitoxantrone)；長春新鹼(vincristine)；長春瑞濱(vinorelbine)；溫諾平(navelbine)；米托蒽醌(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；道諾黴素(daunomycin)；胺喋呤(aminopterin)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；CPT11；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；視黃酸；埃斯培拉黴素(esperamicin)；卡培他濱(capecitabine)(XELODA)及上述任一劑之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。化學治療劑亦包括用來調節或抑制荷爾蒙對腫瘤之作用的抗荷爾蒙劑，諸如抗雌激素劑包括例如它莫西芬(tamoxifen)、雷洛昔芬 (raloxifene)、芳香酶抑制劑4(5)-咪唑、4-羥基它莫西芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)及托瑞米芬(toremifene)(FARESTON)；及抗雄性素劑諸如氟他胺(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、柳普林(leuprolide)及戈舍瑞林(goserelin)；及上述任一劑之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。在某些實施態樣中，該額外治療劑係順鉑。在某些實施態樣中，該額外治療劑係卡鉑。在某些實施態樣中，該額外治療劑係太平洋紫杉醇(紫杉醇(taxol))。在一些實施態樣中，該方法包含投予抗RSPO3抗體131R002、131R003、131R003之變異體、131R006A、131R006B、131R005/131R007或131R008與順鉑之組合。
在某些實施態樣中，該化學治療劑係拓撲異構酶抑制劑。拓撲異構酶抑制劑係干擾拓撲異構酶(例如拓撲異構酶I或II)之活性的化學治療劑。拓撲異構酶抑制劑包括但不限於鹽酸多柔比星(doxorubicin HCl)、檸檬酸正定黴素(daunorubicin citrate)、鹽酸米托蒽醌(mitoxantrone HCl)、放線菌素D、依托泊苷(etoposide)、鹽酸拓撲替康(topotecan HCl)、替尼泊苷(teniposide)(VM-26)及伊立替康(irinotecan)，以及這些任一劑之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。在一些實施態樣中，該額外治療劑係伊立替康。因此，在一些 實施態樣中，該方法包含投予RSPO3結合劑與拓撲異構酶抑制劑之組合。在一些實施態樣中，該方法包含投予抗RSPO3抗體131R002、131R003、131R003之變異體、人化版本之131R003、h131R006A、h131R006B、h131R005/131R007、h131R008、h131R010或h131R011與伊立替康之組合。
在某些實施態樣中，該化學治療劑係抗代謝劑。抗代謝劑係一化學物質，其結構類似正常生化反應所需之代謝物，但仍有足夠之不同處以干擾一或多種細胞正常功能，諸如細胞分裂。抗代謝劑包括但不限於吉西他濱(gemcitabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、卡培他濱(capecitabine)、甲胺喋呤鈉、雷替曲塞(ralitrexed)、培美曲塞(pemetrexed)、替加氟(tegafur)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosine arabinoside)、硫鳥嘌呤、5-氮雜胞苷、6-巰基嘌呤、硫唑嘌呤、6-硫鳥嘌呤、噴司他丁(pentostatin)、磷酸氟達拉濱(fludarabine phosphate)及克拉屈濱(cladribine)，以及這些任一劑之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。在某些實施態樣中，該額外治療劑係吉西他濱。因此，在一些實施態樣中，該方法包含投予RSPO3結合劑與抗代謝劑之組合。在一些實施態樣中，該方法包含投予抗RSPO3抗體131R002、131R003、131R003之變異體、人化版本之131R003、h131R006A、h131R006B、h131R005/131R007、h131R008、h131R010或h131R011 與吉西他濱之組合。在一些實施態樣中，該方法包含投予抗RSPO3抗體131R002、131R003、131R003之變異體、人化版本之131R003、h131R006A、h131R006B、h131R005/131R007、h131R008、h131R010或h131R011與培美曲塞之組合。
在某些實施態樣中，該化學治療劑係抗有絲分裂劑，包括但不限於與微管蛋白結合之劑。在一些實施態樣中，該劑係紫杉烷。在某些實施態樣中，該劑係太平洋紫杉醇(paclitaxel)或多西紫杉醇(docetaxel)，或太平洋紫杉醇或多西紫杉醇之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。在某些實施態樣中，該劑係太平洋紫杉醇(TAXOL)、多西紫杉醇(TAXOTERE)、白蛋白結合型太平洋紫杉醇(nab-paclitaxel；ABRAXANE)、DHA-太平洋紫杉醇或PG-太平洋紫杉醇。在某些替代性實施態樣中，該抗有絲分裂劑包含長春花生物鹼，諸如長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、長春瑞濱(vinorelbine)或長春地辛(vindesine)或彼等之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。在一些實施態樣中，該抗有絲分裂劑係驅動蛋白(kinesin)Eg5之抑制劑或有絲分裂激酶諸如Aurora A或Plk1之抑制劑。在某些實施態樣中，當該與RSPO結合劑組合投予之化學治療劑係抗有絲分裂劑時，該經治療之癌或腫瘤係乳癌或乳房腫瘤。在一些實施態樣中，該方法包含投予抗RSPO3抗體131R002、131R003、131R003之變異體、人化版本之131R003、 h131R006A、h131R006B、h131R005/131R007、h131R008、h131R010或h131R011與太平洋紫杉醇之組合。在一些實施態樣中，該方法包含投予抗RSPO3抗體131R002、131R003、131R003之變異體、人化版本之131R003、h131R006A、h131R006B、h131R005/131R007、h131R008、h131R010或h131R011與白蛋白結合型太平洋紫杉醇(ABRAXANE)之組合。在一些實施態樣中，該方法包含投予抗RSPO3抗體131R002、131R003、131R003之變異體、人化版本之131R003、h131R006A、h131R006B、h131R005/131R007、h131R008、h131R010或h131R011與吉西他濱及白蛋白結合型太平洋紫杉醇(ABRAXANE)之組合。
在一些實施態樣中，額外治療劑包含諸如小分子之劑。舉例來說，治療可涉及組合投予本發明之RSPO3結合劑(例如抗體)與作為其他腫瘤相關性蛋白質之抑制劑的小分子，其他腫瘤相關性抗原包括但不限於EGFR、ErbB2、HER2及/或VEGF。在某些實施態樣中，該額外治療劑係抑制癌幹細胞途徑之小分子。在一些實施態樣中，該額外治療劑係缺口途徑之抑制劑。在一些實施態樣中，該額外治療劑係Wnt途徑之抑制劑。在一些實施態樣中，該額外治療劑係BMP途徑之抑制劑。在一些實施態樣中，該額外治療劑係抑制β-連環蛋白傳訊之分子。
在一些實施態樣中，額外治療劑包含生物性 分子像是抗體。舉例來說，治療可涉及組合投予本發明之RSPO3結合劑(例如抗體)與拮抗其他腫瘤相關性抗原之其他抗體，包括但不限於與EGFR、ErbB2、HER2及/或VEGF結合之抗體。在一些實施態樣中，該額外治療劑係與第二RSPO(例如RSPO1、RSPO2及/或RSPO4)結合之抗體。在一些實施態樣中，該額外治療劑係抗RSPO2抗體。在一些實施態樣中，該額外治療劑係抗RSPO1抗體。在某些實施態樣中，該額外治療劑係抗癌幹細胞標記之抗體。在一些實施態樣中，該額外治療劑係與缺口途徑之成份結合之抗體。在一些實施態樣中，該額外治療劑係與Wnt途徑之成份結合之抗體。在某些實施態樣中，該額外治療劑係抑制癌幹細胞途徑之抗體。在一些實施態樣中，該額外治療劑係缺口途徑之抑制劑。在一些實施態樣中，該額外治療劑係Wnt途徑之抑制劑。在一些實施態樣中，該額外治療劑係BMP途徑之抑制劑。在一些實施態樣中，該額外治療劑係抑制β-連環蛋白傳訊之抗體。在某些實施態樣中，該額外治療劑係血管生成抑制劑之抗體(例如抗VEGF或VEGF受體抗體)。在某些實施態樣中，該額外治療劑係貝伐珠單抗(bevacizumab)(AVASTIN)、曲妥珠單抗(trastuzumab)(HERCEPTIN)、帕尼單抗(panitumumab)(VECTIBIX)或西妥昔單抗(cetuximab)(ERBITUX)。
在一些實施態樣中，此處所述之該等方法包含投予治療有效量之RSPO3結合劑與Wnt途徑抑制劑之 組合。在一些實施態樣中，該Wnt途徑抑制劑為捲曲(FZD)蛋白結合劑(FZD結合劑)。FZD結合劑之非限制性實例可見於美國專利第7,982,013號，其以參照方式整體納入此處。FZD結合劑可包括但不限於抗FZD抗體。在一些實施態樣中，該方法包含投予RSPO結合劑與抗FZD抗體之組合。在一些實施態樣中，該方法包含投予RSPO結合劑與抗FZD抗體18R5之組合。在一些實施態樣中，該Wnt途徑抑制劑為Wnt蛋白結合劑(Wnt結合劑)。Wnt結合劑之非限制性實例可見於美國專利第7,723,477及7,947,277號、國際專利公開號WO 2011/088127及WO 2011/088123，彼等以參照方式整體納入此處。Wnt結合劑可包括但不限於抗Wnt抗體及FZD-Fc可溶性受體。在一些實施態樣中，該方法包含投予RSPO3結合劑與FZD-Fc可溶性受體之組合。在一些實施態樣中，該方法包含投予RSPO3結合劑與FZD8-Fc可溶性受體之組合。在一些實施態樣中，該方法包含投予RSPO3結合劑與抗FZD抗體之組合。在一些實施態樣中，該方法包含投予抗RSPO3抗體131R002、131R003、131R003之變異體、人化版本之131R003、h131R006A、h131R006B、h131R005/131R007、h131R008、h131R010或h131R011與抗FZD抗體之組合。在一些實施態樣中，該方法包含投予抗RSPO3抗體131R002、131R003、131R003之變異體、人化版本之131R003、h131R006A、h131R006B、h131R005/131R007、h131R008、h131R010 或h131R011與抗FZD抗體18R5之組合。在一些實施態樣中，該方法包含投予抗RSPO3抗體131R002、131R003、131R003之變異體、人化版本之131R003、h131R006A、h131R006B、h131R005/131R007、h131R008、h131R010或h131R011與FZD-Fc可溶性受體之組合。在一些實施態樣中，該方法包含投予抗RSPO3抗體131R002、131R003、131R003之變異體、人化版本之131R003、h131R006A、h131R006B、h131R005/131R007、h131R008、h131R010或h131R011與FZD8-Fc可溶性受體之組合。
在一些實施態樣中，此處所述之該等方法包含投予治療有效量之RSPO結合劑與一種以上之額外治療劑之組合。因此，在一些實施態樣中，該方法包含投予RSPO結合劑與化學治療劑及Wnt途徑抑制劑之組合。在一些實施態樣中，該方法包含投予RSPO3結合劑與化學治療劑及Wnt途徑抑制劑之組合。在一些實施態樣中，該方法包含投予RSPO3結合劑與化學治療劑及抗FZD抗體18R5之組合。在一些實施態樣中，該方法包含投予RSPO3結合劑與化學治療劑及FZD8-Fc可溶性受體之組合。在一些實施態樣中，該方法包含投予RSPO3結合劑與吉西他濱及Wnt途徑抑制劑之組合。在一些實施態樣中，該方法包含投予抗RSPO3抗體131R002、131R003、131R003之變異體、人化版本之131R003、h131R006A、h131R006B、h131R005/131R007、h131R008、h131R010 或h131R011與吉西他濱及抗FZD抗體18R5之組合。在一些實施態樣中，該方法包含投予抗RSPO3抗體131R002、131R003、131R003之變異體、人化版本之131R003、h131R006A、h131R006B、h131R005/131R007、h131R008、h131R010或h131R011與吉西他濱及FZD8-Fc可溶性受體之組合。
另外，以此處所述之RSPO3結合劑治療可包括與其他生物分子組合治療，像是一或多種細胞介素(例如淋巴介質、介白素、腫瘤壞死因子及/或生長因子)，或可伴隨手術移除腫瘤、癌細胞或任何其他醫師認為必要之治療。
在某些實施態樣中，該治療涉及投予本發明之RSPO3結合劑(例如抗體)與放射治療之組合。RSPO3結合劑之治療可發生於投予放射治療之前、之同時或之後。該放射治療之投予計畫可由經驗豐富之醫生決定。
組合投予可包括於單一醫藥調製劑中共投或利用分開之調製劑共投，或以任何順序連續投予但通常在一段期間內以使所有活性劑可同步展現彼等之生物活性。
將了解的是，RSPO3結合劑與至少一種額外治療劑之組合可以任何順序投予或同時投予。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑將被投予至已先接受第二治療劑治療之病患。在某些其他實施態樣中，該RSPO3結合劑與第二治療劑將被實質上同步或同時投予。舉例來說， 個體可能在接受第二治療劑(例如化學治療)之療程時被給予RSPO3結合劑(例如抗體)。在某些實施態樣中，RSPO3結合劑將於接受第二治療劑治療之一年內被投予。在某些替代性實施態樣中，RSPO3結合劑將於接受第二治療劑之任何治療的10、8、6、4或2個月內被投予。在某些其他實施態樣中，RSPO3結合劑將於接受第二治療劑之任何治療的4、3、2或1周內被投予。在一些實施態樣中，RSPO3結合劑將於接受第二治療劑之任何治療的5、4、3、2或1天內被投予。將另外了解的是，該二(或多)種劑或治療可在數小時或數分鐘內(即實質上同步)被投予至個體。
以疾病之治療而言，本發明之RSPO3結合劑(例如抗體)之適當劑量取決於所欲治療之疾病類型、該疾病之嚴重性及病程、該疾病之反應性、該RSPO3結合劑或抗體係經投予以達治療或預防目的、先前治療、該病患之臨床病史等，所有皆由主治醫師斟酌。該RSPO3結合劑或抗體可經投予一次或在數天至數月期間之治療系列投予，或直到達成療效或達到減少之疾病狀態(例如腫瘤大小減少)。理想投藥計畫可自藥物累積於病患體內之測量值加以計算，且將視個別抗體或劑之相對強度而異。主治醫師可輕易地決定理想劑量、投藥方法及重複頻率。在某些實施態樣中，劑量係0.01μg至100mg/kg體重、0.1μg至100mg/kg體重、1μg至100mg/kg體重、1mg至100mg/kg體重、1mg至80mg/kg體重、10mg至100mg/kg 體重、10mg至75mg/kg體重、或10mg至50mg/kg體重。在某些實施態樣中，該抗體或其他RSPO3結合劑之劑量係約0.1mg至約20mg/kg體重。在某些實施態樣中，劑量可於每天、每周、每月或每年給予一次或多次。在某些實施態樣中，該抗體或其他RSPO3結合劑係每周給予一次、每二周給予一次或每三周給予一次。
在一些實施態樣中，RSPO3結合劑(例如抗體)可以一開始較高之「起始」劑量投予，之後投予一或多次較低劑量。在一些實施態樣中，投予之頻率亦可能改變。在一些實施態樣中，投藥計畫可能包含投予初始劑量，然後每周、每二周、每三周或每月投予一次額外劑量(或「維持」劑量)。舉例來說，投藥計畫可能包含投予起始劑量，然後投予例如一半起始劑量之每周維持劑量。或投藥計畫可能包含投予起始劑量，然後每隔一周投予例如一半起始劑量之維持劑量。或投藥計畫可能包含三周投予三次起始劑量，然後每隔一周投予例如相同量之維持劑量。
如該領域之技藝人士所知，投予任何治療劑可能導致不良反應及/或毒性。在一些情況中，不良反應及/或毒性非常嚴重以至於無法投予治療有效劑量之特定劑。在一些情況中，藥物治療必須中斷，並嘗試其他劑。然而，許多相同治療類別之劑通常展現類似之不良反應及/或毒性，表示病患必須停止治療，或可能的話忍受與該治療劑有關之不適不良反應。
因此，本發明提供治療個體之癌之方法，該方法包含利用間歇性投藥計畫投予一或多劑，如此可能減少與投予RSPO3結合劑、化學治療劑等有關之不良反應及/或毒性。在一些實施態樣中，治療人個體之癌之方法包含對該個體投予治療有效劑量之RSPO3結合劑與治療有效劑量之化學治療劑之組合，其中該一或二種劑係根據間歇性投藥計畫投予。在一些實施態樣中，該間歇性投藥計畫包含對該個體投予初始劑量之RSPO3結合劑，接著大約每2周投予一次RSPO3結合劑之後續劑量。在一些實施態樣中，該間歇性投藥計畫包含對該個體投予初始劑量之RSPO3結合劑，接著大約每3周投予一次RSPO3結合劑之後續劑量。在一些實施態樣中，該間歇性投藥計畫包含對該個體投予初始劑量之RSPO3結合劑，接著大約每4周投予一次RSPO3結合劑之後續劑量。在一些實施態樣中，該RSPO3結合劑利用間歇性投藥計畫投予，且該化學治療劑每周投予。
V.包含RSPO結合劑之套組
本發明提供包含此處所述之RSPO3結合劑(例如抗體)之套組，其可被用於實施此處所述之方法。在某些實施態樣中，套組包含於一或多個容器中之至少一種經純化之抗至少一種人RSPO蛋白之抗體。在一些實施態樣中，該套組包含所有實施檢測試驗所必需及/或足以實施檢測試驗之成份，包括所有對照物、使用說明及任何 必要軟體以供結果分析及表現。該領域之技藝人士將顯而易見的是，本發明所揭示之RSPO3結合劑可被輕易納入該領域所廣為周知之已建立之套組格式之一。
本發明另提供包含RSPO3結合劑(例如抗RSPO3抗體)以及至少一種額外治療劑之套組。在某些實施態樣中，該第二(或更多)治療劑係化學治療劑。在某些實施態樣中，該第二(或更多)治療劑係Wnt途徑抑制劑。在某些實施態樣中，該第二(或更多)治療劑係血管生成抑制劑。
本發明之實施態樣可藉由參考下列非限制性實施例進一步定義，以下實施例描述本發明之某些抗體之詳細製備及使用本發明之抗體之方法。該領域之技藝人士將顯而易見的是，許多在材料及方法上之調整可加以實施而不背離本發明之範圍。
實施例1 RSPO及LGR在人腫瘤中之表現
來自大量人病患之正常組織、良性腫瘤及惡性腫瘤樣本的mRNA藉由微陣列技術(Genelogic BioExpress Datasuite)分析。此資料顯示在多種腫瘤類型包括腎、子宮內膜及卵巢之惡性組織中，RSPO1的表現量相較於正常組織上升。注意到RSPO1經常過度表現於卵巢癌(圖1A)。此外，此資料顯示在多種腫瘤類型包括卵巢、胰臟及肺臟之惡性組織中，RSPO3的表現量相較於 正常組織上升(圖1C)。此外發現，相較於正常組織，LGR5及LGR6過度表現於惡性乳房腫瘤、結腸腫瘤、肺臟腫瘤及卵巢腫瘤，然而LGR4過度表現於肺臟腫瘤。相較於其他乳房腫瘤亞型，LGR5及LGR6之過度表現似乎局限於三陰性(ERnegPRnegHER2neg)乳房腫瘤。
RNA係分離自生長於鼠異種移植之一系列人腫瘤。該RNA樣本利用已建立之用於產製標記cRNA之Affymetrix程序製備及處理。該經處理之RNA與Affymetrix HG-U133 plus 2.0微陣列(Affymetrix,Santa Clara,CA)雜交，如廠商技術手冊所述。在雜交後，該微陣列係經清洗、掃描及分析。經掃描之陣列背景調整及信號強度正常化利用GCRMA演算法(Bioconductor,www.bioconductor.org)進行。
特定人RSPO及人LGR係經評估：RSPO1(241450_at)、RSPO2(1554012_at)、RSPO3(228186_s_at)、RSPO4(237423_at)、LGR4(218326_s_at)、LGR5(210393_at)及LGR6(227819_at)。微陣列分析顯示，雖然LGR4及LGR6廣泛表現於幾乎所有腫瘤，發現許多腫瘤大幅過度表現僅特定RSPO家族成員及LGR5(表2)，雖然這些表現量並未與正常組織中之表現量比較。通常在給定腫瘤中只有單一RSPO家族成員係高度表現，顯示在該RSPO家族內可能有功能性重複。
實施例2 RSPO蛋白與LGR5之結合
細胞表面LGR5蛋白係藉由連接人LGR5之胺基酸22至564與N端FLAG標籤，再連接CD4之跨膜結 構域與C端GFP蛋白標籤(FLAG-LGR5-CD4TM-GFP)，使用標準重組DNA技術產製。RSPO-Fc建構體利用標準重組DNA技術產製。特別地，全長人RSPO1、RSPO2、RSPO3及RSPO4係符合讀框地連接至人Fc區，該重組RSPO-Fc蛋白利用桿狀病毒(baculovirus)於昆蟲細胞表現。該融合蛋白利用蛋白A層析自該昆蟲培養基純化。
HEK-293細胞係利用該FLAG-LGR5-CD4TM-GFP建構體過渡性轉染。經48小時後，將轉染細胞懸浮於包含2% FBS及肝素之冰冷PBS中，並於10μg/ml RSPO1-Fc、RSPO2-Fc、RSPO3-Fc、RSPO4-Fc或FZD8-Fc融合蛋白存在下培養15分鐘。以100μl PE共軛之抗人Fc二級抗體進行二次培養以檢測與Fc融合蛋白結合之細胞。與抗FLAG抗體(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)培養之細胞作為陽性對照，與抗PE抗體培養者作為陰性對照。該等細胞於FACSCalibur設備(BD Biosciences,San Jose,CA)上分析，資料利用FlowJo軟體處理。
如圖2所示，RSPO1、RSPO2、RSPO3及RSPO4皆與表現在HEK-293細胞表面上之LGR5結合，然而FZD8(陰性對照)不與LGR5結合。
RSPO蛋白與LGR5之間的結合親和性藉由表面電漿共振分析。可溶性LGR5-Fc建構體利用標準重組DNA技術產製。特別地，人LGR5之胺基酸1至564係符合讀框地連接至人Fc，該重組LGR5-Fc融合蛋白利用桿 狀病毒於昆蟲細胞表現。該LGR5-Fc融合蛋白利用蛋白A層析自該昆蟲培養基純化。切割該LGR5信號序列導致包含LGR5之胺基酸22至564之成熟LGR5-Fc融合蛋白。重組RSPO1-Fc、RSPO2-Fc、RSPO3-Fc及RSPO4-Fc融合蛋白利用標準胺基底化學(NHS/EDC)固定於CM5晶片。將二倍稀釋之可溶性LGR5-Fc注射至晶片表面(100nM至0.78nM)。利用Biacore Life Sciences(GE Healthcare)的Biacore 2000系統收集不同時間的動力學資料，並利用同步整體擬合方程式擬合資料，以產生各RSPO蛋白之親和常數(KD值)(表3)。
人RSPO1、RSPO2、RSPO3及RSPO4皆與LGR5結合，顯示RSPO蛋白可能是LGR蛋白之配體。
實施例3 識別抗RSPO3抗體
篩選哺乳動物細胞抗體庫，識別二種抗RSPO3抗體131R002及131R003。後續之序列資料顯示，抗體131R002及131R003具有相同的輕鏈序列但不同的重鏈序列。
抗體131R002及131R003的KD係利用Biacore LifeSciences(GE Healthcare)的Biacore 2000系統測定。重組人RSPO3蛋白係經生物素基化，並以400至700ru包覆密度被捕捉於鏈黴抗生物素蛋白包覆晶片(GE Healthcare)上。該等抗體以HBS-P(0.01M HEPES pH7.4，0.15M NaCl，0.005% v/v表面活性劑P20)自100nM連續2倍稀釋至0.78nM，並注射於晶片表面。收集一段時間之動力學資料並將該等動力學資料利用同步整體擬合方程式擬合以產生各抗體之親和性常數(KD值)。
抗體131R002對人RSPO3之親和常數(KD)為8.2nM，抗體131R003對人RSPO3之KD為7.3nM。
實施例4 抗RSPO3抗體抑制 β-連環蛋白活性之試管內測試
HEK-293細胞係經6倍TCF-螢光素酶報告載體(TOPflash,Millipore,Billerica,MA)轉染。經24至48小時後，該經轉染之HEK-293細胞在抗RSPO3抗體131R002及131R003存在下，與WNT3a(5ng/ml)及人RSPO3(10ng/ml,R&D BioSystems,Minneapolis,MN)之組合一起培養。在細胞中添加經四倍連續稀釋20μg/ml至0.02μg/ml之抗體131R002及131R003。在對照方面，細胞與WNT3a及RSPO3之組合、僅WNT3a、僅RSPO3或無添加下一起培養。該等細胞經培養16小時後，利用 Steady-Glo®螢光素酶檢測系統(Promega,Madison,WI)如廠商說明所述測量螢光素酶活性。
如圖3所示，抗RSPO3抗體131R002及131R003各自以劑量依賴形式減少RSPO3誘導之β-連環蛋白傳訊。這些結果證實，抗體131R002及131R003為RSPO3之特異性抑制劑，且能減少及/或阻斷RSPO3誘導之β-連環蛋白傳訊。
實施例5 RSPO3抗體之親和性成熟及人化
抗RSPO3抗體131R003係經親和性成熟處理，並發現有多種變異體。一種131R003變異體相較於親代131R003抗體，具有經改變之重鏈CDR1(SEQ ID NO：34)。第二種變異體相較於親代131R003，具有經改變之重鏈CDR3(SEQ ID NO：35)。另一被產製之變異體相較於親代131R003包含經改變之重鏈CDR1及CDR3。
HEK-293細胞係經6倍TCF-螢光素酶報告載體(TOPflash,Millipore,Billerica,MA)轉染。在24至48小時後，該經轉染之HEK-293細胞在抗RSPO3抗體131R003、131R003 CDR1變異體及131R003 CDR3變異體存在下與WNT3a及人RSPO3之組合一起培養。在細胞中添加經5倍連續稀釋20μg/ml至0.006μg/ml之131R003、131R003 CDR1變異體及131R003 CDR3變異體。在對照方面，細胞與WNT3a及RSPO3之組合、僅WNT3a、僅 RSPO3、對照抗體或無添加下一起培養。該等細胞經培養16小時後，利用Steady-Glo®螢光素酶檢測系統(Promega,Madison,WI)如廠商說明所述測量螢光素酶活性。
如圖4所示，抗RSPO3抗體131R003 CDR1變異體及131R003 CDR3變異體各自以劑量依賴形式且比親代131R003更低之濃度減少RSPO3誘導之β-連環蛋白傳訊。這些結果證實，131R003變異體保留親代131R003之特徵，即它們是RSPO3之特異性抑制劑且能減少及/或阻斷RSPO3誘導之β-連環蛋白傳訊。此外，這些結果證實131R003變異體比親代131R003具有更佳之活性。
131R003變異體之人化形式係利用標準技術產製。人化抗體h131R005、h131R007、h131R008、h131R010、h131R011包含相較於親代131R003抗體經改變之重鏈CDR3。人化131R006B包含相較於親代131R003抗體經改變之重鏈CDR3。抗體h131R005/131R007、h131R010及h131R011相較於抗體131R006B包含架構區3中之多個胺基酸取代。抗體h131R005/131R007、h131R006及h131R011為IgG2抗體。抗體h131R008及h131R010為IgG1抗體。抗體h131R005/131R007、h131R010及h131R011包含相同的重鏈可變區。抗體h131R010及h131R011包含相同的輕鏈可變區，其與h131R005/131R007之輕鏈可變區不同。
編碼131R010抗體之重鏈的質體依照布達佩 斯條約之規定，於2013年6月18日以ATCC編號PTA-120420寄存於美國菌種保存中心(10801 University Boulevard,Manassas,VA,USA)。編碼131R010抗體之輕鏈的質體依照布達佩斯條約之規定，於2013年6月18日以ATCC編號PTA-120421寄存於美國菌種保存中心(10801 University Boulevard,Manassas,VA,USA)。
實施例6 藉由抗RSPO抗體抑制活體內之卵巢腫瘤生長
游離OMP-OV38卵巢腫瘤細胞(細胞數1 x 105)經注射至6至8周齡之NOD/SCID小鼠。讓腫瘤生長39天直到達到平均體積150mm3。小鼠經隨機分組(每組n=8)，並接受抗RSPO1抗體89M5與抗RSPO3抗體131R003之組合；抗RSPO1抗體89M5、抗RSPO3抗體131R003與紫杉醇之組合；紫杉醇作為單一劑；或對照抗體之治療。抗體劑量為20mg/kg每周一次，紫杉醇之劑量為15mg/ml每周一次。抗體與紫杉醇之投予係經由腹腔注射實施。監測腫瘤生長，於所示時間點以電子卡尺測量腫瘤體積。資料以平均值±SEM表示。
如圖5所示，抗RSPO1與抗RSPO3抗體之組合抑制OMP-OV38卵巢腫瘤生長。意外的是，抗RSPO1抗體89M5、抗RSPO3抗體131R002與紫杉醇之組合抑制腫瘤生長之程度，顯著高於單獨使用紫杉醇或單獨使用抗體組合。
游離OMP-OV38卵巢腫瘤細胞(細胞數1 x 105)經注射至6至8周齡之NOD/SCID小鼠。讓腫瘤生長35天直到達到平均體積140mm3。小鼠經隨機分組(每組n=10)，並經抗RSPO3抗體131R002；抗RSPO1抗體89M5；紫杉醇；89M5與紫杉醇之組合；131R002與紫杉醇之組合；89M5與131R002之組合；89M5、131R002與紫杉醇之組合；或對照抗體治療。抗體劑量為20mg/kg每周一次，紫杉醇之劑量為15mg/ml每周一次投予至第46天，然後劑量為7.5mg/kg。抗體與紫杉醇之投予係經由腹腔注射實施。監測腫瘤生長，於所示時間點以電子卡尺測量腫瘤體積。資料以平均值±SEM表示。
如圖6所示，抗RSPO1抗體89M5與抗RSPO3抗體131R002之組合相較於對照抗體抑制OMP-OV38卵巢腫瘤生長。抗RSPO1抗體89M5與紫杉醇之組合或抗RSPO3抗體131R002與紫杉醇之組合相較於單獨使用紫杉醇無差別。然而，意外的是，抗RSPO1 89M5、抗RSPO3抗體131R002與紫杉醇之組合顯示高於單獨使用紫杉醇之活性。
實施例7 藉由抗RSPO3抗體抑制活體內之肺臟腫瘤生長
在OMP-LU45非小細胞肺腫瘤中，已觀察到CD201+細胞比起CD201-細胞更具腫瘤發生性。另外，發現RSPO3高度表現於CD201+細胞族群。游離且經分選之 OMP-LU45 CD44+CD201+肺腫瘤細胞(細胞數5 x 104)經注射至6至8周齡之NOD/SCID小鼠。讓腫瘤生長38天直到達到平均體積140mm3。小鼠經隨機分組(每組n=10)，並以抗RSPO3抗體131R002或對照抗體治療。抗體劑量為25mg/kg每周一次，抗體投予係經由注射至腹腔內實施。監測腫瘤生長，於所示時間點以電子卡尺測量腫瘤體積。資料以平均值±SEM表示。
在具有第二肺腫瘤之試驗中，游離OMP-LU25肺腫瘤細胞(細胞數5 x 104)經注射至6至8周齡之NOD/SCID小鼠。讓腫瘤生長48天直到達到平均體積110mm3。小鼠經隨機分組(每組n=9)，並以抗RSPO3抗體131R002或對照抗體治療。抗體劑量為25mg/kg每周一次，抗體投予係經由注射至腹腔內實施。監測腫瘤生長，於所示時間點以電子卡尺測量腫瘤體積。資料以平均值±SEM表示。
如圖7A及7B所示，相較於對照抗體，抗RSPO抗體131R002抑制二種肺腫瘤OMP-LU45及OMP-LU25之生長。
實施例8 抗RSPO3抗體抑制 β-連環蛋白活性
HEK-293細胞係經6倍TCF-螢光素酶報告載體(TOPflash,Millipore,Billerica,MA)轉染。經24至48小時後，該經轉染之HEK-293細胞在抗RSPO3抗體 131R002、131R006B或131R007存在下，與WNT3a條件培養基(5ng/ml)及人RSPO3(10ng/ml,R&D BioSystems)之組合一起培養。在細胞中添加經5倍連續稀釋20μg/ml至0.0064μg/ml之抗體131R002、131R006或131R007。在對照方面，細胞與單獨的WNT3a條件培養基、WNT3a條件培養基與人RSPO3之組合一起培養或無添加僅細胞培養。該等細胞經培養16小時後，利用Steady-Glo®螢光素酶檢測系統(Promega,Madison,WI)如廠商說明所述測量螢光素酶活性。
如圖8所示，所有三種抗RSPO3抗體皆以劑量依賴形式減少WNT3a/RSPO3誘導之β-連環蛋白傳訊。人化抗體131R006B及131R007似乎比抗體131R002具有更高抑制β-連環蛋白活性之能力。這些結果證實，人化抗體131R006B及131R007比起131R002為更強的RSPO3抑制劑，且能減少及/或阻斷WNT3a/RSPO3誘導之β-連環蛋白傳訊。
實施例9 抑制RSPO3與LGR5之結合
HEK-293T細胞係經編碼人LGR5之胞外域(FLAG-LGR5-CD4TM-GFP)的cDNA表現載體轉染。轉染細胞與重組RSPO3-生物素融合蛋白在抗RSPO3抗體131R006B或131R007存在下一起培養。不與抗體一起培養之細胞為對照組。用PBS清洗細胞，RSPO3與表現 LGR5之轉染細胞的結合藉由添加PE共軛鏈黴抗生物素蛋白並以流式細胞分析測定。
如圖9所示，抗RSPO3抗體131R006B及131R007高度有效地阻斷RSPO3與LGR5表現細胞之結合。
實施例10 RSPO3抗體之結合親和性
RSPO3抗體131R002、131R003、131R003 CDR3變異體、h131R007、h131R008及h131R011的KD係利用Biacore LifeSciences(GE Healthcare)的Biacore 2000系統測定。所使用之方法與實施例3所述之方法不同。山羊抗人IgG抗體係利用標準胺基底化學(NHS/EDC)與羧甲基-葡聚糖(CM5)SPR晶片偶合，並以乙醇胺封閉。抗體(經純化之抗體或培養上清液)以HBS-P-BSA(0.01M HEPES pH7.4，0.15M NaCl，0.005% v/v聚山梨醇酯20，100ug/ml BSA)稀釋至濃度10μg/ml，經由該抗人IgG抗體捕捉至晶片上。人RSPO3(R&D Systems)以HBS-P-BSA稀釋，自300nM 2倍連續稀釋至37.5nM，並依序注射在該經捕捉之抗RSPO3抗體上。測量各濃度之RSPO3結合及解離。在每次抗原注射後，注射5μl之100mM H3P04以移除抗原-抗體複合物，然後再進行下一次注射。收集一段時間之動力學資料並將該等動力學資料利用同步整體擬合方程式擬合以產生 各抗體之親和性常數(KD值)(表4)。
在其他試驗中，抗體h131R008對人RSPO3具有低至448pM之KD，對人RSPO1或RSPO2不具可檢測之結合，對人RSPO4具有微弱結合。抗體h131R008對鼠RSPO3具有248pM之KD，對鼠RSPO1或RSPO2不具可檢測之結合，對鼠RSPO4具有微弱結合。
實施例11 抗RSPO3抗體抑制活體內之肺臟腫瘤生長
根據微陣列資料中之高量RSPO3表現，選擇用來測試之非小細胞肺癌(NSCLC)細胞系NCI-H2030。將NCI-H2030細胞(1 x 106)注射至NOD-SCID小鼠。讓腫瘤生長大約60天直到達到平均體積100mm3。荷瘤小鼠被隨機分成4組(每組n=7至9)。荷瘤小鼠利用抗RSPO3抗體131R002、卡鉑、抗RSPO3抗體131R002與卡鉑之組合或對照抗體治療。抗體劑量為25mg/kg每周一次。卡鉑劑量為50mg/kg每周一次。監測腫瘤生長，於所示之治療後天數以電子卡尺測量腫瘤體積。
如圖10所示，抗RSPO3抗體與卡鉑組合之治療比起單獨使用卡鉑或單獨使用抗體，更佳地抑制NCI-H2030腫瘤生長。
OMP-LU102是源自病患之非小細胞肺癌(NSCLC)異種移植，其係根據微陣列資料中之高量RSPO3表現被選擇用來測試。將OMP-LU102肺腫瘤細胞(1 x 105)注射至NOD-SCID小鼠。讓腫瘤生長22天直到達到平均體積90mm3。荷瘤小鼠被隨機分成4組(每組n=10)。荷瘤小鼠利用抗RSPO3抗體131R002、卡鉑、抗RSPO3抗體131R002與卡鉑之組合或對照抗體治療。抗體劑量為25mg/kg每周一次。卡鉑劑量為50mg/kg每周一次。監測腫瘤生長，於所示之治療後天數以電子卡尺測量腫瘤體積。
如圖11A所示，抗RSPO3抗體之單一劑治療抑制OMP-LU102肺腫瘤生長，但與卡鉑組合治療時之效應遠高於單一劑治療。
在治療後，自四個試驗組之各腫瘤製備RNA。基因表現以微陣列分析特徵化。如圖11B之基因組富集分析顯示，抗RSPO3抗體治療(不論是單一劑或與卡鉑組合)抑制正常幹細胞或癌幹細胞之多種特徵基因組之表現。僅用卡鉑治療不具此基因表現之影響。
實施例12 抗RSPO3抗體抑制活體內之胰臟腫瘤生長
OMP-PN35是源自病患之胰管腺癌(PDAC)異種移植，其係根據微陣列資料中之高量RSPO3表現被選擇用來測試。將OMP-PN35(1 x 105)腫瘤細胞注射至NOD-SCID小鼠。讓腫瘤生長30天直到達到平均體積90mm3。荷瘤小鼠被隨機分成4組(每組n=10)。荷瘤小鼠係經抗RSPO3抗體131R002、吉西他濱加白蛋白結合型太平洋紫杉醇(ABRAXANE)、抗RSPO3抗體與吉西他濱加白蛋白結合型太平洋紫杉醇(ABRAXANE)治療。抗體劑量為25mg/kg每周一次。吉西他濱劑量為20mg/kg每周一次，白蛋白結合型太平洋紫杉醇(ABRAXANE)之劑量為30mg/kg每周一次。監測腫瘤生長，於所示之治療後天數以電子卡尺測量腫瘤體積。
圖12A顯示所有四個治療組之結果，圖12B僅顯示組合治療之放大圖。圖12A及12B顯示，相較於單獨使用吉西他濱及白蛋白結合型太平洋紫杉醇(ABRAXANE)，抗RSPO3抗體與吉西他濱加白蛋白結合型太平洋紫杉醇(ABRAXANE)之組合抑制OMP-PN35胰腫瘤生長之效果較佳。
實施例13 抗RSPO3抗體抑制 β-連環蛋白活性
HEK-293細胞係經6倍TCF-螢光素酶報告載體(TOPflash,Millipore,Billerica,MA)轉染。經24至48小時後，該經轉染之HEK-293細胞在抗RSPO3抗體 h131R007或h131R010存在下，與WNT3a條件培養基(5ng/ml)及人RSPO3(2ng/ml,R&D BioSystems)之組合一起培養。在細胞中添加經5倍連續稀釋20μg/ml至0.0064μg/ml之抗體h131R007或h131R010。在對照方面，細胞與單獨的WNT3a條件培養基、WNT3a條件培養基與人RSPO3之組合一起培養或無添加僅細胞培養。該等細胞經培養16小時後，利用Steady-Glo®螢光素酶檢測系統(Promega,Madison,WI)如廠商說明所述測量螢光素酶活性。
如圖13所示，抗體h131R010以劑量依賴形式減少WNT3a/RSPO3誘導之β-連環蛋白傳訊且與h131R007之抑制程度類似。由於h131R010抑制β-連環蛋白傳訊之程度與h131R007類似，因此很清楚的是抗RSPO3抗體之活性不受轉換成IgG1同型之影響。
實施例14 抗RSPO3抗體抑制活體內之肺臟腫瘤生長
OMP-LU25是源自病患之非小細胞肺癌(NSCLC)異種移植，其係根據微陣列資料中之高量RSPO3表現被選擇用來測試。將OMP-LU25腫瘤細胞(5 x 104)注射至NOD-SCID小鼠。讓腫瘤生長33天直到達到平均體積120mm3。荷瘤小鼠被隨機分成4組(每組n=9)。荷瘤小鼠係經對照抗體、抗RSPO3抗體131R008、太平洋紫杉醇(paclitaxel)或抗RSPO3抗體 131R008與太平洋紫杉醇之組合治療。抗體劑量為每周20mg/kg。太平洋紫杉醇劑量為每周15mg/kg。監測腫瘤生長，於所示之治療後天數以電子卡尺測量腫瘤體積。
如圖14所示，當以單一劑使用及與化學療法組合使用時，抗RSPO3抗體131R008抑制OMP-LU25腫瘤生長。另外，抗RSPO3抗體131R008與太平洋紫杉醇之組合導致腫瘤消退。
應了解此處所描述之實施例及實施態樣僅供說明示範之目的，各種對於彼等之修飾或改變將由該領域之技藝人士建議且將被納入本申請案之精神與範圍內。
所有此處所提及之公開資料、專利、專利申請案、網站及編號/資料庫序列包括多核苷酸及多肽序列在此係以參照方式整體納入此處以符合所有目的，和特別且獨立指出個別公開資料、專利、專利申請案、網站或編號/資料庫序列各自以參照方式被納入之範圍相同。
本說明書中揭示之序列如下：
含信號序列之人RSPO1蛋白序列(SEQ ID NO：1)
含信號序列之人RSPO2蛋白序列(SEQ ID NO：2)
含信號序列之人RSPO3蛋白序列(SEQ ID NO：3)
含信號序列之人RSPO4蛋白序列(SEQ ID NO：4)
不含預期信號序列之人RSPO3蛋白序列(SEQ ID NO：5)
人RSPO3三呋喃基二氫咪唑樣結構域1(SEQ ID NO：6)PNVSQGCQGGCATCSDYNGCLSCKPRLFFALERIGMKQIGVCLSSCPSGYYG
人RSPO3三呋喃基二氫咪唑樣結構域2(SEQ ID NO：7)INKCTKCKADCDTCFNKNFCTKCKSGFYLHLGKCLDNCPEGLEA
人RSPO3血小板反應素結構域(SEQ ID NO：8)HCEVSEWNPWSPCTKKGKTCGFKRGTETRVREIIQHPSAKGNLCPPTNETRKCTVQRKKCQ
131R002/131R003重鏈CDR1(SEQ ID NO：9)KASGYTFTDYS
131R002/131R003重鏈CDR2(SEQ ID NO：10)IYPSNGDS
131R002/131R003重鏈CDR3(SEQ ID NO：11)ATYFANYFDY
131R002/131R003輕鏈CDR1(SEQ ID NO：12)QSVDYDGDSYM
131R002/131R003輕鏈CDR2(SEQ ID NO：13)AAS
131R002/131R003輕鏈CDR3(SEQ ID NO：14)QQSNEDPLT
131R002重鏈可變區(SEQ ID NO：15)QVQLQESGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYSIHWVKQNHGKSLDWIGYIYPSNGDSGYNQKFKNRATLTVDTSSSTAYLEVRRLTFEDSAVYYCATYFANYFDYWGQGTTLTVSSAST
131R003重鏈可變區(SEQ ID NO：16)QVQLKQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYSIHWVKQNHGKSLDWIGYIYPSNGDSGYNQKFKNRATLTVDTSYSTAYLEVRRLTFEDSAVYYCATYFANYFDYWGQGTTLTVSSAST
131R002/131R003輕鏈可變區(SEQ ID NO：17)DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPLTFGAGTKLELKR
131R002重鏈可變區核苷酸序列(SEQ ID NO：18)
131R003重鏈可變區核苷酸序列(SEQ ID NO：19)
131R002/131R003輕鏈可變區核苷酸序列(SEQ ID NO：20)
含畫底線之預期信號序列的131R002重鏈胺基酸序列(SEQ ID NO：21)
含畫底線之預期信號序列的131R003重鏈胺基酸序列(SEQ ID NO：22)
含畫底線之預期信號序列的131R002/131R003輕鏈胺基酸序列(SEQ ID NO：23)
含預期信號序列之131R002重鏈核苷酸序列(SEQ ID NO：24)
含預期信號序列之131R003重鏈核苷酸序列(SEQ ID NO：25)
含預期信號序列之131R002/131R003輕鏈核苷酸序列(SEQ ID NO：26)
不含預期信號序列之131R002重鏈胺基酸序列(SEQ ID NO：27)
不含預期信號序列之131R003重鏈胺基酸序列(SEQ ID NO：28)
不含預期信號序列之131R002/131R003輕鏈胺基酸序列(SEQ ID NO：29)
不含預期信號序列之131R002重鏈胺基酸序列(SEQ ID NO：30)
不含預期信號序列之131R003重鏈胺基酸序列(SEQ ID NO：31)
不含預期信號序列之131R002/131R003輕鏈胺基酸序列(SEQ ID NO：32)
FLAG標籤(SEQ ID NO：33)DYKDDDDK
131R003重鏈CDR1變異體(SEQ ID NO：34)KASGYTFTSYTF
131R003重鏈CDR3變異體(SEQ ID NO：35)ATYFANNFDY
131R003重鏈可變區-變異體1(SEQ ID NO：36)QVQLKQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYSIHWVKQNHGKSLDWIGYIYPSNGDSGYNQKFKNRATLTVDTSYSTAYLEVRRLTFEDSAVYYCATYFANNFDYWGQGTTLTVSS
131R003重鏈可變區-變異體2(SEQ ID NO：37)QVQLKQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTSYTFHWVKQNHGKSLDWIGYIYPSNGDSGYNQKFKNRATLTVDTSYSTAYLEVRRLTFEDSAVYYCATYFANNFDYWGQGTTLTVSS
含畫底線之預期信號序列的131R003重鏈變異體1(SEQ ID NO：38)
不含預期信號序列之131R003重鏈變異體1(SEQ ID NO：39)
含預期信號序列之131R003重鏈變異體1核酸(SEQ ID NO：40)
含畫底線之預期信號序列的131R003重鏈變異體2(SEQ ID NO：41)
不含預期信號序列之131R003重鏈變異體2(SEQ ID NO：42)
含預期信號序列之131R003重鏈變異體2核酸(SEQ ID NO：43)
人化131R003抗體
人化131R005/131R007/131R008/131R010/131R011重鏈可變區(SEQ ID NO：44)QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSIHWVRQAPGQGLEWIGYIYPSNGDSGYNQKFKNRVTMTRDTSTSTAYMELSRLRSEDTAVYYCATYFANNFDYWGQGTTLTVSS
人化131R006A重鏈可變區(SEQ ID NO：45)QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYTFHWVRQAPGQGLEWIGYIYPSNGDSGYNQKFKNRVTMTRDTSTSTAYMELSRLRSEDTAVYYCATYFANNFDYWGQGTTLTVSS
含畫底線之預期信號序列的人化131R005/131R007/131R011重鏈(IgG2)(SEQ ID NO：46)
含畫底線之預期信號序列的人化131R006A重鏈 (SEQ ID NO：47)
不含預期信號序列之人化131R005/131R007/131R011重鏈(IgG2) (SEQ ID NO：48)
不含預期信號序列之人化131R006A重鏈 (SEQ ID NO：49)
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人化131R006A重鏈可變區核酸(SEQ ID NO：51)
含預期信號序列之人化131R005/131R007重鏈核酸(SEQ ID NO：52)
含預期信號序列之人化131R006A重鏈核酸(SEQ ID NO：53)
不含預期信號序列之人化131R005/131R007重鏈核酸(SEQ ID NO：54)
不含預期信號序列之人化131R006A重鏈核酸(SEQ ID NO：55)
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不含預期信號序列核酸之人化131R008重鏈(IgG1)(SEQ ID NO：71)
人化131R005/131R007/131R008輕鏈可變區(SEQ ID NO：72)DIVLTQSPASLAVSLGQRATITCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDVATYYCQQSNEDPLTFGAGTKLELKR
含畫底線之預期信號序列的人化131R005/131R007/131R008輕鏈(SEQ ID NO：73)
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人化131R005/131R007/131R008輕鏈可變區核酸(SEQ ID NO：75)
含信號序列核酸之人化131R005/131R007/131R008輕鏈(SEQ ID NO：76)
不含預期信號序列核酸之人化131R005/131R007/131R008輕鏈(SEQ ID NO：77)
變異體重鏈CDR1(SEQ ID NO：78)DYSIH
變異體重鏈CDR2(SEQ ID NO：79)YIYPSNGDSGYNQKFK
變異體重鏈CDR3(SEQ ID NO：80)TYFANNFD
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變異體輕鏈CDR2(SEQ ID NO：82)AASNLES
變異體輕鏈CDR3(SEQ ID NO：83)QQSNEDPLTF
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人化131R010/131R011輕鏈可變區(SEQ ID NO：86)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISPVQAEDFATYYCQQSNEDPLTFGAGTKLELKR
含畫底線之預期信號序列的人化131R010/131R011輕鏈(SEQ ID NO：87)
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人化131R010重鏈可變區(SEQ ID NO：95)
<110> 美商安可美德藥物股份有限公司(ONCOMED PHARMACEUTICALS.INC.)
<120> RSPO3結合劑及彼之用途
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IgG3重鏈恆定區
<400> 58
<210> 59
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IgG4重鏈恆定區
<400> 59
<210> 60
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IgG2重鏈恆定區(13A鏈變異體)
<400> 60
<210> 61
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IgG2重鏈恆定區(13B鏈變異體)
<400> 61
<210> 62
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人化131R006B重鏈可變區
<400> 62
<210> 63
<211> 462
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人化131R006B重鏈
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<210> 64
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人化131R006B重鏈
<400> 64
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<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人化131R006B重鏈可變區核酸
<400> 65
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<220>
<223> 人化131R006B重鏈核酸
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<212> DNA
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<220>
<223> 人化131R006B重鏈核酸
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人化131R008/131R010重鏈(IgG1)
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<220>
<223> 人化131R008/131R010重鏈(IgG1)
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<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人化131R008重鏈(IgG1)
<400> 70
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<211> 1344
<212> DNA
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<220>
<223> 人化131R008重鏈(IgG1)
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<212> PRT
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<220>
<223> 人化131R005/131R007/131R008輕鏈可變區
<400> 72
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人化131R005/131R007/131R008輕鏈
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<212> PRT
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<220>
<223> 人化131R005/131R007/131R008輕鏈
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<210> 75
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<212> DNA
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<220>
<223> 人化131R005/131R007/131R008輕鏈
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<211> 714
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人化131R005/131R007/131R008輕鏈
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<211> 657
<212> DNA
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<220>
<223> 人化131R005/131R007/131R008輕鏈
<400> 77
<210> 78
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 變異體重鏈CDR1
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<220>
<223> 變異體重鏈CDR2
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<213> 人工序列
<220>
<223> 變異體重鏈CDR3
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 變異體輕鏈CDR1
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<212> PRT
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<220>
<223> 變異體輕鏈CDR2
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<212> PRT
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<220>
<223> 變異體輕鏈CDR3
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<211> 1404
<212> DNA
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<220>
<223> 人化131R010重鏈(IgG1)
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<211> 1347
<212> DNA
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<223> 人化131R010重鏈(IgG1)
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<211> 112
<212> PRT
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<220>
<223> 人化131R010/131R011輕鏈可變區
<400> 86
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<212> PRT
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<220>
<223> 人化131R010/131R011輕鏈
<400> 87
<210> 88
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人化131R010/131R011輕鏈
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<210> 89
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人化131R010/131R011輕鏈可變區核酸
<400> 89
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<211> 714
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人化131R010/131R011輕鏈
<400> 90
<210> 91
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人化131R010/131R011輕鏈
<400> 91
<210> 92
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人化131R011重鏈可變區核酸
<400> 92
<210> 93
<211> 1392
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人化131R011重鏈(IgG2)
<400> 93
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<211> 1335
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人化131R011重鏈(IgG2)
<400> 94
<210> 95
<211> 350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人化131R010重鏈可變區
<400> 95

Claims (15)

  1. 一種與人R-脊椎蛋白3(RSPO3)特異性結合之經分離之抗體於製造供治療肺纖維化的藥物之用途。
  2. 一種與人R-脊椎蛋白3(RSPO3)特異性結合之經分離之抗體於製造供治療肝纖維化的藥物之用途。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之用途，其中該抗體包含：(a)包含SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：78之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：79之重鏈CDR2及包含SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：80之重鏈CDR3；和(b)包含SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：81之輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：82之輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：83之輕鏈CDR3。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之用途，其中該抗體包含：(a)包含SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：78之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：79之重鏈CDR2及包含SEQ ID NO：80之重鏈CDR3、及包含SEQ ID NO：81之輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：82之輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：83之輕鏈CDR3；(b)包含SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：34之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：10之重鏈CDR2及包含SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：35之重鏈CDR3、及包含SEQ ID NO：12之輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：13之輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：14之輕鏈CDR3；或(c)包含SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：78之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：10之重鏈CDR2及包含SEQ ID NO：80之重鏈CDR3、及包含SEQ ID NO：12之輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：13之輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：14之輕鏈CDR3。
  5. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之用途，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO：78之重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：79之重鏈CDR2及包含SEQ ID NO：80之重鏈CDR3、及包含SEQ ID NO：81之輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：82之輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：83之輕鏈CDR3。
  6. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之用途，其中該抗體包含：(a)與SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：62具有至少90%序列一致性之重鏈可變區；和(b)與SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：86具有至少90%序列一致性之輕鏈可變區。
  7. 如申請專利範圍第6項之用途，其中該抗體包含：(a)包含SEQ ID NO：44之重鏈可變區和包含SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：86之輕鏈可變區；(b)包含SEQ ID NO：15之重鏈可變區和包含SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：72之輕鏈可變區；(c)包含SEQ ID NO：16之重鏈可變區和包含SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：72之輕鏈可變區；(d)包含SEQ ID NO：36之重鏈可變區和包含SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：72之輕鏈可變區；(e)包含SEQ ID NO：37之重鏈可變區和包含SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：72之輕鏈可變區；(f)包含SEQ ID NO：45之重鏈可變區和包含SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：86之輕鏈可變區；或(g)包含SEQ ID NO：62之重鏈可變區和包含SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：86之輕鏈可變區。
  8. 如申請專利範圍第1至7項中任一項之用途，其中該抗體係重組抗體、單株抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體、人化抗體、人抗體、IgG1抗體、IgG2抗體或包含抗原結合部位之抗體片段。
  9. 如申請專利範圍第1至7項中任一項之用途，其中該抗體包含：由寄存於美國菌種保存中心(ATCC)之質體PTA-120420所編碼之重鏈可變區和由寄存於ATCC之質體PTA-120421所編碼之輕鏈可變區。
  10. 如申請專利範圍第1至7項中任一項之用途，其中該抗體抑制RSPO3與至少一種富含白胺酸重複之G蛋 白偶合受體(LGR)之結合。
  11. 如申請專利範圍第10項之用途，其中該LGR係選自LGR5、LGR4或LGR6。
  12. 如申請專利範圍第11項之用途，其中該LGR係LGR5。
  13. 如申請專利範圍第1至7項中任一項之用途，其中該抗體(a)抑制RSPO3傳訊；(b)抑制β-連環蛋白之活化；(c)抑制β-連環蛋白傳訊；及(d)抑制腫瘤生長。
  14. 如申請專利範圍第1至11項中任一項之用途，其中治療肝纖維化或肺纖維化包含投予至少一種額外之治療劑。
  15. 如申請專利範圍第14項之用途，其中該額外之治療劑為化學治療劑、血管生成抑制劑或額外之抗體。
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