JP2019531254A - Prl3抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
抗体または抗原結合性断片は、以下のCDR:
抗体または抗原結合性断片は、以下のCDR:
抗体は、図7に示すCDRを取り込む少なくとも1つの軽鎖可変領域を含んでもよい。抗体は、図7に示すCDRを取り込む少なくとも1つの重鎖可変領域を含んでもよい。
抗体は、図7に示すアミノ酸配列の1つ、あるいは図7に示すVH鎖アミノ酸配列のアミノ酸配列の1つに、少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の1つの配列同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも1つの重鎖可変領域(VH)を含んでもよい。抗体は、図7に示すアミノ酸配列の1つに、少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の1つの配列同一性を有するVH鎖アミノ酸配列を有し、そして以下のCDR配列:
抗体は、図7に示すアミノ酸配列の1つ(あるいは図7に示すVL鎖アミノ酸配列のアミノ酸配列の1つに、少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の1つの配列同一性を有するアミノ酸配列)を含む少なくとも1つの軽鎖可変領域、および図7に示すアミノ酸配列の1つ(あるいは図7に示すVH鎖アミノ酸配列のアミノ酸配列の1つに、少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の1つの配列同一性を有するアミノ酸配列)を含む少なくとも1つの重鎖可変領域を含んでもよい。
本発明の1つの側面において:
重鎖が、HC−CDR1配列(配列番号1)、HC−CDR2配列(配列番号2)、HC−CDR3配列(配列番号3)に、それぞれ、少なくとも85%の全体の配列同一性を有するHC−CDR1、HC−CDR2、HC−CDR3を含み、そして軽鎖が、LC−CDR1配列(配列番号4)、LC−CDR2配列(配列番号5)、LC−CDR3配列(配列番号6)に、それぞれ、少なくとも85%の全体の配列同一性を有するLC−CDR1、LC−CDR2、LC−CDR3を含む
重鎖および軽鎖可変領域配列を含む、抗体または抗原結合性断片を提供する。
重鎖配列が、図7に示す重鎖配列に少なくとも85%の配列同一性を有し、そして;
軽鎖配列が、図7に示す軽鎖配列に少なくとも85%の配列同一性を有する
前記抗体または抗原結合性断片を提供する。
本発明の1つの側面において、任意に、本明細書に記載するような重鎖可変領域ポリペプチドと組み合わされた、単離軽鎖可変領域ポリペプチドであって、以下のCDR:
いくつかの態様において、抗体、抗原結合性断片またはポリペプチドは、配置LCFR1:LC−CDR1:LCFR2:LC−CDR2:LCFR3:LC−CDR3:LCFR4にしたがって、CDR間に可変領域軽鎖フレームワーク配列をさらに含む。フレームワーク配列は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列由来であってもよい。
いくつかの場合、抗体、抗原結合性断片またはポリペプチドは:
抗体は、図7に示すアミノ酸配列の1つ、あるいは図7に示すアミノ酸配列の1つに、少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の1つの配列同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも1つの軽鎖可変領域(VL)および/または重鎖可変領域(VH)を含み、そして以下のCDR配列:
抗体は、図7に示すアミノ酸配列の1つ、あるいは図7に示すアミノ酸配列の1つに、少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の1つの配列同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも1つの軽鎖可変領域(VL)および/または重鎖可変領域(VH)を含んでもよい。
いくつかの態様において、抗体または抗体結合性断片は、ヒト定常領域をさらに含んでもよい。例えば、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4の1つより選択されるものである。
本発明の任意の側面において、抗体は、好ましくは、他のPRLホスファターゼ、例えばPRL1またはPRL2よりも、PRL3に特異的に結合する。
いくつかの態様において、抗体はPRL3−ZUMABであってもよい。
他の側面において、癌を治療する方法において使用するためのヒト化抗体または抗体結合性断片を提供する。抗体は、腫瘍形成を阻害し、そして/または腫瘍転移を阻害するために有用であってもよい。抗体は、腫瘍サイズを減少させるために有用であってもよい。治療される個体は、治療されていない個体に比較して、または治療前の同じ個体に比較して、例えば、特定の腫瘍の腫瘍サイズにおける1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%またはそれより多い減少、または腫瘍数の減少、あるいはその両方を示してもよい。
癌は、PRL3発現または過剰発現癌であってもよい。癌は胃癌であってもよい。
いくつかの方法において、患者は、以前、化学療法、特に代謝拮抗剤療法、例えば5−FUを投与されていない。いくつかの場合、患者は以前、こうした療法を受けておらず、または癌のために、例えば胃癌のためにこうした治療を受けていない。いくつかの場合、抗体は別の剤と同時投与されない(すなわち抗体単剤療法)。いくつかの場合、抗体は5−FUと同時投与されない。
説明
抗体
本発明記載の抗体は、好ましくは、任意に、5pM〜8pM、好ましくは6〜7pmの範囲、好ましくは約6.3pMのKdで、PRL3(抗原)に結合する。いくつかの場合、抗体は、およそ7x10−5s−1のオフ速度を有する。例えば、約1x10−5s−1および1x10−6s−1の間である。
本発明記載の抗体は、単離型で提供されてもよい。
モノクローナル抗体技術に関連した今日の技術を考慮すると、抗体は、大部分の抗原に対して調製可能である。抗原結合部分は、抗体の部分(例えばFab断片)または合成抗体断片(例えば一本鎖Fv断片[ScFv])であってもよい。選択した抗原に対する適切なモノクローナル抗体は、既知の技術、例えば、“Monoclonal Antibodies: A manual of techniques”, H Zola(CRC Press, 1988)に、そして“Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications”, J G R Hurrell(CRC Press, 1982)に開示されるものによって調製可能である。キメラ抗体は、Neubergerら(1988, 8th International Biotechnology Symposium Part 2, 792−799)によって論じられる。
Fab、Fv、ScFvおよびdAb抗体断片は、すべて大腸菌において発現可能であり、そして大腸菌から分泌可能であり、したがって、多量の前記断片の容易な産生が可能になる。
本明細書に記載するようなCDRを有する抗体分子の構造は、一般的に、CDRが、再編成免疫グロブリン遺伝子によってコードされる、天然存在VHおよびVL抗体可変ドメインのCDRに対応する位置に位置する、抗体分子またはそのかなりの部分の重鎖または軽鎖配列のものであろう。免疫グロブリン可変ドメインの構造および位置は、Kabat, E.A.ら, Sequences of Proteins of Immunological Interest. 第4版 US Department of Health and Human Services. 1987、およびその改訂版を参照することによって決定可能である。いくつかの学術的および商業的オンライン供給源が、このデータベースを検索するために利用可能である。例えば、Martin, A.C.R. Accessing the Kabat Antibody Sequence Database by Computer PROTEINS: Structure, Function and Genetics, 25(1996), 130−133、および関連するオンライン供給源、現在は、ワールドワイドウェブアドレス、bioinf.org.uk/abs/simkab.htmlを参照されたい。
軽鎖および重鎖CDRはまた、いくつかの異なるフレームワーク領域と組み合わせて特に有用でありうる。したがって、LC−CDR1〜3またはHC−CDR1〜3を有する軽鎖および/または重鎖は、代替フレームワーク領域を所持しうる。適切なフレームワーク領域が当該技術分野に周知であり、そして例えば、本明細書に援用されるM. Lefranc & G. Le:franc (2001) ”The Immunoglobulin FactsBook”, Academic Pressに記載される。
本明細書記載の抗体または抗原結合性断片を、PRL3に対する抗体または抗原結合性断片の結合を伴う方法で用いてもよい。こうした方法は、抗体または抗原結合性断片およびPRL3の結合した複合体の検出を伴ってもよい。こうしたものとして、1つの態様において、PRL3を含有するかまたは含有すると推測される試料を、本明細書に記載するような抗体または抗原結合性断片と接触させ、そして抗体または抗原結合性断片およびPRL3の複合体の形成を検出する工程を含む方法を提供する。
本発明記載の抗体、抗原結合性断片およびポリペプチド、ならびにこうした剤を含む組成物を、医学的治療の方法において使用するために提供してもよい。治療を、治療を必要とする疾患または状態を有する被験体に提供してもよい。疾患または状態は、転移性癌を含む癌であってもよい。
この目的に向けて、癌の進行または患者の健康を反映する、いくつかの判断基準を設計してもよい。有用な判断基準には、腫瘍サイズ、腫瘍寸法、腫瘍の最大寸法、腫瘍数、腫瘍マーカー(例えばアルファ−フェトタンパク質)の存在、転移の度合いまたは数等が含まれてもよい。
薬学的に有用な組成物および薬剤の配合
本発明記載の抗体、抗原結合性断片およびポリペプチドは、臨床的使用のための薬学的組成物として配合されてもよく、そして薬学的に許容されうるキャリアー、希釈剤、賦形剤またはアジュバントを含んでもよい。
癌は、任意の望ましくない細胞増殖(または望ましくない細胞増殖によって現れる任意の疾患)、新生物または腫瘍、あるいは望ましくない細胞増殖、新生物または腫瘍に対するリスクまたは素因の増加であってもよい。癌は、良性または悪性であってもよく、そして原発性または続発性(転移性)であってもよい。新生物または腫瘍は、細胞の任意の異常な成長または増殖であってもよく、そして任意の組織に位置していてもよい。組織の例には、副腎、副腎髄質、肛門、虫垂、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、盲腸、中枢神経系(脳を含むまたは除く)、小脳、子宮頸部、結腸、十二指腸、子宮内膜、上皮細胞(例えば腎上皮)、胆嚢、食道、グリア細胞、心臓、回腸、空腸、腎臓、涙腺、喉頭、肝臓、肺、リンパ、リンパ節、リンパ芽球、上顎骨、縦隔、腸間膜、子宮筋、鼻咽頭、網(omentume)、口腔、卵巣、膵臓、耳下腺、末梢神経系、腹膜、胸膜、前立腺、唾液腺、S状結腸、皮膚、小腸、柔組織、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、舌、扁桃腺、気管、子宮、外陰部、白血球が含まれる。
治療しようとする状態に応じて、組成物を単独で、あるいは他の治療と組み合わせて、同時にまたは連続してのいずれかで投与してもよい。
いくつかの態様において、本発明の抗体、抗原結合性断片またはポリペプチドでの治療には、化学療法が付随してもよい。
化学療法は、薬剤または電離放射線(例えばX線またはγ線を用いた放射療法)での癌の治療を指す。好ましい態様において、化学療法は、薬剤での治療を指す。薬剤は、化学実体、例えば小分子薬剤、抗生物質、DNA挿入剤、タンパク質阻害剤(例えばキナーゼ阻害剤)、あるいは生物学的剤、例えば抗体、抗体断片、核酸またはペプチドアプタマー、核酸(例えばDNA、RNA)、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質であってもよい。薬剤を、薬学的組成物または薬剤として配合してもよい。配合物は、1またはそれより多い薬剤(例えば1またはそれより多い活性剤)を、1またはそれより多い薬学的に許容されうる希釈剤、賦形剤またはキャリアーと一緒に含んでもよい。
化学療法は治療措置にしたがって投与されてもよい。治療措置は、医者または医師によって準備されてもよく、そして治療を必要とする患者に合わせてあつらえてもよい、化学療法投与のあらかじめ決定されたタイムテーブル、計画、スキームまたはスケジュールであってもよい。
・アルキル化剤、例えばシスプラチン、カルボプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、イホスファミド;
・プリンまたはピリミジン代謝拮抗剤、例えばアザチオプリンまたはメルカプトプリン;
・アルカロイドおよびテルペノイド、例えばビンカアルカロイド(例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン)、ポドフィロトキシン、エトポシド、テニポシド、タキサン、例えばパクリタキセル(タキソールTM)、ドセタキセル;
・トポイソメラーゼ阻害剤、例えばI型トポイソメラーゼ阻害剤、カンプトテシン、イリノテカンおよびトポテカン、またはII型トポイソメラーゼ阻害剤、アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、テニポシド;
・抗腫瘍抗生物質(例えばアントラサイクリン抗生物質)、例えばダクチノマイシン、ドキソルビシン(アドリアマイシンTM)、エピルビシン、ブレオマイシン、ラパマイシン;
・抗体に基づく剤、例えば抗TIM−3抗体、抗VEGF、抗TNFα、抗IL−2、抗GpIIb/IIIa、抗CD−52、抗CD20、抗RSV、抗HER2/neu(erbB2)、抗TNF受容体、抗EGFR抗体、モノクローナル抗体または抗体断片、例には:セツキシマブ、パニツムマブ、インフリキシマブ、バシリキシマブ、ベバシズマブ(アバスチン(登録商標))、アブシキシマブ、ダクリズマブ、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、リツキシマブ(マブテラ(登録商標))、パリビズマブ、トラスツズマブ、エタネルセプト、アダリムマブ、ニモツズマブが含まれる;
・EGFR阻害剤、例えばエルロチニブ、セツキシマブおよびゲフィチニブ;
・抗血管新生剤、例えばベバシズマブ(アバスチン(登録商標))。
本発明の側面にしたがった抗体、抗原結合性断片、ポリペプチドおよび他の療法剤、薬剤および薬学的組成物を、限定されるわけではないが、非経口、静脈内、動脈内、筋内、腫瘍内および経口を含む、いくつかの経路による投与のために配合してもよい。抗体、抗原結合性断片、ポリペプチドおよび他の療法剤を、液体または固体型で配合してもよい。ヒトまたは動物の体の選択した領域への注射による投与のため、液体配合物を配合してもよい。
いくつかの場合、抗体を癌性細胞から離れた、または癌性細胞の既知の位置からは離れた位置で適用する。こうした場合、抗体は、体内を癌性細胞まで移動してもよく、例えば腫瘍まで移動してもよい。
投薬措置
抗体、抗原結合性断片またはポリペプチドの多数回の用量を提供してもよい。用量の1つまたはそれより多くまたは各々には、別の療法剤の同時または連続投与が付随していてもよい。
本発明のいくつかの側面において、部分のキットを提供する。いくつかの態様において、キットは、あらかじめ決定された量の抗体、抗原結合性断片またはポリペプチドを有する少なくとも1つの容器を有してもよい。キットは、薬剤または薬学的組成物の形で、抗体、抗原結合性断片またはポリペプチドを提供してもよく、そして明記する疾患または状態を治療するため、患者に投与するための使用説明書とともに提供されてもよい。抗体、抗原結合性断片またはポリペプチドを、腫瘍へのまたは血液への注射または注入に適切であるように配合してもよい。
治療しようとする被験体は、任意の動物またはヒトであってもよい。被験体は好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。被験体は、非ヒト哺乳動物であってもよいが、より好ましくはヒトである。被験体は男性または女性であってもよい。被験体は患者であってもよい。被験体は治療が必要な疾患または状態を有すると診断されていてもよいし、あるいはこうした疾患または状態を有すると推測されていてもよい。
いくつかの側面において、患者は、ヒト化抗PRL3抗体または抗体断片での治療に関して選択されている。いくつかの場合、患者は、PRL3を発現している癌を有すると決定されている。いくつかの場合、癌はPRL3を過剰発現している癌である。いくつかの場合、患者は、例えば患者が正常白血球カウントを有することによって示されるように、機能するかまたは活性である免疫系を有すると決定されている。いくつかの方法において、患者は損なわれた免疫系を持たないことが決定されている。特に、患者は、正常範囲内の白血球カウントを有すると決定されていてもよい。特に、患者は、白血球減少症を持たないことが決定されていてもよい。患者は、正常範囲内の好中球、リンパ球、単球、赤血球または血小板カウントを有すると決定されていてもよい。患者は、対照、例えば損なわれた免疫系を持たないことが知られている個体由来のカウント、または確立された正常値と有意には異ならない白血球、好中球、リンパ球、単球、赤血球または血小板カウントを有してもよい。例えば、患者は、血液マイクロリットル当たり、約4,500〜約10,000の間の白血球を有すると決定されてもよい。
細胞において本発明記載のポリペプチドを産生するために適した分子生物学技術は、当該技術分野に周知であり、例えば、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ニューヨーク:Cold Spring Harbor Press, 1989に示されるものがある。
アミノ酸またはヌクレオチド配列同一性パーセントを決定する目的のための整列を、当業者に知られる多様な方式で達成してもよく、例えば公的に入手可能なコンピュータソフトウェア、例えばClustalW 1.82. T−coffeeまたはMegalign(DNASTAR)ソフトウェアを用いてもよい。こうしたソフトウェアを用いる場合、好ましくは、デフォルトパラメータ、例えばギャップペナルティおよび伸長ペナルティに関するものを用いる。ClustalW 1.82のデフォルトパラメータは:タンパク質ギャップ・オープンペナルティ=10.0、タンパク質ギャップ伸長ペナルティ=0.2、タンパク質マトリックス=Gonnet、タンパク質/DNA ENDGAP=−1、タンパク質/DNA GAPDIST=4である。
本明細書に用いるセクション見出しは、構成上の目的のみのためであり、そして記載する主題を限定するとは意図されないものとする。
いくつかの場合、方法は、1またはそれより多い対照試料に対して、個体由来の試料における癌タンパク質の細胞位置を比較する工程を伴う。
対照試料は、別の個体、例えば癌を持たない個体から得た試料であってもよい。該個体は、1またはそれより多い特性、例えば性別、年齢、病歴、民族、体重または特定のマーカーの発現にしたがって、個体にマッチしていてもよい。対照試料は、身体の位置から得られていてもよいし、あるいは個体から得た試料と同じ組織または試料タイプのものであってもよい。
いくつかの場合、対照は、参照試料または参照データセットであってもよい。参照は、特定の治療のための既知の度合いの適切性を持つ被験体から以前得られた試料であってもよい。参照は、参照試料の分析から得たデータセットであってもよい。
PRL3−zumab構築物を、以前特徴付けられたネズミ抗PRL−3抗体クローンから操作した。本発明者らは、米国の2つの独立の開発業務受託機関(CRO)を手配し、Queenら(60)に記載される方法の占有修飾法を用いて、ヒト化またはクローニングした。
実施例2:胃癌を治療するためのPRL3−zumabの使用
材料および方法
組織および細胞溶解物の調製
多数の正常マウス臓器をFVB/野生型マウスから採取する一方、乳房腫瘍および転移性肺腫瘍を、乳腺特異的ポリオーマウイルス・ミドルT癌遺伝子のトランスジェニック過剰発現によって駆動される、転移性乳癌のよく確立された自発的モデルであるアイソジェニックFVB/MMTV−PyMTマウス系統(28)から切除した。組織に関しては、切除試料(5mm3)を、プロテアーゼ−ホスファターゼ阻害剤カクテル(Pierce)を含有するRIPA溶解緩衝剤(Sigma)中に懸濁し、そして組織ホモジナイザー(Polytron)で完全に破壊した。13,000xg、4℃で40分間遠心分離することによって、溶解物を清澄化した。細胞株に関しては、5x106細胞を、プロテアーゼ−ホスファターゼ阻害剤を含有するRIPA溶解緩衝剤中に懸濁し、そして上述のように清澄化した。ビシンコニン酸アッセイキット(Pierce)を用いて、タンパク質濃度を概算した。2xLamelli緩衝剤を添加した後、試料を煮沸して、そしてウェスタンブロッティングのために直ちに用いるか、または使用するまで−20℃で保存した。
200μgの溶解物を、12%SDS−ポリアクリルアミドゲルの別個のウェル中で分離し、そしてニトロセルロース膜にトランスファーした後、ブロッキングし、そして1:1,000希釈の示す一次抗体で4℃で一晩探査した。TBS−T緩衝剤(20mM Tris pH7.6、140mM NaCl、0.2%Tween−20)で徹底的に洗浄した後、膜を、1:5,000希釈のそれぞれのセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲート化二次抗体と、1時間インキュベーションし、TBS−Tで洗浄し、そして化学発光基質(Pierce)を用いて視覚化した。
22の研究したヒトGC細胞株は、以下の供給源から得られた:MKN7、MKN74、NUGC−3、OCUM−1(Health Science Research Resources Bank); YCC−1、YCC−3、YCC−7、YCC−17細胞(Yonsei Cancer Centre); AGS、CRL−5822、KATO−III、SNU−1、SNU−5(アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ATCC); HGC27、NUGC−4、OE19(Sigma−Aldrich); MKN28、MKN45(理化学研究所バイオリソース研究センター); IM−95、SCH(JCRB細胞バンク); SNU−484、SNU−719(Korean Cell Line Bank)。CHO細胞をATCCから購入した。GFPタグ化PRL−1、PRL−2またはPRL−3融合タンパク質を安定発現するCHO細胞の生成は、以前記載されている(23)。ヒトユビキチンCプロモーターの制御下のルシフェラーゼ2遺伝子(pGL4 luc2)を含有するランチウイルス(lantivirus)を、親HCT116細胞(ATCC)に安定形質導入することによって、ルシフェラーゼ発現HCT116−luc2ヒト線癌細胞(Caliper Life Sciences)を確立した。10%熱不活性化ウシ胎児血清(Hyclone)および1%ペニシリン−ストレプトマイシン(Life Technologies)を補充したRPMI−1640培地(Gibco)中で細胞株を培養し、そして5%CO2を補充した37℃インキュベーター中で維持した。
本発明者らは、Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Genechipアレイ上にプロファイリングされた200の初代胃癌標本からなる、Gene Expression Omnibus(GEO)データベース由来の公的に入手可能なGCマイクロアレイデータセット(GSE 15459)を分析した。「affyPLM」Rパッケージ(v2.15)を用いて、データ前処理を行った。外れ値を排除し、下流分析のために利用可能な総数185の腫瘍試料を生じた(SGset1;患者特性を図17に提供する)。転帰測定として全生存を含む、生存分析を行って、それぞれの遺伝子の「低い」、「中程度の」および「高い」発現を有する腫瘍(n=183;2試料は生存データを欠く)を比較し、すなわち「低い」および「高い」発現群は、それぞれ、33.3パーセンタイルより低く、そして66.7パーセンタイル発現レベルより高い試料に対応し、一方、中央のパーセンタイルは、「中程度」と分類された。
組換えGST−PRL−1、GST−PRL−2、およびGST−PRL−3融合タンパク質の調製は、以前記載される通りであった(53)。
以前記載されるようにELISAアッセイを行った(53)。簡潔には、GST−PRL−1(20ng)、GST−PRL−2(20ng)またはGST−PRL−3(1ng、20ng)で一晩コーティングされた96ウェルプレートを、PBS−0.05%Tween−20中の3%ウシ血清アルブミンでブロッキングした後、200ng PRL3−zumabと37℃で2時間インキュベーションした。徹底的に洗浄した後、HRPコンジュゲート化抗マウス抗体(Pierce)を37℃で1時間添加した。Turbo−TMB基質(Pierce)を用いて、比色現像を行い、そして2M H2SO4での酸性化によって停止した。プレート読み取り装置(Dynatech)を用いて、450nmで吸光度を測定した。
Biological Resource Centre(A*STAR、シンガポール)から得た8週齢の雄Balb/Cヌードマウスを、この研究におけるすべての動物モデルに用いた。マウスを2.5%アバーチン(100μl/10g体重)でi.p.麻酔した。同所性胃癌モデル:麻酔したマウスの腹部を、剣状胸骨(xiphoid sternum)の0.5cm下から始まり1cmの正中線切開によって、層状に開いた。外科用ピンセットによって腹部切開から胃を取り出し、そして漿膜下層内に癌細胞を注入した。続いて、胃を戻し、そして腹部を層状に縫合した。各細胞株に関して、同所性胃腫瘍を誘導するために必要な細胞数、および実験期間を、予備的実験後に確認した:SNU−484腫瘍に関しては3x106細胞、またはIM−95、NUGC−4およびMKN−45腫瘍に関しては5x106細胞。治療措置を、胃漿膜下層中に癌細胞を接種した2日後に開始した。マウスに、100μL PBS中の100μgのPRL3−zumab(Wuxi Pharmatech)を、総数8回(SNU−484およびNUGC−4腫瘍)または10回(IM−95およびMKN45腫瘍)、静脈内(i.v.)投与した。PBSを「未治療」マウスにおける対照として用いた。個々の腫瘍の増殖速度は異なるため、実験期間は以下の通りであった:SNU−484およびNUGC−4腫瘍に関しては4週間、MKN−45腫瘍に関しては8週間、そしてIM−95腫瘍に関しては12週間。公式:体積=0.4x腫瘍の長さx腫瘍の幅x腫瘍の幅を用いて腫瘍体積を計算した。異種移植片腫瘍モデル:150μlのPBS中の3x106 SNU−484細胞を、麻酔したマウスの両脇腹に注入した。3週間後、生じた腫瘍(5〜10mm)を麻酔下で外科切除し、そしてマウスを2群に分けて、腫瘍除去後、週2回、PRL3−zumab(100μL PBS中、100μg、i.v.)またはPBS(100μL)のいずれかを投与した。腫瘍再発を、未治療および治療群両方において、切除後7週まで、毎週分析した。腫瘍増殖を両群で注意深く監視した。続発性胃転移モデル:3x106 HCT116−luc2細胞を、記載するように、麻酔したマウスの胃漿膜内に直接移植した。マウスを治療(PRL3−zumab、100μL PBS中、100μg)または未治療(100μL PBS)群に分け、そして移植後1、2および3週でのin vivoの腫瘍増殖を、150mg/kgルシフェリン(Caliper Life Sciences)の腹腔内注射後15分間、2%イソフルオラン麻酔下で、IVIS画像化によって監視した。
マウス血液スメアのWBC染色:ガラススライド上の新鮮なマウス血液滴から薄層のスメアを作製した後、スライドを37℃で1時間ベイクしてから、修飾ライト・ギムザ染色液(Sigma)に1分間浸し、その後、脱イオン水で3分間洗浄した。乾燥後、WBCが青く染まった染色スライドを顕微鏡下で観察した。各スライド中、10の視野をカウントし、そして等式WBC/μl=(カウントしたWBCの総数/視野の数)x2000を用いて計算することによって、光学顕微鏡(Olympus)下で、総WBCの概算を行った。全血カウント:Quest Laboratories(シンガポール)によって、マウス試料の血液学的分析を行った。
HSP70(カタログ番号EXOAB−Hsp70A)抗体を、System Biosciences, Incより購入した。カルネキシン(カタログ番号2679)抗体をCell Signalingより購入した。CD63(カタログ番号sc−15363)抗体をSanta Cruz Biotechnologyより購入した。GAPDH(クローンMAB374)抗体をMilliporeより購入した。B細胞マーカー(CD45/CD220、クローンRA3−6B2)およびNK細胞マーカー(CD335/Nkp46、クローン29A1.4)をBD Pharmingenより購入した。
細胞スライドの調製:細胞をガラスカバースリップ上に直接植え付け、そして48時間増殖させた。PBSCM(PBS pH7.0、1mM MgCl2、1mM CaCl2)で2回洗浄した後、細胞を3%パラホルムアルデヒド中、室温(RT)で20分間固定し、洗浄し、そしてPBS−0.1%サポニン(Sigma)で15分間透過処理した。組織切片スライドの調製:SNU−484およびMKN45同所性胃腫瘍の新鮮凍結標本から、クリオスタット(Leica)を用いて、−18℃で、10μmスライドを切片作製した。スライドを4%パラホルムアルデヒドで20分間固定し、PBS−0.05%Tween−20で洗浄し、そしてPBS−FDB(PBS pH7.0、2%BSA、5%ヤギ血清、5%ウシ胎児血清)中、RTで1時間ブロッキングした。続いて、スライドを、1:200希釈の示す一次抗体とRTで4時間インキュベーションし、洗浄し、そして対応する蛍光色素コンジュゲート化二次抗体(Life Technologies)と2時間インキュベーションした。洗浄したスライドに、DAPI含有退色防止マウント試薬(Vector Laboratories)をマウントし、そしてマニキュア液を用いて密封した。LSM 510共焦点顕微鏡(Zeiss AG)を用いて、共焦点画像化を行った。
10μm厚の凍結切片スライドを、4%ホルマリンで20分間固定し、そして1%H2O2−PBSと暗所で5分間インキュベーションした。次いで、洗浄したスライドを、10%ヤギ血清および1%BSA(Sigma)を含有するPBS中、RTで1時間ブロッキングした。続いて、穏やかに振盪しながら、スライドをPBS−0.05%Tween−20中で4回洗浄し、そしてヤギ抗ヒト標識ポリマー−HRP(Dako)と2時間インキュベーションした後、徹底的に洗浄して、そして基質−色素原溶液(Dako)と暗所で10〜20分間インキュベーションした。明視野顕微鏡(Olympus)を用いて、マウントしたスライドを調べ、そして代表的な画像を捕捉した。
ヒト研究に関して、ログランク検定を用いて、PRL−3 mRNA発現群に基づいて、全体のGC患者の生存のKaplan−Meier分析の有意性を評価した。COX比例ハザード回帰を用いて、単変数および多変数分析を行った。マウス研究に関して、ログランク検定を用いて、「未治療」および「治療」マウス群間の全生存のKaplan−Meier分析の有意な相違を評価した。スチューデントのt検定を用いて、同所性腫瘍体積の統計的に有意な相違を計算した。SPSSソフトウェアv19.0(IBM)を統計計算に用いた。すべての例において、p値<0.05は有意と見なされた。
PRL−3は腫瘍特異的ターゲットである
抗癌ターゲティング療法の開発に関連する困難は、望ましくないオフターゲット効果を回避するように、腫瘍において独占的に発現されるが、正常組織においては発現されない「腫瘍特異的抗原」の同定である。本発明者らはまず、内因性PRL−3のウェスタンブロッティングによって、すべての主な臓器由来の正常ネズミ組織をスクリーニングした。これらの完全ブロットにおいて、PRL−3の予測される分子量に対応する単一の〜20kDa内因性タンパク質が検出された(図1A)。本発明者らは、いかなる非特異的バンドも観察せず、PRL−3抗体が他の分子と交差反応しないことが確認された(27)。PRL−3タンパク質は、正常結腸において弱く検出された(図1A、レーン2)が、乳房および肺組織(図1A、レーン14〜15)を含めて、調べた他の14の主な正常ネズミ組織においては検出不能であった(図1A、レーン1、3〜15)。対照的に、PRL−3は、MMTV−PyMTマウス(28)由来の自発的発展乳房および肺腫瘍においては豊富に発現された(図1A、レーン16〜17)。重要なことに、PRL−3タンパク質はまた、免疫組織化学によって調べた15の主な正常ヒト臓器においてもまた、検出不能であった(図S1A)。さらに、患者マッチ組織試料において、PRL−3は、非癌性胃組織において検出不能であった(図11B、パネルa)が、胃腫瘍切片においては高発現され(図11B、パネルb)、やはり腫瘍特異的上方制御を示した。癌における高頻度のPRL−3過剰発現に関する公開された文献(29)、およびPRL−3条件的ノックアウトマウスが全般的に正常であるという近年の観察(30)と併せて、癌性組織における、しかし正常組織にはない、PRL−3の特異的発現は、PRL−3が適切な腫瘍特異的ターゲットであることを実証する。
過去10年に渡って、いくつかの研究によって、上昇したPRL−3発現が、胃癌の負の予後因子であることが立証されてきた(14、31、32)。本発明者らはさらに、185のGC患者の独立コホート(臨床特性を図17に提供する)において、上昇したPRL−3 mRNAレベルの臨床的有意性を研究した。Kaplan−Meier生存分析によって、腫瘍における上昇したPRL−3 mRNAレベルは、より短い全生存と関連することが明らかになった(p=0.002;図1B)。多変数Cox分析において、高PRL−3 mRNA発現はまた、より高い腫瘍悪性度と有意に関連した(図18)。次に、本発明者らは、シンガポール国立大学病院に入院しているGC患者由来の20のマッチした新鮮凍結生検組織試料対(腫瘍対隣接正常組織)を用いて、PRL−3タンパク質のレベルを調べた。ウェスタンブロットは、明らかに、17/20(85%)の胃腫瘍(T;図1C)における内因性PRL−3過剰発現を示したが、マッチした正常胃組織(n;図1C)のいずれでも過剰発現を示さず、PRL−3の腫瘍特異的発現が実証された。特に、PRL−3タンパク質は、これらのブロットにおいて、20〜25kDaの間の広いバンドとして出現し、ヒト腫瘍試料におけるPRL−3が潜在的に翻訳後修飾される(〜20kDa)ことが示唆されるが、これはまだ定義されていない。総合すると、本発明者らの臨床データは、ヒトGCにおける一般的な現象として、PRL−3癌タンパク質過剰発現を特徴付け、これは、疾患重症度と相関し、ターゲティング療法のための候補としての適切性を再確認する。
本発明者らは、以前、ヌードおよび野生型C57BL/6マウスの両方において、細胞内PRL−3を発現している腫瘍に対する、ネズミおよびキメラPRL−3抗体の高い有効性を示した(24、27)。これらの研究において、PRL−3モノクローナル抗体を投与されたマウスは、連続して体重が増加し、そして正常な活動を示し、オフターゲット副作用が最小限であることが示唆された。これらの初期の知見を、ヒトにおける臨床的適用に変換するため、本発明者らは、「PRL3−zumab」と称するヒト化モノクローナル抗PRL−3抗体を生成した。ウェスタンブロッティング、ELISA、および免疫蛍光分析によって、その前身と同様、操作されたPRL−3−zumabは、PRL−3を特異的に認識し、そしてPRL−3相同体、PRL−1またはPRL−2とは交差反応しなかった(図12A〜C)。続いて、本発明者らは、本報告に記載するすべてのさらなる実験のために、PRL3−zumabを用いた。
マウス腫瘍モデルにおいて、天然(同所性)位置で増殖しているヒト癌細胞は、高い忠実性でヒト疾患を複製する。より重要なことに、療法に対する腫瘍反応は、癌細胞が皮下対同所性位置に移植されているかに応じて、劇的に変化することが示されてきており(33)、抗腫瘍剤の療法的有効性をアッセイするための、正しいモデルを選択する必要性が強調される。胃腫瘍に対してPRL3−zumabの有効性を調べるために適切な前臨床同所性マウスモデルを確立するため、本発明者らはまず、PRL−3タンパク質発現状態に関して22のヒトGC細胞株パネルをスクリーニングし、そして続いて、マウスの胃の漿膜下層内でのその腫瘍形成能を試験した。PRL−3タンパク質は、分析した22のヒトGC細胞株のうち、13(59%)で検出された(図2A)。しかし、培養中でよく増殖し、そして管理可能な時間枠(<2ヶ月)内に同所性腫瘍を形成するGC細胞株は一部のみであった。これらの判断基準に基づいて、3つのPRL−3+細胞株(SNU−484、NUGC−4およびIM−95)および1つのPRL−3−細胞株(MKN45)を、同所性GCモデルを開発するために選択して、PRL3−zumabの抗腫瘍有効性を評価した。これらの株由来の細胞を胃の漿膜下層内に接種し、そして続いて、図2Bに概略するプロトコルにしたがって治療した。実験終了時、マウスから胃を採取し、そして胃腫瘍負荷に関して分析した。
5−FUは、胃癌の一次治療として用いられる化学療法薬剤である(17)ため、本発明者らは、PRL3−zumabが、同所性腫瘍増殖を阻害する際に、5−FUと併用して、より有効でありうるかどうかを研究した。本発明者らは、4つの治療プロトコルを試験した:PBS対照(群1)、PRL3−zumab単剤療法(群2)、PRL3−zumab+5−FU併用療法(群3)、または5−FU単剤療法(群4)。治療プロトコルにしたがって、PRL3−zumab(100μg/用量)または5−FU(30mg/kg/用量)の週2回の用量を、個々に、または併用して、同所性PRL−3+ SNU−484胃腫瘍を所持するヌードマウス群に静脈内投与した。実験経過中、本発明者らは、5−FU治療マウス(群3および4)において、全体の動物活動の減少を観察した。腫瘍体積の分析は、PRL3−zumab単剤療法(群2)が、最高の療法効率を有し、平均腫瘍体積は0.67±0.59cm3で最低であり、次にPRL3−zumab+5−FU併用治療(群3; 1.49±0.27cm3)、5−FU単剤療法(群4; 1.76±0.52cm3)、そして最後にPBS対照(群1; 3.98±0.60cm3;図4A)が続くことを示した。これらの結果は、PRL3−zumabを、化学療法剤、5−FUを伴わずに用いた場合、胃腫瘍を減少させる際により有効であることを示唆する。
手術は、GC治療の基礎であるが、患者の80%近くが、大部分は局所領域の再発のため、そして/またはより低い度合いで、遠位転移のため、短い期間内に死亡する(36)。PRL3−zumabがPRL−3+ GC増殖をin vivoで抑制する能力を考慮して、本発明者らは、PRL3−zumabが、腫瘍再発を抑制するための術後アジュバント治療としてもまた有効性を有するかどうかを調べた。PRL−3+ SNU−484 GC細胞を用いて、本発明者らはまず、3週間の経過に渡って、ヌードマウスの両脇腹に、異種移植片腫瘍(幅5〜10mmの間)を確立した(図19、パネルa)。次いで、生じた固形腫瘍を、注意深い手術を通じて完全に除去し(図19、パネルb)、そして対照抗体(未治療)、またはPRL3−zumab(治療)の週2回注射のため、マウスを2群に分けた。次いで、局所腫瘍再発を毎週監視した。術後7週までに、未治療群は、切除部位に巨大な局所腫瘍を発展させた(図19、パネルc)。対照的に、同じ期間に渡って、PRL3−zumab療法を受けているマウスの切除部位には、可視性の腫瘍増殖は観察されなかった(図19、パネルd)。これは解剖に際して確認され、未治療群からは巨大固形腫瘍が採取可能であった(図19、パネルe)が、PRL3−zumab治療群では、切除部位に固形腫瘍はまったく見られなかった(図19、パネルf)。総合すると、これらの結果は、PRL3−zumabが術後局所腫瘍再発を抑制する際に有効性を有することを示し、アジュバント療法としてのこの薬剤の臨床的変換のためのありうる手段が示唆される。
胃における転移の存在は、まれな状態であり(37〜39)、ほぼ常に劣った予後と関連する(40、41)。PRL3−zumabが転移性腫瘍形成を遮断可能であるかどうかに取り組むため、本発明者らは、PRL−3+ HCT116−luc2結腸直腸癌細胞を用いて、マウスの胃漿膜下層内に外科的に注入する、胃への結腸直腸癌転移の実験モデルを開発した。本発明者らは、HCT116−luc2細胞を、主に2つの理由で用いた:1)結腸癌からの胃転移がヒトにおいて記載されており(38、39、42)、そして2)HCT116−Luc2は、恒常的にホタル(firefly)ルシフェラーゼを発現し、in vivo画像化系(IVIS)を用いた腫瘍増殖の監視が可能になる。2つの別個の実験的複製において、PRL−3+ HCT116−luc2腫瘍は、未治療マウスにおいて、迅速に増殖したが、PRL3−zumab治療マウスは、同じ期間に渡り、はるかに減少したPRL−3+ HCT116−luc2腫瘍増殖を有した(図14A)。切除に際して、未治療マウスの胃に、重い腫瘍負荷が観察された(図14B、パネルa、a’)。対照的に、PRL3−zumab治療マウスは、はるかにより低い胃腫瘍負荷を有した(図14B、パネルb、b’)。さらに、未治療マウスにおいて、腹壁への広範囲の転移性播種が見られた(図14B、パネルc、c’)が、これもまた、治療マウスでは非常に減少した(図14B、パネルd、d’)。総合すると、これらの結果は、PRL3−zumabが、胃微小環境中およびその周囲のPRL−3+ HCT116−luc2結腸直腸癌腫瘍の増殖および転移を減少させうることを示唆した。
多様な癌モデルにおいて、PRL3−zumabの抗腫瘍有効性が立証されており、本発明者らは次に、PRL3−zumab療法のためにPRL−3+癌患者を同定する単純な方法を探した。以前、本発明者らは、抗PRL−3抗体が、in vitroで、PRL−3+腫瘍細胞によって内在化されうることを報告した(23)。しかし、「細胞内」PRL−3抗原の抗体認識がどのように、そしてどこで起こるかは不明であった。本明細書において、本発明者らは、PRL−3タンパク質が、in vitroで、対応するPRL−3+癌細胞株から分泌されそして濃縮培地中で検出されることが可能であるが、PRL−3−癌細胞株からは検出されないという、以前は認識されていなかった天然の現象を報告する(図5A、レーン1〜4)。死んだ細胞または細胞破片による非特異的混入を排除するため、本発明者らは、もっぱら溶解物中にあり(図5A、レーン5〜8)、馴化培地中にはない(図5A、レーン1〜4)ER局在タンパク質、カルネキシン(CANX)を対照として検出した。
PRL−3は、癌患者由来の尿試料において頻繁に検出可能であるため、本発明者らは、尿PRL−3がin vivoの本物のPRL−3+腫瘍の存在を反映するかどうか疑問を持った。この関係を実証するために、臨床的にマッチした腫瘍−尿試料を得ることが困難であるため、本発明者らは、その代わり、PRL−3+ SNU−484およびPRL−3− MKN45同所性胃マウスモデルを用いて、マッチした腫瘍−尿対でのPRL−3の発現を比較した。さらに、各同所性モデルを未治療、またはPRL3−zumab(治療)の2群に分け、PRL3−zumab療法および尿PRL−3発現の間の関連を解明した。未治療PRL−3+ SNU−484腫瘍所持マウスにおいて、PRL−3タンパク質は、尿試料中、非常に豊富であった(図6A、奇数レーン1〜9)。しかし、尿PRL−3はPRL3−zumab治療後、すべてのマウスでもはや検出不能であり、これはPRL−3の腫瘍内発現の減少と一致した(図6A、偶数レーン2〜10)。重要なことに、PRL3−zumab治療マウスからの尿PRL−3シグナルの喪失は、各場合で、胃腫瘍縮小と対応し(図6A、上部パネル)、尿PRL−3がPRL3−zumab療法有効性の代理バイオマーカーとして有用でありうることを示唆した。対照的に、本発明者らは、PRL3−zumab療法を行うか行わないかに関わらず、PRL−3− MKN45同所性腫瘍を所持するマウスにおいて、尿PRL−3を検出しなかった(図6A、レーン11〜12)。したがって、尿PRL−3は、PRL−3+癌を所持するマウスでは特異的に検出されたが、PRL−3−癌のマウスでは検出されず、そして腫瘍負荷の減少と並行して、PRL3−zumabでの治療に際して減少する。
臨床的抗体発展において考慮する重要な点は、in vivoでの腫瘍および正常(または非抗原発現)組織の間の抗体の生体分布である(46)。これを考慮して、本発明者らは、本発明者らの同所性モデルにおいて、腫瘍部位でのPRL3−zumabの分布を調べた。PRL3−zumab治療後、本発明者らは、PRL−3+ SNU−484腫瘍内でPRL3−zumabの濃縮を検出した(図6B、パネルb〜c)が、PRL−3− MKN45腫瘍では検出しなかった(図6B、パネルf)。対照として、未治療マウス(図6B、パネルa)または5−FU単独(図6B、パネルd)ではシグナルは見られなかった。これらの結果は、PRL−3発現腫瘍の微小環境におけるPRL3−zumabの特異的集積を示した。免疫エフェクター細胞による抗体の認識は、免疫グロブリン受容体(FcR)を通じて起こり、該受容体が抗体のFc部分に結合し、これらのエフェクター細胞の補充および活性化を生じる(47)。腫瘍組織におけるPRL3−zumabの集積が、免疫細胞の浸潤を生じるかどうかを決定するため、細胞内抗体療法の有効性に関して非常に重要であると示唆される2つのFcR所持免疫細胞タイプであるB細胞およびNK細胞に対する特異的抗体を用いて、PRL−3+ SNU−484胃腫瘍切片に対して免疫蛍光を行った(26)。PRL−3+ SNU−484同所性腫瘍切片において、未治療腫瘍切片(図6B、パネルgおよびm)と比較して、浸潤B細胞およびNK細胞の数は、PRL3−zumab治療腫瘍において、可視的により多かった(図6B、パネルhおよびn)。驚くべきことに、本発明者らは、一貫して、PRL3−zumabおよび5−FUでの併用療法に供したマウス(図6B、パネルiおよびо)、ならびに5−FU治療マウス(図6B、パネルjおよびp)において、BまたはNK細胞浸潤が欠けていることを観察し、これはおそらく、5−FU投与に際して、リンパ球集団が減少するためであった(図4C)。PRL−3− MKN45腫瘍切片においては、PRL3−zumab治療にもかかわらず、B細胞またはNK細胞浸潤の相違は観察されなかった(図6B、パネルk〜lおよびq〜r)。これらの知見に基づいて、本発明者らは、PRL3−zumabおよびPRL−3抗原が相互作用して、in vivoで療法的効果を誘発する新規機構を提唱する(図6C):1)PRL−3抗原は、非慣用的な分泌を通じて(エクソソームPRL−3)外在化するか、あるいは壊死性またはアポトーシス性PRL−3+腫瘍細胞から自発的に漏洩(遊離PRL−3)し、ベイトとして作用し、2)これにPRL3−zumabが結合し、そして免疫複合体が腫瘍微小環境内に集積し、続いて、3)抗腫瘍効果のため、エフェクターNKおよびB細胞が補充され、そして活性化される。
自己免疫病理に関する研究によって、自己抗体が特異的細胞内抗原に結合し、そして抗原提示細胞の細胞質および核区画内に集積可能であることが示されてきている(47)。同様に、本発明者らは、抗PRL−3抗体が、in vitroで、PRL−3+腫瘍細胞によって内在化可能であることを観察している(4)。しかし、抗体取り込み様式は、ほとんど定義されないままである。ここで、本発明者らは、細胞内PRL−3抗原が特異的結合および腫瘍抑制のために抗体と関与しうる2つの新規知見を明らかにする:1)細胞内PRL−3癌タンパク質は分泌されうる。腫瘍細胞において、いくつかの古典的「細胞内」タンパク質が、分泌および/または細胞表面再局在を通じて外在化され、それによって抗体を用いた療法介入に対してアクセス可能となることが報告されてきている(48、49)。本発明者らは、3つのPRL−3+細胞株:SNU−484、NUGC−4、IM−95、および1つのPRL−3−細胞株、MKN45において、PRL−3細胞内および細胞外PRL−3発現を比較することによって、PRL−3がPRL3−zumabのターゲット抗原として、同様に外在化可能であるかどうかを調べた。PRL−3発現を、対照としての非分泌ER係留タンパク質、カルネキシンと比較した。PRL−3タンパク質は、PRL−3+ GC細胞の細胞内タンパク質分画(細胞溶解物)(図6A、レーン1〜3)、ならびにPRL−3+ GC細胞の細胞外タンパク質プール(濃縮馴化培地)(図6A、レーン5〜7)の両方で検出されたが、PRL−3− GC細胞株では検出されなかった(図6A、レーン4、8)。対照的に、カルネキシンは、PRL−3+およびPRL−3− PRL GC細胞両方で、もっぱら細胞内プールに存在した(図6A、レーン1〜4)が、細胞外プールには存在しなかった(図6A、レーン5〜8)。この観察は、死んだ細胞または細胞破片による非特異的混入を排除し、そしてPRL−3を新規分泌タンパク質として特徴付ける。2)外在化PRL−3は、PRL3−zumab結合のベイトとして働きうる。本発明者らは次に、治療した同所性GCマウス由来の腫瘍切片を調べ、そして腫瘍微小環境内のPRL3−zumab分布を分析した。対照として、未治療マウス(図6B、一番左のパネル)にはシグナルはまったく見られなかった。治療後、PRL3−zumabは、PRL−3+ SNU−484腫瘍の微小環境内で濃縮されたが、5−FU単剤療法を受けているもの、またはPRL−3− MKN45腫瘍では濃縮されなかった(図6B)。これらの結果は、PRL−3+腫瘍の微小環境においてPRL3−zumabが特異的に集積するが、PRL−3−腫瘍には集積しないことを示した。
本研究は、最小限の副作用で、癌ターゲティング免疫療法のための利用可能な分子ターゲットとしての、腫瘍特異的細胞内癌タンパク質の以前は認識されていなかった潜在的可能性をさらに示す。本発明者らの結果は、PRL−3を優れた腫瘍特異的癌ターゲットと特徴付け、そしてヒト胃癌細胞株を用いて同所性腫瘍モデルを生成して、臨床的に適切なセッティングで、PRL3−zumabの特異的抗腫瘍有効性を立証した。PRL3−zumabは、同所性PRL−3+胃腫瘍の増殖を特異的に阻害し(しかしPRL−3−腫瘍の増殖は阻害せず)、PRL−3+胃癌の治療のためのPRL3−zumabの適切性を確立した。さらに、分泌尿PRL−3を、診断および治療反応監視のためのバイオマーカーとして使用してもよい。
この研究において、本発明者らは主に、「シード・アンド・ソイル(seed and soil)」肝臓同所性腫瘍モデルを用いて、PRL−3抗体が、その細胞内PRL−3抗原とどのように結合可能でありうるかに取り組む、分子作用機構(MOA)に重点を置いた。本発明者らは、異なる側面から研究して、実際に「細胞内癌タンパク質」が、in vitroよりもin vivoでより高い率で、「細胞外癌タンパク質」として細胞表面に再局在化し、したがって、細胞外癌ターゲットに対する抗体慣用的経路を通じて、腫瘍排除のための合理的基礎にしたがうという重要な結論に到達する。それと一致して、本発明者らは、機構的に、PRL3−zumabが、PRL−3「細胞内」抗原を発現している腫瘍を遮断するには以下が必要であることを見出した:1.FcγII/III遮断剤の両方が治療有効性を無効にするため、宿主FcγII/III受容体相互作用。2.完全抗体活性、Fc断片(CH1およびCh2ドメイン)を欠くミニボディは、治療有効性を退ける。3.M1(しかしM2はそうではない)マクロファージ、Bリンパ球、ナチュラルキラー細胞を増加させて、宿主免疫を増進させる。これらの結果は、「細胞内癌タンパク質」をターゲティングする抗体のMOAが、実際に、腫瘍を除去するための古典的な抗体依存性細胞傷害性(ADCC)または食作用(ADCP)経路を通じて、「細胞外癌タンパク質」をターゲティングするのと類似の原理にしたがうことを示唆する。最後に、110の貴重な新鮮凍結ヒト腫瘍またはそのマッチした正常組織を用いて、本発明者らはさらに、PRL−3が、9つの異なるヒト癌タイプ:肝臓、肺、結腸、乳房、胃、膀胱、前立腺、AML、および腎臓患者腫瘍試料の平均≧78%で広く過剰発現されるが、マッチした正常組織では発現されないことを示した。これらの知見は、大部分の「治療が困難な」癌に対するターゲティング免疫療法の次のフロンティアとして、PRL3−zumab臨床試験を正当化する。
細胞株。ヒトHCC細胞株Hep3B2.1、HepG2、Huh−7、PLC、SNU449を、American Type Cell Culture(米国バージニア州マナサス)から購入した。ネズミHCC細胞株Hep53.4をCLS Cell Lines Service GmbH(ドイツ・エッペルハイム)より購入した。すべての細胞株を、組換え培地中で培養した。MHCC−LM3ヒトHCC癌細胞株を、ルーチンにKam−Man Hui博士の研究室(シンガポール国立癌センター)で維持した。
PRL−3「細胞内癌タンパク質」は、in vivoで、「細胞外癌タンパク質」と同定されうる
PRL−3抗体は、PRL−3発現異種移植片腫瘍、転移性肺腫瘍、および同所性胃腫瘍に対して、有効性を示した。細胞内癌タンパク質に対するこれらの非慣用的抗体療法を理解するため、PRL3抗体は、免疫細胞上のFcγRと、細胞内PRL−3をどのように架橋可能であるのかを考える必要がある。ありうる仮説は、PRL−3自体の何らかの部分が、in vivoで、さっとひっくり返って、細胞表面で暴露されて、サイクリング効果を誘発し、それによって、他の細胞表面(細胞外)抗原と同様、直接PRL3−zumabが結合することを可能にしうるというものである。これを試験するため、本発明者らは、穏やかな酵素的解離を用いて、固形肝臓腫瘍から単細胞懸濁物を調製し、そしてフローサイトメトリーアプローチを用いて、in vitro培養細胞に対して、これらのex vivo腫瘍細胞の細胞表面発現を比較した(図20a)。これらの非透過処理細胞プールのサイトメトリー分析によって、これらの間の主な抗原特異的相違が明らかになった。抗上皮増殖因子受容体(EGFR)キメラ抗体であるセツキシマブは、多量の増殖因子を人工的に添加した培養細胞に比較して、ex vivo腫瘍でEGFR表面発現の劇的な低下を示し、一方、PRL−3に関しては逆が当てはまった(図20bの代表的なフローヒストグラム)。定量化によって、培養細胞(CC;図20c、カラム3対4)に比較して、ex vivo腫瘍細胞(T)において、表面EGFR染色の3倍の減少が明らかになった。対照的に、PRL3−zumab染色で分析した際のPRL−3発現は、ex vivo腫瘍細胞ではおよそ7倍増加しており、ここで、in vivoの癌細胞は、低酸素ストレスおよび血清枯渇下にあり、こうした条件は、培養細胞条件(CC;図20c、カラム5対6)に比較して、癌細胞が細胞内PRL−3タンパク質を外在化させる能力を増進させうる。フローサイトメトリーで見られるこれらの変化が、これらの抗原の総細胞レベルの変化のためでありうるかどうかを検証するため、本発明者らは、平行して、溶解物のウェスタンブロッティングを行った。以前のサイトメトリー観察と一致して、培養細胞と比較して、EGFRの総レベルは、ex vivo腫瘍細胞において、顕著に下方制御されていた(図20d)。対照的に、PRL−3発現は、元来の細胞に比較して、腫瘍で明らかに増加していた(図20d)。しかし、総PRL−3レベルの増加は、PRL−3表面レベルの増加に比較してはるかに小さいため、本発明者らは、後者の観察は、主に、細胞内PRL−3の再局在化に起因しうると結論付ける。これを実証するため、培養MHCC細胞およびMHCC腫瘍の透過型電子顕微鏡検査(TEM)を行い、ここで、MHCC細胞に比較して、MHCC腫瘍の細胞膜の細胞外小葉上に、細胞膜の細胞内小葉に対する有意な相違を伴わず、抗PRL−3免疫金染色の顕著な増加が観察された。
次いで、in vivоでのこれらのより高いレベルの「細胞外」PRL−3抗原は、PRL−3抗体によって認識されて、免疫細胞を補充し、そして伝統的な細胞外癌タンパク質に対する抗体療法の古典的なADCCおよびADCPにしたがうことも可能であった。ヒト癌細胞(「シード」)が、天然の位置(「ソイル」)中で増殖を可能にされる同所性腫瘍モデルは、高い忠実性でヒト疾患を複製する。本発明者らは、近年、PRL3−zumabが、ヒト胃癌細胞によって形成されたPRL−3を発現している同所性胃腫瘍を抑制可能であることを報告した(8)。さらに、本発明者らは、PRL3−zumabがまた、切除後、PRL−3を発現する腫瘍の再発も遮断可能であることを示した。
考察
本研究は、本発明者らの以前の研究に基づき、ありうる抗体が、どのように「細胞内癌タンパク質」をターゲティングしうるか、そして多数のPRL−3陽性ヒト癌タイプに対して、PRL3−zumabの将来の療法的価値をさらに詳しく分析するための分子作用に関する決定的な証拠を提供する。PRL−3の本発明者らの知見は、110のランダムに分析した新鮮凍結ヒト癌試料において、>78%の頻度で存在し、そして同所性胃腫瘍モデル(参照)に関する本研究および以前の研究において、同所性肝臓および肺腫瘍におけるPRL3−zumabの有意な療法的利益を示す腫瘍関連癌タンパク質であるというものであり、本発明者らは再び、他の癌一般に加えて、喫緊の満たされていない医学的必要性を伴う、これらの急性悪性腫瘍に関するブレイクスルー免疫療法候補としてのPRL3−zumabを立証する。
Claims (20)
- PRL3に結合するヒト化抗体または抗体結合性断片。
- 抗体または抗体結合性断片がCH1およびCH2ドメインを含有する、請求項1のヒト化抗体または抗体結合性断片。
- アミノ酸配列KAKFYNおよび/またはHTHKTRを含むエピトープに結合する、請求項1記載のヒト化抗体または抗体結合性断片。
- アミノ酸配列i)〜iii)、またはアミノ酸配列iv)〜vi)、あるいは好ましくはアミノ酸配列i)〜vi);
- 以下のCDR:
- 以下のCDR:
- PRL3に結合する先行する請求項のいずれか一項記載の抗体または抗原結合性断片を含む、任意に単離されたin vitro複合体。
- 図7に示すような重鎖および軽鎖可変領域配列を含む、抗体および抗原結合性断片。
- 癌治療のための薬剤製造における、先行する請求項のいずれか一項記載のヒト化抗体、抗原結合性断片の使用。
- 癌を治療する方法において使用するための、先行する請求項のいずれか一項記載のヒト化抗体または抗体結合性断片。
- 癌を治療するための、患者に対する請求項1記載のヒト化抗体または抗体結合性断片を投与する工程を含む方法。
- 癌が胃癌または胃癌の転移である、請求項11記載の方法。
- ヒト化抗体または抗体結合性断片を静脈内投与する、請求項11記載の方法。
- ヒト化抗体を、治療しようとする癌とは離れた位置で投与する、請求項11記載の方法。
- ヒト化抗PRL3抗体を胃癌患者に投与する工程を含み、ここで患者が以前、胃癌に関する代謝拮抗剤療法を受けていなかったか、または以前、代謝拮抗剤療法を受けていなかった、請求項11記載の方法。
- 代謝拮抗剤療法が5−FUである、請求項12記載の方法。
- 患者が損なわれた免疫系を持たないことが決定されている、請求項11記載の方法。
- 細胞においてPRL3の細胞局在を決定する工程を含むin vitro法であって、細胞表面でのPRL3発現が、細胞が癌性であることを示す、前記方法。
- 細胞表面でのPRL3発現が、対照細胞と比較して、2倍増加している、請求項18の方法。
- PRL3が細胞表面で発現されている場合、個体が癌を有することが決定されるか、または個体が抗癌療法のために選択される、請求項18の方法。
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