KR20170136553A - 당화 pd-l1에 특이적인 항체 및 그의 사용 방법 - Google Patents

당화 pd-l1에 특이적인 항체 및 그의 사용 방법 Download PDF

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Abstract

비당화 PD-L1에 비하여 당화 PD-L1에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 당화 PD-L1 단백질의 특정 에피토프를 인식하며 PD-1에의 PD-L1의 결합을 차단할 수 있는 항체가 제공된다. 일부 양태에서, PD-L1 세포외 도메인의 아미노 및 카르복시 말단 위치의 당화된 아미노산 잔기를 포함하는 PD-L1 폴리펩티드가 또한 제공된다. (예를 들어, 암의 치료를 위하여) 그러한 항체 및 폴리펩티드를 제조하고 이용하는 방법 또한 제공된다.

Description

당화 PD-L1에 특이적인 항체 및 그의 사용 방법
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출되었으며 그 전체가 참고로 본원에 포함되는 서열 목록을 함유한다. 2016년 3월 25일에 생성된 ASCII 카피는 명칭이 24258.105003PCT_SL.txt이며 크기가 41,706 바이트이다.
기술 분야
본 발명은 일반적으로 분자 생물학, 의학 및 종양학 분야에 관련된다. 보다 구체적으로, 당화(glycosylated) PD-L1에 특이적으로 결합하는 신규 항체 및 암 치료를 위한 그들의 용도를 제공한다.
T-세포 활성화의 영속화는 광범위한 악성 암의 치료를 극적으로 개조하였다. 예를 들어, T-세포 반응을 표적화하는, 첫번째 FDA 승인된 체크포인트 차단제인 이피리무맙의 개발은 전이성 흑색종의 치료를 가능하게 하였다(Hodi, F.S. et al., 2010, NEJM, 363 :711-723; Robert, C. et al., 2013, Clin. Cancer Res., 19:2232-2239; 및 Robert, C. et al., 2011, NEJM, 364:2517-2526). 항-세포독성 T 림프구 항원-4(CTLA-4) 단일클론 항체가 흑색종 환자 치료에서 유망한 결과를 나타낸 한편, PD-1 또는 PD-L1을 표적화하는 2세대 체크포인트 억제제는 임상 III상 시험에서 더 우수한 임상 활성 및 안전성을 입증하였다(Topalian, S.L. et al., 2012, NEJM, 366:2443-54; 및 Brahmer, J.R. et al., 2012, NEJM, 366:2455-2465). PD-L1은 그의 면역억제 활성에 더하여 또한 암 세포 진행을 유도하는 발암 가능성을 보유하므로(Topalian, S.L. et al., Id ; Page, D.B. et al., 2014, Ann. Rev. Med., 65: 185-202), PD-1/PD-L1 상호작용을 표적화하는 것은 PD-L1을 통한 세포 진행을 감소시키는 한편 PD-1을 통한 면역억제를 차단함으로써 이중 효능을 제공하며, 보다 민감한 결과를 가질 것으로 예상된다(Topalian, S.L. et al., Id ; Brahmer, J.R. et al., Id; 및 Hamid, O., 2013, NEJM, 369: 134-144). US FDA는 일부 암의 치료를 위하여 두 가지 항-PD-1 치료 항체를 승인하였다: 키트루다(KEYTRUDA)®(펨브로리주맙) 및 옵디보(OPDIVO)®(니보루맙). 유망한 결과를 가진 여러가지 성공적인 임상 시험이 있었지만(Page, D.B. et al., Id), PD-L1의 병리생리학적 기능 및 조절 기전은 완전히 정의되지 않았다.
침묵화된 면역 반응, 특히 이펙터 T-세포를 다시 깨우는 것이 최근에 외과적 제거, 화학요법, 방사선요법 및 표적화된 치료법 후의 치료 옵션 레퍼토리에 추가되었다. 항-CTLA-4 단일클론 항체의 사용이(Dunn et al., 2002, Nature immunology, 3 :991-998; 및 Leach et al., 1996, Science, 271 : 1734-36) 처음에는 전이성 흑색종의 치료에서 성공을 입증하였지만, 자가면역 반응도 유도하는 것으로 나타났다. 면역 세포에만 영향을 주는 항-CTLA-4 항체와 달리, 항-PD-L1 항체 및 항-PD-1 항체는 세포 수준에서 그리고 종양 부위에서 작용하여 PD-1-발현 이펙터 T-세포와 PD-L1-발현 종양 세포 사이의 상호작용을 차단한다. 이것은 종양 세포와 T-세포 둘 모두로부터의 이중 영향을 생성하여, 부작용을 제한하고 더 나은 치료 효능을 제공한다(Okazaki, T. et al., 2013, Nature immunology, 14: 1212- 1218). PD-1/PD-L1 경로를 성공적으로 표적화하고 면역계의 이펙터 세포를 활성화시켜 종양 세포를 공격하고 암을 치료하는 새롭고 더욱 효과적인 치료제 및 방법이 여전히 필요하다.
본 발명자들은 종양 세포 상에 발현된 PD-L1(CD274, PDCD1L1, 또는 B7-H1로도 알려짐)의 당화가 T 세포와 같은 면역 이펙터 세포 상에 발현된 PD-1에의 결합을 촉진하거나 향상시켜, 종양 세포에 대한 T 세포 활성의 억제를 증가시킴을 발견하였다. 본 발명자들은 비당화 인간 PD-L1 폴리펩티드에 비하여 당화 인간 PD-L1 폴리펩티드에 특이적으로 그리고 우선적으로 결합하며 PD-1에의 당화 PD-L1의 결합을 차단하거나 억제하는 항체를 확인하였다. 본 명세서에서 사용될 때, 당화 인간 PD-L1에 대해 특이적이며 PD-1에의 당화 PD-L1의 결합을 억제하는 그러한 항체는 "항-glycPD-L1 항체"로 불린다.
본 발명은 이들 항-glycPD-L1 항체 하나 이상을 투여하여, 이를 필요로 하는 개체에서 암, 특히 그 세포가 PD-L1을 발현하거나 과발현하는 암을 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 본 명세서에 개시된 항-glycPD-L1 항체는 PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용을 억제하거나 차단하고, 이는 다시 PD-1/PD-L1 상호작용으로부터 야기되는 면역억제를 억제하여, 종양 세포에 의해 발현된 면역억제 리간드인 PD-L1을 발현하는 종양 세포에 대한 PD-1-발현 이펙터 T-세포의 세포독성 활성의 영속화를 허용한다. PD-1/PD-L1 상호작용을 억제함으로써, 본 명세서에 개시된 항-glycPD-L1 항체는 이펙터 T-세포 반응을 향상시키고 항-종양 활성을 매개할 수 있다. 본 명세서에서 사용될 때, 용어 비당화 PD-L1 및 비-당화 PD-L1은 상호교환되어 사용된다. 달리 나타내지 않으면, 본 명세서에서 사용될 때 "PD-L1"은 PD-L1 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드, 특히 인간 PD-L1(시그널 서열을 포함하는, 서열 번호 1의 아미노산 서열)을 말하며; "PD-1"은 PD-1 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드, 특히 인간 PD-1을 말한다.
본 발명자들은 인간 PD-L1이 예를 들어, 서열 번호 1에 개시된, 인간 PD-L1 단백질의 아미노산 위치 N35, N192, N200 및/또는 N219에서 세포외 도메인(ECD) 내의 4 부위에서 당화됨을 추가로 발견하였다. 개시된 항-glycPD-L1 항체는 이들 부위 중 하나 이상에 결합할 수 있으며, 예를 들어, 이들 당화 부위 중 하나 이상에서 돌연변이를 가지며(예를 들어, 당화 컨센서스(consensus) 서열 내에서 아스파라긴에 대해 글루타민의 치환) 따라서 이들 부위 중 하나 이상에서 당화되지 않은 PD-L1에 결합하지 않을 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 PD-L1 당폴리펩티드 또는 그의 펩티드 내의 하나 이상의 당화 모티프에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 당화 모티프 및 인접 펩티드를 포함하는 PD-L1 당펩티드에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 3차원에서 당화 모티프 중 하나 이상 근처에 위치한 펩티드 서열에 결합한다. 따라서, 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 당화 PD-L1의 형태적(conformational) 에피토프(epitope)를 인식하고 선택적으로 결합한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 비당화 PD-L1에 대하여 나타내진 Kd의 85% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 50% 미만, 45% 미만의 Kd로, 하지만, 실시양태에서는, 비당화 PD-L1에 대하여 나타내진 Kd의 5%, 10%, 15%, 20% 또는 25% 이하의 Kd로, 당화 PD-L1에 결합한다. 전술한 Kd 값과 동일한 값뿐만 아니라 그 사이의 값이 포함됨이 이해된다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 비당화 PD-L1에 대하여 나타내진 Kd의 절반 미만의 Kd로 당화 PD-L1에 결합하지만, 여전히 이중 항-당화 PD-L1 기능을 나타낸다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 비당화 PD-L1에 대하여 나타내진 Kd 보다 적어도 5분의 1 이하의 Kd로 당화 PD-L1 단백질에 결합한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 비당화 PD-L1에 대하여 나타내진 Kd 보다 적어도 10분의 1 이하의 Kd로 당화 PD-L1 단백질에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는, 예를 들어, WT PD-L1을 발현하는 세포와 비당화 PD-L1이 혼합되고 상이하게 라벨링된 후, 예를 들어, 실시예 5에 개시된 대로, 그리고 예를 들어, FITC와 같은 형광 라벨 또는 마커에 의해 직접 또는 간접적으로 항체가 감출가능할 경우 두 세포 집단에 대한 측정된 형광 강도(MFI)에 의해 측정되는 검출가능 마커로 라벨링된 분석될 항체와 접촉되는 세포 유동세포측정 분석에서 분석할 때, 비당화 PD-L1을 발현하는 세포보다 적어도 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 또는 10배 더 큰 빈도로 WT 당화 PD-L1을 발현하는 세포에 우선적으로 결합한다. 실시양태에서, 항체는 FITC와 같은 형광 라벨 또는 마커로 직접 라벨링된다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 5-20 nM, 5-10 nM, 또는 10-20 nM의 친화성으로 당화 PD-L1 단백질에 선택적으로 결합한다. 실시양태에서, 항체는 단일클론 항체이며, 더욱 바람직하게는 키메라 또는 인간화 또는 인간 항체이다. 용어 "특이적으로 결합하다" 및 "선택적으로 결합하다"는 본 명세서에 상호교환되어 사용된다.
구체적 양태에서 본 발명은 각각 서열 번호 3 및 11(성숙 VH 및 VL 영역 아미노산 서열), 또는 각각 시그널 펩티드 서열을 함유하는 서열 번호 86 및 88의 아미노산 서열을 각각 가진 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 갖는 항-glycPD-L1 단일클론 항체 STM004, 및 그의 항원 결합 부분, 및 그의 인간화 및 키메라 형태를 제공한다. STM004는 본 명세서에서 서열 번호 1에 개시된 인간 PD-L1 아미노산 서열의 위치 Y56, K62 및 K75에서의 아미노산 잔기에 해당하는 PD-L1 상의 에피토프인 형태적 에피토프에 결합하는 것으로 결정되었다. STM004 MAb 에피토프를 포함하는 인간 PD-L1 폴리펩티드의 부분은 서열 LDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQH(서열 번호 93)을 가진다. 본 명세서에 나타난 대로, MAb STM004에 의해 인식되는, 즉, PD-L1에 결합된 mAb에 의해 접촉되는 에피토프를 구성하는 아미노산 잔기 Y56, K62 및 K75는 밑줄 표시된다. 본 발명은 PD-L1에의 결합을 위해 STM004 MAb와 경쟁하고/하거나 STM004와 동일한 에피토프에 결합하는 항-glycPD-L1 항체를 제공한다.
STM004 MAb의 중쇄 및 경쇄 가변(V) 도메인의 핵산(DNA) 및 상응하는 아미노산 서열이 하기 표 3에 나타난다. 서열 번호 2, 3, 10 및 11은 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 성숙 형태(즉, 시그널 펩티드를 갖지 않음)의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이다. 표 3은 또한 시그널 서열이 이탤릭체로 표시된 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 서열 번호 85-88로서 제공한다. 또한 표 3에는 STM004의 카밧(Kabat) 및 초티아(Chothia) 중쇄 및 경쇄 V 도메인 CDR이 나타난다.
실시양태에서, 당화 PD-L1에 특이적으로 그리고 우선적으로 결합하는 항-glycPD-L1 항체는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 가진 VH 도메인 및/또는 서열 번호 11의 아미노산 서열을 가진 VL 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 당화 PD-L1에의 특이적 결합을 위하여 서열 번호 3의 VH 도메인 및 서열 번호 11의 VL 도메인을 포함하는 항체와 경쟁한다. 다른 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 서열 번호 3의 아미노산 서열에 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 VH 도메인 및/또는 서열 번호 11의 아미노산 서열에 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 VL 도메인을 포함한다. 이들 항-glycPD-L1 항체는 키메라 항체일 수 있으며, 예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터의 인간 불변 도메인(human constant domain)을 포함할 수 있다.
실시양태에서, 당화 PD-L1에 특이적으로 그리고 우선적으로 결합하는 항-glycPD-L1 항체는 각각 서열 번호 4, 서열 번호 6 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 가진 초티아 CDR 1-3을 포함하거나 각각 서열 번호 5, 서열 번호 7, 서열 번호 9로부터의 아미노산 서열을 가진 카밧 CDR 1-3을 포함하거나 그 조합을 포함하는 VH 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 당화 PD-L1에의 특이적 결합을 위해 각각 서열 번호 4, 서열 번호 6 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 가진 초티아 CDR 1-3을 포함하거나 각각 서열 번호 5, 서열 번호 7, 서열 번호 9의 아미노산 서열을 가진 카밧 CDR 1-3을 포함하거나 그 조합을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항체와 경쟁한다. 실시양태에서, 당화 PD-L1에 특이적으로 그리고 우선적으로 결합하는 항-glycPD-L1 항체는 각각 서열 번호 12, 서열 번호 14 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 가진 CDR 1-3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 당화 PD-L1에의 특이적 결합을 위해 각각 서열 번호 12, 서열 번호 14 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 가진 CDR을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 항체와 경쟁한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 각각 서열 번호 4, 서열 번호 6 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 가진 초티아 CDR 1 내지 3을 포함하거나 각각 서열 번호 5, 서열 번호 7, 서열 번호 9로부터의 아미노산 서열을 가진 카밧 CDR 1 내지 3을 포함하는 VH 도메인을 포함하며 각각 서열 번호 12, 서열 번호 14 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 가진 CDR 1-3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 항체를 포함하거나 결합을 위해 경쟁한다.
다른 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 각각 서열 번호 4, 서열 번호 6 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 가진 CDR 중, 또는 각각 서열 번호 5, 서열 번호 7 및 서열 번호 9의 아미노산 서열을 가진 CDR 중, 1, 2 또는 3개에서 1, 2, 3, 4, 또는 5 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 가진 CDR H1, H2 및 H3을 포함하는 VH 도메인을 갖는다. 항-glycPD-L1 항체는 각각 서열 번호 12, 서열 번호 14 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 가진 1, 2 또는 3 CDR에서 1, 2, 3, 4, 또는 5 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 가진 CDR L1, L2 및 L3을 포함하는 VL 도메인을 가질 수 있다. 항-glycPD-L1 항체는 VH 및 VL 도메인 둘 모두를 위해 CDR에서 아미노산 치환을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산 치환은 보존적 치환이다.
바람직하게는 전술한 항체는 인간 골격 영역(human framework region)을 가지며, 즉, STM004의 인간화 형태이며, 선택적으로, 예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터의 인간 불변 도메인을 포함한다.
결합 친화성 또는 다른 파라미터를 개선하기 위하여 인간화 항체의 CDR 및/또는 골격 영역에서 하나 이상의 아미노산 치환이 이루어질 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 당화 PD-L1에의 특이적 결합을 위해 상술한 VH 및 VL 도메인 및 그안의 CDR을 포함하는 항체와 경쟁한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 비당화 PD-L1에의 항체의 결합에 의해 나타내지는 Kd의 절반 미만의 Kd로 당화 PD-L1에 결합한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 비당화 PD-L1에 대하여 나타내진 Kd보다 적어도 5분의 1 이하의 Kd로 당화 PD-L1 단백질에 결합한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 비당화 PD-L1 단백질에의 항체의 결합에 의해 나타내지는 Kd보다 적어도 10분의 1 이하의 Kd로 당화 PD-L1 단백질에 결합한다. 실시양태에서, 실시예 5에 개시된 세포 유동세포측정 결합 분석에서, 항체는 비당화 PD-L1을 발현하는 세포에의 결합에 대한 MFI보다 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배 또는 10 배 더 큰 WT PD-L1 발현 세포에의 MFI로서 표현되는 결합을 나타낸다. 실시양태에서, 항체는 형광 라벨 또는 마커에 의해 직접 또는 간접적으로 검출가능하다. 실시양태에서, 항체는 FITC와 같은 형광 라벨 또는 마커로 직접적으로 라벨링된다. 실시양태에서, 당화 PD-L1에 대한, STM004 MAb, 또는 그의 키메라 또는 인간화 형태의 결합 친화성은 하한 및 상한 값을 포함하여 5-20 nM 또는 5-10 nM이다. 실시양태에서, 항체는 PD-1과 PD-L1의 상호작용을 억제하며, 특히 이펙터 T-세포에 의해 발현된 PD-1과 종양 세포에 의해 발현된 PD-L1, 특히, 당화 PD-L1의 상호작용을 억제한다.
다른 구체적 양태에서, 본 발명은 당화 PD-L1에 특이적으로 결합하는, 각각 서열 번호 19 및 27(성숙 VH 및 VL 영역 아미노산 서열), 또는 각각 시그널 펩티드 서열을 함유하는 서열 번호 90 및 92의 아미노산 서열을 가진 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 갖는 항-glycPD-L1 단일클론 항체 STM115, 및 그의 항원 결합 부분, 및 그의 인간화 및 키메라 형태를 제공한다. STM115 MAb의 중쇄 및 경쇄 가변(V) 도메인의 핵산(DNA) 및 상응하는 아미노산 서열이 하기 표 3에 나타난다. 서열 번호 18, 19, 26 및 27은 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 성숙 형태(즉, 시그널 펩티드를 갖지 않음)의 아미노산 서열 및 이를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다. 표 3은 또한 시그널 서열이 이탤릭체로 표시된, 시그널 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 서열 번호 89-92로서 제공한다. 또한 표 3에는 STM115의 카밧 및 초티아 중쇄 및 경쇄 V 도메인 CDR이 나타난다. 또한 PD-L1에의 결합을 위하여 STM115 MAb와 경쟁하고/하거나 STM115와 동일한 에피토프에 결합하는 항-glycPD-L1 항체를 제공한다.
실시양태에서, 당화 PD-L1에 특이적으로 그리고 우선적으로 결합하는 항-glycPD-L1 항체는 서열 번호 19의 아미노산 서열을 가진 VH 도메인 및/또는 서열 번호 27의 아미노산 서열을 가진 VL 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 당화 PD-L1에의 특이적 결합을 위하여 서열 번호 19의 VH 도메인 및 서열 번호 27의 VL 도메인을 포함하는 항체와 경쟁한다. 실시양태에서, 당화 PD-L1에 특이적으로 그리고 우선적으로 결합하는 항-glycPD-L1 항체는 서열 번호 19의 아미노산 서열에 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 VH 도메인 및/또는 서열 번호 27의 아미노산 서열에 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 VL 도메인을 포함한다. 이들 항-glycPD-L1 항체는 키메라 항체일 수 있으며 예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터의 인간 불변 도메인을 포함할 수 있다.
실시양태에서, 당화 PD-L1에 특이적으로 그리고 우선적으로 결합하는 항-glycPD-L1 항체는 각각 서열 번호 20, 서열 번호 22 및 서열 번호 24의 아미노산 서열을 가진 초티아 CDR 1-3을 포함하거나 각각 서열 번호 21, 서열 번호 23, 및 서열 번호 25의 아미노산 서열을 가진 카밧 CDR 1-3을 포함하거나 그 조합을 포함하는 VH 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 당화 PD-L1에의 특이적 결합을 위해 각각 서열 번호 20, 서열 번호 22 및 서열 번호 24의 아미노산 서열을 가진 초티아 CDR 1-3을 포함하거나 각각 서열 번호 21, 서열 번호 23, 서열 번호 25의 아미노산 서열을 가진 카밧 CDR 1-3을 포함하거나 그 조합을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항체와 경쟁한다. 실시양태에서, 당화 PD-L1에 특이적으로 그리고 우선적으로 결합하는 항-glycPD-L1 항체는 각각 서열 번호 28, 서열 번호 30 및 서열 번호 32의 아미노산 서열을 가진 CDR 1-3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 각각 서열 번호 28, 서열 번호 30 및 서열 번호 32의 아미노산 서열을 가진 CDR 1-3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 항체와 당화 PD-L1에의 특이적 결합을 위해 경쟁한다. 실시양태에서, 당화 PD-L1에 특이적으로 그리고 우선적으로 결합하는 항-glycPD-L1 항체는 각각 서열 번호 20, 서열 번호 22 및 서열 번호 24의 아미노산 서열을 가진 초티아 CDR 1-3을 포함하거나 각각 서열 번호 21, 서열 번호 23, 및 서열 번호 25의 아미노산 서열을 가진 카밧 CDR 1-3을 포함하는 VH 도메인을 포함하며 각각 서열 번호 28, 서열 번호 30 및 서열 번호 32의 아미노산 서열을 가진 CDR 1-3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 항체를 포함하거나 결합을 위해 이와 경쟁한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 각각 서열 번호 20, 서열 번호 22, 및 서열 번호 24, 또는 각각 서열 번호 21, 서열 번호 23, 및 서열 번호 25의 아미노산 서열을 갖는 1, 2 또는 3 CDR에서 1, 2, 3, 4, 또는 5 아미노산 치환을 가지는 아미노산 서열을 가진 CDR H1, H2 및 H3을 포함하는 VH 도메인을 가진 항-glycPD-L1 항체를 제공한다. 항-glycPD-L1 항체는 또한 각각 서열 번호 28, 서열 번호 30 및 서열 번호 32의 아미노산 서열을 가진 1, 2 또는 3 CDR에서 1, 2, 3, 4, 또는 5 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 가진 CDR L1, L2 및 L3을 포함하는 VL 도메인을 가질 수 있다. 항-glycPD-L1 항체는 VH 및 VL 도메인 둘 모두에서 CDR에서 아미노산 치환을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산 치환은 보존적 치환이다.
실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 당화 PD-L1에의 특이적 결합을 위해, 상술한 VH 및 VL 도메인 및 그안의 CDR을 포함하는 항체와 경쟁한다. 바람직하게는 이들 항체는 인간 골격 영역을 가지며, 즉, STM115의 인간화 형태이며, 선택적으로, 예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터의 인간 불변 도메인을 포함한다. 결합 친화성 또는 다른 파라미터를 개선하기 위하여 인간화 항체의 CDR 또는 골격 영역에서 하나 이상의 아미노산 치환이 이루어질 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 비당화 PD-L1에 대하여 나타내진 Kd의 절반 보다 적은 Kd로 당화 PD-L1에 결합한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 비당화 PD-L1에 대하여 나타내진 Kd의 절반 보다 적은 Kd로 당화 PD-L1에 결합한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 비당화 PD-L1에의 항체의 결합에 의해 나타내진 Kd보다 적어도 5분의 1 이하의 Kd로 당화 PD-L1 단백질에 결합한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 비당화 PD-L1에의 항체의 결합에 의해 나타내진 Kd보다 적어도 10분의 1 이하의 Kd로 당화 PD-L1 단백질에 결합한다. 실시양태에서, 실시예 5에 개시된 세포 유동세포측정 결합 분석에서, 항체는 비당화 PD-L1을 발현하는 세포에의 결합을 위한 MFI보다 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배 또는 10 배 더 큰 WT PD-L1 발현 세포에의 MFI로서 표현되는 결합을 나타낸다. 실시양태에서, 항체는 형광 라벨 또는 마커에 의해 직접 또는 간접적으로 검출가능하다. 실시양태에서, 항체는 FITC와 같은 형광 라벨 또는 마커로 직접적으로 라벨링된다. 실시양태에서, 당화 PD-L1에 대한, STM115 MAb, 또는 그의 결합 도메인 또는 인간화 또는 키메라 형태의 결합 친화성은 하한 및 상한 값을 포함하여 5-20 nM 또는 5-10 nM이다. 실시양태에서, 항체는 PD-1과 PD-L1의 상호작용을 억제하며, 특히 이펙터 T-세포에 의해 발현된 PD-1과 종양 세포에 의해 발현된 PD-L1, 특히, 당화 PD-L1의 상호작용을 억제한다.
일 양태에서 본 발명은 당화 PD-L1에 결합하며, 종래의 경쟁 방법을 통해 분석할 때, 당화 PD-L1에의 특이적 결합을 위하여 본 명세서에 개시된 MAb STM004 또는 MAb STM115와 경쟁하거나 교차 경쟁하는 분리된 항-glycPD-L1 항체를 제공한다. 일 양태에서, MAb STM004, MAb STM115, 또는 본 명세서에 개시된 분리된 항-glycPD-L1 MAb와 동일한 에피토프에 결합하는 분리된 항체가 제공된다.
다른 양태에서 본 발명은 PD-L1 서열 LDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQH(서열 번호 93) 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 분리된 항-glycPD-L1 항체를 제공한다.
일부 실시양태에서 본 발명은 서열 번호 1의 인간 PD-L1 단백질의 아미노산 잔기 Y56, K62 및 K75를 포함하는 에피토프에 결합하는 분리된 항-glycPD-L1 항체를 제공한다. 일 양태에서, 인간 PD-L1에 결합될 경우 항체가 서열 번호 1의 하기 아미노산 잔기 Y56, K62, 또는 K75 중 적어도 하나에 결합하며, 항체가 인간 당화 PD-L1에의 인간 PD-1 결합을 억제하도록, 당화 인간 PD-L1에 특이적으로 결합하는 분리된 항-glycPD-L1 항체를 제공한다.
다른 실시양태에서 본 발명은 서열 번호 1의 인간 PD-L1 단백질의 아미노산 잔기 K62, H69 및 K75를 포함하는 에피토프에 결합하는 분리된 항-glycPD-L1 항체를 제공한다. 일 양태에서, 인간 PD-L1에 결합될 경우 항체가 서열 번호 1의 하기 아미노산 잔기 K62, H69, 또는 K75 중 적어도 하나에 결합하며, 항체가 인간 당화 PD-L1에의 인간 PD-1 결합을 억제하도록, 당화 인간 PD-L1에 특이적으로 결합하는 분리된 항-glycPD-L1 항체를 제공한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 PD-L1의 에피토프 영역(들)을 구성하는 아미노산 잔기 중 적어도 둘, 적어도 셋, 또는 넷과 접촉한다.
다른 양태에서, 본 발명은 인간 PD-L1에 결합될 경우 항체가 서열 번호 1의 아미노산 영역 L48 내지 H78 이내의 적어도 하나의 아미노산에 결합하도록, 당화 인간 PD-L1에 특이적으로 결합하는 분리된 항체를 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 인간 PD-L1에 결합될 경우 단일클론 항체가 서열 번호 1의 아미노산 영역 L48 내지 H78 이내의 하기의 아미노산 잔기 Y56, K62, K75 그룹에 결합하도록, 당화 인간 PD-L1에 특이적으로 결합하는 분리된 항체를 제공하며; 단일클론 항체는 PD-1의 PD-L1에의 결합, 특히, 인간 PD-1의 인간 당화 PD-L1에의 결합을 억제한다. 다른 양태에서, 본 발명은 인간 PD-L1에 결합될 경우 항체가 서열 번호 1의 아미노산 영역 D61 내지 H78 이내의 적어도 하나의 아미노산에 결합하도록, 당화 인간 PD-L1에 특이적으로 결합하는 분리된 항체를 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 인간 PD-L1에 결합될 경우 단일클론 항체가 서열 번호 1의 아미노산 영역 D61 내지 H78 이내의 하기의 아미노산 잔기 K62, H69 및 K75 그룹에 결합하도록, 당화 인간 PD-L1에 특이적으로 결합하는 분리된 항체를 제공하며; 단일클론 항체는 PD-1의 PD-L1에의 결합, 특히, 인간 PD-1의 인간 당화 PD-L1에의 결합을 억제한다.
다른 양태에서, 본 발명은 인간 PD-L1에 결합될 경우 항체가 인간 PD-L1 단백질(서열 번호 1)의 아미노산 영역 L48-H78 이내 또는 아미노산 영역 D61-H78 이내에 결합하도록, 당화 인간 PD-L1 단백질에 특이적으로 결합하는 분리된 항-glycPD-L1 항체를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 비-당화 인간 PD-L1에 비하여 당화 인간 PD-L1에 특이적으로 그리고 우선적으로 결합하는 분리된 항체 또는 그의 결합 단편을 제공하며, 항체는 (a) 서열 번호 5 또는 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는 카밧 CDR1 또는 서열 번호 4 또는 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는 초티아 CDR1; 서열 번호 7 또는 서열 번호 23의 아미노산 서열을 갖는 카밧 CDR2 또는 서열 번호 6 또는 서열 번호 22의 아미노산 서열을 갖는 초티아 CDR2; 및 서열 번호 9 또는 서열 번호 25의 아미노산 서열을 갖는 카밧 CDR3 또는 서열 번호 8 또는 서열 번호 24의 아미노산 서열을 갖는 초티아 CDR3;을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열 번호 12 또는 서열 번호 28의 아미노산 서열을 갖는 CDR1; 서열 번호 14 또는 서열 번호 30의 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및 서열 번호 16 또는 서열 번호 32의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 VL 도메인을 포함하며, 항체는 인간 PD-1과 인간 PD- L1 상호작용을 억제한다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 인간 항체 골격 및 선택적으로 인간 항체 불변 도메인을 가진 인간화 항체이다.
다른 양태에서 본 발명은 각각 서열 번호 2 또는 18로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 및/또는 서열 번호 10, 또는 26으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 뉴클레오티드 분자를 제공한다. 실시양태는 뉴클레오티드 서열이 서열 번호 2 또는 18의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90-98% 동일한, 항-glycPD-L1 VH 도메인을 인코딩하는 분리된 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 다른 실시양태는 뉴클레오티드 서열이 서열 번호 19 또는 26의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90-98% 동일한, 항-glycPD-L1 VL 도메인을 인코딩하는 분리된 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 실시양태에서, VH 및/또는 VL 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호 2 또는 18 또는 서열 번호 10 또는 26과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일하다. 이들 뉴클레오티드 서열은 적어도 2가 항체의 맥락내에서 당화 PD-L1에 특이적으로 결합하는 VH 도메인과 VL 도메인을 인코딩한다.
일부 양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 IgG, IgM, IgA, 그의 아이소타입, 예를 들어, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG4, 또는 그의 항원 결합 단편이다. 다른 양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 Fab', F(ab')2, F(ab')3, 1가 scFv, 2가 scFv, 이특이적 항체, 이특이적 scFv, 또는 단일 도메인 항체이다. 일부 양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 인간 항체 또는 인간화 항체이다. 일 양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 재조합적으로 생산된다. 추가 양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 영상화 제제, 화학요법 제제, 독소 또는 방사성핵종에 접합된다.
일 양태에서, 본 발명은 약학적 허용 담체 또는 매질 내에 항-glycPD-L1 항체(예를 들어, 비당화 PD-L1에 비하여 당화 PD-L1에 선택적으로 그리고 우선적으로 결합하는 항체)를 포함하는 조성물을 제공한다.
추가 양태에서 본 발명은 인간 PD-L1의 세포외 도메인(ECD) 내의 위치 N35, N192, N200 또는 N219에 해당하는 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 인간 PD-L1의 적어도 7(예를 들어, 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 이상) 연속 아미노산의 펩티드를 포함하는 분리된 폴리펩티드를 제공한다. 실시양태에서, 분리된 폴리펩티드는 인간 PD-L1의 위치 N35, N192, N200 또는 N219에 해당하는 적어도 하나의 아미노산을 포함하는, 인간 PD-L1의 적어도 7(예를 들어, 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 이상) 연속 아미노산의 펩티드를 포함하며, PD-L1의 위치 N35, N192, N200 또는 N219에 해당하는 아미노산 중 적어도 하나가 당화된다. 실시양태에서, 분리된 폴리펩티드는 면역원성 폴리펩티드(예를 들어, 키홀 림펫(keyhole limpet) 헤모시아닌, KLH)에 융합되거나 접합된다. 일부 양태에서, 폴리펩티드는 그의 아미노(N)- 또는 카르복시(C)- 말단에서 시스테인(Cys) 잔기를 추가로 포함한다. 예를 들어, 폴리펩티드는 Cys 잔기에서 이황화 결합에 의해 면역원성 폴리펩티드에 접합될 수 있다. 구체적 실시양태에서, 인간 PD-L1의 위치 N35, N192, N200 또는 N219에 해당하는 위치에서 당화된 적어도 하나의 아미노산 잔기를 포함하는 PD-L1 펩티드는 항-glycPD-L1 항체를 생성하기 위한 면역원으로서 사용된다.
추가 양태에서, 본 발명은 인간 PD-L1의 ECD 내의 위치 N35, N192, N200 또는 N219에 해당하는 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 인간 PD-L1의 적어도 7(예를 들어, 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 이상) 연속 아미노산의 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공하며, PD-L1의 위치 N35, N192, N200 또는 N219에 해당하는 적어도 하나의 상기 아미노산은 당화되며, 폴리펩티드는 약학적 허용 담체, 희석제, 부형제 또는 비히클에서 제형화된다.
다른 추가의 양태에서, 본 발명은 인간 PD-L1 폴리펩티드의 ECD 내의 위치 N35, N192, N200 또는 N219에 해당하는 적어도 하나의 아미노산을 포함하는, 인간 PD-L1의 적어도 7 연속 아미노산의 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물을 제공하며, PD-L1 폴리펩티드의 ECD 내의 위치 N35, N192, N200 또는 N219에 해당하는 아미노산 중 적어도 하나는 당화되며, 폴리펩티드는 약학적 허용 담체, 희석제, 부형제 또는 비히클에서 제형화된다. 일부 양태에서, 면역원성 조성물은 백반 또는 프로인트 아쥬반트(Freund's adjuvant)와 같은 아쥬반트를 추가로 포함한다.
추가 양태에서 본 발명은 유효량의 항-glycPD-L1 항체를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 가진 개체와 같은, 이를 필요로 하는 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 구체적 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 본 명세서에 개시된 MAb STM004 또는 MAb STM115 또는 다른 항-glycPD-L1 항체의 인간화 또는 키메라 형태이다. 일부 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 당화 PD-L1에의 결합을 위하여 본 명세서에 개시된 MAb STM004, MAb STM115, 또는 항-glycPD-L1 항체와 경쟁하는 항체이다. 실시양태에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 항체의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 항-glycPD-L1 항체의 투여는 PD-1의 면역-억제성 활성을 차단하여, T 세포에서 항암 활성을 촉진하여, 종양 세포 사멸을 야기한다.
비제한적 실시양태에서, 개체에서 치료될 암, 질병 또는 병리학은 유방암, 폐암, 두경부암, 전립선암, 식도암, 기관암, 피부암, 뇌암, 간암, 방광암, 위암, 췌장암, 담낭암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 고환암, 결장암, 직장암 또는 피부암이다. 일부 실시양태에서, 치료될 암은 부신암, 항문암, 담관암, 방광암, 뼈암, 성인에서의 뇌/CNS 종양, 아동에서의 뇌/CNS 종양, 유방암, 남성에서의 유방암, 청소년에서의 암, 아동에서의 암, 젊은 성인에서의 암, 원발부위 불명 암, 캐슬맨 질병(Castleman disease), 자궁경부암, 결장/직장 암, 자궁내막암, 식도암, 유잉 육종(Ewing family tumor), 눈암, 담낭암, 위장관 칼시노이드 종양(gastrointestinal carcinoid tumor), 위장관 기질 종양(GIST), 임신성 융모성 질병, 호지킨 질병, 카포시 육종, 신장암, 후두 또는 하인두 암, 백혈병(예를 들어, 성인 급성 림프구성(ALL), 급성 골수성(AML), 만성 림프구성(CLL), 만성 골수성(CML), 만성 골수단핵구성(CMML), 아동 백혈병), 간암, 폐암(예를 들어, 비-소세포, 소세포), 폐 칼시노이드 종양, 림프종, 피부의 림프종, 악성 중피종, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 비강암, 부비강암, 비인두암, 신경아세포종, 비-호지킨 림프종, 아동에서의 비-호지킨 림프종, 구강암, 구강인두암, 골육종, 난소암, 췌장암, 음경암, 뇌하수체 종양, 전립선암, 망막아세포종, 횡문근육종, 침샘암, 육종(예를 들어, 성인 연조직 암), 피부암(예를 들어, 기질 및 편평 세포, 흑색종, 메르켈(merkel) 세포), 소장암, 위암, 고환암, 흉선암, 갑상선암, 자궁육종, 질암, 외음부암, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom macroglobulinemia), 또는 윌름 종양(Wilms tumor)이다.
일부 실시양태에서, 암은 PD-L1 및 제2 암 마커, 예를 들어, EGFR에 대해 양성이다. 그러한 암은 항-glycPD-L1 항체 및 암 마커를 표적화하는 항암제, 예를 들어, 수용체 티로신 키나제 억제제, 예를 들어, 제피티닙과 같은 EGFR 티로신 키나제 억제제의 조합으로 치료될 수 있다.
일부 양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 약학적 허용 조성물 내에 있다. 추가 양태에서, 항체는 전신성으로 투여된다. 구체적 양태에서, 항체는 정맥내, 피내, 종양내, 근육내, 복강내, 피하, 척추강내, 또는 국소 투여된다. 다른 양태에서, 하나 또는 하나보다 많은 항-glycPD-L1 항체가 필요로 하는 개체에게 공동투여될 수 있다. 항체의 공동투여는 다른 항체 이전에, 이후에, 또는 동시에 한 항체를 투여하는 것에 관련될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 암 또는 종양, 구체적으로 암 또는 종양 세포 표면 상에 PD-L1을 발현하거나 PD-L1을 고도로 발현하는 암 또는 종양을 가진 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 그러한 방법은 PD-L1과 PD-1의 상호작용을 억제하거나 차단하고 면역억제를 방지하고 개체의 이펙터 T 림프구에 의한 암 또는 종양 세포의 사멸을 촉진하기 위하여 본 발명 실시양태에 따른 항-glycPD-L1 항체 유효량을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 STM004 또는 STM115, 또는 비당화 PD-L1에 비하여 PD-L1에 선택적으로 결합하기 위하여 이들 항체 중 하나 또는 둘 모두와 경쟁하는 항체의 인간화 또는 키메라 형태이다.
일부 실시양태는 적어도 두 가지 상이한 항-glycPD-L1 항체를 투여하여, 바람직하게는 한 가지 항-glycPD-L1 항체보다 큰 치료 효능을 야기하는 것을 포함하는, 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 본 방법은 본 발명 실시양태에 따른 항-glycPD-L1 항체로 치료받고 있는 개체에게 적어도 두 번째 항암 치료법 또는 약물을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 두 번째 항암 치료법은 제한없이 수술 치료법, 화학요법, 방사선요법, 냉동요법, 호르몬요법, 면역요법 또는 사이토카인요법을 포함할 수 있다. 두번째 항암 약물은 또한 제한되지 않으며 본 기술분야의 임상의, 의료 전문가(예를 들어, 종양학자)에 의해 실무적으로 또는 실험적으로 결정될 수 있을 것이다. 당업자가 이해할 것처럼, 적어도 두 번째 항암 치료법 또는 약물의 투여는 본 실시양태의 항체의 투여 이전, 이후 또는 동시에 발생할 수 있다.
다른 양태에서 본 발명은 암 환자가 PD-L1의 PD-1에의 결합을 차단하는 제제를 이용한 치료로부터 이득을 볼 가능성이 있는지 여부를 결정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 당화 PD-L1에 우선적으로 결합하는 항체를 이용하여 환자의 암세포 샘플로부터 유래된 세포 상에 당화 PD-L1이 존재하는지를 시험하고; 만일 개체의 암세포가 당화 PD-L1 단백질의 발현에 대해 양성으로 발견되면 PD-1에의 PD-L1의 결합을 방지하는 제제의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 실시양태에서, PD-1에의 PD-L1의 결합을 방지하는 제제는 본 명세서에 개시된 것과 같은 항-glycPD-L1 항체, 항-PD-1 항체, 또는 그 조합이다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체 및/또는 항-PD-1 항체는 다른 항암 약물 또는 치료제와 조합되어 투여된다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 본 명세서에 개시된 것과 같은 다른 항-glycPD-L1 항체와 조합되어 투여된다. 실시양태에서, 본 방법은 환자로부터 암 세포 샘플을 수득하는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서 본 발명은 생물 샘플에서 PD-L1 단백질의 당화, N-연결된 당화, 또는 N-당화를 평가하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 명세서에 개시된 항체(예를 들어, 본 발명의 STM004 또는 STM115와 같은, 비당화 PD-L1에 비하여 당화 PD-L1에 우선적으로 결합하는 항체)와 샘플을 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 양태에서, 본 방법은 시험관내(in vitro) 방법 또는 분석이다. 일부 양태에서, 생물 샘플은 세포 샘플, 조직 샘플, 체액(예를 들어, 혈장, 혈청, 혈액, 소변, 객담, 림프, 복수액, 복강내액, 뇌 또는 척수 액, 등)이다. 구체적 실시양태에서, 샘플은 세포 샘플 또는 암 또는 종양을 가진 개체로부터 수득한 종양 또는 암으로부터의 세포 샘플이다. 그러한 암 또는 종양 세포 샘플은, 특히 당화 PD-L1이 개체의 암 또는 종양 세포 상에 존재한다면 그 세포가 본 명세서에 개시된 항-glycPD-L1 항체를 이용한 치료를 위해 적절한 표적일 가능성이 높은지를 결정하기 위하여, 본 명세서에 개시된 항-glycPD-L1 항체를 이용하여 암 또는 종양 세포 표면 상의 당화 PD-L1에 대해 분석될 수 있다.
다른 양태에서 본 발명은 항체의 제조 방법을 제공하며, 상기 방법은 개체(예를 들어, 동물)에게 실시양태에 따른 폴리펩티드(예를 들어, 인간 PD-L1의 위치 N35, N192, N200 또는 N219에 해당하는 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 인간 PD-L1의 적어도 7 연속 아미노산의 단편을 포함하며, PD-L1의 위치 N35, N192, N200 또는 N219에 해당하는 상기 아미노산 중 적어도 하나가 당화되는 폴리펩티드)를 투여하고 개체로부터 항체를 분리하는 것을 포함한다. 예를 들어, 동물은 비-인간 영장류, 마우스, 래트, 토끼, 염소 또는 인간일 수 있다. 일부 양태에서 본 방법은 본 기술분야에 알려진 방법과 절차를 이용하여 인간화 항체를 생산하기 위하여 항체의 CDR을 확인하고 CDR을 둘러싸는 서열(즉, 골격 서열)을 인간화하는 것을 추가로 포함한다. 다른 추가의 양태에서, 본 방법은 인간화 항체를 재조합적으로 발현하는 것을 포함한다. 따라서, 추가 실시양태에서, 전술한 방법에 의해 생산된 분리된 항체를 제공한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 비당화 PD-L1에 비하여 실시양태의 폴리펩티드(예를 들어, 인간 PD-L1의 위치 N35, N192, N200 또는 N219에 해당하는 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 인간 PD-L1의 적어도 7 연속 아미노산의 단편을 포함하며, PD-L1의 위치 N35, N192, N200 또는 N219에 해당하는 상기 아미노산 중 적어도 하나가 당화되는 폴리펩티드)의 에피토프, 예를 들어, 형태적 에피토프에 선택적으로 결합하는 분리된 항체를 제공한다. 실시양태에서 본 발명은 면역 반응, 예를 들어, 항원에 대해 지시된 항체 반응을 생성하기 위하여 개체를 면역시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 면역원성 항원으로서 실시양태의 폴리펩티드(예를 들어, 당화 PD-L1 폴리펩티드)의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함한다.
개시된 실시양태의 다른 양태, 특징 및 효과는 하기의 상세한 설명 및 예시적인 실시예로부터 명백해질 것이다.
하기의 도면은 본 명세서의 일부를 형성하며 제한없이 본 명세서에 개시된 실시양태의 일부 양태를 추가로 입증하기 위하여 포함된다.
도 1a-1h. PD-L1은 암 세포에서 당화된다 . 1a. 원발성 유방암 환자 샘플에서 PD-L1 단백질의 발현. 대표적인 유방암 환자 샘플에서 PD-L1의 웨스턴 블롯 분석. 1b. 4가지 대표적인 유방암 세포주, 4가지 흑색종 세포주, 3가지 폐암 세포주 및 3가지 결장암 세포주에서 PD-L1의 웨스턴 블롯 분석. 1c. A431 세포의 shCTRL 및 두 가지 독립적 shPD-L1 안정한 클론에서 PD-L1 발현의 웨스턴 블롯 분석. PD-L1을 shPD-L1#5 클론 내로 일시적으로 형질감염시켰다. 1d. PNGase F로 처리되거나 처리되지 않은 정제된 PD-L1 단백질의 당단백질 염색. 쿠마시 블루 염색된 패널은 PD-L1 단백질의 총량을 나타낸다. 레인 4 및 5에서 나타나는 상부 밴드는 PNGase F의 로딩으로부터이다. (-) Ctrl, 비-당단백질을 위한 대조군; (+) Ctrl, 당단백질을 위한 대조군. 1e. PD-L1-GFP, HA-PD-L1, 및 PD-L1-Flag 단백질의 당화 패턴. 세포 용해물을 PNGase F 및 Endo H로 처리하고 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 1f. GFP-태그를 가진 PD-L1 전길이(WT), 세포외 도메인(ECD), 또는 세포내 도메인(ICD)을 293T 세포에서 일시적으로 발현시켰다. 이어서 세포를 5 ㎍/ml 투니카마이신(TM)이 있거나 없이 밤새 처리하였다. PD-L1의 단백질 발현은 웨스턴 블롯을 이용하여 검사하였다. 1g. 본 명세서에 개시된 실험 연구에서 사용된 대표적인 PD-L1 단백질 발현 구조체의 도식적 다이아그램으로서, 전길이 PD-L1 단백질 및 그의 성분 세포외 도메인(ECD), 세포내 도메인(ICD), 시그널 펩티드(SP); 경막 도메인(TM)을 보여준다. 다이아그램에서, PD-L1의 ECD 도메인 내의 4개의 N-당화 부위(NXT 모티프)가 적색으로 나타난다. 숫자는 PD-L1 폴리펩티드에서 아미노산 잔기의 위치를 나타낸다. 1h. PD-L1 WT 및 PD-L1의 당화 돌연변이(NQ 돌연변이)의 단백질 발현 패턴의 웨스턴 블롯 분석. 레인 14는 투니카마이신(TM)으로 밤새 처리된 비-당화 야생형(WT) PD-L1을 나타낸다. 도면에서, 흑색 원은 당화 PD-L1을 나타내며, 흑색 화살표는 비-당화 PD-L1을 나타낸다.
도 2a-2d. 암세포에서 PD-L1 단백질의 발현. a. 폐암세포에서 PD-L1의 웨스턴 블롯 분석. b. 결장암 세포에서 PD-L1의 웨스턴 블롯 분석. c. 유방암 세포에서 PD-L1의 웨스턴 블롯 분석. d. 난소암 세포에서 PD-L1의 웨스턴 블롯 분석. 흑색 원 = 당화 PD-L1; 화살표 = 비-당화 PD-L1.
도 3a-3d. PD-L1은 암세포에서 당화된다. a. 상이한 항-PD-L1 항체를 이용한 암세포에서 PD-L1의 웨스턴 블롯 분석. 상이한 항체를 이용하여 PD-L1의 발현을 분석하기 위하여 4가지 BLBC 세포주인 HCC1937, SUM149, MB-231 및 BT20, 그리고 2가지 비-BLBC 세포주인 MB-483 및 MB-474를 선택하였다. b. MDA-MB-231 및 A431 세포의 shCTRL 및 2가지 독립적 shPD-L1 안정한 클론에서 PD-L1의 웨스턴 블롯 분석. c. Flag-PD-L1 및 PD-L1의 shRNA를 위한 이중-발현 구조체의 도식 다이아그램. d. MDA-MB-231 및 A431 세포에서 PD-L1 단백질의 당화 패턴. 세포 용해물을 PNGase F로 처리하고 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 흑색 원 = 당화 PD-L1; 화살표 = 비-당화 PD-L1.
도 4a-4e. 당화 및 비-당화 PD-L1 단백질의 발현. a. 투니카마이신(TM) 처리된 세포에서 PD-L1-Myc, PD-L1-Flag, 및 HA-PD-L1 단백질의 웨스턴 블롯 분석. b. 투니카마이신(TM) 처리되거나 미처리된 세포에서 PD-L1-GFP-WT, PD-L1-GFP-ECD 및 PD-L1-GFP-ICD 단백질의 웨스턴 블롯 분석. c. 투니카마이신(TM) 처리된 세포에서 PD-L1-Myc, PD-L1-Flag, HA-PD-L1, PD-L1-GFP-WT, PD-L1-GFP-ECD 및 PD-L1-GFP-ICD 단백질의 웨스턴 블롯 분석. 당화 PD-L1 단백질(흑색 막대) 또는 비-당화 PD-L1 단백질(적색 막대)의 강도를 농도계 정량에 의해 결정하였다(웨스턴 블롯 분석 아래 막대 그래프에서). d. 상기 (c)에 나타난 막대 그래프로부터 수득한 당화 PD-L1 단백질(흑색 막대) 또는 비-당화 PD-L1 단백질(적색 막대)의 강도의 평균. 에러 바(Error bar)는 SD를 나타낸다. e. PD-L1 발현 HEK 293T 세포에서 PD-L1 단백질의 당화 패턴. 세포 용해물을 PNGase F 또는 O-글리코시다제로 처리하거나 처리하지 않고 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 흑색 원 = 당화 PD-L1; 화살표 = 비-당화 PD-L1. 당업자가 이해하는 바처럼, 투니카마이신은 단백질의 N-연결된 당화를 억제하는 뉴클레오시드 항생제이다(Heifetz, A. et al., 1979, Biochemistry, 18:2186-2192).
도 5a 및 5b. PD-L1 단백질의 N-당화 부위. 상이한 종으로부터의 PD-L1 아미노산 서열의 서열 배열. 4개의 NXT 모티프인 N35, N192, N200, 및 N219는 상자 표시되고 적색으로 제시되며, 2개의 비-NXT 모티프인 N63 및 N204는 녹색으로 제시된다. 적색 상자 = 보존된 NXT 모티프. 도 5a: 컨센서스 서열(서열 번호 74); Q9NZQ7_인간(서열 번호 75); Q9EP73_마우스(서열 번호 76); D4AE25_래트(서열 번호 77); C 5NU11_양(서열 번호 78); Q4QTK1_돼지(서열 번호 79); 및 F7DZ76_말(서열 번호 80). 도 5b: 컨센서스 서열(서열 번호 94); Q9NZQ7_인간(서열 번호 95); Q9EP73_마우스(서열 번호 96); D4AE25_래트(서열 번호 97); C 5NU11_양(서열 번호 98); Q4QTK1_돼지(서열 번호 99); 및 F7DZ76_말(서열 번호 100).
도 6a-6h. N - 당펩티드의 LC-MS/MS-기반 확인. HEK 293 세포로부터의 PD-L1의 4가지 N-당화 부위, N35(a 및 e), N192(b 및 f), N200(c 및 g), 및 N219(d 및 h)의 각각에 해당하는 N-당펩티드의 LC-MS/MS-기반 확인. LC-MS 프로파일(a-d)가 대표적인 당형태 서브세트가 검출되었을 때 (도면에 라벨링된 대로)용리 시간에 걸쳐 평균된 스펙트럼으로 나타난다. 각 N-당화 부위에 대하여, 하나의 대표적인 HCD MS2 스펙트럼(e-h)이, 그의 펩티드 서열을 정의하는 b 및 y 이온과 함께, y1 이온(N-당화 Asn에 부착된 GlcNAc을 보유한 트립신분해 펩티드 백본)의 검출에 기초한 그의 확인을 예시하기 위해 나타난다. 글리칸을 위해 사용된 카툰 기호(삽도 참고)는 기능적 글리코믹스 컨소시엄(Consortium for Functional Glycomics)에 의해 권장된 표준 도식에 부합한다: 추가의 Hex 및 HexNAc는 트리만노실 코어(Man3-GlcNAc2)로부터의 lacNAc(Gal-GlcNAc) 또는 lacdiNAc(GalNAc- GlcNAc) 연장으로서 시험적으로 할당되었으며, 이는 코어 푸코실화되거나 되지 않을 수 있다. 도 6e-6h에 도시된 서열은 각각 서열 번호 81-84에 개시된다.
도 7a-7e. 암세포-연합 면역억제를 위해 PD-L1의 당화가 요구된다. a. 막 결합된 PD-1 및 BT549 세포 상에 발현된 PD-L1 WT 또는 PD-L1 4NQ 돌연변이 단백질의 상호작용을 측정하는 유동세포측정. 실험 전에 세포를 MG132로 전처리하였다. b. 마지막 시점에 PD-L1과 PD-1 사이의 동적 상호작용을 보여주는 시간 경과 현미경(Time lapse microscopy) 이미지. PD-L1 WT 또는 4NQ 발현 세포의 적색 형광(핵 제한 RFP(nuclear restricted RFP)) 및 녹색 형광(녹색 형광 라벨링된 PD-1/Fc 단백질) 병합 이미지(20x). b에서 우측의 동적 그래프는 매 시간 시점에서 BT549 세포 상에 발현된 PD-L1 WT 또는 PD-L1 4NQ 단백질에의 PD-1/Fc 단백질의 정량적 결합을 보여준다. c. BT549 세포 상에 발현된 PD-L1 WT 또는 4NQ PD-L1 단백질에 관련된 T 세포-매개 종양 세포 사멸(TTK) 분석. 카스파제(Caspase) 3/7 기질의 존재하에서 PD-L1 WT 또는 4NQ 발현 세포, 및 PD-1-발현 T 세포 공동배양물의 96시간에서의 대표적인 상, 적색 형광(핵 제한 RFP) 및/또는 녹색 형광(누크뷰(NucView)™ 488 카스파제 3/7 기질) 병합 이미지(10x). T 세포를 항-CD3 항체(100 ng/ml) 및 IL-2(10 ng/ml)로 활성화시켰다. 녹색 형광 세포를 사멸 세포로 계수하였다. 사멸 세포 대 PD-L1 WT 또는 PD-L1 4NQ 단백질과 연합된 전체 세포의 정량적 비율이 이미지의 우측에 막대 그래프에서 제시된다. d. PD-L1 WT 또는 PD-L1 4NQ 돌연변이 단백질을 발현한 주입된 4T1 세포로부터 유래된 종양을 보유한 BALB/c 마우스에서 종양 성장. 4T1-luc 세포의 종양 성장을 IVIS100을 이용하는 생물발광 영상화에 의해 생체내(in vivo)로 나타냈다(d에서 좌측). d에서 우측: 종양 부피를 보여주는 상자 그림 및 PD-L1 WT 대 PD-L1 4NQ 단백질을 발현하는 4T1 세포로부터 유래된 종양을 보유한 마우스에서 종양 크기를 보여주는 사진. 종양을 측정하고 종점에서 해부하였다. n = 8 마우스/그룹(우측). e. CD8+ CD3+ T 세포 집단에서 IFNγ의 세포내 사이토카인 염색. 유의성은 *p < 0.05 및 **p < 0.001; n = 7 마우스/그룹으로, 투-웨이(two-way) ANOVA에 의해 결정하였다. *은 스튜던츠 t 테스트(Student's t test)에 의해 통계적으로 유의함을 나타낸다. 모든 에러 바는 3번의 독립 실험의 평균±SD로 표현된다.
도 8a-8c. PD-L1 단백질의 당화 및 비-당화 형태의 도식 다이아그램 및 웨스턴 블롯 분석. a. 야생형의 당화 PD-L1 단백질(PD-L1 WT) 및 각각 PD-L1 단백질의 4개의 N-당화 부위 중 하나의 당화 아미노산과 3개의 비-당화 아미노산 잔기를 갖는(N35/3NQ; N192/3NQ; N200/3NQ; 및 N219/3NQ) 4개의 PD-L1 단백질 변이체의 도식적 도시. 흑색으로 표시된 아미노산은 당화 잔기를 나타내며; 적색으로 나타난 아미노산 부위는 변이체 PD-L1 단백질에서 비-당화된다. b. PD-L1 단백질의 N35/3NQ, N192/3NQ, N200/3NQ 및 N219/3NQ 형태를 발현하는 BT 549의 안정한 클론을 생성하였다. 항-glycPD-L1 항체의 일부는 웨스턴 블롯 분석에 의해 결정할 때 다른 것에 비하여 PD-L1 당화 변이체의 일부에 더 높은 수준의 결합을 나타내어, 이들 MAb가 부위 특이적임을 입증하였다. b에 나타난 대로, 예를 들어, MAb STM004는 N35/3NQ PD-L1 변이체를 인식하고 결합하여, 이 단일클론 항체가 당화 PD-L1의 N35 영역에 결합하였음을 나타냈다. c는 간암 세포주의 용해물에의 STM004 MAb 결합의 웨스턴 블롯의 결과를 보여준다.
도 9. 항-glycPD-L1 항체는 T 세포에 의한 종양 세포 사멸을 향상시킨다.
STM004 MAb를 실시예 8에 개시된 대로 세포의 세포독성 분석에서 상이한 양으로 이용하여 종양 세포(BT549)에 대한 PBMC-유래 T-세포의 세포독성을 평가하였다. 도 9는 실시간으로 MAb STM004로 처리된 BT549(RFP PD-L1(WT) 세포의 세포 사멸을 보여준다. 도 9에서, 하부 그래프(진한 청색 사각형)은 대조군(PBMC로부터의 T 세포 없음)을 나타내며; 진한 적색 원은 무항체 대조군을 나타내며; 진한 흑색 사각형은 분석에서 사용된 20 ㎍/ml의 STM004 MAb를 나타내며; 진한 갈색 원은 분석에서 사용된 40 ㎍/ml의 STM004 MAb를 나타낸다. 도 9로부터 관찰된 대로, 시간에 따른 PD-L1 보유 종양 세포의 투여량 비례 사멸이 입증된다.
도 10a 및 10b. 결합 분석. 도 10a 및 10b는 실시예 9에서 개시된 결합 분석의 결과를 보여주며, 여기서는 STM004 MAb(도 10a)가 분석 대조군, 무 PD-1/Fc; 무 Ab; mIgG Ab 대조군(도 10b)에 비하여 투여량 의존 방식으로 WT PD-L1을 발현하는 BT549 표적 세포에의 PD-1의 결합을 차단하는 것으로 나타난다.
개시된 실시양태의 다른 양태, 특징 및 효과는 하기의 상세한 설명과 예시적인 실시예로부터 명백해질 것이다.
종양 세포 상에 발현된 프로그램된 사멸 리간드-1 단백질(PD-L1)과 면역 이펙터 세포, 예를 들어, T-세포 상에 발현된 프로그램된 사멸-1 단백질(PD-1) 사이의 세포외 상호작용은 종양-연합 면역 탈출에 뚜렷한 영향을 갖는다. 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체를 이용한 면역 체크포인트 차단의 임상적 성공에도 불구하고, PD-L1과 PD-1 상호작용의 조절 기전 및 구조적 특징은 대부분 알려져 있지 않다. 본 명세서에 개시된 발견에 따라, PD-L1의 N-연결 당화가 PD-1에의 PD-L1 결합을 촉진하고 향상시키며, 이는 T 세포-매개 면역 반응의 억제를 촉진함이 입증되었다. 역으로, 종양 세포 상에 발현된 PD-L1 폴리펩티드의 비정상적 당화 또는 부분적 또는 완전한 탈당화로부터와 같은 N-연결 당화의 결핍이 PD-L1/PD-1 상호작용에 부정적 영향을 주며, 예를 들어, 약화시키거나 파괴하며, 이는 결과적으로 면역억제를 억제하고 이펙터 T-세포 세포독성 활성 및 종양 세포의 사멸을 촉진함이 새롭게 밝혀졌다. 또한, 그의 종양이 고도로 당화된 PD-L1을 발현하는 환자의 생존이 좋지 못하므로, 본 발명에서의 발견에 기초하여, 당화 PD-L1은 암 치료를 위한 효과적인 치료 타겟으로 인식된다. 본 발명에서는 당화 PD-L1/PD-1 상호작용을 파괴하고, 면역억제를 억제하고 T-세포 이펙터 기능을 촉진하여 암을 치료하기 위하여, 비당화 PD-L1에 비하여, 당화 PD-L1을 특이적으로 그리고 우선적으로 결합하고 상호작용하는 항-glycPD-L1 항체와 같은 암 치료제를 제공하고 개시한다. 본 명세서에 개시된 항-당화 PD-L1 항체를 이용한 종양 치료는 PD-L1의 당화 형태에 대해 특이적이지 않은 항-PD-L1 항체에 비하여 향상된 면역억제 억제 효과를 제공한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 단일클론 항체이며, 본 명세서에서 "MAb"로 표시된다.
본 명세서에 개시된 실시예는 본 명세서에 개시된 항-glycPD-L1 항체에 의한 당화 PD-L1 대 비-당화 PD-L1의 결합에서 유의한 차이, 예를 들어, 2-3배를 보여주는 실험 결과를 제공한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 비-당화 PD-L1에 비하여, 나노몰 범위, 예를 들어, 약 5-20 nM 또는 약 10-20 nM의, 당화 PD-L1에 대한 결합 친화성을 나타낸다.
정의
본 명세서에서 사용될 때, 용어 부정관사("a" 또는 "an")는 하나 이상을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "또는"은 본 명세서가 대안 만 그리고 "및/또는"을 지칭하는 정의를 지지하지만, 대안 만을 지칭하는 것으로 명백하게 나타내지거나 대안이 상호 배타적이 아니라면 "및/또는"을 의미한다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "다른"은 적어도 두 번째 또는 그 이상을 의미한다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "약"은 값이 그 값을 결정하기 위해 이용되는 장치, 방법을 위한 오차의 내재적 변이, 또는 연구 개체 간에 존재하는 변이를 포함함을 나타내기 위해 사용된다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "프로그램된 사멸 리간드-1" 또는 "PD-L1"은 달리 나타내지 않으면, 영장류(예를 들어, 인간, 필리핀 원숭이(사이노(cyno)), 개 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 비롯한 임의의 척추동물공급원으로부터의 폴리펩티드(용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 본 명세서에서 상호교환되어 사용됨) 또는 임의의 천연 PD-L1을 말하며, 일부 실시양태에서, 그의 SNP 변이체를 비롯한, 다양한 PD-L1 아이소형태, 관련된 PD-L1 폴리펩티드를 포함하였다.
인간 PD-L1의 예시적인 아미노산 서열(UniProtKB/Swiss-Prot: Q9NZQ7.1 ; GL83287884)이 하기에 제공된다:
Figure pct00001
서열 번호 1에서, 아미노 말단 아미노산 1-18은 인간 PD-L1 단백질의 시그널 서열을 구성한다. 따라서, 성숙 인간 PD-L1 단백질은 서열 번호 1의 아미노산 19-290으로 이루어진다.
본 명세서에 개시된 폴리펩티드 및 펩티드를 구성하는 아미노산 잔기를 위한 약어, 및 이들 아미노산 잔기를 위한 보존적 치환이 하기 표 1에 나타난다. 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 함유하는 폴리펩티드 또는 본 명세서에 개시된 폴리펩티드의 보존적으로 변형된 변이체는 원래의 또는 자연 발생의 아미노산이 유사한 특징, 예를 들어, 유사한 전하, 소수성/친수성, 측쇄 크기, 백본 형태, 구조 및 강직성 등을 가진 다른 아미노산으로 치환된 폴리펩티드를 말한다. 따라서, 이들 아미노산 변화는 전형적으로 항원에 대한 그의 친화성 또는 그의 특이성과 같은 폴리펩티드의 생물학적 활성, 기능 또는 다른 바람직한 특성의 변경없이 이루어질 수 있다. 일반적으로, 폴리펩티드의 비필수 영역에서의 단일 아미노산 치환은 생물 활성을 실질적으로 변경하지 않는다. 더욱이, 구조 또는 기능이 유사한 아미노산의 치환은 폴리펩티드의 생물 활성을 파괴할 가능성이 낮다.
Figure pct00002
표 1. 아미노산 잔기 및 보존적 아미노산 치환의 예
용어 "항체", "면역글로불린" 및 "Ig"는 넓은 의미에서 상호교환되어 본 명세서에서 사용되며, 구체적으로, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 단일클론 항체와 같은 개별 항-PD-L1 항체(아고니스트, 안타고니스트, 중화 항체, 전길이 또는 그대로의 단일클론 항체, 항원 결합 활성을 유지하는 항체의 펩티드 단편 포함), 항-비당화 PD-L1 항체 및 항-당화 PD-L1 항체; 다중에피토프 또는 단일에피토프 특이성, 다중클론 또는 1가 항체, 다가 항체, 적어도 2개의 본래 항체로부터 형성된 다중특이적 항체(예를 들어, 그들이 원하는 생물 활성을 나타내는 한, 이특이적 항체), 단일 쇄 항-PD-L1 항체, 및 항-PD-L1 항체의 단편을 가진 항-PD-L1 항체 조성물을 커버한다. 항체는 인간, 인간화, 키메라 및/또는 친화성 성숙될 수 있다. 항체는 다른 종, 예를 들어, 마우스, 래트, 토끼 등으로부터 올 수 있다. 용어 "항체"는 특정 분자 항원에 결합할 수 있는 폴리펩티드의 면역글로불린 부류 내의 B 세포의 폴리펩티드 생성물을 포함하는 것을 의도한다. 항체는 전형적으로 두 개의 동일한 폴리펩티드 쇄 쌍으로 구성되며, 각 쌍은 하나의 중쇄(약 50-70 kDa) 및 하나의 경쇄(약 25 kDa)을 가지며; 중쇄 및 경쇄의 아미노-말단 부분은 약 100 내지 약 130 이상 아미노산의 가변 영역을 포함하며 각 쇄의 카르복시-말단 부분은 불변 영역을 포함한다(Borrebaeck (ed.), 1995, Antibody Engineering, Second Ed., Oxford University Press.; Kuby, 1997 Immunology, Third Ed., W.H. Freeman and Company, New York 참고). 구체적 실시양태에서, 본 발명에서 제공된 항체에 의해 결합된 특정 분자 항원은 PD-L1 폴리펩티드, PD-L1 펩티드 단편, 또는 PD-L1 에피토프를 포함한다. PD-L1 폴리펩티드, PD-L1 펩티드 단편 또는 PD-L1 에피토프는 비당화되거나 당화될 수 있다. 구체적 실시양태에서, PD-L1 폴리펩티드, PD-L1 펩티드 단편, 또는 PD-L1 에피토프는 당화된다. PD-L1 항원에 결합하는 항체 또는 그의 펩티드 단편은 예를 들어, 면역분석, 비아코어(BIAcore) 또는 당업자에게 알려진 다른 기술에 의해 확인될 수 있다. 항체 또는 그의 단편은 방사면역측정법(RIA) 및 효소 연결 면역흡착 분석(ELISA)와 같은 실험 기술을 이용하여 결정할 때 임의의 교차반응성 항원에 대해서보다 더 높은 친화성으로 PD-L1 항원에 결합할 경우 PD-L1 항원에 특이적으로 결합한다. 전형적으로, 특이적 또는 선택적 결합 반응은 배경 시그널 또는 노이즈의 적어도 2배일 것이며, 더욱 전형적으로는 배경 시그널 또는 노이즈의 5-10 배 초과일 것이다. 예를 들어, 항체 특이성에 관한 토의를 위해 Paul, ed., 1989, Fundamental Immunology Second Edition, Raven Press, New York의 페이지 332-336을 참고한다.
본 발명에서 제공되는 항체는 합성 항체, 단일클론 항체, 재조합으로 생산된 항체, 다중특이적 항체(이특이적 항체 포함), 인간 항체, 인간화 항체, 낙타화 항체, 키메라 항체, 인트라바디(intrabodies), 항-이디오타입(항-Id) 항체, 및 상기 중 어느 것의 기능성 단편(예를 들어, PD-L1 결합 단편과 같은 항원-결합 단편)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 결합 단편은 그 단편이 유래되는 항체의 결합 활성의 일부 또는 전부를 보유하는, 펩티드 부분과 같은, 항체 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드의 일부를 말한다. 기능성 단편(예를 들어, PD-L1 결합 단편과 같은 항원-결합 단편)의 비제한적인 예는 단일-쇄 Fv(scFv)(예를 들어, 단일특이적, 이특이적 등 포함), Fab 단편, F(ab') 단편, F(ab)2 단편, F(ab')2 단편, 이황화-결합 Fv(sdFv), Fd 단편, Fv 단편, 디아바디(diabodies), 트리아바디(triabodies), 테트라바디(tetrabodies) 및 미니바디(minibodies)를 포함한다. 구체적으로, 본 발명에서 제공되는 항체는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역 활성 부분, 예를 들어, PD-L1 항원, 특히 당화 PD-L1 항원에 결합하는 항원-결합 부위를 함유하는 항원 결합 도메인 또는 분자(예를 들어, 항-PD-L1 항체의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR))를 포함한다. 그러한 항체 단편의 설명은 예를 들어, Harlow and Lane, 1989, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York; Myers (ed.), Molec. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, New York: VCH Publisher, Inc.; Huston et al., 1993, Cell Biophysics, 22: 189-224; Pluckthun and Skerra, 1989, Meth. Enzymol, 178:497-515 및 Day, E.D., 1990, Advanced Immunochemistry, Second Ed., Wiley-Liss, Inc., New York, NY에서 찾을 수 있다. 본 발명에서 제공되는 항체는 임의의 타입(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 면역글로불린 분자의 임의의 클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2), 또는 임의의 서브클래스(예를 들어, IgG2a 및 IgG2b)일 수 있다. 항-PD-L1 항체는 아고니스트 항체 또는 안타고니스트 항체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 완전히 인간, 예를 들어, 완전히 인간 단일클론 항-PD-L1 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 인간화 단일클론 항-PD-L1 항체와 같은 인간화 항체이다. 일부 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 항체는 IgG 항체, 또는 그의 클래스(예를 들어, 인간 IgG1 또는 IgG4) 또는 서브클래스, 특히 IgG1 서브클래스 항체이다.
4-쇄 항체 단위는 2개의 동일한 경(L) 쇄 및 2개의 동일한 중(H)쇄로 이루어진 이종사량체 당단백질이다. IgG의 경우, 4-쇄(비환원) 항체 단위의 분자량은 일반적으로 약 150,000 달톤(dalton)이다. 각각의 L 쇄는 하나의 공유적 이황화 결합에 의해 H 쇄에 연결되는 한편, 두 H 쇄는 H 쇄 아이소타입에 따라 하나 이상의 이황화 결합에 의해 서로 연결된다. 각각의 H 및 L 쇄는 또한 규칙적 간격을 가진 쇄내 이황화 가교를 갖는다. N-말단에서, 각각의 H 쇄는 α 및 γ 쇄의 각각을 위해서는 3개의 불변 도메인(CH) 그리고 μ 및 ε 아이소타입을 위해서는 4개의 CH 도메인이 뒤따르는 가변 도메인(VH)를 가진다. 각각의 L 쇄는 N-말단에서, 그의 카르복시 말단에서 불변 도메인(CL)이 뒤따르는 가변 도메인(VL)을 가진다. VL 도메인은 VH 도메인과 배열되며, CL 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)과 배열된다. 특정 아미노산 잔기가 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이의 계면을 형성하는 것으로 생각된다. VH와 VL의 쌍이루기(pairing)은 함께 단일 항원-결합 부위를 형성하지만, 일부 VH와 VL 도메인은 각각 VL 또는 VH 도메인과 쌍을 이루지 않고서 항원에 결합할 수 있다. 면역글로불린 분자의 기본 구조는 당업자가 이해한다. 예를 들어, 상이한 클래스의 항체의 구조 및 특성은 Terr, Abba I. et al., 1994, Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Appleton & Lange, Norwalk, CT, 페이지 71 및 챕터 6에서 찾을 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "항원" 또는 "표적 항원"은 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 소정의 분자이다. 표적 항원은 폴리펩티드, 펩티드, 탄수화물, 핵산, 지질, 합텐, 또는 다른 자연 발생 또는 합성 화합물일 수 있다. 실시양태에서, 표적 항원은 소분자이다. 일부 실시양태에서, 표적 항원은 폴리펩티드 또는 펩티드, 바람직하게는 당화 PD-L1 폴리펩티드이다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "항원 결합 단편", "항원 결합 도메인", "항원 결합 영역", 및 유사한 용어는 항원과 상호작용하며 결합 제제로서의 항체에 항원에 대한 그의 특이성 및 친화성을 부여하는 아미노산 잔기를 포함하는 항체의 부분을 말한다(예를 들어, 항체의 CDR이 항원 결합 영역이다). 항원 결합 영역은 설치류(예를 들어, 토끼, 래트 또는 햄스터) 및 인간과 같은 임의의 동물 종으로부터 유래될 수 있다. 구체적 실시양태에서, 항원 결합 영역은 인간 기원일 수 있다.
"분리된" 항체는 그 항체가 유래된 세포 또는 조직 공급원 및/또는 다른 오염 성분으로부터의 세포 물질 또는 다른 오염 단백질이 실질적으로 없거나, 또는 화학적으로 합성된 경우 화학 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없다. 어구 "세포 물질이 실질적으로 없는"은 항체가 그로부터 분리되거나 재조합으로 생산된 세포의 세포 성분으로부터 항체가 분리된 항체 제제를 포함한다. 따라서, 실질적으로 세포 물질이 없는 항체는 약 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 또는 1%(건조 중량 기준) 보다 적은 이종성 단백질(본 명세서에서 "오염 단백질"로도 불림)을 갖는 항체 제제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체가 재조합에 의해 생산될 경우, 항체는 배양 배지가 실질적으로 없으며, 예를 들어, 배양 배지는 단백질 제제 부피의 약 20%, 15%, 10%, 5%, 또는 1% 미만을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 항체가 화학 합성에 의해 생산될 경우, 항체는 화학 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없으며, 예를 들어, 항체는 단백질 합성에 관련되는 화학 전구체 또는 다른 화학물질로부터 분리된다. 따라서, 그러한 항체 제제는 약 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 또는 1%(건조 중량 기준) 미만의 화학 전구체 또는 관심 항체 외의 다른 화합물을 가진다. 오염 성분은 또한 항체를 위한 치료 용도를 방해할 물질을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 (1) 로우리법(Lowry method) (Lowry et al., 1951, J. Bio. Chem., 193 : 265-275)에 의해 결정할 때, 중량 기준으로 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%와 같은, 95중량% 이상의 항체로, (2) 회전 컵 서열분석기(spinning cup sequenator)를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15 잔기를 수득하기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 은 염색을 이용하여 환원 또는 비환원 조건하에서 SDS-PAGE에 의해 균질할 정도로, 정제된다. 분리된 항체는 또한 항체의 자연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이므로 재조합 세포 내의 인 시추(in situ) 항체를 포함한다. 분리된 항체는 전형적으로 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조된다. 일부 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 항체는 분리된다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "결합하다" 또는 "결합하는"은 예를 들어, 복합체를 형성하기 위한 것을 포함하여, 분자 사이의 상호작용을 말한다. 예시적으로, 그러한 상호작용은 수소 결합, 이온 결합, 소수성 상호작용 및/또는 반데르발스 상호작용을 비롯한 비-공유적 상호작용을 포함한다. 복합체는 또한 공유 또는 비-공유 결합, 상호작용 또는 힘에 의해 함께 유지된 둘 이상의 분자의 결합을 포함할 수 있다. 항체의 단일 항원-결합 부위와 표적 (항원) 분자, 예를 들어, PD-L1 상의 그의 에피토프 사이의 전체 비-공유 상호작용의 강도는 항체 또는 기능성 단편의 그 에피토프에 대한 친화성이다. 1가 항원에 대한 항체의 결합(kon) 대 해리(koff)의 비율(kon/koff)은 친화성의 척도인 결합 상수 Ka이다. K의 값은 항체와 항원의 상이한 복합체에 대해 변하며 kon 및 koff 둘 모두에 의존한다. 본 발명에서 제공되는 항체를 위한 결합 상수 Ka는 본 명세서에 제공되는 임의의 방법 또는 당업자에게 알려진 임의의 다른 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 하나의 결합 부위에서의 친화성이 항상 항체와 항원 사이의 상호작용의 진짜 강도를 반영하는 것은 아니다. 다수의 반복되는 항원 결정인자를 함유한 복합 항원이 다수의 결합 부위를 함유한 항체와 접촉될 경우, 한 부위에서의 항체와 항원의 상호작용은 두 번째 결합 부위에서의 상호작용의 가능성을 증가시킬 것이다. 다가 항체와 항원 사이의 그러한 다수의 상호작용의 강도는 결합친화도(avidity)로 불린다. 항체의 결합친화도는 그의 개별 결합 부위의 친화성보다 더 우수한 그의 결합 능력의 척도일 수 있다. 예를 들어, 높은 결합친화도는 때로는 5량체 IgM 항체에 대해 발견되는 낮은 친화성을 보상할 수 있으며, 상기 5량체 IgM 항체는 IgG보다 낮은 친화성을 가질 수 있으나, 그의 다가성으로부터 야기되는 IgM의 높은 결합친화도는 IgM이 항원에 효과적으로 결합하도록 한다.
"결합 친화성"은 일반적으로 분자(예를 들어, 항체와 같은 결합 단백질)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너(예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총합의 강도를 말한다. 달리 나타내지 않으면, 본 명세서에서 사용될 때, "결합 친화성"은 결합 쌍(예를 들어, 항체와 항원)의 구성원 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유의 결합 친화성을 말한다. 그의 결합 파트너 Y에 대한 결합 분자 X의 친화성은 일반적으로 해리 상수(Kd)에 의해 나타낼 수 있다. 친화성은 본 명세서에 개시된 것들을 비롯한 본 기술분야에 알려진 일반적인 방법에 의해 측정할 수 있다. 저-친화성 항체는 일반적으로 느리게 항원에 결합하며 쉽게 해리하는 경향을 가지는 한편, 고-친화성 항체는 일반적으로 항원에 더 빠르게 결합하고 항원에 더 오래 결합된채 남아 있는 경향을 갖는다. 결합 친화성을 측정하기 위한 다양한 방법이 본 기술분야에 알려져 있으며, 이 중 임의의 방법이 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다. 구체적인 예시적 실시양태는 하기를 포함한다: 일 실시양태에서, "Kd" 또는 "Kd 값"은 본 기술분야에 알려진 분석, 예를 들어, 결합 분석에 의해 측정된다. Kd는 예를 들어, 관심 항체의 Fab 부분과 그의 항원으로 수행되는, 방사성라벨링된 항원 결합 분석(RIA)에서 측정될 수 있다(Chen, et al., 1999, J. Mol. Biol, 293 :865-881). Kd 또는 Kd 값은 또한 예를 들어, 비아코어TM-2000 또는 비아코어TM-3000(비아코어, 인크(BIAcore, Inc.), 미국 뉴저지주 피스카타웨이)를 이용한 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석(비아코어에 의함)을 이용하여, 또는 예를 들어, 옥테트(Octet)QK384 시스템(포르테바이오(ForteBio), 캘리포니아주 먼로 파크)를 이용한 생물층 간섭측정(BLI)에 의해, 또는 석영 결정 마이크로밸런스(QCM) 기술에 의해 측정할 수 있다. "온-레이트(on-rate)" 또는 "결합의 속도" 또는 "결합 속도" 또는 "kon"은 또한 예를 들어, 비아코어TM-2000 또는 비아코어TM-3000(비아코어, 인크. 뉴저지주 피스카타웨이) 또는 OctetQK384 시스템(포르테바이오, 캘리포니아주 먼로 파크)를 이용하여 상기에 개시한 동일한 표면 플라스몬 공명 또는 생물층 간섭측정으로 결정될 수 있다.
용어 "항-PD-L1 항체", "PD-L1에 특이적으로 결합하는 항체" 또는 "PD-L1에 대해 특이적인 항체", "PD-L1 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체", "PD-L1에 선택적으로 결합하는 항체", "PD-L1 에피토프에 선택적으로 결합하는 항체", "PD-L1에 우선적으로 결합하는 항체" 및 유사한 용어는 본 명세서에서 상호교환되어 사용되며, 특히 비-당화 PD-L1 또는 PD-L1의 당화 돌연변이에 비교하여, 충분한 친화성과 특이성으로, PD-L1, 즉, 당화 또는 WT PD-L1에 결합할 수 있는 항체를 말한다. 본 발명에서 제공되는 항-glycPD-L1 항체의 "우선적 결합"은, 비-당화 또는 변이체 PD-L1(예를 들어,4NQ PD-L1), 또는 비-당화 또는 변이체 PD-L1 형태(예를 들어, 4NQ PD-L1)을 발현하는 세포, 예를 들어, 분자 조작된 세포, 세포주 또는 종양 세포 분리물, 예를 들어, 실시예 5에서처럼, 본 명세서에 개시된 것에의 결합과 같은 적절한 대조군에 비하여, PD-L1, 즉, 당화 PD-L1 폴리펩티드, 또는 PD-L1 WT, 또는 세포 상에 발현된 당화 PD-L1에의 항체의 결합의 형광 강도의 정량에 기초하여 결정되거나 정의될 수 있다. 당화 PD-L1 폴리펩티드 또는 당화 PD-L1(PD-L1 WT)-발현 세포에의 개시된 항-glycPD-L1 항체의 우선적 결합은 세포 유동세포측정에 의해 평가할 때, 비-당화 또는 돌연변이 당화 PD-L1 폴리펩티드 또는 비-당화 또는 돌연변이 당화 PD-L1-발현 세포에의 항체의 결합에 비하여, 적어도 2-배, 적어도 3 -배, 적어도 4-배, 적어도 5-배, 적어도 6-배, 적어도 7-배, 적어도 8-배, 적어도 10-배, 적어도 15-배, 적어도 20-배 이상의 측정된 형광 결합 강도(MFI) 값에 의해 나타내지며, 분석되는 항체는 FITC와 같은 형광 라벨 또는 마커에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능하다. 실시양태에서, 분석될 항체는 FITC와 같은 형광 마커로 직접적으로 라벨링된다. 실시양태에서, 당화 PD-L1에 우선적으로 또는 선택적으로 결합하는 항-glycPD-L1 항체는 비-당화 PD-L1 또는 본 명세서에 개시된 PD-L1 당화 변이체, 예를 들어, 당화되지 않은 4NQ PD-L1에의 결합에 대한 동일 항체의 MFI 값 보다 1.5-배 내지 25-배, 또는 2-배 내지 20-배, 또는 3-배 내지 15-배, 또는 4-배 내지 8-배, 또는 2-배 내지 10-배, 또는 2-배 내지 5-배 이상 더 큰 MFI 값을 나타낸다. 전술한 모든 것의 사이에 있는 값 및 동일한 값의 배수-형광 강도 값이 포함될 것이다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 당화 PD-L1 항원, 펩티드 단편, 또는 에피토프(예를 들어, 인간 당화 PD-L1, 예를 들어, 인간 당화 PD-L1 폴리펩티드, 항원 또는 에피토프)와 같은 당화 PD-L1 폴리펩티드에 특이적으로 그리고 우선적으로 결합한다. PD-L1(예를 들어, 당화 또는 야생형 인간 PD-L1)에 특이적으로 결합하는 항체는 PD-L1의 세포외 도메인(ECD) 또는 ECD로부터 유래된 펩티드에 결합할 수 있다. PD-L1 항원(예를 들어, 인간 PD-L1)에 특이적으로 결합하는 항체는 관련 항원(예를 들어, 원숭이(사이노) PD-L1)과 교차-반응성일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, PD-L1 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 다른 항원과 교차-반응하지 않는다. PD-L1 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 예를 들어, 면역형광 결합 분석, 면역조직화학 분석법, 면역분석법, 비아코어, 또는 당업자에게 알려진 다른 기술에 의해 확인될 수 있다.
일부 다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된, PD-L1에 결합하는 항체는 20 nM, 19 nM, 18 nM, 17 nM, 16 nM, 15 nM, 14 nM, 13 nM, 12 nM, 11 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 0.9 nM, 0.8 nM, 0.7 nM, 0.6 nM, 0.5 nM, 0.4 nM, 0.3 nM, 0.2 nM, 또는 0.1 nM 이하이고/이거나 0.1 nM 이상인 해리 상수(Kd)를 가진다. 일부 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 상이한 종(예를 들어, 인간과 원숭이 PD-L1)로부터의 PD-L1 단백질 사이에 보존되는 PD-L1의 에피토프에 결합한다. 항체는 방사면역측정법(RIA) 및 효소 연결 면역흡착 분석(ELISA)와 같은 실험 기술을 이용하여 결정할 때 임의의 교차 반응성 항원에 대해서보다 더 높은 친화성으로 PD-L1 항원에 결합할 경우 PD-L1 항원에 특이적으로 결합한다. 전형적으로 특이적 또는 선택적 반응은 배경 시그널 또는 노이즈의 적어도 두 배일 것이며 배경의 10배 보다 많을 수 있다. 예를 들어, 항체 특이성에 관한 토의를 위해서는 Paul, ed., 1989, Fundamental Immunology Second Edition, Raven Press, New York의 페이지 332-336을 참고한다. 그러한 실시양태에서, "비-표적" 단백질에의 항체의 결합 정도는 예를 들어, 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분석 또는 방사면역침전(RIA)에 의해 결정할 때, 항체의 특정 표적 단백질에의 항체의 결합의 약 10% 미만일 것이다.
항-PD-L1 항체는 항-당화 PD-L1 항체 또는 항-야생형 PD-L1 (PD-L1 WT) 항체를 포함하며, 야생형 PD-L1 단백질은 당화되며, 항체는 당화 PD-L1에 대해 특이적이다. 바람직한 실시양태에서, 항-PD-L1 항체는 비-당화 PD-L1에 비하여 당화 PD-L1에 특이적으로 결합하는 항-glycPD-L1 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-당화 PD-L1 항체는 PD-L1의 선형 당화 모티프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-당화 PD-L1 항체는 3차원에서 당화 모티프 중 하나 이상의 근처에 위치된 펩티드 서열에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-당화 PD-L1 항체는 비당화 PD-L1에 비하여 PD-L1의 하나 이상의 당화 모티프 또는 PD-L1의 당화 모티프를 가진 PD-L1 펩티드에 선택적으로 결합한다. 다른 실시양태에서, 항-당화 PD-L1 항체(항-glycPD-L1 항체)는 PD-L1 단백질의 아미노산을 포함하는 선형 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-당화 PD-L1 항체는 PD-L1의 하나 이상의 당화 모티프에 선택적으로 결합하며, 당화 모티프는 서열 번호 1의 PD-L1 폴리펩티드의 N35, N192, N200, 및/또는 N219를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 PD-L1 단백질의 아미노산을 포함하는 형태적(비선형) 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체, 또는 그의 결합 부분은 비당화 PD-L1에 대하여 나타내진 Kd의 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 90% 보다 적은 Kd로 당화 PD-L1에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체, 또는 그의 결합 부분은 비당화 PD-L1에 대하여 나타내진 Kd의 50% 보다 적은 Kd로 당화 PD-L1에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체, 또는 그의 결합 부분은 비당화 PD-L1에 대하여 나타내진 Kd의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 90% 보다 적은 Kd로 당화 PD-L1에 결합한다. 추가 양태에서, 항-glycPD-L1 항체, 또는 그의 결합 부분은 비당화 PD-L1에 대하여 나타내진 Kd 보다 적어도 5-10 분의 1 이하의 Kd로 당화 PD-L1에 결합한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체, 또는 그의 결합 부분은 비당화 PD-L1에 대하여 나타내진 Kd 보다 적어도 10 분의 1 이하의 Kd로 당화 PD-L1에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 비당화 PD-L1에의 결합에 의해 나타내진 Kd의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 또는 20% 이하의 Kd로 당화 PD-L1에 결합한다.
실시양태에서, 실시예 5에서 개시된 세포 유동세포측정 결합 분석에서, 항체는 비당화 PD-L1을 발현하는 세포에의 결합을 위한 MFI 보다 적어도 1.5 배, 2 배, 3, 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배 또는 10 배 더 큰, 그리고 일부 실시양태에서는, 비당화 PD-L1을 발현하는 세포에의 결합을 위한 MFI 보다 10 배, 20 배, 50 배 또는 100 배 이하로 더 큰, WT PD-L1를 발현하는 세포에의 MFI로서 표현되는 결합을 나타낸다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체, 또는 그의 결합 부분은 하한 및 상한 값을 포함하여, 5-20 nM 또는 10-20 nM의 친화성과 같은 나노몰 친화성으로 당화 PD-L1에 결합한다.
항체와 관련하여 본 명세서에서 사용될 때, 용어 "중(H)쇄"는 약 50-70 kDa의 폴리펩티드 쇄를 말하며, 아미노-말단 부분은 약 115 내지 130 이상 아미노산의 가변(V) 영역(V 도메인으로도 불림)을 포함하며 카르복시-말단 부분은 불변(C) 영역을 포함한다. 불변 영역(또는 불변 도메인)은 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열에 기초하여, 알파(α), 델타(δ), 입실론(ε), 감마(γ) 및 뮤(μ)로 불리는 5가지 구별되는 타입(예를 들어, 아이소타입) 중 하나일 수 있다. 구별되는 중쇄는 크기가 상이하며: α, δ 및 γ는 대략 450 아미노산을 함유하는 한편, μ 및 ε은 대략 550 아미노산을 함유한다. 경쇄와 조합될 경우, 이들 구별되는 중쇄 타입은 5가지의 잘 알려진 항체 클래스(예를 들어, 아이소타입), 즉, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 4가지 서브클래스의 IgG를 비롯한, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM을 각각 생성한다. 항체 중쇄는 인간 항체 중쇄일 수 있다.
항체와 관련하여 본 명세서에서 사용될 때, 용어 "경(L)쇄"는 약 25 kDa의 폴리펩티드 쇄를 말하며, 아미노-말단 부분은 약 100 내지 약 110 이상 아미노산의 가변 도메인을 포함하고 카르복시-말단 부분은 불변 영역을 포함한다. 경쇄(V 및 C 도메인 둘 모두)의 대략적인 길이는 211 내지 217 아미노산이다. 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는 두 가지 구별되는 타입의 경쇄가 있다. 경쇄 아미노산 서열은 본 기술분야에 잘 알려져 있다. 항체 경쇄는 인간 항체 경쇄일 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "가변(V) 영역" 또는 "가변(V) 도메인"은 일반적으로 L 또는 H 쇄의 아미노-말단에 위치하는 항체 폴리펩티드의 경(L) 또는 중(H) 쇄의 부분이다. H 쇄 V 도메인은 길이가 약 115 내지 130 아미노산인 한편, L 쇄 V 도메인은 길이가 약 100 내지 110 아미노산이다. H 및 L 쇄 V 도메인은 그의 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에서 사용된다. H 쇄의 V 도메인은 "VH"로 불릴 수 있다. L 쇄의 V 영역은 "VL"로 불릴 수 있다. 용어 "가변"은 V 도메인의 일부 분절이 상이한 항체 간에 서열에서 방대하게 상이하다는 사실을 말한다. V 도메인이 항원 결합을 매개하고 그의 특정 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 정의하는 한편, 가변성은 항체 V 도메인의 110-아미노산 스팬(span)에 걸쳐 균일하게 분포되지 않는다. 대신, V 도메인은 각각 약 9-12 아미노산 길이인 "초가변 영역" 또는 "상보성 결정 영역"(CDR)으로 불리는 더 큰 가변성(예를 들어, 극도의 가변성)의 더 짧은 영역에 의해 분리된 약 15-30 아미노산의 골격 영역으로 불리는 덜 가변성인(예를 들어, 상대적으로 비변이성) 스트레치로 이루어진다. 항체 H 및 L 쇄의 V 도메인은 각각, β 시트 구조를 연결하며 그리고 일부 경우에는 β 시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성하는 3가지 초가변 영역에 의해 연결되는, β 시트 형태를 대부분 채택하는, 4개의 FR을 포함한다. 각 쇄 내의 초가변 영역은 FR에 의해 매우 인접하여 함께 유지되며, 다른 쇄로부터의 초가변 영역과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다(예를 들어, Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 참고). C 도메인은 항원에의 항체의 결합에 직접 관련되지 않지만, 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC) 및 보체 의존성 세포독성(CDC)와 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낸다. V 도메인은 상이한 항체 클래스 또는 타입 간에 서열에 있어서 매우 상이하다. 서열에서의 가변성은 CDR에 집중되며, 이는 주로 항체의 항원과의 상호작용을 책임진다. 구체적 실시양태에서, 항체의 가변 도메인은 인간 또는 인간화 가변 도메인이다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "상보성 결정 영역", "CDR", "초가변 영역", "HVR" 및 "HV"는 상호교환되어 사용된다. "CDR"은 항체 VHβ-시트 골격의 비-골격 영역 이내의 세 개의 초가변 영역(H1, H2 또는 H3) 중 하나, 또는 항체 VLβ-시트 골격의 비-골격 영역 이내의 세 개의 초가변 영역(L1, L2 또는 L3) 중 하나를 말한다. 본 명세서에서 사용될 때, 상기 용어는 서열에서 초가변성이고/이거나 구조적으로 한정된 루프를 형성하는 항체 V 도메인의 영역을 말한다. 일반적으로, 항체는 6개의 초가변 영역을 포함한다: VH 도메인 내의 3개(H1, H2, H3) 및 VL 도메인 내의 3개(L1, L2, L3). 따라서, CDR은 전형적으로 V 도메인의 골격 영역 서열 이내에 배치된 고도로 가변성인 서열이다. "골격" 또는 "FR" 잔기는 CDR 측면의 가변성 영역 잔기들이다. FR 잔기는 예를 들어, 키메라, 인간화 항체, 인간, 도메인 항체, 디아바디, 선형 항체, 및 이특이적 항체에서 존재한다.
많은 초가변 영역 설명이 사용중이며 본 명세서에 포함된다. CDR 영역은 당업자에게 잘 알려져 있으며 예를 들어, 항체 V 도메인 내의 가장 초가변성 영역으로서 카밧에 의해 정의되었다(Kabat et al., 1977, J. Biol. Chem., 252:6609-6616; Kabat, 1978, Adv. Prot. Chem., 32: 1-75). 카밧 CDR은 서열 가변성에 기초하며 가장 일반적으로 사용된다(예를 들어, Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD). CDR 영역 서열은 또한 보존된 β-시트 골격의 일부가 아닌 잔기들로서 초티아에 의해 구조적으로 정의되었으며, 따라서 상이한 형태를 채택할 수 있다(Chothia et al., 1987, J. Mol. Biol, 196:901-917). 초티아는 대신에 구조적 루프의 위치를 칭한다. 카밧 넘버링 관례를 이용하여 넘버링할 때 초티아 CDR-H1 루프의 마지막은 루프의 길이에 따라 H32와 H34 사이에서 변한다(이것은 카밧 넘버링 도식이 H35A와 H35B에서 삽입을 위치시키기 때문이며; 만일 35 A 또는 35B가 존재하지 않으면, 루프는 32에서 끝나며; 만일 35 A만이 존재하면, 루프는 33에서 끝나며; 만일 35A와 35B가 존재하면, 루프는 34에서 끝난다). 넘버링 시스템 및 용어 둘 모두 본 기술분야에 잘 알려져 있다.
최근에는, 보편적인 넘버링 시스템이 개발되어 널리 채택되었으며, 이는 임뮤노제네틱스(ImMunoGeneTics)(IMGT) 정보 시스템(Information System)®이다(Lafranc et al., 2003, Dev. Comp. Immunol, 27(l):55-77). IMGT는 인간 및 다른 척추동물의 면역글로불린(Ig), T 세포 수용체(TR) 및 주요 조직적합성 복합체(MHC)에서 특화된 통합 정보 시스템이다. 여기에서는 CDR은 아미노산 서열 및 경쇄 또는 중쇄 내의 위치 둘 모두의 측면에서 지칭된다. 면역글로불린 V 도메인의 구조 내의 CDR의 "위치"는 종 사이에서 보존되며 루프로 불리는 구조에 존재하므로, 구조적 특징에 따라 가변 도메인 서열을 배열하는 넘버링 시스템을 이용함으로써, CDR 및 골격 잔기는 쉽게 확인된다. 이 정보는 한 가지 종의 면역글로불린으로부터의 CDR 잔기를 전형적으로는 인간 항체로부터의 수용체 골격 내로 치환할 때 및 그래프팅에서 사용될 수 있다. 추가의 넘버링 시스템(AHon)은 Honegger et al., 2001, J. Mol. Biol, 309: 657-670에 의해 개발되었다. 예를 들어, 카밧 넘버링과 IMGT 유일 넘버링 시스템을 비롯한 넘버링 시스템 사이의 대응은 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, Kabat, Id; Chothia et al., Id. ; Martin, 2010, Antibody Engineering, Vol. 2, Chapter 3, Springer Verlag; 및 Lefranc et al., 1999, Nuc. Acids Res., 27:209-212 참고).
CDR 영역 서열은 또한 AbM, 컨택(Contact) 및 IMGT에 의해 정의되었다. AbM 초가변 영역은 카밧 CDR과 초티아 구조 루프 사이의 타협을 나타내며, 옥스포드 몰에큘라스 AbM 항체 모델링 소프트웨어(Oxford Molecular's AbM antibody modeling software)에 의해 사용된다(예를 들어, Martin, 2010, Antibody Engineering, Vol. 2, Chapter 3, Springer Verlag 참고). "접촉" 초가변 영역은 이용가능한 복합체 결정 구조의 분석에 기초한다. 이들 초가변 영역 또는 CDR의 각각으로부터의 잔기가 하기에 표시된다.
CDR 영역 서열의 예시적인 설명이 하기 표 2에 예시된다. 정규 항체 가변 영역 내의 CDR의 위치는 많은 구조의 비교에 의해 결정되었다(Al-Lazikani et al., 1997, J. Mol. Biol., 273 :927-948); Morea et al., 2000, Methods, 20:267-279). 초가변 영역 내의 잔기의 수가 상이한 항체에서 변하므로, 정규 위치에 대한 추가 잔기는 통상적으로 정규 가변 영역 넘버링 도식에서 잔기 번호 옆에 a, b, c 등으로 넘버링된다(Al-Lazikani et al., Id). 그러한 명명법은 유사하게 당업자에게 잘 알려져 있다.
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표 2. CDR 영역 서열의 예시적 설명
"친화성 성숙" 항체는 이들 변경(들)을 보유하지 않는 모 항체에 비하여 항원에 대한 항체의 친화성을 개선하는, 항체의 하나 이상의 HVR에서의 하나 이상의 변경(예를 들어, 변화, 부가 및/또는 결실을 비롯한 아미노산 서열 변이)를 가진 항체이다. 일부 실시양태에서, 친화성 성숙 항체는 당화 PD-L1과 같은 표적 항원에 대한 나노몰 또는 심지어 피코몰 친화성을 가질 것이다. 친화성 성숙 항체는 본 기술분야에 알려진 절차에 의해 생산된다. 리뷰를 위해서는, Hudson and Souriau, 2003, Nature Medicine, 9: 129-134; Hoogenboom, 2005, Nature Biotechnol, 23 : 1105-1116; Quiroz and Sinclair, 2010, Revista Ingeneria Biomedia, 4 : 39-51을 참고한다.
"키메라" 항체는 H 및/또는 L 쇄의 일부, 예를 들어, V 도메인이 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 내의 상응하는 아미노산 서열과 동일하거나 상동성인 한편, 쇄(들)의 나머지, 예를 들어, C 도메인은 다른 종으로부터 유래되거나 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 항체, 및 그 단편이 바람직한 생물 활성을 나타낸다면 그러한 항체의 단편이다(예를 들어, 미국 특허 4,816,567호; 및 Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 :6851-6855 참고).
"인간화" 비인간(예를 들어, 쥐) 항체는 천연 CDR 잔기가 원하는 특이성, 친화성, 및 항원 결합 및 상호작용 능력을 가진 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비인간 종(예를 들어, 공여체 항체)의 상응하는 CDR로부터의 잔기에 의해 치환된 인간 면역글로불린 서열(예를 들어, 수용체 항체)를 말하는 키메라 형태 항체이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 하나 이상의 FR 영역 잔기는 또한 상응하는 비인간 잔기에 의해 치환될 수 있다. 또한, 인간화 항체는 수용체 항체 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 인간화 항체의 성능을 더 개선하기 위하여 만들어진다. 인간화 항체 H 또는 L 쇄는 적어도 하나 이상의 가변 영역의 실질적으로 전부를 포함할 수 있으며, 모든 또는 실질적으로 모든 CDR이 비인간 면역글로불린의 CDR에 상응하며 모든 또는 실질적으로 모든 FR이 인간 면역글로불린 서열의 것들이다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역(Fc), 전형적으로는 인간 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 당업자에게 잘 알려져 있지만, 추가 상세 사항은 원한다면, 예를 들어, Jones et al., 1986, Nature, 321 :522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-329; 및 Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596; Carter et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285-4289; 및 미국 특허 6,800,738호(2004년 10월 5일 등록), 6,719,971호(2005년 9월 27일 등록), 6,639,055호(2003년 10월 28일 등록), 6,407,213호(2002년 6월 18일 등록), 및 6,054,297호(2000년 4월 25일 등록)을 참고한다.
용어 "인간 항체" 및 "완전히 인간 항체"는 본 명세서에서 상호교환되어 사용되며 인간에 의해 생산된 항체의 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하고/하거나 당업자가 실시하는 인간 항체 제조 기술 중 임의의 것을 이용하여 만들어진 항체를 말한다. 인간 항체의 이 정의는 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 구체적으로 배제한다. 인간 항체는 파아지-디스플레이 라이브러리(Hoogenboom et al., 1991, J. Mol. Biol, 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol, 222:581) 및 효모 디스플레이 라이브러리(Chao et al., 2006, Nature Protocols, 1 :755-768)를 비롯한 본 기술분야에 알려진 다양한 기술을 이용하여 생산될 수 있다. 인간 단일클론 항체의 제조를 위해 또한 이용가능한 것은 Cole et al., 1985 Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77; Boerner et al., 1991, J. Immunol, 147(1):86-95에 개시된 방법이다. 또한, van Dijk et al., 2001, Curr. Opin. Pharmacol, 5: 368-74를 참고한다. 인간 항체는 그의 내인성 Ig 유전자좌가 불능상태가 되었으며 인간 항체를 인코딩하는 인간 면역글로불린 유전자를 보유하도록 유전적으로 변형된 트랜스제닉 동물, 예를 들어, 마우스에게 항원을 투여하여, 인간 항체가 항원 공격에 대한 반응으로 생성되도록 함으로써 제조될 수 있다(예를 들어, Jakobovits, A., 1995, Curr. Opin. Biotechnol. 6(5):561-566; Bruggemann et al., 1997 Curr. Opin. Biotechnol., 8(4):455-8; 및 제노마우스(XENOMOUSE)™ 기술에 관한 미국 특허 6,075,181호 및 6,150,584호 참고). 또한, 예를 들어, 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체에 관한 Li et al., 2006, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103 :3557-3562를 참고한다. 구체적 실시양태에서, 인간 항체는 인간 기원의 가변 영역과 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, "완전히 인간" 항-PD-L1 항체는 또한 PD-L1 폴리펩티드에 결합하며 인간 생식세포 면역글로불린 핵산 서열의 자연 발생 체세포 변이체인 핵산 서열에 의해 인코딩되는 항체를 포함할 수 있다. 구체적 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 항-PD-L1 항체는 완전히 인간 항체이다. 용어 "완전히 인간 항체"는 Kabat 등에 의해 개시된 인간 생식세포 면역글로불린 서열에 해당하는 가변 및 불변 영역을 가진 항체를 포함한다(Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 참고). 어구 "재조합 인간 항체"는 숙주 세포 내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 이용하여 발현된 항체; 재조합의 조합 인간 항체 라이브러리로부터 분리된 항체; 인간 면역글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉 및/또는 트랜스염색체인 동물(예를 들어, 마우스 또는 소)로부터 분리된 항체(예를 들어, Taylor, L. D. et al., 1992, Nucl. Acids Res. 20:6287-6295 참고)와 같은, 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 인간 항체; 또는 다른 DNA 서열에의 인간 면역글로불린 유전자 서열의 스플라이싱에 관련되는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 항체를 포함한다. 그러한 재조합 인간 항체는 인간 생식세포 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 가질 수 있다(Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 참고). 하지만, 일부 실시양태에서, 그러한 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이유발(또는, 인간 Ig 서열에 대해 트랜스제닉인 동물이 이용될 경우, 생체내 체세포 돌연변이유발)을 거치며 따라서 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 생식세포 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이에 관련되는 한편 생체내에서 인간 항체 생식세포 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "에피토프"는 항원, 예를 들어, 항-PD-L1 또는 항-glycPD- L1 항체의 하나 이상의 항원 결합 영역에 의해 결합될 수 있는 PD-L1 폴리펩티드 또는 당화 PD-L1 폴리펩티드의 표면 상의 국소 영역과 같은, 단일 항체 분자가 결합하는 항원 분자의 표면 상의 부위(들) 또는 영역(들)이다. 에피토프는 면역원성일 수 있으며 동물에서 면역 반응을 유발할 수 있다. 에피토프는 반드시 면역원성일 필요는 없다. 에피토프는 종종 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹으로 이루어지며 특정 전하 특성 뿐만 아니라 특정 3차원 구조 특징을 가진다. 에피토프는 선형 에피토프 및 형태적 에피토프일 수 있다. 에피토프에 기여하는 폴리펩티드 영역은 선형 에피토프를 형성하는, 폴리펩티드의 연속 아미노산일 수 있거나, 또는 에피토프는 폴리펩티드의 둘 이상의 비-연속 아미노산 또는 영역으로부터 형성될 수 있으며, 전형적으로 형태적 에피토프로 불린다. 에피토프는 항원의 삼차원 표면 특징이거나 아닐 수 있다. 일부 실시양태에서, PD-L1 에피토프는 PD-L1 폴리펩티드의 삼차원 표면 특징이다. 다른 실시양태에서, PD-L1 에피토프는 PD-L1 폴리펩티드의 선형 특징이다. 일부 실시양태에서, PD-L1 에피토프는 비당화 PD-L1 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, PD-L1 에피토프는 하나 이상의 부위에서 당화된다. 일반적으로, 항원은 여러개의 또는 많은 상이한 에피토프를 가지며 많은 상이한 항체와 반응할 수 있다. 구체적 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 개시된 대로, 형태적 에피토프인, PD-L1, 특히 당화 PD-L1의 에피토프에 결합한다.
두 항체가 3차원 공간에서 동일하거나, 중복되거나, 또는 이웃한 에피토프를 인식할 경우, 항체는 기준 항체의 "에피토프" 또는 "본질적으로 동일한 에피토프" 또는 "동일한 에피토프"에 결합한다. 두 항체가 3차원 공간에서 동일하거나, 중복되거나, 이웃한 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하기 위한 가장 널리 사용되고 신속한 방법은 예를 들어, 라벨링된 항원 또는 라벨링된 항체를 이용하는 많은 상이한 포맷으로 구성될 수 있는 경쟁 분석이다. 일부 분석에서, 항원은 96-웰 플레이트 상에 고정되거나, 세포 표면 상에 발현되며, 라벨링되지 않은 항체가 라벨링된 항체의 항원에의 결합을 차단하는 능력이 검출가능한 시그널, 예를 들어, 방사성, 형광 또는 효소 라벨을 이용하여 측정된다.
PD-L1 표적 단백질 또는 그의 펩티드 상의 동일한 에피토프 또는 결합 부위에 대하여 경쟁하는 항-PD-L1 항체의 맥락에서 사용될 경우 용어 "경쟁하다"는 연구중인 항체 또는 그의 결합 단편이 공통 항원(예를 들어, PD-L1 또는 그 단편)에의 기준 분자(예를 들어, 기준 리간드, 또는 기준 항원 결합 단백질, 예를 들어, 기준 항체)의 특이적 결합을 방지, 차단 또는 억제하는 분석에 의해 결정된 경쟁을 의미한다. 시험 항체가 PD-L1(예를 들어, 인간 PD-L1 또는 인간 당화 PD-L1)에의 결합에 대하여 기준 항체와 경쟁하는지 여부를 결정하기 위해 많은 타입의 경쟁 결합 분석이 사용될 수 있다. 이용될 수 있는 분석의 예는 고체상 직접 또는 간접 방사면역측정(RIA); 고체상 직접 또는 간접 효소 면역분석(EIA); 샌드위치 경쟁 분석(예를 들어, Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 9:242-253 참고); 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA(예를 들어, Kirkland et al., 1986, J. Immunol. 137:3614-3619 참고); 고체상 직접 라벨링된 분석; 고체상 직접 라벨링된 샌드위치 분석(예를 들어, Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press 참고); 라벨링된 요오드(I125 라벨)를 이용하는 고체상 직접 라벨 RIA(예를 들어, Morel et al., 1988, Molec. Immunol. 25:7-15 참고); 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA(예를 들어, Cheung, et al., 1990, Virology 176:546-552 참고); 및 직접 라벨링된 RIA(Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82)를 포함한다. 전형적으로, 그러한 분석은 고체 표면에 결합된 정제된 항원(예를 들어, 인간 PD-L1 또는 당화 PD-L1와 같은 PD-L1), 또는 라벨링되지 않은 시험 항원 결합 단백질(예를 들어, 시험 항-PD-L1 항체) 또는 라벨링된 기준 항원 결합 단백질(예를 들어, 기준 항-PD-L1 항체)를 보유한 세포의 사용에 관련된다. 경쟁적 억제는 시험 항원 결합 단백질의 공지량의 존재하에서 고체 표면 또는 세포에 결합된 라벨의 양을 결정함으로써 측정될 수 있다. 보통, 시험 항원 결합 단백질은 과량으로 존재한다. 경쟁 분석에 의해 확인된 항체(경쟁 항체)는 기준 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체 및/또는 기준 항체에 의해 결합되는 에피토프에 충분히 인접한 이웃 에피토프에 결합하여 입체 장애가 발생하도록 하는 항체를 포함한다. 경쟁적 결합을 결정하는 방법에 관한 추가의 상세 사항은 본 명세서에서 개시된다. 보통, 경쟁 항체 단백질이 과량으로 존재할 경우, 이는 공통 항원에의 기준 항체의 특이적 결합을 적어도 15%, 또는 적어도 23%, 예를 들어, 제한없이, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 또는 75% 이상 및 서술된 양 사이의 퍼센트 양만큼 억제할 것이다. 일부 경우에, 결합은 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96% 또는 97%, 98%, 99% 이상 억제된다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "차단" 항체 또는 "안타고니스트" 항체는 항체가 결합하는 항원의 생물학적 또는 기능적 활성을 방지, 억제, 또는 감소시키는 항체를 말한다. 차단 항체 또는 안타고니스트 항체는 항원의 생물학적 활성 또는 기능을 실질적으로 또는 완전히 방지, 억제, 차단 또는 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 차단 항-PD-L1 항체는 PD-L1과 PD-1 사이의 결합 상호작용을 방지, 억제, 차단 또는 감소시켜, PD-1/PD-L1 상호작용과 연합된 면역억제 기능을 방지, 차단, 억제 또는 감소시킬 수 있다. 용어 차단, 억제 및 중화는 본 명세서에서 상호교환되어 사용되며, 항-glycPD-L1 항체가 PD-L1/PD-1 상호작용을 방지하거나 다르게는 파괴 또는 감소시키는 능력을 말한다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "폴리펩티드" 또는 "펩티드"는 펩티드 결합을 통해 연결된, 연속 배열의 셋 이상의 아미노산의 아미노산 중합체를 말한다. "폴리펩티드"는 단백질, 단백질 단편, 단백질 유사체, 올리고펩티드 등일 수 있다. 폴리펩티드를 구성하는 아미노산은 자연적으로 유래되거나 합성일 수 있다. 폴리펩티드는 생물학적 샘플로부터 정제될 수 있다. 예를 들어, PD-L1 폴리펩티드 또는 펩티드는 인간 PD-L1 또는 당화 PD-L1의 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 연속 아미노산으로 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 PD-L1 또는 당화 PD-L1의 적어도 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 또는 285 연속 아미노산을 갖는다. 일부 실시양태에서, PD-L1 폴리펩티드는 PD-L1 폴리펩티드 또는 당화 PD-L1 폴리펩티드의 아미노산 서열의 적어도 5 연속 아미노산 잔기, 적어도 10 연속 아미노산 잔기, 적어도 15 연속 아미노산 잔기, 적어도 20 연속 아미노산 잔기, 적어도 25 연속 아미노산 잔기, 적어도 40 연속 아미노산 잔기, 적어도 50 연속 아미노산 잔기, 적어도 60 연속 아미노산 잔기, 적어도 70 연속 아미노산 잔기, 적어도 80 연속 아미노산 잔기, 적어도 90 연속 아미노산 잔기, 적어도 100 연속 아미노산 잔기, 적어도 125 연속 아미노산 잔기, 적어도 150 연속 아미노산 잔기, 적어도 175 연속 아미노산 잔기, 적어도 200 연속 아미노산 잔기, 적어도 250 연속 아미노산 잔기를 포함한다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "유사체"는 기준 폴리펩티드와 유사하거나 동일한 기능을 보유하지만 기준 폴리펩티드와 유사하거나 동일한 아미노산 서열을 반드시 포함하거나 기준 폴리펩티드와 유사하거나 동일한 구조를 반드시 보유하지는 않는 폴리펩티드를 말한다. 기준 폴리펩티드는 PD-L1 폴리펩티드, PD-L1 폴리펩티드의 단편, 항-PD-L1 항체, 또는 항-glycPD-L1 항체일 수 있다. 기준 폴리펩티드와 유사한 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드는 PD-L1 폴리펩티드 또는 본 명세서에 개시된 항-glycPD-L1 항체일 수 있는 기준 폴리펩티드의 아미노산 서열과 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 말한다. 기준 폴리펩티드와 유사한 구조를 가진 폴리펩티드는 PD-L1 폴리펩티드 또는 본 명세서에 개시된 항-glycPD-L1 항체일 수 있는 기준 폴리펩티드와 유사한 2차, 3차 또는 4차 구조를 가진 폴리펩티드를 말한다. 폴리펩티드의 구조는 X-선 결정학, 핵 자기 공명(NMR) 및 결정 전자 현미경을 포함하며 이에 제한되지 않는 당업자에게 알려진 방법에 의해 결정할 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때, PD-L1 폴리펩티드 또는 항-PD-L1 항체와 관련하여 사용될 경우 용어 "변이체"는 천연 또는 비변형 PD-L1 서열 또는 항-PD-L1 항체 서열과 비교할 때 하나 이상(예를 들어, 약 1 내지 약 25, 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 15, 약 1 내지 약 10, 또는 약 1 내지 약 5) 아미노산 서열 치환, 결실 및/또는 부가를 가진 폴리펩티드 또는 항-PD-L1 항체를 말한다. 예를 들어, PD-L1 변이체는 천연 PD-L1의 아미노산 서열에의 하나 이상의(예를 들어, 약 1 내지 약 25, 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 15, 약 1 내지 약 10, 또는 약 1 내지 약 5) 변화로부터 야기될 수 있다. 또한 예로서, 항-PD-L1 항체의 변이체는 천연 또는 이전에 변형되지 않은 항-PD-L1 항체의 아미노산 서열에의 하나 이상(예를 들어, 약 1 내지 약 25, 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 15, 약 1 내지 약 10, 또는 약 1 내지 약 5) 변화로부터 야기될 수 있다. 변이체는 대립유전자 또는 스플라이스 변이체와 같은 자연 발생성일 수 있거나, 인위적으로 제작될 수 있다. 폴리펩티드 변이체는 변이체를 인코딩하는 상응하는 핵산 분자로부터 제조될 수 있다.
용어 "동일성"은 서열을 배열하고 비교하여 결정될 때, 둘 이상의 폴리펩티드 분자 또는 둘 이상의 핵산 분자의 서열 사이의 관계를 말한다. "퍼센트 동일성"은 비교된 분자에서 아미노산 또는 뉴클레오티드 사이의 동일한 잔기의 퍼센트를 의미하며, 비교되는 분자의 최소 크기를 기초로 계산된다. 이들 계산을 위하여, (있다면) 배열에서의 갭은 특정 수학적 모델 또는 컴퓨터 프로그램(예를 들어, "알고리즘")에 의해 해결되어야 한다. 배열된 핵산 또는 폴리펩티드의 동일성을 계산하기 위하여 사용될 수 있는 방법은 Lesk, A. M., ed., 1988, Computational Molecular Biology, New York: Oxford University Press; Smith, D. W., ed., 1993, Biocomputing Informatics and Genome Projects, New York: Academic Press; Griffin, A. M., et al., 1994, Computer Analysis of Sequence Data, Part I, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Gribskov, M. et al., 1991, Sequence Analysis Primer, New York: M. Stockton Press; 및 Carillo et al., 1988, Applied Math., 48: 1073에 개시된 것들을 포함한다.
퍼센트 동일성 계산에서는, 비교되는 서열은 서열 간에 최대의 매치를 제공하는 방식으로 배열될 수 있다. 퍼센트 동일성을 결정하기 위하여 사용될 수 있는 컴퓨터 프로그램의 예는 GCG 프로그램 패키지이며, 이는 그들의 퍼센트 서열 동일성을 결정하기 위하여 두 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 배열하기 위하여 사용되는 컴퓨터 알고리즘인 GAP을 포함한다(Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res., 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI). 서열은 그들의 각 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 최적 매치를 위해 배열될 수 있다(알고리즘에 의해 결정된 "매치된 스팬"). 갭 오프닝 페널티(gap opening penalty)(평균 다이아고날(average diagonal)의 3배로 계산되며, "평균 다이아고날"은 사용되는 비교 매트릭스의 다이아고날의 평균이며, "다이아고날"은 특정 비교 매트릭스에 의한 각각의 완벽한 아미노산 매치에 할당된 점수 또는 수임) 및 갭 연장 페널티(보통 갭 오프닝 페널티의 1/10배임), 및 PAM 250 또는 BLOSUM 62와 같은 비교 매트릭스가 알고리즘과 함께 사용된다. 일부 실시양태에서, 표준 비교 매트릭스(PAM 250 비교 매트릭스를 위해서는 Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352 참고; BLOSUM 62 비교 매트릭스를 위해서는 Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919 참고)가 또한 알고리즘에 의해 사용된다. GAP 프로그램을 이용하여 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열을 위한 퍼센트 동일성을 결정하기 위한 예시적인 파라미터는 하기를 포함한다: (i) 알고리즘: Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol, 48:443-453; (ii) 비교 매트릭스: Henikoff et al, Id.로부터의 BLOSUM 62; (iii) 갭 페널티: 12(그러나 말단 갭을 위한 페널티는 없음); (iv) 갭 길이 페널티: 4; 및 (v) 유사성의 역치: 0.
두 아미노산 서열을 배열하기 위한 일부 배열 도식은 두 서열의 짧은 영역만의 매칭을 야기할 수 있으며, 이 작은 배열 영역은 두 전길이 서열 사이에 유의한 관계가 없는데도 불구하고 매우 높은 서열 동일성을 가질 수 있다. 따라서, 선택된 배열 방법(예를 들어, GAP 프로그램)은 필요하다면 표적 폴리펩티드의 대표적인 수의 아미노산, 예를 들어, 적어도 50 연속 아미노산에 걸친 배열을 야기하도록 조정될 수 있다.
기준 폴리펩티드 서열에 대한 퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성은 서열들을 배열하고 필요하면 최대 퍼센트 서열 동일성을 이루기 위해 갭을 도입한 후, 그리고 서열 동일성의 일부로서 어떤 보존적 치환도 고려하지 않고서, 기준 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하는 목적을 위한 배열은 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공중이 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여, 당업자의 기술 이내인 다양한 방식으로 이루어질 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전길이에 걸친 최대 배열을 이루는데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여, 서열을 배열하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "유도체"는 아미노산 잔기 치환, 결실 또는 부가의 도입에 의해 변경된 기준 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 말한다. 기준 폴리펩티드는 PD-L1 폴리펩티드 또는 항-PD-L1 항체일 수 있다. 본 명세서에서 사용될 때 용어 "유도체"는 또한 예를 들어, 폴리펩티드에 임의의 타입의 분자를 공유 부착하여, 화학적으로 변형된 PD-L1 폴리펩티드 또는 항-PD-L1 항체를 말한다. 예를 들어, PD-L1 폴리펩티드 또는 항-PD-L1 항체는 예를 들어, 당화, 아세틸화, 페길화, 인산화, 아미드화, 공지의 보호/차단 기에 의한 유도체화, 단백질분해성 절단, 세포 리간드에의 연결, 펩티드 또는 단백질 태그 분자 또는 다른 단백질에의 연결, 등에 의해, 화학적으로 변형될 수 있다. 유도체는 부착되는 분자의 타입 또는 위치에서, 자연 발생 또는 출발 펩티드 또는 폴리펩티드와 상이한 방식으로 변형된다. 유도체는 펩티드 또는 폴리펩티드 상에 자연적으로 존재하는 하나 이상의 화학적 기의 결실을 추가로 포함할 수 있다. PD-L1 폴리펩티드 또는 항-PD-L1 항체의 유도체는 특정 화학 절단, 아세틸화, 제형화, 투니카마이신에 의한 대사적 합성, 등을 포함하며 이에 제한되지 않는, 당업자에게 알려진 기술을 이용한 화학적 변형에 의해 화학적으로 변형될 수 있다. 추가로, PD-L1 폴리펩티드 또는 항-PD-L1 항체의 유도체는 하나 이상의 비-전통적 아미노산을 함유할 수 있다. 폴리펩티드 유도체는 본 명세서에 개시된 PD-L1 폴리펩티드 또는 항-PD-L1 항체, 특히 항-glycPD-L1 단일클론 항체일 수 있는 기준 폴리펩티드와 유사하거나 동일한 기능을 보유한다.
본 명세서에서 사용될 때 용어 "융합 단백질"은 적어도 두 이종성 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 말한다. PD-L1 폴리펩티드 또는 항-PD-L1 항체와 관련하여 사용될 경우 용어 "융합"은 PD-L1 폴리펩티드 또는 항-PD-L1 항체, 그의 변이체 및/또는 유도체를 이종성 펩티드 또는 폴리펩티드와 연결, 융합 또는 커플링하는 것을 말한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 PD-L1 폴리펩티드 또는 항-PD-L1 항체의 생물학적 활성을 보유한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 이종성 펩티드 또는 폴리펩티드에 커플링되거나, 융합되거나 연결된 PD-L1 항체 VH 영역, VL 영역, VH CDR(1, 2, 또는 3 VH CDR), 및/또는 VL CDR(1, 2, 또는 3 VL CDR)을 포함하며, 융합 단백질은 PD-L1 단백질 또는 펩티드 상의 에피토프에 결합한다. 융합 단백질은 본 기술분야에서 실시되는 화학 커플링 반응을 통해 또는 분자 재조합 기술을 통해 제조될 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "조성물"은 선택적으로 특정 또는 유효 양으로 특정 성분(예를 들어, 본 발명에서 제공되는 폴리펩티드 또는 항체)를 함유하는 생성물, 및 선택적으로 특정 또는 유효 양의 특정 성분의 조합 또는 상호작용으로부터 직접 또는 간접적으로 야기되는 임의의 원하는 생성물을 말한다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "담체"는 이용되는 투여량 및 농도에서 거기에 노출되는 세포 또는 포유류에 비독성인 약학적 허용 담체, 부형제, 희석제, 비히클 또는 안정화제를 포함한다. 종종, 생리학적 허용 담체는 수성 pH 완충 용액이다. 생리학적 허용 담체의 예는 포스페이트, 시트레이트, 석시네이트 및 다른 유기산과 같은 버퍼; 아스코르브산을 비롯한 산화방지제; 저분자량(예를 들어, 약 10 아미노산 잔기 미만) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트린을 비롯한 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이팅제; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당 알콜; 소듐과 같은 염-형성 카운터이온; 및/또는 트윈(TWEEN)™, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 및 플루로닉스(PLURONICS)™과 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다. 용어 "담체"는 또한 치료제가 함께 투여되는 희석제, 아쥬반트(예를 들어, 프로인트 아쥬반트, 완전 또는 불완전), 부형제, 또는 비히클을 말할 수 있다. 약학적 담체를 비롯한 그러한 담체는 물 및 광유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 오일, 예를 들어, 땅콩유, 대두유, 미네랄유, 참기름 등을 비롯한 오일과 같은 멸균 액체일 수 있다. 물은 조성물(예를 들어, 약학 조성물)이 정맥내 투여될 경우 예시적인 담체이다. 생리식염수와 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 또한 특히 주사용 용액을 위한, 액체 담체로서 이용될 수 있다. 적합한 부형제(예를 들어, 약학적 부형제)는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카겔, 소듐 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 소듐클로라이드, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 제한없이 포함한다. 원하면, 조성물은 또한 소량의 습윤 또는 유화 제제, 또는 pH 버퍼링제를 함유할 수 있다. 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 알약, 캡슐, 분말, 서방성 제형 등의 형태를 취할 수 있다. 제형을 비롯한 경구 조성물은 약학 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 셀룰로스, 마그네슘 카보네이트 등과 같은 표준 담체를 포함할 수 있다. 적합한 약학적 담체의 예는 Remington s' Pharmaceutical Sciences, (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA에 개시된다. 약학적 화합물을 포함하는 조성물은 개체(예를 들어, 환자)에게의 적절한 투여를 위한 형태를 제공하기 위하여 적합한 양의 담체와 함께, 예를 들어, 분리되거나 정제된 형태의, 치료적 유효량의 항-glycPD-L1 항체와 같은 항-PD-L1 항체를 함유할 수 있다. 조성물 또는 제형은 투여 방식에 적합해야 한다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "부형제"는 희석제, 비히클, 방부제, 결합제 또는 안정화제로서 일반적으로 사용되는 불활성 물질을 말하며, 단백질(예를 들어, 혈청 알부민 등), 아미노산(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산, 리신, 아르기닌, 글리신, 히스티딘 등), 지방산 및 인지질(예를 들어, 알킬 설포네이트, 카프릴레이트 등), 계면활성제(예를 들어, SDS, 폴리소르베이트, 비이온성 계면활성제 등), 당류(예를 들어, 수크로스, 말토스, 트레할로스 등) 및 폴리올(예를 들어, 만니톨, 소르비톨 등)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 또한, 참고로, 그 전체가 본원에 참고로 통합되는 Remington's Pharmaceutical Sciences, (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA를 참고한다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "약학적 허용" 또는 "약리학적 허용"은 인간과 같은 동물에게 적절히 투여될 때 부작용, 알러지, 또는 뜻밖이거나 원치않는 다른 반응을 생성하지 않는 분자 물질, 제형 및 조성물을 말한다. 항체 또는 추가의 활성 성분을 포함하는 약학 조성물의 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences, Id에 의해 예시되는 바처럼, 본 발명에 비추어 당업자에게 알려져 있다. 또한, 동물(예를 들어, 인간) 투여의 경우, 제제가 FDA 생물 표준 사무국(Office of Biological Standards)와 같은 연방 또는 주 정부의 관리 기관에 의해 요구되거나, 미국 약전, 유럽 약전, 또는 동물, 그리고 더욱 구체적으로는 인간에서의 사용을 위해 일반적으로 인정되는 다른 약전에 열거된 멸균성, 발열성, 일반 안전성 및 순도 표준을 충족해야 한다.
용어 "약학 제형"은 활성 성분(예를 들어, 항-PD-L1 항체 및 항-glycPD-L1 항체)의 생물학적 활성이 효과적이도록 하는 그러한 형태에 있으며, 제형이 투여될 개체에게 허용될 수 없는 독성인 추가 성분을 함유하지 않는 제제를 말한다. 그러한 제형은 멸균성일 수 있으며, 즉, 모든 살아있는 미생물 및 그들의 포자 등이 없을 수 있다.
용어 "포장 삽입물"은 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 용법, 투여량, 투여, 금기 및/또는 경고에 대한 정보를 함유하는, 치료 제품의 상업적 포장에 관례적으로 포함되는 설명서를 말한다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "치료하다", "치료" 또는 "치료하는"은 질병 또는 건강-관련 병태를 치료하는 것과 같은, 적어도 하나의 긍정적 치료 효과 또는 이득을 수득할 목적으로, 이를 필요로 하는 개체에 치료제를 투여하거나 적용하는 것 또는 개체에서 절차 또는 양식을 수행하는 것을 말한다. 예를 들어, 치료는 다양한 타입의 암을 치료할 목적으로 당화 PD-L1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 조성물 또는 제형의 약학적 유효량을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 용어 "치료 요법", "투약 요법" 또는 "투약 프로토콜"은 상호교환되어 사용되며, 본 명세서에 개시된 항-glycPD-L1 항체와 같은, 치료제의 타이밍과 투여량을 말한다. 본 명세서에서 사용될 때, 용어 "개체"는 암을 갖거나 암으로 진단된 인간 또는 비-인간 동물, 예를 들어, 영장류, 포유류 및 척추동물을 말한다. 바람직한 실시양태에서, 개체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 개체는 암 환자이다. 실시양태에서, 필요로 하는 개체는 항-glycPD-L1 항체 치료로부터 이득을 보거나 이득을 볼 것으로 예상된다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "치료 이득" 또는 "치료적으로 효과적"은 특히 항-glycPD-L1 항체의 사용과 개시된 방법의 수행의 결과로서, 병태의 의료적 치료, 치료법, 투여량 투여와 관련하여 필요로 하는 개체(예를 들어, 암을 갖거나 암으로 진단된 개체)의 웰빙의 촉진 또는 향상을 말한다. 이것은 질병의 신호 또는 증상의 빈도 또는 심각성의 감소를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 암의 치료는 예를 들어, 종양 크기의 감소, 종양의 침윤성 또는 심각성의 감소, 암세포의 주변 조직 또는 기관내로의 침윤 감소; 종양 또는 암의 성장 속도의 감소, 또는 전이의 방지 또는 감소에 관련될 수 있다. 암의 치료는 또한 개체에서 지속된 반응을 이루거나 암 환자의 생존을 연장시키는 것을 말할 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "투여하다" 또는 "투여"는 예를 들어, 주사 또는 경구 경로를 통해, 신체 밖에 존재하는 물질을 경구, 피하, 점막, 피내, 정맥내, 근육내 전달 및/또는 본 명세서에 개시되거나 본 기술분야에 알려진 임의의 다른 물리적 전달 방법에 의해서와 같이, 환자 내로 물리적으로 전달하는 행위를 말한다. 질병, 질환 또는 병태, 또는 그의 증상이 치료법으로 치료 중일 경우, 물질의 투여는 전형적으로 질병, 질환 또는 병태 또는 그의 증상의 개시 후에 일어난다. 예방적 치료는 질병, 질환 또는 병태 또는 그의 증상의 개시 전의 시점에 물질을 투여하는 것에 관련된다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "유효량"은 암 또는 그에 관련된 증상의 심각성 및/또는 지속을 감소, 약화, 경감 및/또는 완화하기에 충분한 치료제(예를 들어, 본 발명에서 제공되는 항체 또는 약학 조성물)의 양을 말한다. 이 용어는 또한 암의 전진 또는 진행의 감소 또는 완화; 암의 재발, 발달 또는 개시의 감소 또는 완화; 및/또는 다른 암 치료법(예를 들어, 본 발명에서 제공되는 항-PD-L1 항체 또는 항-glycPD-L1 항체의 투여 외의 다른 치료법)의 예방 또는 치료 효과(들)의 개선 또는 향상을 위해 필요한 양포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 항체의 유효량은 약 0.1 또는 0.1 mg/kg(항체 mg/개체 체중 kg) 내지 약 100 또는 100 mg/kg이다. 일부 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 항체의 유효량은 약 0.1 또는 0.1 mg/kg, 약 0.5 또는 0.5 mg/kg, 약 1 또는 1 mg/kg, 약 3 또는 3 mg/kg, 약 5 또는 5 mg/kg, 약 10 또는 10 mg/kg, 약 15 또는 15 mg/kg, 약 20 또는 20 mg/kg, 약 25 또는 25 mg/kg, 약 30 또는 30 mg/kg, 약 35 또는 35 mg/kg, 약 40 또는 40 mg/kg, 약 45 또는 45 mg/kg, 약 50 또는 50 mg/kg, 약 60 또는 60 mg/kg, 약 70 또는 70 mg/kg, 80 mg/kg, 90 mg/kg, 또는 100 mg/kg이다. 이들 양은 그안의 양과 범위를 포함하는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, "유효량"은 또한 특정 결과(예를 들어, 세포 표면 PD-L1에의 세포 표면 PD-1 결합을 방지, 차단 또는 억제; 또는 PD-1/PD-L1 매개 면역억제를 방지, 차단 또는 억제)를 이루기 위한 본 발명에 제공되는 항체의 양을 말한다.
다른 치료법(예를 들어, 다른 제제, 암 약물, 암 치료법)의 투여 맥락에서 용어 "조합된"은 한 가지보다 많은 치료법(예를 들어, 약물 치료법 및/또는 암 치료법)의 사용을 포함한다. 하나 이상의 추가 치료제"와의 조합" 투여는 동시(예를 들어, 동시 발생) 및 임의의 순서의 연속 투여를 포함한다. 용어 "조합된"의 사용은 치료법이 개체에 투여되는 순서를 제한하지 않는다. 비제한적인 예로서, 첫번째 치료법(예를 들어, 항-glycPD-L1 항체와 같은 제제)는 두번째 치료법(예를 들어, 제제)가 암을 갖거나 암으로 진단된 개체에게 투여되기 전에(예를 들어, 1 분, 15 분, 30 분, 45 분, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 7 시간, 8 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 1 주, 2 주, 3 주, 4 주, 5 주, 6 주, 8 주, 8 주, 9 주, 10 주, 11 주, 또는 12 주), 투여와 동시에, 또는 투여 후(예를 들어, 1 분, 15 분, 30 분, 45 분, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 7 시간, 8 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 1 주, 2 주, 3 주, 4 주, 5 주, 6 주, 7 주, 8 주, 9 주, 10 주, 11 주, 또는 12 주 이상)에 투여될 수 있다.
치료법(예를 들어, 치료제를 비롯한 제제의 사용)의 조합은 임의의 둘 이상의 단일 치료법의 부가적 효과보다 더 효과적일 수 있다(예를 들어, 상승적 효과를 가질 수 있다). 상승적 효과는 전형적으로 예상되지 않으며 예측될 수 없다. 예를 들어, 치료제의 조합의 상승적 효과는 빈번히 제제 중 하나 이상의 낮은 투여량의 사용 및/또는 암환자에의 제제의 덜 빈번한 투여를 허용한다. 낮은 투여량의 치료제 및 암 치료법을 이용하고/하거나 덜 빈번하게 치료제를 투여하는 능력은 치료법의 효과를 감소시키지 않고서 개체에게의 치료법의 투여와 관련된 독성의 가능성을 감소시킨다. 또한, 상승적 효과는 암의 치료 또는 완화에서 치료법의 개선된 효능을 야기할 수 있다. 또한, 치료법(예를 들어, 치료제)의 조합에 의해 입증되는 상승적 효과는 임의의 단일 치료법의 사용과 연합된 나쁜 또는 원치않는 부작용을 피하거나 감소시킬 수 있다.
항-당화 PD-L1 항체 (항-glycPD-L1 항체)
실시양태에서 본 발명은 바람직하게는 비당화 PD-L1에 대해서보다 더 높은 친화성으로, 당화 PD-L1 단백질(예를 들어, 특정 N-글리칸 구조를 가진 PD-L1 단백질; PD-L1의 특정 당펩티드) 또는 당화 PD-L1 펩티드에 결합하며(즉, 우선적으로 결합하며), 당화 PD-L1/PD-1 상호작용의 면역 억제 기능을 억제하는 항체 또는 그의 결합 단편, 및 질병, 특히 암의 치료에서 그러한 항체의 용도를 제공한다. 항-glycPD-L1 항체는 IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE Ig 클래스, 및 항원 결합 활성을 보유한 하나 이상의 항체 CDR 도메인을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다. 예시적으로, 항-glycPD-L1 항체는 키메라, 친화성 성숙, 인간화 또는 인간 항체일 수 있다. 항-glycPD-L1 항체는 단일클론 항체이다. 일부 실시양태에서, 단일클론 항-glycPD-L1 항체는 STM004 또는 STM115, 또는 그의 인간화 또는 키메라 형태이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 단일클론 항-glycPD-L1 항체는 인간화 항체이다. 공지 수단에 의해 그리고 본 명세서에 개시된 대로, 당화 PD-L1 항원, 그의 각 에피토프 중 하나 이상, 또는 전술한 것 중 어느 것의 접합체에 대해 특이적인 다중클론 또는 단일클론 항체, 항체 단편, 결합 도메인 및 CDR(전술한 것 중 어느 것의 조작된 형태를 포함)은 그러한 항원 또는 에피토프가 천연 공급원으로부터 분리되건 또는 합성 유도체 또는 천연 단백질의 변이체이건 간에, 생성될 수 있다.
실시양태에서, 항체는 키메라 항체, 예를 들어, 이종성 비-인간, 인간 또는 인간화 서열(예를 들어, 골격 및/또는 불변 도메인 서열)에 그래프팅된 비-인간 공여체로부터의 항원 결합 서열(예를 들어, V 도메인 및/또는 CDR)을 포함하는 항체이다. 일 실시양태에서, 비-인간 공여체 서열은 마우스 또는 래트로부터 온다. 일 실시양태에서, 항원 결합 서열은 합성이며, 예를 들어, 돌연변이유발(예를 들어, 인간 파아지 라이브러리의 파아지 디스플레이 스크리닝 등)에 의해 수득된다. 일 실시양태에서, 키메라 항체는 쥐 V 영역 및 인간 C 영역을 가진다. 일 실시양태에서, 쥐 경쇄 V 영역은 인간 카파 경쇄 C 영역에 융합된다. 일 실시양태에서, 쥐 중쇄 V 영역은 인간 IgG1 C 영역에 융합된다.
실시양태에서, 항체는 낙타 항체로부터, 바람직하게는 VHH 도메인 서열 또는 나노바디(Nanobodies)™로 알려진, 경쇄가 없는 중쇄 낙타 항체로부터 유래된 면역글로불린 단일 가변 도메인이다. 나노바디™(Nb)는 자연 발생 단일-쇄 항체의 최소의 기능성 단편 또는 단일 가변 도메인(VHH)이며 당업자에게 알려져 있다. 그들은 낙타에서 나타난 중쇄만을 가진 항체로부터 유래된다(Hamers-Casterman et al., 1993, Nature, 363, p. 446-448; Desmyter et al., 1996, Nat. Struct. Biol., p. 803-811). "낙타"과에서는, 경쇄 폴리펩티드가 없는 면역글로불린이 발견된다. "낙타과"는 구세계 낙타(쌍봉 낙타(Camelus bactrianus) 및 단봉 낙타(Camelus dromedarius) 및 신세계 낙타(예를 들어, 라마 파코스(Lama paccos), 라마 글라마(Lama glama), 라마 구아니코에(Lama guanicoe) 및 라마 비쿠그나(Lama vicugna)를 포함한다. 단일 가변 도메인 중쇄 항체는 본 명세서에서 나노바디™ 또는 VHH 항체로 표시된다. Nb의 작은 크기 및 독특한 생물물리학 특성은 드물거나 숨겨진 에피토프의 인식에 대해 그리고 단백질 표적의 동공 또는 활성 부위 내로의 결합에 대해 종래의 항체 단편보다 탁월하다. 또한, Nb는 리포터 분자에 부착된 다중-특이적 및 다가 항체로서 설계되거나 인간화될 수 있다. Nb는 안정하며, 위장관 시스템에서 생존하며 쉽게 제조될 수 있다.
다른 실시양태에서, 항체는 이특이적 항체이다. 상이한 특이성의 두 항원 결합 부위를 단일 구조체로 단일화하여 이특징적 항체는 정교한 특이성을 가진 두 개의 구별되는 항원을 합치는 능력을 가지며 따라서 치료제로 큰 가능성을 갖는다. 이특이적 항체는 원래는 각각 상이한 면역글로불린을 생산할 수 있는 두 하이브리도마를 융합시켜 만들어졌다. 이특이적 항체는 또한 전체 면역글로불린에 존재하는 Fc 부분을 생략하는 한편 두 scFv 항체 단편을 연결시켜 생산된다. 그러한 구조체 내의 각각의 scFv 단위는 합성 폴리펩티드 링커를 통해 서로 연결된 중쇄(VH) 및 경쇄(VL) 항체 쇄의 각각으로부터의 하나의 가변 도메인을 함유할 수 있으며, 링커는 종종 단백질분해에 대한 최대의 저항성을 유지하면서 최소로 면역원성이도록 유전적으로 조작된다. 각 scFv 단위는 두 scFv 단위를 연결하는 짧은(보통 10 아미노산 미만) 폴리펩티드 스페이서의 통합을 비롯한 많은 공지 기술에 의해 연결되어, 이특이적 단일 쇄 항체를 생성할 수 있다. 따라서, 생성되는 이특이적 단일 쇄 항체는 단일 폴리펩티드 쇄 상에 상이한 특이성의 두 VH/VL 쌍을 함유하는 종이며, 여기서 각 scFv 단위 내의 VH 및 VL 도메인은 이들 두 도메인 사이의 분자내 연합을 허용하기에 충분히 긴 폴리펩티드 링커에 의해 분리되어, 그렇게 형성된 scFv 단위가 예를 들어, 하나의 scFv 단위의 VH 도메인과 다른 scFv 단위의 VL 사이의 원치않는 연합을 방지하기에 충분히 짧게 유지되는 폴리펩티드 스페이서를 통해 서로 인접하게 묶인다.
사용하기 적합한 항체 단편의 예는 제한없이 (i) VL, VH, CL, 및 CH1 도메인으로 이루어지는 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어지는 "Fd" 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어지는 "Fv" 단편; (iv) VH 도메인으로 이루어지는 "dAb" 단편; (v) 분리된 CDR 영역; (vi) 두 개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (vii) VH 도메인 및 VL 도메인이 두 도메인이 결합 도메인을 형성하기 위하여 연합하도록 허용하는 펩티드 링커에 의해 연결되는 단일 쇄 Fv 분자("scFv"); (viii) 이특이적 단일 쇄 Fv 이량체(미국 특허 5,091,513호 참고); 및 (ix) 유전자 융합에 의해 제작된 다가 또는 다특이적 단편인 디아바디(미국 특허 출원 공개 20050214860호 참고)를 포함한다. Fv, scFv, 또는 디아바디 분자는 VH 및 VL 도메인을 연결하는 이황화 가교의 통합에 의해 안정화될 수 있다. CH3 도메인에 연결된 scFv를 포함하는 미니바디(Hu et al., 1996, Cancer Res., 56:3055-3061) 또한 유용할 수 있다. 또한, 항체-유사 결합 펩티드모방체가 또한 실시양태에서 고려된다. 삭감된(pared-down) 항체처럼 작용하며 덜 성가신 합성 방법 뿐만 아니라 더 긴 혈청 반감기의 일부 이점을 가진 펩티드인 "항체 유사 결합 펩티드모방체"(ABiP)는 Liu et al., 2003, Cell Mol. Biol, 49:209-216에 의해 보고되었다.
동물은 면역 반응을 생성하고 당화 PD-L1 폴리펩티드에 대해 특이적인 항체를 생산하기 위하여 당화 PD-L1 폴리펩티드 또는 펩티드와 같은 항원으로 접종될 수 있다. 종종, 항원은 면역 반응을 향상시키기 위하여 다른 분자에 결합되거나 접합된다. 본 명세서에서 사용될 때, 접합체는 동물에서 면역 반응을 유발하기 위하여 사용되는 항원에 결합된 임의의 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 또는 비-단백질성 물질이다. 항원 접종에 대한 반응으로 동물에서 생산된 항체는 다양한 개별 항체 생산 B 림프구로부터 만들어진 다양한 비-동일 분자(다중클론 항체)를 포함한다. 다중클론 항체는 항체 종의 혼합 집단이며, 각 항체 종은 동일한 항원 상의 상이한 에피토프를 인식할 수 있다. 동물에서 다중클론 항체 생산을 위한 정확한 조건을 고려할 때, 동물의 혈청 내의 항체의 대부분은 동물이 면역된 항원성 화합물 상의 전체 에피토프를 인식할 것이다. 이 특이성은 관심 항원 또는 에피토프를 인식하는 항체만을 선택하기 위한 친화성 정제에 의해 더 향상된다.
단일클론 항체는 항체의 단일 클론 종이며, 이때 모든 항체 분자는 동일한 에피토프를 인식하며 그 이유는 모든 항체 생산 세포가 단일의 항체-생산 B-림프구(또는 항체 분자를 재조합적으로 발현하는 세포와 같은 다른 클론 세포)로부터 유래되기 때문이다. 단일클론 항체(MAb)를 생성하는 방법은 일반적으로 다중클론 항체의 제조를 위한 방법과 동일한 방식으로 시작한다. 일부 실시양태에서, 마우스 및 래트와 같은 설치류가 단일클론 항체 생산에 사용된다. 일부 실시양태에서, 토끼, 양 또는 개구리 세포가 단일클론 항체 생산에 사용된다. 래트의 사용은 잘 알려져 있으며 일부 이점을 제공할 수 있다. 마우스(예를 들어, BALB/c 마우스)가 일상적으로 이용되며 일반적으로 높은 백분율의 안정한 융합을 제공한다. 단일클론 항체 생산에서 사용되는 하이브리도마 기술은 이전에 당화 PD-L1 단백질 또는 펩티드로 면역된 마우스로부터 분리된 단일의 항체-생산 B 림프구를 불멸화된 골수종 세포, 예를 들어, 마우스 골수종 세포주와 융합시키는 것에 관련된다. 이 기술은 동일한 항원 또는 에피토프 특이성을 가진 구조적으로 동일한 항체, 즉 단일클론 항체의 무한한 양이 생산될 수 있도록, 무한한 수의 세대 동안 단일 항체-생산 세포를 증식시키는 방법을 제공한다.
단일클론 항체의 경쇄 및 중쇄 불변 도메인을 인간 기원의 유사 도메인으로 치환하여, 외래 항체의 가변 영역을 그대로 남기는 방법이 개발되었다. 대안적으로, "완전히 인간" 단일클론 항체는 인간 면역글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉인 마우스 또는 래트에서 생산된다. 설치류 및 인간 아미노산 서열 둘 모두를 가진 항체 가변 도메인을 재조합적으로 제작하여 단일클론 항체의 가변 도메인을 보다 인간 형태로 전환하는 방법 또한 개발되었다. "인간화" 단일클론 항체에서는, 초가변 CDR만이 비-인간(예를 들어, 마우스, 래트, 치킨, 라마 등) 단일클론 항체로부터 유래되고, 골격 영역은 인간 항체 아미노산 서열로부터 유래된다. 설치류의 특징인 항체 내의 아미노산 서열을 인간 항체의 상응하는 위치에서 발견되는 아미노산 서열로 치환하면 인간에서 치료적 사용 동안 외래 단백질에 대한 불리한 면역 반응의 가능성을 감소시킨다. 항체를 생산하는 하이브리도마 또는 다른 세포는 또한 하이브리도마에 의해 생산된 항체의 결합 특이성을 변경하거나 변경하지 않을 수 있는 유전적 돌연변이 또는 다른 변화를 거칠 수 있다.
조작된 항체는, 원래 항체의 항원 또는 에피토프 결합 특이성을 보유하는 다른 항체 또는 키메라 분자를 생산하기 위하여 단일클론 및 다른 항체 및 재조합 DNA 기술을 이용하여 생성될 수 있으며, 즉, 상기 분자는 특이적 결합 도메인을 갖는다. 그러한 기술은 면역글로불린 가변 영역 또는 항체의 CDR을 인코딩하는 DNA를 상이한 항체의 골격 영역, 불변 영역 또는 불변 영역 + 골격 영역을 위한 유전자 물질 내로 도입하는 것에 관련될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 5,091,513호 및 6,881,557호를 참고하며, 이들은 참고로 본원에 포함된다.
본 명세서에 개시된 공지 수단에 의해, 그러한 항원 또는 에피토프가 천연 공급원으로부터 분리되건 또는 합성 유도체이거나 천연 화합물의 변이체이건 간에, 당화 PD-L1 단백질, 그의 각 에피토프 중 하나 이상, 또는 전술한 것 중 어느 것의 접합체에 특이적으로 결합하는 다중클론 또는 단일클론 항체, 결합 활성을 갖는 항체 단편, 결합 도메인 및 CDR(전술한 것 중 어느 것의 조작된 형태를 포함)이 생성될 수 있다.
항체는 새와 포유류를 비롯한 임의의 동물 공급원으로부터 생산될 수 있다. 바람직하게는, 항체는 양, 쥐(예를 들어, 마우스와 래트), 토끼, 염소, 기니아피그, 낙타, 말, 또는 닭이다. 또한, 더 새로운 기술은 인간 조합 항체 라이브러리로부터 인간 항체의 개발과 스크리닝을 허용한다. 예를 들어, 박테리오파아지 항체 발현 기술은 참고로 본원에 포함되는 미국 특허 6,946,546호에 개시된 대로, 동물 면역의 부재하에서 특정 항체가 생산되도록 한다. 이들 기술은 Marks et al., 1992, Bio/Technol., 10:779-783; Stemmer, 1994, Nature, 370:389-391; Gram et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:3576-3580; Barbas et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91 :3809-3813; 및 Schier et al., 1996, Gene, 169(2): 147-155에서 추가로 개시된다.
다양한 동물 종에서 다중클론 항체를 생산하는 방법 및 인간화, 키메라 및 완전히 인간을 비롯한 다양한 타입의 단일클론 항체를 생산하는 방법은 본 기술분야에 잘 알려져 있으며 고도로 재현가능하다. 예를 들어, 하기의 미국 특허는 그러한 방법의 설명을 제공하며 참고로 본원에 포함된다: 미국 특허 3,817,837호; 3,850,752호; 3,939,350호; 3,996,345호; 4,196,265호; 4,275,149호; 4,277,437호; 4,366,241호; 4,469,797호; 4,472,509호; 4,606,855호; 4,703,003호; 4,742,159호; 4,767,720호; 4,816,567호; 4,867,973호; 4,938,948호; 4,946,778호; 5,021,236호; 5,164,296호; 5,196,066호; 5,223,409호; 5,403,484호; 5,420,253호; 5,565,332호; 5,571,698호; 5,627,052호; 5,656,434호; 5,770,376호; 5,789,208호; 5,821,337호; 5,844,091호; 5,858,657호; 5,861,155호; 5,871,907호; 5,969,108호; 6,054,297호; 6,165,464호; 6,365,157호; 6,406,867호; 6,709,659호; 6,709,873호; 6,753,407호; 6,814,965호; 6,849,259호; 6,861,572호; 6,875,434호; 6,891,024호; 7,407,659호; 및 8,178,098호.
본 명세서에 개시된 당화 PD-L1에 대해 형성된 항체는 항체의 동물 종, 단일클론 세포주 또는 다른 공급원에 관계없이 당화 PD-L1의 효과를 중화, 차단, 억제 또는 대응하는 능력을 가질 것으로 예상된다. 일부 동물 종은 항체의 "Fc" 부분을 통해 보체 시스템의 활성화로 인한 면역 또는 알러지 반응을 야기할 가능성이 더 높을 수 있으므로 치료 항체를 생성하기 위해 덜 바람직할 수 있다. 하지만, 전체 항체는 "Fc"(보체 결합) 단편으로, 그리고 결합 도메인 또는 CDR을 가진 펩티드 단편으로 효소에 의해 분해될 수 있다. Fc 부분의 제거는 이 항체 단편이 바람직하지 못한 면역 반응을 유발할 가능성을 감소시키며, 따라서 Fc 부분이 없는 항체는 예방 또는 치료적 치료를 위해 바람직할 수 있다. 상기한 대로, 항체는 또한 다른 종에서 생산되거나 다른 종으로부터의 아미노산 서열을 가진 항체를 동물에게 투여하여 야기되는 잠재적인 불리한 면역학적 효과를 감소시키거나 제거하기 위하여, 키메라, 인간화 항체, 또는 부분적 또는 완전히 인간이도록 제작될 수 있다.
치환 변이체는 전형적으로 단백질 내의 하나 이상의 부위에서 하나의 아미노산의 다른 아미노산으로의 교환을 함유하며, 다른 기능 또는 특성의 상실이 있거나 없이, 폴리펩티드의 하나 이상의 특성을 조절하도록 설계될 수 있다. 치환은 보존적일 수 있으며, 즉, 하나의 아미노산이 유사한 형상과 전하의 아미노산으로 치환된다. 보존적 치환은 상기 표 1에 개시된다. 대안적으로, 치환은 폴리펩티드의 기능 또는 활성이 영향을 받도록 비-보존적일 수 있다. 비-보존적 변화는 전형적으로 비극성 또는 비하전 아미노산을 위한 극성 또는 하전된 아미노산 및 그 역과 같은, 화학적으로 비유사한 잔기로 잔기를 치환하는 것에 관련된다.
항체 단백질은 재조합성이거나, 시험관내에서 합성될 수 있다. 본 명세서에서 개시된 항-glycPD-L1 항체-함유 조성물에는 약 0.001 mg 내지 약 10 mg의 총 항체 폴리펩티드/ml이 있는 것으로 생각된다. 따라서, 조성물 내의 항체 단백질의 농도는 약, 적어도 약 또는 최대 약 또는 정확하게 0.001, 0.010, 0.050, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0 mg/ml 이상(또는 그안의 유도가능한 임의의 범위)일 수 있다. 이중에서, 약, 적어도 약, 최대 약, 또는 정확하게 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%가 당화 PD-L1에 결합하는 항체일 수 있다.
항체 또는 결합 활성을 보유하는 항체의 면역학적 부분은 다른 단백질에 화학적으로 접합되거나, 또는 다른 단백질과의 융합 단백질로서 재조합적으로 발현될 수 있다. 본 명세서에 개시된 목적을 위하여, 모든 그러한 융합된 단백질은 항체 또는 항체의 면역학적 부분의 정의에 포함된다. 일부 실시양태에서, 당화 PD-L1에 대해 생성된 항체 및 항체-유사 분자, 또는 항체 접합체 또는 페이로드(payload)를 형성하기 위하여 적어도 하나의 제제에 연결되는 폴리펩티드가 포함된다. 진단 또는 치료 제제로서 항체 분자의 효능을 증가시키기 위하여, 항체에 적어도 하나의 원하는 분자 또는 모이어티를 연결 또는 공유 결합 또는 복합체화시키는 것이 통상적이다. 그러한 연결된 분자 또는 모이어티는 적어도 하나의 이펙터 또는 리포터 분자일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 이펙터 분자는 원하는 활성, 예를 들어, 세포독성 활성을 가진 분자를 포함한다. 항체에 부착될 수 있는 이펙터 분자의 비제한적인 예는 독소, 치료 효소, 항생제, 방사성-라벨링된 뉴클레오티드 등을 포함한다. 대조적으로, 리포터 분자는 분석을 이용하여 검출될 수 있는 임의의 모이어티로서 정의된다. 항체에 접합될 수 있는 리포터 분자의 비제한적인 예는 효소, 방사성라벨, 합텐, 형광 라벨, 인광 분자, 화학발광 분자, 발색단, 발광 분자, 광친화성 분자, 착색 입자 또는 리간드, 예를 들어, 비오틴, 등을 포함한다. 항체를 접합체 분자 또는 모이어티에 부착하거나 접합시키기 위한 여러 방법이 본 기술분야에 알려져 있다. 일부 부착 방법은 비제한적인 예로서 항체에 부착된 디에틸렌트리아민펜타아세트산 안하이드라이드(DTPA); 에틸렌트리아민테트라아세트산; N-클로로-p-톨루엔설폰아미드; 및/또는 테트라클로로-3-6α-디페닐글리코우릴-3과 같은 유기 킬레이팅 제제를 이용하는, 금속 킬레이트 착물의 사용에 관련된다. 항체, 특히 본 명세서에 개시된 단일클론 항체는 또한 글루타르알데히드 또는 페리오데이트와 같은 커플링제의 존재하에서 효소와 반응될 수 있다. 플루오르세인 마커를 가진 접합체는 통상적으로 이들 커플링제의 존재하에서 또는 이소티오시아네이트와의 반응에 의해 제조된다. 다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 항-glycPD-L1 항체, 특히 그의 결합 단편은 투여 후 혈장, 혈청 또는 혈액에서의 생체내 반감기를 증가시키기 위하여, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)와 같은 화합물 또는 물질에 커플링되거나 연결될 수 있다.
구체적 실시양태에서 본 발명은 비-당화 PD-L1 단백질에 비하여 당화 PD-L1 단백질에 특이적으로 그리고 우선적으로 결합하는, 단일클론 항체와 같은 항체를 제공한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 예를 들어, 서열 번호 1에 개시된, PD-L1 단백질의 아미노산 서열의 위치 N35, N192, N200 및/또는 N219에서 당화되는 PD-L1 단백질에 특이적으로 또는 우선적으로 결합한다. 대안적으로, 항-glycPD-L1 항체는 3차원 공간에서 N35, N192, N200 또는 N219 중 하나 이상에 인접하게 결합하며, 예를 들어, 당화 잔기 또는 잔기들을 마스크하거나 차단할 수 있다. 예를 들어, 항-glycPD-L1 항체의 특이적 또는 선택적 결합은 비당화 PD-L1에 대하여 나타내진 Kd의 절반보다 적은 Kd로 PD-L1 항원에 항체가 결합하는 것에 관련된다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 비당화 PD-L1에 대하여 나타내진 Kd 보다 적어도 5분의 1 이하의 Kd로 당화 PD-L1 단백질에 결합한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 비당화 PD-L1에 대하여 나타내진 Kd 보다 적어도 10분의 1 이하의 Kd로 당화 PD-L1 단백질에 결합한다. 실시양태에서, 실시예 5에 개시된 세포 유동세포측정 결합 분석에서, 항체는 비당화 PD-L1을 발현하는 세포에의 결합을 위한 MFI 보다 1.5 배, 2 배, 3, 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배 또는 10 배 더 큰 WT PD-L1 발현 세포에의 MFI로서 표현되는 결합을 나타낸다.
구체적 실시양태는 항-glycPD-L1 단일클론 항체 STM004인, 당화 PD-L1에 대해 특이적인 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다. 다른 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 본 명세서에서 서열 번호 1에서 개시된 인간 PD-L1 아미노산 서열의 위치 Y56, K62 및 K75의 아미노산 잔기에 해당하는 PD-L1 상의 에피토프에 특이적으로 결합한다. STM004는 PD-L1 내의 비-연속 아미노산에 결합하며 에피토프는 형태적 에피토프이다. STM004 MAb 에피토프를 포함하는 인간 PD-L1 폴리펩티드의 부분은 서열 LDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQH(서열 번호 93)을 갖는다. 본 명세서에 나타난 대로, MAb STM004에 의해 인식되는 에피토프를 구성하는 아미노산 잔기 Y56, K62 및 K75는 밑줄 표시된다.
다른 구체적인 실시양태는 항-glycPD-L1 단일클론 항체 STM115인, 당화 PD-L1에 대해 특이적인 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다. 다른 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 본 명세서에서 서열 번호 1에서 개시된 인간 PD-L1 아미노산 서열의 위치 K62, H69 및 K75의 아미노산 잔기에 해당하는 PD-L1 상의 에피토프에 특이적으로 결합한다. STM115 MAb 에피토프를 포함하는 인간 PD-L1 폴리펩티드의 부분은 서열 번호 1 내의 서열 DKNIIQFVHGEEDLKVQH를 갖는다. 본 명세서에 나타난 대로, MAb STM115에 의해 인식되는 에피토프를 구성하는 아미노산 잔기 K62, H69 및 K75는 밑줄 표시된다.
STM004 MAb의 중쇄 및 경쇄 가변(V) 도메인의 핵산(DNA) 및 상응하는 아미노산 서열이 하기 표 3에 나타난다. 표 3은 STM004의 성숙(즉, 시그널 펩티드 함유하지 않음) VH 및 VL 도메인의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열(각각 서열 번호 2, 3, 10, 및 11) 및 시그널 펩티드를 함유한 VH 및 VL 도메인 서열(각각 서열 번호 85, 86, 87, 및 88)을 제공한다. 표 3에 나타난 시그널 서열 함유 중쇄 및 경쇄 도메인의 중쇄 DNA 및 단백질 V 도메인 서열에서, 아미노 말단 시그널 서열(각각 VH 도메인의 뉴클레오티드 1-57 및 아미노산 1-19 및 VL 도메인의 뉴클레오티드 1-60 및 아미노산 1-20)이 이탤릭체로 나타난다. 또한 표 3에서 카밧 및 초티아 넘버링 정의 둘 모두를 이용하여, STM004 MAb 중쇄 및 경쇄 V 도메인 CDR이 나타난다.
실시양태에서, 당화 PD-L1에 특이적으로 그리고 우선적으로 결합하는 항-glycPD-L1 항체는 서열 번호 3의 VH 도메인 및 서열 번호 11의 VL 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 서열 번호 3의 VH 도메인 및 서열 번호 11의 VL 도메인을 포함하는 항체와 당화 PD-L1에의 특이적 결합을 위해 경쟁한다. 실시양태에서, 당화 PD-L1에 특이적으로 그리고 우선적으로 결합하는 항-glycPD-L1 항체는 각각 서열 번호 4, 서열 번호 6, 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 가진 초티아 CDR 1-3, 또는 각각 서열 번호 5, 서열 번호 7, 및 서열 번호 9의 아미노산 서열을 가진 카밧 CDR 1-3, 또는 그 조합을 포함하는 VH 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 각각 서열 번호 4, 서열 번호 6, 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 가진 초티아 CDR 1-3, 또는 각각 서열 번호 5, 서열 번호 7, 및 서열 번호 9의 아미노산 서열을 가진 카밧 CDR 1-3, 또는 그 조합을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항체와 당화 PD-L1에의 특이적 결합을 위해 경쟁한다. 실시양태에서, 당화 PD-L1에 특이적으로 그리고 우선적으로 결합하는 항-glycPD-L1 항체는 각각 서열 번호 12, 서열 번호 14, 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 가진 CDR 1-3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 각각 서열 번호 12, 서열 번호 14, 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 가진 CDR 1-3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 항체와 당화 PD-L1에의 특이적 결합을 위해 경쟁한다. 실시양태에서, 당화 PD-L1에 특이적으로 그리고 우선적으로 결합하는 항-glycPD-L1 항체는 (a) 각각 서열 번호 4, 서열 번호 6, 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 가진 초티아 CDR 1-3, 또는 각각 서열 번호 5, 서열 번호 7, 및 서열 번호 9의 아미노산 서열을 가진 카밧 CDR 1-3, 또는 그 조합을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) 각각 서열 번호 12, 서열 번호 14, 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 가진 CDR 1-3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 상기에 개시한 VH 및 VL 도메인 및 그안의 CDR을 포함하는 항체와 당화 PD-L1에의 특이적 결합을 위해 경쟁한다.
실시양태에서, 당화 PD-L1에 특이적으로 결합하는 항-glycPD-L1 항체는 서열 번호 3의 아미노산 서열에 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 VH 도메인 및/또는 서열 번호 11의 아미노산 서열에 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 VL 도메인을 포함하며, PD-1에의 당화 PD-L1의 결합을 억제하거나 차단한다. 실시양태에서, 당화 PD-L1에 특이적으로 그리고 우선적으로 결합하는 항-glycPD-L1 항체는 CDR 1-3을 포함하는 VH 도메인을 포함하며, 적어도 1, 2, 또는 모든 3 CDR은 각각 서열 번호 4, 서열 번호 6, 및 서열 번호 8의 아미노산 서열 또는 각각 서열 번호 5, 서열 번호 7, 및 서열 번호 9의 아미노산 서열에 대하여 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5 아미노산 치환을 가지며, 항-glycPD-L1 항체는 PD-1에의 당화 PD-L1의 결합을 차단한다. 실시양태에서, 당화 PD-L1에 특이적으로 그리고 우선적으로 결합하는 항-glycPD-L1 항체는 CDR 1-3을 포함하는 VL 도메인을 포함하며, 적어도 1, 2, 또는 모든 3 CDR은 각각 서열 번호 12, 서열 번호 14, 및 서열 번호 16의 아미노산 서열에 대하여 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5 아미노산 치환을 가진다. 실시양태에서, 당화 PD-L1에 특이적으로 그리고 우선적으로 결합하는 항-glycPD-L1 항체는 (a) CDR 1-3을 포함하며, 적어도 1, 2, 또는 모든 3 CDR은 각각 서열 번호 4, 서열 번호 6, 및 서열 번호 8의 아미노산 서열 또는 각각 서열 번호 5, 서열 번호 7, 및 서열 번호 9의 아미노산 서열에 대하여 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5 아미노산 치환을 가지는 VH 도메인; 및 (b) CDR 1-3을 포함하며, 적어도 1, 2, 또는 모든 3 CDR은 각각 서열 번호 12, 서열 번호 14, 및 서열 번호 16의 아미노산 서열에 대하여 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5 아미노산 치환을 가지는 VL 도메인을 포함하며, 항체는 PD-1에의 당화 PD-L1의 결합을 차단한다. 또한 본 발명은 AbM, 컨택 또는 IMGT 정의된 CDR을 이용하여, 인간 골격 영역 및 선택적으로 인간 불변 도메인을 가진, STM004의 인간화 형태를 제공한다.
전술한 항-glycPD-L1 항체는 비당화 PD-L1에 대해 나타내진 Kd의 절반 보다 적은 Kd로 당화 PD-L1에 결합한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 비당화 PD-L1에 대해 나타내진 Kd 보다 5분의 1 이하의 Kd로 당화 PD-L1 단백질에 결합한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 비당화 PD-L1에 대해 나타내진 Kd 보다 적어도 10분의 1 이하의 Kd로 당화 PD-L1 단백질에 결합한다. 실시양태에서, 당화 PD-L1에 대한 항-glycPD-L1 항체의 결합 친화성은 하한 및 상한 값을 포함하여 5-20 nM 또는 5-10 nM이다. 실시양태에서, 실시예 5에 개시된 세포 유동세포측정 결합 분석에서, 항체는 비당화 PD-L1을 발현하는 세포에의 결합을 위한 MFI보다 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배 또는 10 배 더 큰 WT PD-L1 발현 세포에의 MFI로서 표현되는 결합을 나타낸다.
실시양태에서, 항체는 PD-1와 PD-L1의 상호작용을 억제하며, 특히 이펙터 T-세포에 의해 발현된 PD-1과 종양 세포에 의해 발현된 PD-L1, 특히 당화 PD-L1의 상호작용을 억제한다.
다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 항-glycPD-L1 단일클론 항체 STM115인, 당화 PD-L1에 특이적으로 그리고 우선적으로 결합하는 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다. STM115 MAb의 성숙 중쇄 및 경쇄 가변(V) 도메인의 핵산(DNA) 및 상응하는 아미노산 서열(서열 번호 18, 19, 26 및 27)이 하기 표 3에서 나타난다. 프로세싱되지 않은 중쇄 및 경쇄 V 도메인 서열(즉, N-말단에 시그널 서열을 함유하는 서열)의 DNA 및 아미노산 서열이 또한 표 3에 나타나며(서열 번호 89, 90, 91 및 92), 아미노 말단 시그널 서열은 이탤릭체로 표시된다(VH 도메인의 뉴클레오티드 1-57 및 아미노산 1-19 및 VL 도메인의 뉴클레오티드 1-66 및 아미노산 1-22). 카밧 및 초티아 정의 둘 모두에 따른, STM115 MAb 중쇄 및 경쇄 V 도메인 CDR이 또한 표 3에 나타난다.
실시양태에서, 당화 PD-L1에 특이적으로 그리고 우선적으로 결합하는 항-glycPD-L1 항체는 서열 번호 19의 아미노산 서열의 VH 도메인 및 서열 번호 27의 아미노산 서열의 VL 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 당화 PD-L1에의 특이적 결합을 위해 서열 번호 19의 아미노산 서열의 VH 도메인 및 서열 번호 27의 아미노산 서열의 VL 도메인을 포함하는 항체와 경쟁한다. 실시양태에서, 당화 PD-L1에 특이적으로 그리고 우선적으로 결합하는 항-glycPD-L1 항체는 각각 서열 번호 20, 서열 번호 22, 및 서열 번호 24의 아미노산 서열을 가진 초티아 CDR 1-3, 또는 각각 서열 번호 21, 서열 번호 23, 및 서열 번호 25의 아미노산 서열을 가진 카밧 CDR 1-3, 또는 그 조합을 포함하는 VH 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 당화 PD-L1에의 특이적 결합을 위해 각각 서열 번호 20, 서열 번호 22, 및 서열 번호 24의 아미노산 서열을 가진 초티아 CDR 1-3, 또는 각각 서열 번호 21, 서열 번호 23, 및 서열 번호 25의 아미노산 서열을 가진 카밧 CDR 1-3, 또는 그 조합을 포함하는 VH 도메인을 포함하는 항체와 경쟁한다. 실시양태에서, 당화 PD-L1에 특이적으로 그리고 우선적으로 결합하는 항-glycPD-L1 항체는 각각 서열 번호 28, 서열 번호 30, 및 서열 번호 32의 아미노산 서열을 가진 CDR 1-3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 당화 PD-L1에의 특이적 결합을 위해 각각 서열 번호 28, 서열 번호 30, 및 서열 번호 32의 아미노산 서열을 가진 CDR 1-3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 항체와 경쟁한다. 실시양태에서, 당화 PD-L1에 특이적으로 그리고 우선적으로 결합하는 항-glycPD-L1 항체는 (a) 각각 서열 번호 20, 서열 번호 22, 및 서열 번호 24의 아미노산 서열을 가진 초티아 CDR 1-3, 또는 각각 서열 번호 21, 서열 번호 23, 및 서열 번호 25의 아미노산 서열을 가진 카밧 CDR 1-3, 또는 그 조합을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) 각각 서열 번호 28, 서열 번호 30, 및 서열 번호 32의 아미노산 서열을 가진 CDR 1-3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 당화 PD-L1에의 특이적 결합을 위해 상기에 개시한 VH 및 VL 도메인 및 그안의 CDR을 포함하는 항체와 경쟁한다.
실시양태에서, 당화 PD-L1에 특이적으로 그리고 우선적으로 결합하는 항-glycPD-L1 항체는 서열 번호 19의 아미노산 서열에 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 VH 도메인 및 서열 번호 27의 아미노산 서열에 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 VL 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 당화 PD-L1에 특이적으로 그리고 우선적으로 결합하는 항-glycPD-L1 항체는 적어도 1, 2, 또는 모든 3 CDR이 각각 서열 번호 20, 서열 번호 22, 및 서열 번호 24의 아미노산 서열에 대하여 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5 아미노산 치환을 가진 CDR 1-3, 또는 각각 서열 번호 21, 서열 번호 23, 및 서열 번호 25의 아미노산 서열을 가진 CDR 1-3, 또는 그 조합을 포함하는 VH 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 당화 PD-L1에 특이적으로 그리고 우선적으로 결합하는 항-glycPD-L1 항체는 적어도 1, 2, 또는 모든 3 CDR이 각각 서열 번호 28, 서열 번호 30, 및 서열 번호 32의 아미노산 서열에 대하여 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5 아미노산 치환을 가진 CDR 1-3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 실시양태에서, 당화 PD-L1에 특이적으로 그리고 우선적으로 결합하는 항-glycPD-L1 항체는 (a) CDR 1-3을 포함하며, 적어도 1, 2, 또는 모든 3 CDR이 각각 서열 번호 20, 서열 번호 22, 및 서열 번호 24의 아미노산 서열에 대하여 또는 각각 서열 번호 21, 서열 번호 23, 및 서열 번호 25의 아미노산 서열 또는 그 조합에 대하여 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5 아미노산 치환을 가진 VH 도메인; 및/또는 (b) CDR 1-3을 포함하며 적어도 1, 2, 또는 모든 3 CDR이 각각 서열 번호 28, 서열 번호 30, 및 서열 번호 32의 아미노산 서열에 대하여 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5 아미노산 치환을 가진 VL 도메인을 포함한다. 또한 본 발명은 AbM, 컨택 또는 IMGT 정의된 CDR을 이용하여, 인간 골격 영역 및 선택적으로 인간 불변 도메인을 가진, STM115의 인간화 형태를 제공한다.
실시양태에서, 전술한 항-glycPD-L1 항체는 비당화 PD-L1에 대해 나타내진 Kd의 절반 보다 적은 Kd로 당화 PD-L1에 결합한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 비당화 PD-L1에 대해 나타내진 Kd 보다 적어도 5분의 1 이하의 Kd로 당화 PD-L1에 결합한다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 비당화 PD-L1에 대해 나타내진 Kd 보다 적어도 10분의 1 이하의 Kd로 당화 PD-L1에 결합한다. 실시양태에서, 당화 PD-L1에 대한 STM115 MAb의 결합 친화성은 하한 및 상한 값을 포함하여 5-20 nM 또는 5-10 nM이다. 실시양태에서, 실시예 5에 개시된 세포 유동세포측정 결합 분석에서, 항체는 비당화 PD-L1을 발현하는 세포에의 결합을 위한 MFI보다 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배 또는 10 배 더 큰 WT PD-L1 발현 세포에의 MFI로서 표현되는 결합을 나타낸다. 이들 항-glycPD-L1 항체는 PD-1과 PD-L1의 상호작용을 억제하며, 특히 이펙터 T-세포에 의해 발현된 PD-1과 종양 세포에 의해 발현된 PD-L1, 특히 당화 PD-L1의 상호작용을 억제한다.
다른 실시양태는 종래의 경쟁 방법을 통해 분석할 때, 당화 PD-L1에 결합하며 당화 PD-L1에의 특이적 결합을 위해 본 명세서에 개시된 MAb STM004 또는 MAb STM115와 경쟁하거나 교차 경쟁하는 분리된 항-glycPD-L1 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다. 일 양태에서, MAb STM004 또는 MAb STM115와 동일한 에피토프에 결합하는 분리된 항체, 예를 들어, 단일클론 항체 또는 그의 결합 단편이 제공된다.
다른 실시양태는 서열 번호 1의 성숙 인간 PD-L1 폴리펩티드 서열 내에 위치된 LDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQH(서열 번호 93)으로부터 선택된 아미노산 서열 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 분리된 항-glycPD-L1 항체를 제공한다.
다른 실시양태는 서열 번호 1의 인간 PD-L1 단백질의 아미노산 잔기 Y56, K62 및 K75를 포함하는 에피토프에 결합하는 분리된 항-glycPD-L1 항체를 제공한다. 일 양태에서, 서열 번호 1의 하기 아미노산 잔기 Y56, K62, 또는 K75 중 적어도 하나를 포함하는 에피토프에서 당화 인간 PD-L1에 특이적으로 결합하는 분리된 항-glycPD-L1 항체가 제공된다. 다른 실시양태는 서열 번호 1의 인간 PD-L1 단백질의 아미노산 잔기 K62, H69 및 K75를 포함하는 에피토프에 결합하는 분리된 항-glycPD-L1 항체를 제공한다. 일 양태에서, 서열 번호 1의 하기 아미노산 잔기 K62, H69, 또는 K75 중 적어도 하나를 포함하는 에피토프에서 당화 인간 PD-L1에 특이적으로 결합하는 분리된 항-glycPD-L1 항체가 제공된다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 PD-L1, 즉, 당화 인간 PD-L1의 에피토프 영역(들)을 구성하는 아미노산 잔기 중 적어도 둘, 적어도 셋, 또는 넷과 접촉한다.
또 다른 실시양태는 서열 번호 1의 L48 내지 H78의 아미노산 영역 이내 또는 D61 내지 H78의 아미노산 영역 이내의 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 에피토프에서 당화 인간 PD-L1에 특이적으로 결합하는 분리된 항-glycPD-L1 항체를 제공한다. 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 1의 L48 내지 H78의 아미노산 영역 이내의 하기 아미노산 잔기 그룹 Y56, K62, K75를 포함하는 에피토프에서 당화 인간 PD-L1에 특이적으로 결합하는 분리된 항-glycPD-L1 항체를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 1의 L48 내지 H78의 아미노산 영역 이내 또는 D61 내지 H78의 아미노산 영역 이내의 하기 아미노산 잔기 그룹 K62, H69, K75을 포함하는 에피토프에서 당화 인간 PD-L1에 특이적으로 결합하는 분리된 항-glycPD-L1 항체를 제공한다.
또 다른 실시양태는 서열 번호 2 또는 18에 적어도 90-98% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 항-glycPD-L1 VH 도메인을 인코딩하고/하거나 각각 서열 번호 10, 또는 26에 적어도 90-98% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 항-glycPD-L1 항체 VL 도메인을 인코딩하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 실시양태에서, VH 및/또는 VL 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호 2 또는 18, 또는 서열 번호 10 또는 26에 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일하다.
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
표 3. 항- glycPD -L1 MAb의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열
질병 치료
일부 양태에서, 본 명세서의 실시양태에서 개시된 항체 또는 그의 항원 결합 단편(예를 들어, 당화 PD-L1에 특이적으로 그리고 우선적으로 결합하며 PD-1에의 항-PD-L1의 결합을 차단하거나 억제하는 항체)는 암을 치료하기 위해 치료 방법에서 사용되고 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명은 암을 치료하기 위하여 본 명세서에 개시된 적어도 하나의 항-glycPD-L1 항체의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하여 암을 치료하는 방법을 제공한다. 개체는 바람직하게는 인간 환자이다. 본 명세서에 개시된 대로, 치료 또는 치료적 치료는 환자에서 암세포의 성장, 증식, 이동 등의 감소, 방지, 억제 또는 차단, 및 특히 세포 사멸 또는 어팝토시스의 촉진에 관련된다. 개시된 방법은 치료를 받고 있는 개체, 바람직하게는 인간 환자에게, T-세포, 특히 킬러 또는 세포독성 T-세포와 같은 면역 이펙터 세포의 세포 표면 상에 발현된 PD-1과 결합/상호작용할 수 있는 PD-L1 세포 표면 단백질을 발현하는 개체의 종양 세포와 특히 관련하여, 이득을 제공한다.
본 명세서에 개시된 항-glycPD-L1 항체 중 적어도 하나의 유효량을 이용한 이들 개체의 치료는 항체(들)이 종양 세포 상의 당화 PD-L1에 결합하고 PD-1-발현 T 세포와 PD-L1-발현 종양 세포의 상호작용을 방지, 차단 또는 억제하여, T-세포 활성의 면역억제를 방지하거나 회피하고 T 세포가 활성화되어 PD-L1-보유 종양 세포를 사멸하도록 할 것으로 예상된다. 따라서, 제공되는 방법은 본 방법의 실시에 의해 이루어지는 항암 결과를 필요로 하거나, 그로부터 이득을 볼 수 있거나, 그 이득을 보기를 원하는 개체를 위해 유익하다. 치료적 유효량의 적어도 하나의 항-glycPD-L1 항체의 투여에 관련된 방법의 치료적 이득을 원하거나, 또는 그러한 치료적 이득을 받는 개체는 본 기술분야에 이점을 제공한다. 또한, 본 방법은 부작용, 불리한 결과, 금기 등을 제거하거나 회피하거나, 또는 다른 치료 및 치료 양식과 비교하여 그러한 문제가 발생할 위험 또는 가능성을 감소시키는 추가의 이점을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 본 명세서에 개시된 둘 이상의 상이한 항-glycPD-L1 항체의 투여를 포함한다. 항-glycPD-L1 항체의 공동-투여는 어느 항체 단독의 투여 보다 치료적 또는 예방적으로 더욱 효과적이고/이거나 어느 항체 단독보다 낮은 투여량 또는 낮은 빈도로 투여하는 것을 허용할 수 있다.
본 치료 방법이 유용한 암은 고형 종양 또는 혈액 종양에서 발견되는 것과 같은 임의의 악성 세포 타입을 포함한다. 일반적으로, 종양은 임의의 크기의 악성 또는 잠재적 악성 신생물 또는 조직 덩어리를 말하며, 원발성 종양 및 이차 종양을 포함한다. 고형 종양은 보통은 낭종 또는 액체를 함유하지 않는 비정상 조직 덩어리 또는 성장물이다. 예시적인 고형 종양은 췌장, 담낭, 결장, 맹장, 위, 뇌, 머리, 목, 난소, 고환, 신장, 후두, 육종, 폐, 방광, 흑색종, 전립선, 및 유방으로 이루어지는 군으로부터 선택된 기관의 종양을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 예시적인 혈액 종양은 골수의 종양, T 또는 B 세포 악성종양, 백혈병, 림프종, 모세포종, 골수종 등을 포함한다. 본 발명에서 제공되는 방법을 이용하여 치료될 수 있는 암의 추가의 예는 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 백혈병, 편평세포암, 폐암(소-세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암 및 폐의 편평상피암 포함), 복막의 암, 간세포 암, 위장 또는 위 암(위장관암 및 위장관 기질 암 포함), 췌장암, 담낭암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘암종, 신장 또는 콩팥 암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 다양한 타입의 두경부암, 흑색종, 표재 확장성 흑색종, 흑색점 악성 흑색종(lentigo malignant melanoma), 말단 흑자 흑색종(acral lentiginous melanomas), 결절성 흑색종, 및 B-세포 림프종(저 등급/여포성 비-호지킨 림프종(follicular non-Hodgkin's lymphoma)(NHL); 소형 림프구성(SL) NHL; 중간 등급/여포성 NHL; 중간 등급 확산(intermediate grade diffuse) NHL; 고 등급 면역아세포 NHL; 고 등급 림프아구 NHL; 고 등급 비-절단 소세포 NHL; 벌키 질병(bulky disease) NHL; 외투 세포 림프종(mantle cell lymphoma); AIDS-관련 림프종; 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 포함), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 림프구성 백혈병(ALL), 모양 세포 백혈병, 다발성 골수종, 급성 골수성 백혈병(AML) 및 만성 골수성 백혈병을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
암은 구체적으로 하기의 조직학적 타입일 수 있으나, 이들로 제한될 필요는 없다: 악성 신생물; 암종; 미분화 암종; 거대 및 방추 세포 암종; 소세포 암종; 유두상 암종; 편평세포 암종; 림프상피종; 기저 세포 암종; 모기질 암종; 이행 세포 암종; 유두상 이행 세포 암종; 선암종; 악성 가스트린종; 담관암종; 간세포 암종; 혼합 간세포 암종 및 담관암종; 육주상 선암종; 샘낭 암종; 선종성 폴립 내의 선암종; 선암종, 가족성 용종증(familial polyposis coli); 고형 암종; 악성 칼시노이드 종양(carcinoid tumor); 기관지-폐포 선암종; 유두상 선암종; 혐색소성 암종; 호산성 암종; 호산세포성 선암종; 호염기성 암종; 투명 세포 선암종; 과립 세포 암종; 여포성 선암종; 유두상 및 여포성 선암종; 비피낭 경화성 암종; 부신 피질 암종; 자궁내막양 난소암; 피부 부속물 암종; 아포크린 선암종; 피지의 선암종; 귀지 선암종; 점액표피모양 암종; 낭선암종; 유두상 낭선암종; 유두상 장액성 낭선암종; 점액성 낭선암종; 점액성 선암종; 반지 세포 암종; 침윤성 도관 암종; 수질 암종; 소엽 암종; 염증형 암종; 파제트 병(Paget's disease), 유방성; 선방 세포 암종; 선편평세포 암종; 편평상피화생을 동반한 선암종; 악성 흉선종; 악성 난소 기질 종양; 악성 협막세포종; 악성 과립막 세포 종양; 악성 남성모세포종;세르톨리(sertoli) 세포 암종; 악성 라이디히(leydig) 세포 종양; 악성 지질 세포 종양; 악성 부신경절종; 악성 유선밖 부신경절종(extra-mammary paraganglioma); 갈색세포종; 사구맥관육종; 악성 흑색종; 무흑색소성 흑색종; 표재 확장성 흑색종; 거대 색소 모반 내의 악성 흑색종; 유상피 세포 흑색종; 악성 청색 모반; 육종; 섬유육종; 악성 섬유성 조직구증; 점액육종; 지방육종; 평활근육종; 횡문근육종; 배아형 횡문근육종; 포상 횡문근육종; 간질성 육종; 악성 혼합 종양; 뮬러관 혼합 종양(mullerian mixed tumor); 신아세포종; 간아세포종; 암육종; 악성 간엽세포종;악성 브레너 종양(brenner tumor); 악성 엽상 종양; 활막 육종; 악성 중피종;미분화배세포종; 배아 암종; 악성 기형종; 악성 난소갑상선종; 융모막암종; 악성 중신종; 혈관육종; 악성 혈관내피종; 카포시 육종; 악성 혈관주위세포종; 림프관육종; 골육종; 측피질 골육종(juxtacortical osteosarcoma); 연골육종; 악성 연골모세포종; 간엽성 연골육종; 골거대세포종양; 유잉 육종(Ewing's sarcoma); 악성 치성 종양;법랑아세포육종(amyeloblastic odontosarcoma); 악성 법랑모세포종; 사기질모세포 섬유육종; 악성 송과체부종양; 척색종; 악성 신경교종; 상의세포종; 성상세포종; 원형질성 성상세포종; 원섬유성 성상세포종; 성아세포종; 교모세포종; 핍지교종; 핍지모세포종; 원시신경 외배엽; 소뇌 육종; 신경절아세포종; 신경아세포종; 망막아세포종; 후각 신경성 종양(olfactory neurogenic tumor); 악성 뇌수막종; 신경섬유육종; 악성 신경집종; 악성 과립세포 종양; 악성 림프종; 호지킨 병; 파라육아종(paragranuloma); 소형 림프구성 악성 림프종; 미만성 거대 세포 악성 림프종(malignant lymphoma, large cell, diffuse); 여포성 악성 림프종; 균상 식육종; 기타 명시된 비-호지킨 림프종; 악성 조직구증; 다발성 골수종; 비만 세포 육종; 면역증식성 소장 질병(immunoproliferative small intestinal disease); 백혈병; 림프성 백혈병; 형질세포성 백혈병; 적백혈병; 림프육종 세포 백혈병; 골수성 백혈병; 호염기성 백혈병; 호산구성 백혈병; 단구성 백혈병; 비만 세포성 백혈병;거대핵세포성 백혈병; 골수성 육종; 및 모양세포성 백혈병.
치료될 암은 바람직하게는 PD-L1, 특히 당화 PD-L1에 대해 양성이다. 일부 실시양태에서, 종양 세포는 또한 예를 들어, 유방암의 경우, EGFR 또는 HER2/neu 발현과 같은 종양 세포 마커에 대해 양성이다. 이들 마커의 존재 또는 부재는 본 명세서에 개시된 이중 기능 항-glycPD-L1 항체와 조합된, EGFR 양성 암을 위한 제피티닙 또는 HER2/neu 양성 암을 위한 허셉틴과 같은 티로신 키나제 억제제와 같은 표적화된 치료제와의 조합 치료법을 나타낼 수 있다. 따라서, 일부 실시양태는 암에 걸린 개체에서 당화 PD-L1 및 EGFR과 같은 두번째 암 마커에 대해 양성인 암을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 두번째 암 마커를 표적화하는 암 치료제, 예를 들어, 제피티닙과 같은 EGFR 티로신 키나제 억제제와 조합하여 본 명세서에 개시된 항-glycPD-L1 항체를 투여하는 것을 포함한다. 그러한 조합은 부작용, 독성 등의 감소를 비롯한 치료 효능 개선을 야기할 수 있다. 일부 실시양태에서, 암은 BLBC이다.
치료법의 선택을 가이드하거나 치료법을 모니터하기 위하여 암을 규명하기 위해 사용될 수 있는 다른 마커는 비-소세포 폐암 및 역형성 대세포 림프종에서의 ALK 유전자 재배열 및 과발현; 간암 및 생식세포 종양을 위한 알파-태아단백질(AFP); 다발성 골수종, 만성 림프구성 백혈병 및 일부 림프종을 위한 베타-2-마이크로글로불린(B2M); 융모막암종 및 생식세포 종양을 위한 베타-인간 융모성 고나도트로핀(베타-hCG); 난소암 및 유방암을 위한 BRCA1 및 BRCA2 유전자 돌연변이; 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병 및 급성 골수성 백혈병을 위한 BCR-ABL 융합 유전자(필라델피아 염색체(Philadelphia chromosome)); 피부 흑색종(cutaneous melanoma) 및 대장암을 위한 BRAF V600 돌연변이; 위장관 기질 종양 및 점막 흑색종을 위한 C-kit/CD117; 유방암을 위한 CA15-3/CA27.29; 췌장암, 담낭암, 담관암 및 위암을 위한 CA19-9; 난소암을 위한 CA-125; 갑상선수질암을 위한 칼시토닌; 대장암 및 일부 다른 암을 위한 암배아 항원(CEA); 비-호지킨 림프종을 위한 CD20; 신경내분비 종양을 위한 크로모그라닌(Chromogranin) A(CgA); 방광암을 위한 염색체 3, 7, 17, 및 9p21; 폐암을 위한 시토케라틴 단편 21-1; 비-소세포 폐암을 위한 EGFR 유전자 돌연변이 분석; 유방암을 위한 에스트로겐 수용체(ER)/프로게스테론 수용체(PR); 방광암을 위한 피브린/피브리노겐; 난소암을 위한 HE4; 유방암, 위암 및 위식도접합부 선암종을 위한 HER2/neu 유전자 증폭 또는 단백질 과발현; 다발성 골수종 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증을 위한 면역글로불린; 대장암 및 비-소세포 폐암을 위한 KRAS 유전자 돌연변이 분석; 생식세포 종양, 림프종, 백혈병, 흑색종 및 신경아세포종을 위한 락테이트 디하이드로게나제; 소세포 폐암 및 신경아세포종을 위한 신경-특이적 에놀라제(NSE); 방광암을 위한 핵 매트릭스 단백질 22; 전립선암을 위한 전립선-특이적 항원(PSA); 갑상선암을 위한 티로글로불린; 및 유방암을 위한 유로키나제 플라스미노겐 활성자(uPA) 및 플라스미노겐 활성자 억제제(PAI-1)을 포함한다.
단일클론 항체와 같은 항-glycPD-L1 항체는 다양한 양식에서 항종양 제제로서 사용될 수 있다. 구체적 실시양태는 항종양 제제로서 항체를 이용하는 방법에 관련되며, 따라서 종양 세포 성장을 차단하거나 억제하기에 충분한 기간 동안, 항체 또는 항체를 함유하는 조성물의 치료적 유효량과 종양 세포 집단을 접촉시키는 것을 포함한다. 실시양태에서, 생체내에서 종양 세포와 접촉하는 것은 필요로 하는 환자에게 예를 들어, 정맥내, 피하, 복강내, 또는 종양내 주사에 의해, 본 명세서에 개시된 항-glycPD-L1 항체를 포함하는 생리학적 허용 조성물의 치료적 유효량을 투여함으로써 이루어진다. 항체는 주사에 의해 또는 시간에 걸친 점진적 주입에 의해 비경구로 투여될 수 있다. 유용한 투여 및 전달 요법은 정맥내, 복강내, 경구, 근육내, 피하, 강내(intracavity), 경피, 피부, 연동 수단(peristaltic means), 또는 종양 세포를 함유하는 조직 내로의 직접 주사를 포함한다.
항체를 포함하는 치료 조성물은 통상적으로 예를 들어, 단위 투여량의 주사에 의해서와 같이, 정맥내 투여된다. 치료 조성물과 관련하여 사용될 경우 용어 "단위 투여량"은 개체를 위한 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 구별되는 단위를 말하며, 각 단위는 요구되는 희석제, 즉, 담체 또는 비히클과 연합하여 원하는 치료 효과를 생산하기 위해 계산된 소정의 양의 활성 물질을 함유한다. 항-glycPD-L1 항체 함유 조성물은 투약 제형과 양립성인 방식으로 그리고 치료적 유효량으로 투여된다. 투여될 양은 치료될 개체, 활성 성분을 이용하는 개체의 시스템의 능력, 및 원하는 치료 효과의 정도에 의존한다. 투여되는데 요구되는 활성 성분의 정확한 양은 실무자의 판단에 의존하며 각 개인에 특유하다. 하지만, 전신 적용을 위한 적합한 투여량 범위가 본 명세서에 개시되며 투여 경로에 의존한다. 초기 및 부스터(booster) 투여를 위한 적합한 요법이 또한 고려되며 전형적으로는 초기 투여 후 후속 주사 또는 다른 투여에 의한 하나 이상의 간격(시간)의 반복된 투여량에 관련될 수 있다. 예시적인 다중 투여는 연속적으로 항체의 높은 혈청 및 조직 수준을 유지하는데 적합하다. 대안적으로, 생체내 치료법을 위해 특정된 범위 내의 혈중 농도를 유지하기에 충분한 연속적 정맥내 주입이 고려된다.
본 명세서에 개시된 항-glycPD-L1 항체는 국소적으로 진행되거나 전이성인 암을 가진 암 환자에서 종양 세포 성장을 억제하거나 암 세포를 사멸하는 것과 같이, 질병을 치료하기 위하여 전신성으로 또는 국소적으로 투여될 수 있음이 고려된다. 항체는 단독으로 또는 항-증식성 약물 또는 항암 약물과 조합되어 투여될 수 있다. 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 수술 또는 다른 절차 이전에 환자에서 암 크기를 감소시키기 위하여 투여된다. 대안적으로, 그들은 임의의 남아 있는 암(예를 들어, 수술이 제거하지 못한 암)의 크기 또는 성장 능력이 감소되고/되거나 생존하지 못하도록 하기 위하여 수술 후 주기적인 간격으로 투여될 수 있다. 상기에서 기재된 바와 같이, 항체의 치료적 유효량은 원하는 효과를 이루기 위해 계산된 소정의 양이다. 따라서, 항-glycPD-L1 항체의 투여를 위한 투여량 범위는 종양 세포 분열 및 세포 사이클링의 증상이 감소되는 원하는 효과를 생산하기에 충분히 큰 범위이다. 적절하게는, 투여량은 과점도 증후군, 폐 부종, 울혈성 심부전, 신경학적 영향 등과 같은 부작용을 야기할 정도로 커서는 안된다. 일반적으로, 투여량은 환자의 연령, 병태, 크기 및 성별 및 질병의 정도에 따라 변할 것이며, 의료 실무자 또는 임상의와 같은 당업자가 결정할 수 있다. 물론, 투여량은 임의의 합병증의 발생시에는 개별 의사에 의해 조정될 수 있다.
치료 방법
일부 실시양태에서, 개시된 조성물과 방법은 본 명세서에 개시된 항-glycPD-L1 항체를 단독으로 또는 두번째 또는 추가의 약물 또는 치료법과 조합하여 투여하는 것에 관련된다. 그러한 약물 또는 치료법은 PD-L1 또는 당화 PD-L1과 연합되는, 바람직하게는 인간 PD-L1 또는 당화 인간 PD-L1과 인간 PD-1의 상호작용과 연합되는 임의의 질병의 치료에서 적용될 수 있다. 예를 들어, 질병은 암일 수 있다. 비당화 PD-L1 또는 변이체 당화 PC-L1에 비하여 당화 PD-L1 단백질에 우선적으로 결합하는 적어도 하나의 항-PD-L1 항체를 포함하는 조성물 및 방법은 특히 PD-1/PD-L1 상호작용을 방지, 감소, 차단 또는 억제하여, 치료 효과 및 치료를 제공함으로써, 암 또는 다른 질병의 치료에서 치료 또는 예방 효과를 갖는다.
조합 치료법을 비롯한, 본 조성물 및 방법은 치료 또는 예방 효과를 가지며 치료 또는 예방 효과를 향상시키고/시키거나 다른 항암 또는 항-과증식 치료법의 치료 효과를 증가시킬 수 있다. 치료 및 예방 방법 및 조성물은 암세포의 사멸 및/또는 세포 과증식의 억제와 같은 원하는 효과를 이루기에 효과적인 조합된 양으로 제공될 수 있다. 이 과정은 항-glycPD-L1 항체 또는 그의 결합 단편과 두 번째 치료제를 투여하는 것에 관련될 수 있다. 두 번째 치료법은 직접적인 세포독성 효과를 갖거나 갖지 않을 수 있다. 예를 들어, 두 번째 치료법은 직접적인 세포독성 효과없이 면역계를 상향조절하는 제제일 수 있다. 조직, 종양 및/또는 세포는 조직, 종양 및/또는 세포는 제제(예를 들어, 항체 또는 항암제) 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 조성물 또는 약리학적 제형(들)에 노출될 수 있으며, 또는 조직, 종양 및/또는 세포를 둘 이상의 구별되는 조성물 또는 제형에 노출시킬 수 있으며, 이때 하나의 조성물은 예를 들어, 1) 항체, 2) 항암제, 3) 항체와 항암제 둘 모두, 또는 4) 둘 이상의 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 두 번째 치료법은 또한 항- PD-L1 항체, 바람직하게는 비당화 PD-L1에 비하여 당화 PD-L1에 우선적으로 결합하는 항-glycPD-L1 항체이며, 또는 다른 실시양태에서는 항-PD-1 항체이다. 제한없이, 예시적인 항-PD-1 항체는 펨브로리주맙 및 니보루맙을 포함하며; 예시적인 항-PD-L1 항체는 아테조리주맙을 포함한다. 또한, 그러한 조합 치료법은 화학요법, 방사선요법, 수술 치료법 또는 면역요법과 함께 사용될 수 있다.
예를 들어, 세포에 적용될 경우, 용어 "접촉되다" 및 "노출되다"는 특히 종양 또는 암세포의 표면 상에 발현되거나 고도로 발현된, 표적 항원, 예를 들어, PD-L1, 특히, 당화 PD-L1에 특이적으로 결합하기 위하여, 치료 폴리펩티드, 바람직하게는 본 명세서에 개시된 항-glycPD-L1 항체가 표적 세포에 전달되거나 표적 세포와 직접 병렬배치로 위치되는 과정을 설명하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 치료 항-glycPD-L1 항체 또는 그의 결합 단편에 의한 그러한 결합은 종양 또는 암세포-발현된 PD-L1과 이펙터 T-세포 상의 PD-1의 상호작용을 방지, 차단, 억제 또는 감소시켜, PD-L1/PD-1 상호작용과 연합된 면역억제를 방지한다. 실시양태에서, 화학요법 또는 방사성요법 제제가 또한 항-glycPD-L1 항체 또는 그의 결합 단편과 함께 개체에게 투여되거나 전달된다. 세포 사멸을 이루기 위하여, 예를 들어, 하나 이상의 제제가 세포를 사멸시키거나 세포 분열을 방지하는데 효과적인 조합된 양으로 세포에게 전달된다.
항-glycPD-L1 항체는 다른 항암 치료에 대하여 이전에, 그 동안에, 그 후에 또는 다양한 조합으로 투여될 수 있다. 투여는 동시 내지 서로 수분 내지 수일에서 수주 이전 또는 이후 범위의 간격일 수 있다. 항체가 항암제와 별도로 환자에게 제공되는 실시양태에서, 일반적으로 각각의 전달 시간 사이에 상당한 기간이 경과하지 않아서 투여된 화합물이 여전히 환자를 위해 유익하게 조합된 효과를 나타낼 수 있도록 할 것이다. 예시적으로, 그러한 경우, 서로 약 12 내지 24 또는 72 h 이내에 그리고 보다 구체적으로는 서로 약 6-12 h 이내에 항체 및 항암 치료법을 환자에게 제공할 수 있도록 고려된다. 일부 상황에서는, 치료 기간을 유의하게 연장하여 각 투여 사이에 수 일(2, 3, 4, 5, 6, 또는 7) 내지 수 주(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8)가 경과하는 것이 바람직할 수 있다.
일부 실시양태에서, 치료 또는 치료 사이클의 과정은 1-90 일 이상 지속될 것이다(이 범위는 그 사이의 일 수 및 마지막 일을 포함한다). 하나의 제제가 제1일 내지 제90일(이러한 범위는 그 사이의 일수 및 마지막 일을 포함함) 또는 임의의 그 조합 중 어느 날에 주어지고, 다른 제제는 제1일 내지 제90일(이러한 범위는 그 사이의 일수 및 마지막 일을 포함함) 또는 임의의 그 조합 중 어느 날에 주어질 수 있음이 고려된다. 하루(24-시간 기간) 이내에, 환자에게 제제(들)의 1회 또는 다수 투여가 제공될 수 있다. 또한, 치료 과정 후, 항암 치료가 투여되지 않는 기간이 있을 수 있음이 고려된다. 이 기간은 예후, 강도, 건강 등과 같은 환자의 상태에 따라, 예를 들어, 1-7 일, 및/또는 1-5 주, 및/또는 1-12 개월 이상(이러한 범위는 그 사이의 일수 및 상한 시점을 포함함) 지속될 수 있다. 치료 사이클은 필요에 따라 반복될 것이다. 치료의 다양한 조합이 이용될 수 있다. 하기에 나타난 조합 치료 요법의 대표적인 예에서, 항-glycPD-L1 항체 또는 그의 결합 단편과 같은 항체는 "A"로 나타나고 항암 요법은 "B"로 나타난다:
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본 실시양태의 임의의 항체 또는 치료법의 환자에게의 투여는, 만일 있다면, 제제의 독성을 고려하여, 그러한 화합물의 투여를 위한 일반적인 프로토콜을 따를 것이다. 따라서, 일부 실시양태에서 부작용 및 독성, 특히 조합 치료법에 기인할 수 있는 것들을 모니터하는 단계가 있다.
실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체를 단독으로 또는 다른 항암제와 조합하여 이를 필요로 하는 환자, 즉, 암 또는 종양을 가진 환자에게 투여하는 것에 관련되는 방법이 제공된다. 항-glycPD-L1 항체의 투여 전에, 환자의 종양 또는 암의 샘플이 PD-L1의 존재에 대해 평가될 수 있다. 만일 그러한 평가의 결과가 환자의 종양 또는 암이 당화 PD-L1에 대해 양성임을 밝히면, 환자는 환자의 glycPD-L1+ 종양 또는 암이 항-glycPD-L1 항체를 이용한 치료에 더욱 순응할 가능성에 기초하여 치료를 위해 선택될 것이며, 치료는 더욱 가능성있는 유익한 결과를 가지고 진행될 수 있다. 의료 전문가 또는 의사는 환자에게 항-glycPD-L1 항체 치료 방법을 진행하도록 조언할 수 있으며, 환자는 의료 전문가 또는 의사의 조언에 기초하여 치료를 진행하기 위해 결정할 수 있다. 또한, 치료 과정 동안, 환자의 종양 또는 암 세포는 치료의 진행 또는 효과를 모니터하기 위한 방식으로서 당화 PD-L1의 존재에 대해 분석될 수 있다. 만일 분석이 예를 들어, 환자의 종양 또는 암 세포 상의 당화 PD-L1에서 변화, 상실 또는 감소를 보여준다면, 치료를 계속할지 또는 일부 방식에서 변경할지, 예를 들어, 더 높은 투여량, 다른 항암제 또는 치료법의 추가 등에 관해 의료 전문가가 환자와 함께 결정할 수 있다.
화학요법
매우 다양한 화학요법 제제가 본 실시양태의 치료 또는 치료 방법에 따라 사용될 수 있다. 용어 "화학요법"은 암을 치료하기 위한 약물의 사용을 말한다. "화학요법 제제"는 암의 치료에서 투여되는 화합물 또는 조성물을 함축한다. 그러한 제제 또는 약물은 세포 내에서 그들의 활성 방식에 의해, 예를 들어, 그들이 세포 주기 및 세포 성장 및 증식에 영향을 주는지 그리고 어떤 단계에서 영향을 주는지에 의해 분류된다. 대안적으로, 화학요법 제제는 DNA를 직접적으로 가교하거나, DNA 내로 삽입되거나, 세포에서 핵산 합성에 영향을 주어 염색체 및 유사분열 이상을 유도하는 능력에 기초하여 규명될 수 있다.
화학요법 제제의 비제한적인 예는 티오테파 및 시클로포스파미드와 같은 알킬화제; 부설판, 임프로설판 및 피포설판과 같은 알킬 설포네이트; 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파 및 우레도파와 같은 아지리딘; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸올로멜라민을 비롯한 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 아세토제닌(특히 불라타신 및 불라타시논); 캄포테신(합성 유사체 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065(그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 바이젤레신 합성 유사체 포함); 크립토피신(특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 도라스타틴; 듀오카르마이신(합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 에류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕틴; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예를 들어, 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜파란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 및 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예를 들어, 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라림누스틴; 항생제, 예를 들어, 에네딘 항생제(예를 들어, 칼리케마이신, 특히 칼리케마이신 감마 1I 및 칼리케마이신 오메가 I1); 다이네마이신 A를 비롯한 다이네마이신; 크로드로네이트와 같은 비스포스포네이트; 에스페라마이신; 및 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색소단백질 에네딘 항생제 발색단, 아크라시노마이신, 액티노마이신, 아우트라르니신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르루이신, 독소루비신(모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예를 들어, 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라르니신, 올리보마이신, 페플로마이신, 팟피로마이신, 퓨로마이신, 퀘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴 및 조루비신; 항-대사물, 예를 들어, 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU); 엽산 유사체, 예를 들어, 데노프테린, 프테로프테린 및 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예를 들어, 플루다라빈, 6-머캡토퓨린, 티아미프린 및 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 다이데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈 및 플록스우리딘; 안드로겐, 예를 들어, 카루스테론, 드로모스타노론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄 및 테스토락톤; 항-아드레날, 예를 들어, 미토탄 및 트리로스탄; 엽산 보충제, 예를 들어, 프로린산; 아세그라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트렉세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포티론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예를 들어, 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미토잔트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나멧; 피라루비신; 로소잔트론; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카르바진; PSK다당류 복합체; 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센스(특히, T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안귀딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드("Ara-C"); 시클로포스파미드; 탁소이드, 예를 들어, 파클리탁셀 및 도세탁셀 젬시타빈; 6-티오구아닌; 머캡토퓨린; 백금 배위 착물, 예를 들어, 시스플라틴, 옥살리플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포사이드(VP-16); 이포스파미드; 미토잔트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; 이리노테칸(예를 들어, CPT-11); 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 다이플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노이드, 예를 들어, 레티노산; 카페시타빈; 카르보플라틴, 프로카르바진, 플리코마이신, 젬시타빈, 나벨빈, 파네실-단백질 트랜스퍼라제 억제제, 트랜스플래티늄(transplatinum), 및 상기 중 어느 것의 약학적 허용 염, 산 또는 유도체를 포함한다.
방사선요법
방사선요법은 DNA 손상을 야기하는 제제를 이용한 치료를 포함한다.
방사선요법은 암 및 질병 치료에서 광범위하게 사용되었으며 일반적으로 γ-선, X-선, 및/또는 종양 세포에의 방사성동위원소의 지시된 전달로 알려진 것을 포함한다. 마이크로파, 양성자빔 조사(미국 특허 5,760,395호 및 4,870,287호) 및 UV-조사와 같은 다른 형태의 DNA 손상 인자 또한 고려된다. 모든 이들 인자는 DNA 자체에, DNA의 전구체에, DNA의 복제 및 복구에, 그리고 염색체의 조립 및 유지에 광범위한 손상을 줄 것으로 보인다. X-선을 위한 예시적인 선량 범위는 연장된 기간(3 내지 4주) 동안 50 내지 200 뢴트겐의 일일 선량 내지 2000 내지 6000 뢴트겐의 단일 선량 범위이다. 방사성동위원소를 위한 선량 범위는 매우 광범위하며 동위원소의 반감기, 방출되는 방사선의 강도 및 타입, 신생물 세포에 의한 흡수 및 치료를 받는 개체의 용인에 의존한다.
면역요법
방법의 일부 실시양태에서, 면역요법은 본 명세서에 개시된 항-glycPD-L1 항체의 투여와 조합되어 또는 함께 사용될 수 있다. 암 치료 맥락에서, 면역치료제는 일반적으로 암세포를 표적화하고 파괴하기 위하여 면역 이펙터 세포 및 분자의 사용에 의존한다. 리툭시맙(리툭산(RITUXAN)®)은 그러한 예이다. 이피리무맙을 비롯한 다른 체크포인트 억제제가 조합되어 투여될 수 있다. 항-glycPD-L1 항체는 또한 아테조리주맙, 두르바루맙 또는 아베루맙을 비롯한 PD-L1에 대한 항체 또는 니보루맙, 펨브로리주맙 또는 피디리주맙을 비롯한 PD-1에 대한 항체와 같은, 다른 항-PD-1 또는 항-PD-L1 억제제와 조합되어 투여될 수 있다. 또한, 실시양태의 항-glycPD-L1 항체 중 하나 이상이 서로 조합되어 투여될 수 있다. 항체 단독이 치료법의 이펙터로서 작용하거나 실제로 세포 사멸을 일으킬 다른 세포를 모집할 수 있다. 항체는 또한 약물 또는 독소(화학치료제, 방사성핵종, 리신 A 쇄, 콜레라 독소, 백일해 독소 등)에 접합되고 단지 표적화 제제로서 작용할 수 있다. 대안적으로, 이펙터는 종양 세포 표적과 직접 또는 간접적으로 상호작용하는 표면 분자를 보유한 림프구일 수 있으며, 예를 들어, T-세포 상의 PD-1/종양 세포 상의 PD-L1 상호작용이 있다. 다양한 이펙터 세포는 세포독성 T 세포 및 천연 킬러(NK) 세포를 포함한다.
면역요법의 일 양태에서, 종양 세포는 표적화에 순응하는 일부 마커(단백질/수용체)를 보유해야 한다. 적절하게는, 종양 마커 단백질/수용체는 비암세포 또는 정상 세포와 같은 대다수의 다른 세포 상에 존재하지 않는다. 많은 종양 마커가 존재하며 이들 중 어느 것이든 본 실시양태의 맥락에서 항-glycPD-L1 항체와 투여되는 다른 약물 또는 치료법에 의한 표적화를 위해 적합할 수 있다. 일반적인 종양 마커는 예를 들어, CD20, 암배아 항원(CEA), 티로시나제(p97), gp68, TAG-72, HMFG, 시알릴 루이스(Sialyl Lewis) 항원, MucA, MucB, PLAP, 라미닌 수용체, erbB, 및 p155를 포함한다. 면역요법의 대안적 양태는 항암 효과를 면역 자극 효과와 조합하는 것이다. 면역 자극 분자 또한 존재하며 사이토카인, 예를 들어, IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, 감마-IFN; 케모카인, 예를 들어, MIP-1, MCP-1, IL-8; 및 성장 인자, 예를 들어, FLT3 리간드를 포함한다.
현재 연구중이거나 사용중인 면역요법의 예는 면역 아쥬반트, 예를 들어, 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 다이니트로클로로벤젠 및 방향족 화합물(미국 특허 5,801,005호 및 5,739,169호; Hui et al., 1998, Infection Immun., 66(11):5329-5336; Christodoulides et al., 1998, Microbiology, 144(Pt 11):3027-3037); 사이토카인 치료법, 예를 들어, a, β, 및 γ 인터페론; IL-1, GM-CSF, 및 TNF(Bukowski et al., 1998, Clinical Cancer Res., 4(10):2337-2347; Davidson et al., 1998, J. Immunother, 21(5):389-398; Hellstrand et al., 1998, Acta Oncologica, 37(4):347-353); 유전자 치료법, 예를 들어, TNF, IL-1, IL-2, 및 p53(Qin et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(24): 14411-14416; Austin-Ward and Villaseca, 1998, Revista Medica de Chile, 126(7):838-845; 미국 특허 5,830,880호 및 5,846,945호); 및 단일클론 항체, 예를 들어, 항-CD20, 항-강글리오사이드 GM2, 및 항-p185(Hollander, 2012, Front. Immun., 3 :3; Hanibuchi et al., 1998, Int. J. Cancer, 78(4):480-485; 미국 특허 5,824,311호)이다. 하나 이상의 항암 치료법이 본 명세서에 개시된 항체 치료법과 이용될 수 있음이 고려된다.
수술
암을 가진 개체의 대략 60%가 일부 타입의 수술을 거치며, 이는 예방적, 진단성 또는 병기결정, 치료, 및 고식적 수술을 포함한다. 치료적 수술은 암 조직의 전부 또는 일부가 물리적으로 제거, 절제, 및/또는 파괴되는 절제술을 포함하며 본 명세서에 개시된 항-glycPD-L1 항체 치료, 화학요법, 방사선요법, 호르몬요법, 유전자 치료법, 면역요법, 및/또는 대안적 치료법, 및 그 조합과 같은 다른 치료법과 함께 사용될 수 있다. 종양 절제술은 종양의 적어도 일부의 물리적 제거를 말한다. 종양 절제술에 더하여, 수술에 의한 치료는 레이저 수술, 저온 수술, 전기 수술, 및 현미경-제어 수술(모스 수술(Mohs' surgery))을 포함한다. 암성 세포, 조직, 또는 종양의 일부 또는 전부의 절제시, 신체 내에 동공이 형성될 수 있다. 치료는 추가의 항암 치료법을 영역에 관류, 직접 주사 또는 국소 적용함으로써 이루어질 수 있다. 그러한 치료는 예를 들어, 매 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7 일마다, 또는 매 1, 2, 3, 4, 및 5 주 또는 매 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 개월 마다 반복될 수 있다. 이들 치료는 또한 투여량이 변할 수 있다.
단백질 정제
항체 및, 특히 항-glycPD-L1 항체를 비롯한 단백질 정제 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이들 기술은 한 가지 수준에서는 세포, 조직 또는 기관의 균질화 및 폴리펩티드 및 비-폴리펩티드 분획으로의 조 분획화에 관련된다. 관심 단백질 또는 폴리펩티드는 달리 표시되지 않으면 크로마토그래피 및 전기영동 기술을 이용하여 더 정제되어 부분적 또는 완전한 정제(또는 균질하도록 정제)를 이룰 수 있다. 순수한 단백질 또는 펩티드의 제조에 특히 적합한 분석 방법은 이온-교환 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 폴리아크릴아미드 젤 전기영동, 친화성 크로마토그래피, 면역친화성 크로마토그래피 및 등전점 전기영동이다. 펩티드의 특히 효율적인 정제 방법은 고속-성능 액체 크로마토그래피(FPLC) 또는 고-성능 액체 크로마토그래피(HPLC)이다. 일반적으로 본 기술분야에 알려진 대로, 다양한 정제 단계를 수행하는 순서는 바뀔 수 있고/있거나 일부 단계는 생략될 수 있으며, 여전히 실질적으로 정제된 폴리펩티드의 제조를 위해 적합한 방법이 된다.
본 명세서에 개시된 항-glycPD-L1 항체와 같은 정제된 폴리펩티드는 다른 성분으로부터 분리가능하거나 분리되며 그의 자연적으로 수득가능한 상태에 비하여 어느 정도까지 정제된 폴리펩티드를 말한다. 따라서, 분리되거나 정제된 폴리펩티드는 그것이 자연적으로 발생하는 환경, 예를 들어, 세포, 조직, 기관, 생물 샘플 등이 없는 폴리펩티드를 말한다. 일반적으로, "정제된"은 다양한 다른 성분을 제거하기 위한 분획화를 거친 폴리펩티드 조성물을 말할 것이며 그 조성물은 그의 발현된 생물학적 활성을 실질적으로 보유한다. "실질적으로 정제된" 조성물은 폴리펩티드가 조성물의 주요 성분을 형성하며 따라서 조성물의 단백질 성분 중 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 이상을 구성하는 것을 말한다.
항체 단백질과 같은 폴리펩티드의 정제 정도를 정량하기 위한 다양한 방법이 본 명세서에 비추어 당업자에게 알려져 있다. 이들은 예를 들어, 활성 분획의 비활성을 결정하거나, SDS/PAGE 분석에 의해 분획 내의 폴리펩티드의 양을 평가하는 것을 포함한다. 분획의 순도를 평가하는 바람직한 방법은 분획의 비 활성을 계산하고, 그것을 초기 추출물의 비 활성과 비교하고, 따라서 "배수 정제 수"에 의해 평가되는, 그안의 순도의 정도를 계산하는 것이다. 활성의 양을 나타내기 위해 사용되는 실제 단위는 물론 정제에 이어 선택된 구체적 분석 기술에 그리고 발현된 폴리펩티드가 검출가능한 활성을 나타내는지 여부에 의존할 것이다.
일반적으로 폴리펩티드가 항상 가장 정제된 상태로 제공되어야 할 필요성은 없다. 사실상, 덜 실질적으로 정제된 생성물이 일부 실시양태에서는 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 부분적 정제는 더 적은 정제 단계를 조합하여 사용하거나, 또는 동일한 일반적 정제 계획의 상이한 형태를 이용함으로써 이루어질 수 있다. 예를 들어, HPLC 장치를 이용하여 수행된 양이온-교환 컬럼 크로마토그래피는 일반적으로 저압 크로마토그래피 시스템을 이용하는 동일 기술보다 더 큰 "배수" 정제를 야기할 것임이 이해된다. 상대적으로 더 낮은 정제 정도를 나타내는 방법은 단백질 생성물의 총 회수율에서 또는 발현된 단백질의 활성 유지에서 이점을 가질 수 있다.
친화성 크로마토그래피는 분리될 물질(단백질)과 그것이 특이적으로 결합할 수 있는, 예를 들어, 수용체-리간드 타입 상호작용할 수 있는, 분자 사이의 특이적 친화성에 의존하는 크로마토그래피 절차이다. 컬럼 물질(수지)는 결합 파트너 중 하나를 불용성 매트릭스에 공유적으로 커플링시켜 합성된다. 이어서 컬럼 물질은 컬럼 수지를 통과하는 용액으로부터의 물질에 특이적으로 흡착할 수 있다. 용리는 결합이 파괴될/발생하지 않을 조건으로(예를 들어, 변경된 pH, 이온 강도, 온도 등) 조건을 변화시켜 발생한다. 매트릭스는 어떤 유의한 정도로도 분자를 흡착하지 않으며 광범위한 화학적, 물리적 및 열적 안정성을 가진 물질이어야 한다. 리간드는 그의 결합 특성에 영향을 주지 않는 방식으로 커플링되어야 한다. 리간드는 또한 상대적으로 단단한 결합을 제공해야 하지만, 결합된 물질의 용리는 원하는 샘플 단백질 또는 리간드를 파괴하지 않고 발생해야 한다.
크기-배제 크로마토그래피(SEC)는 용액 내의 분자가 그들의 크기 또는 보다 기술적 개념으로는 그들의 수력학적 부피에 기초하여 분리되는 크로마토그래피 방법이다. 이것은 보통 단백질 및 산업용 중합체와 같은 큰 분자 또는 거대분자 복합체에 적용된다. 전형적으로, 수용액이 컬럼을 통해 샘플을 수송하기 위해 이용될 경우, 유기 용매가 이동상으로 이용될 경우 사용되는 젤 투과 크로마토그래피라는 이름에 비하여, 그 기술은 젤 여과 크로마토그래피로 알려진다. SEC의 근복적인 원리는 상이한 크기의 입자가 상이한 속도로 고정상을 통해 용리(여과)하여, 크기에 기초하여 입자의 용액의 분리를 야기한다는 것이다. 모든 입자가 동시에 또는 거의 동시에 로딩된다면, 같은 크기의 입자는 함께 용리한다.
고-성능(고-압으로도 알려짐) 액체 크로마토그래피(HPLC)는 화합물을 분리, 확인 및 정량하기 위하여 생화학 및 분석 화학에서 빈번히 이용되는 컬럼 크로마토그래피 형태이다. HPLC는 크로마토그래프 패킹 물질(고정상)을 유지하는 컬럼, 컬럼을 통해 이동상(들)을 움직이는 펌프, 및 분자의 체류 시간을 보여주는 검출기를 이용한다. 체류 시간은 고정상, 분석되는 분자 및 사용되는 용매(들) 사이의 상호작용에 따라 변한다.
약학 제제
항-glycPD-L1 항체 또는 당화 PD-L1 폴리펩티드를 함유하는 약학 조성물의 임상적 적용이 이루어질 경우, 일반적으로 의도된 응용에 적절한 약학 또는 치료 조성물을 제조하는 것이 유익하다. 일반적으로, 약학 조성물은 약학적 허용 담체에 용해되거나 분산된 하나 이상의 폴리펩티드 또는 추가 제제의 유효량을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 예를 들어, 적어도 약 0.1%의 폴리펩티드 또는 항체를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 항체는 예를 들어, 단위의 중량의 약 2% 내지 약 75% 또는 약 25% 내지 약 60%, 및 상한값과 하한값을 비롯한 그 사이의 유도가능한 임의의 범위를 구성할 수 있다. 각 치료적으로 유용한 조성물 내의 활성 화합물(들)의 양은 적합한 투여량이 임의의 주어진 단위 투여량에서 수득되는 방식으로 제조될 수 있다. 용해도, 생체이용률, 생물학적 반감기, 투여 경로, 제품 수명, 및 다른 약리학적 고려사항과 같은 인자들이 그러한 약학 제형을 제조하는 당업자에 의해 고려되며, 따라서 다양한 투여량과 치료 요법이 바람직할 수 있다.
추가로 일부 양태에 따라서, 투여에 적합한 조성물은 불활성 희석제가 있거나 없이 약학적 허용 담체내에 제공될 수 있다. 담체는 동화가능해야 하며 액체, 반-고체, 예를 들어, 젤 또는 페이스트, 또는 고체 담체를 포함한다. 담체 또는 희석제의 예는 지방, 오일, 물, 생리식염수, 지질, 리포좀, 수지, 결합제, 충진제, 등 또는 그 조합을 포함한다. 본 명세서에서 사용될 때, 당업자에게 알려진 바처럼, "약학적 허용 담체"는 임의의 그리고 모든 수성 용매(예를 들어, 물, 알콜성/수성 용액, 에탄올, 생리식염수, 비경구 비히클, 예를 들어, 염화나트륨, 링거 덱스트로스 등), 비-수성 용매(예를 들어, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일 및 주사용 유기 에스테르, 예를 들어, 에틸올리에이트), 분산 매질, 코팅(예를 들어, 레시틴), 계면활성제, 산화방지제, 방부제(예를 들어, 항균 또는 항진균 제제, 항-산화제, 킬레이팅제, 불활성 가스, 파라벤(예를 들어, 메틸파라벤, 프로필파라벤), 클로로부탄올, 페놀, 솔브산, 티메로살), 등장제(예를 들어, 당, 염화나트륨), 흡수 지연제(예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트, 젤라틴), 염, 약물, 약물 안정화제(예를 들어, 버퍼, 아미노산, 예를 들어, 글리신 및 리신, 탄수화물, 예를 들어, 덱스트로스, 만노스, 갈락토스, 프럭토스, 락토스, 수크로스, 말토스, 솔비톨, 만니톨 등), 젤, 결합제, 부형제, 붕해제, 활택제, 감미제, 향미료, 염료, 유체 및 영양소 보충제, 그의 유사 물질 및 조합을 포함한다. 임의의 종래의 매질, 제제, 희석제 또는 담체가 수용체에게 또는 그안에 함유된 조성물의 치료적 효과에 해로운 경우에 한해서를 제외하고는, 본 방법의 실시를 위한 투여가능한 조성물에서의 그의 사용은 적절하다. 약학 조성물 내의 다양한 성분의 pH 및 정확한 농도는 잘 알려진 파라미터에 따라 조정된다. 일부 양태에 따라, 조성물은 임의의 편리하고 실용적인 방식으로, 즉, 용액, 현탁액, 유화, 혼합, 캡슐화, 흡수, 분쇄 등에 의해, 담체와 조합된다. 그러한 절차는 당업자에게 일상적이다.
일부 실시양태에서, 조성물은 그들이 고체, 액체 또는 에어로졸 형태로 투여될 것인지 여부에 따라 그리고 그것이 주사와 같은 투여 경로를 위해 멸균이 필요한지 여부에 따라 상이한 타입의 담체를 포함할 수 있다. 조성물은 정맥내로, 피내로, 경피로, 척추강내로, 동맥내로, 복강내로, 비내로, 질내로, 직장내로, 근육내로, 피하로, 점막으로, 경구로, 국소적으로, 국부적으로, 흡입에 의해(예를 들어, 에어로졸 흡입), 주사에 의해, 주입에 의해, 연속 주입에 의해, 직접적으로, 카테터를 통해, 세척을 통해 지질 조성물(예를 들어, 리포좀)에서 표적 세포를 적시는 국소화된 관류에 의해, 또는 당업자에게 알려진 다른 방법 또는 전술한 것의 임의의 조합에 의한 투여를 위해 제형화될 수 있다. 예를 들어, Remington s' Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990을 참고한다. 전형적으로, 그러한 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서 제조될 수 있으며; 주사 전에 액체를 첨가할 경우 용액 또는 현탁액을 제조하기 위해 사용하기에 적합한 고체 또는 재구성가능한 형태가 또한 제조될 수 있으며; 제제는 또한 유화될 수 있다.
항체는 유리 염기, 중성 또는 염 형태로 조성물 내로 제형화될 수 있다. 약학적 허용 염은 산 부가 염, 예를 들어, 단백질성 조성물의 자유 아미노기와 형성된 것들, 또는 무기산, 예를 들어, 염산 또는 인산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산 또는 만델산과 같은 유기산과 형성되는 것들을 포함한다. 자유 카르복실기와 형성된 염은 또한 무기 염기, 예를 들어, 소듐, 포타슘, 암모늄, 칼슘 또는 페릭 하이드록사이드; 또는 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘 또는 프로카인같은 유기 염기로부터 유도될 수 있다.
추가 실시양태에서, 폴리펩티드, 하나 이상의 지질 및 수성 용매를 포함하는 약학적 지질 비히클 조성물이 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용될 때, 용어 "지질"은 물에서 불용성이며 유기 용매로 추출가능함을 특징으로 하는 광범위한 물질 중 어느 것을 말한다. 이 넓은 화합물 부류는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 용어 "지질"이 본 명세서에서 사용될 때, 어떤 구체적 구조에 제한되지 않는다. 예로는 장쇄 지방족 탄화수소를 함유하는 화합물 및 그들의 유도체를 포함한다. 지질은 자연 발생 또는 합성(즉, 사람에 의해 설계되거나 생산됨)일 수 있다. 하지만, 지질은 보통 생물학적 물질이다. 생물학적 지질은 본 기술분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 중성 지방, 인지질, 포스포글리세라이드, 스테로이드, 테르펜, 라이소지질, 글리코스핑고지질, 당지질, 설파티드, 에테르- 및 에스테르-연결된 지방산을 가진 지질, 중합가능한 지질 및 그 조합을 포함한다. 물론, 당업자에 의해 지질로서 이해되는, 본 명세서에 구체적으로 개시된 것들 외의 화합물 또한 본 조성물과 방법에 의해 포함된다. 당업자는 지질 비히클 내에 조성물을 분산시키기 위해 이용될 수 있는 기술의 범위에 친숙할 것이다. 예를 들어, 항체는 지질을 함유한 용액에서 분산되거나, 지질과 용해되거나, 지질과 유화되거나, 지질과 혼합되거나, 지질과 조합되거나, 지질에 공유적으로 결합되거나, 지질 내에 현탁액으로서 함유되거나, 미셀 또는 리포좀과 함유되거나 복합되거나, 또는 다르게는 당업자에게 알려진 임의의 수단에 의해 지질 또는 지질 구조와 연합될 수 있다. 분산액은 리포좀의 형성을 야기하거나 야기하지 않을 수 있다.
용어 "단위 투여량(unit dose)" 또는 "투여량(dosage)"은 개체에서 사용하기 적합한 물리적으로 구별되는 단위를 말하며, 각 단위는 그 투여, 즉, 적절한 경로 및 치료 요법과 연합하여 상기에 토의된 바람직한 반응을 생성하기 위해 계산된 치료 항체 또는 치료 항체를 함유하는 조성물의 소정의 양을 함유한다. 치료 횟수 및 단위 투여량 둘 모두에 따른, 투여될 양은 원하는 효과에 의존한다. 환자 또는 개체에게 투여되는 본 실시양태의 조성물의 실제 투여량은 개체의 체중, 연령, 건강 및 성별, 치료되는 질병 타입, 질병 침투의 정도, 이전의 또는 공존하는 치료 개입, 환자의 특발성 질환, 투여 경로 및 구체적인 치료 물질의 효능, 안정성 및 독성과 같은 물리적 및 생리학적 인자에 의해 결정될 수 있다. 다른 비제한적인 예에서, 투여량은 또한 투여 당 약 1 마이크로그램/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중, 약 10 마이크로그램/kg/체중, 약 50 마이크로그램/kg/체중, 약 100 마이크로그램/kg/체중, 약 200 마이크로그램/kg/체중, 약 350 마이크로그램/kg/체중, 약 500 마이크로그램/kg/체중, 약 1 밀리그램/kg/체중, 약 5 밀리그램/kg/체중, 약 10 밀리그램/kg/체중, 약 50 밀리그램/kg/체중, 약 100 밀리그램/kg/체중, 약 200 밀리그램/kg/체중, 약 350 밀리그램/kg/체중, 약 500 밀리그램/kg/체중 내지 약 1000 밀리그램/kg/체중 이상 및 그안의 유도가능한 임의의 범위를 포함할 수 있다. 본 명세서에 열거된 수로부터 유도가능한 범위의 비제한적인 예에서는, 약 5 밀리그램/kg/체중 내지 약 100 밀리그램/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중 내지 약 500 밀리그램/kg/체중 등의 범위가, 상기 개시된 수에 기초하여, 투여될 수 있다. 전술한 투여량은 나타낸 것들 사이의 양을 포함하며 범위의 하한 및 상한 값 또한 포함하는 것을 의도한다. 투여를 책임지는 실무자는 어떤 경우든 조성물 내의 활성 성분(들)의 농도 및 개별 개체를 위한 적절한 투여량(들)을 결정할 것이다.
치료 조성물 또는 제제의 구체적 특성은 제한되지 않는다. 예를 들어, 적합한 조성물은 생리학적 허용 액체, 젤, 또는 고체 담체, 희석제 및 부형제와 함께 제형으로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료 제제는 가축에서와 같은 수의학적 용도를 위해, 그리고 다른 치료제와 유사한 방식으로 인간에서의 임상적 사용을 위해 포유류에게 투여될 수 있다. 일반적으로, 치료 효능을 위해 요구되는 투여량은 투여의 사용 타입 및 양식, 및 상기한 대로, 개별 개체의 구체적인 요구에 따라 변할 것이다.
바이오마커로서 당화 PD-L1
본 발명은 실시양태에서 개시된 적어도 하나의 항-glycPD-L1 항체의 사용에 관련된 방법을 제공한다. 그러한 방법은 암 또는 종양을 가진 개체로부터 수득한 종양 또는 암 세포의 바이오마커 평가에서 유용할 수 있다. 본 발명은 암을 가진 개체가 PD-L1-보유 종양 또는 암 세포의 바이오마커로서 당화 PD-L1, 특히 그러한 세포의 세포 표면 상의 검출가능한 수준의 당화 PD-L1을 발현하는 암 또는 종양을 또한 갖는지를 결정하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 만일 개체의 암 또는 종양 세포가 시험되고 세포 표면 상에 당화 PD-L1을 발현하는 것으로 결정된다면, 개체는 개시된 항-glycPD-L1 항체 단독으로 또는 다른 항암제와 조합되어 치료하기 위한 후보이며, 예를 들어, 치료로부터 이득을 볼 것이다. 그러한 방법은 암 또는 종양을 가진 개체로부터 샘플을 수득하고, 본 기술분야에서 알려지고 사용되며 본 명세서에 개시된 결합 방법을 이용하여, 예를 들어, 실시양태의 항-glycPD-L1 항체를 이용하여, 개체의 암 또는 종양으로부터 유래된 세포 상에서 당화 PD-L1의 존재에 대해 샘플을 시험하고, 만일 개체의 암 또는 종양이 당화 PD-L1 단백질의 세포 표면 발현에 대해 양성인 것으로 밝혀지면 개체에게 항-glycPD-L1 항체의 유효량을 단독으로 또는 다른 항암제와 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 투여된 항-glycPD-L1 항체는 개체의 당화 PD-L1-발현 암 또는 종양 세포와 개체의 PD-1-발현 T 세포의 상호작용을 차단하거나 억제하여 T-세포 활성의 면역억제를 방지하고 활성화된 T-세포 사멸에 의해 종양 또는 암 세포의 사멸을 촉진할 가능성이 더 높으므로, 치료 이전에 개체가 당화 PD-L1을 발현하는 암 또는 종양을 갖는 것으로 진단하는 것은 개체에게 더욱 효과적인 치료와 이득을 허용한다. 실시양태에서, 본 방법은 그의 암 또는 종양이 발현된 당화 PD-L1 단백질의 존재에 대한 시험에 순응할 수 있는 개체를 먼저 선택하는 것에 관련될 수 있다.
항-glycPD-L1 항체 및 다른 항암 약물 또는 치료와의 병용 치료를 비롯한 암 치료 또는 치료법의 과정 동안 시간에 걸쳐 그리고 치료가 중단된 후, 환자의 종양 세포 상의 당화 PD-L1의 존재를 모니터하기 위해 유사한 방법이 이용될 수 있다. 그러한 방법은 또한 성공적인 결과 또는 그 가능성을 결정하기 위하여, 항암 치료 요법 또는 조합 치료가 치료 전 및 치료 과정 동안 당화 PD-L1-발현 종양 또는 암 세포에 대해 환자의 종양 또는 암 샘플을 시험하거나 분석하는 것, 예를 들어, 모니터링하는 것에 관련되는 동반 진단 방법에서 이용될 수 있다.
다른 제제
치료의 치료적 효능을 개선하기 위하여 본 실시양태의 일부 양태와 조합되어 다른 제제가 사용될 수 있음이 고려된다. 이들 추가 제제는 세포 표면 수용체 및 GAP 정션(junction)의 상향조절에 영향을 주는 제제, 세포증식억제 및 분화 제제, 세포 부착 억제제, 어팝토시스 유도자에 대한 과증식 세포의 민감성을 증가시키는 제제, 또는 다른 생물학적 제제를 포함한다. GAP 정션의 수를 상승시켜 세포간 시그날링을 증가시키는 것은 이웃한 과증식 세포 집단에 대한 항-과증식 효과를 증가시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 세포증식억제 또는 분화 제제는 치료의 항-과증식 효능을 개선하기 위하여 본 실시양태의 일부 양태와 조합되어 사용될 수 있다. 세포 부착의 억제제는 본 실시양태의 효능을 개선하는 것으로 생각된다. 세포 부착 억제제의 예는 국소 부착 키나제(focal adhesion kinase)(FAK) 억제제 및 로바스타틴이다. 항체 c225와 같은, 어팝토시스에 대한 과증식 세포의 민감성을 증가시키는 다른 제제가 치료 효능을 개선하기 위하여 본 실시양태의 일부 양태와 조합되어 사용될 수 있음이 추가로 고려된다.
키트 및 진단
다른 실시양태에서, 치료 제제 및/또는 다른 치료 및 전달 제제를 함유하는 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 키트는 본 명세서에 개시된 항-glycPD-L1 항체에 관련되는 치료법을 제조하고/하거나 투여하기 위해 사용된다. 키트는 본 명세서에 개시된 임의의 약학 조성물을 함유하는 하나 이상의 밀봉된 바이알을 포함할 수 있다. 키트는 예를 들어, 하나 이상의 항-glycPD-L1 항체를 제조, 제형화 및/또는 투여하기 위한 또는 개시된 방법의 하나 이상의 단계를 수행하기 위한 시약 및, 적어도 하나의 항-당화 PD-L1 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 또한 에펜돌프 튜브, 분석 플레이트, 시린지, 병, 또는 튜브와 같은, 키트의 성분과 반응하지 않을 용기인 적합한 용기 수단을 포함할 수 있다. 용기는 플라스틱 또는 유리와 같은 멸균가능한 물질로 만들어질 수 있다.
키트는 본 명세서에 개시된 방법의 절차적 단계를 설명하며 본 명세서에 개시되거나 당업자에게 알려진 것과 실질적으로 동일한 절차를 따를 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 설명 정보는 컴퓨터를 이용하여 실행될 경우 약학적 유효량의 치료 제제 전달의 실제 또는 가상 절차가 나타나도록 하는 기계-판독가능 설명을 함유한 컴퓨터 판독가능 매체 내에 있을 수 있다.
융합 및 접합체
본 발명에서 제공되는 항-당화 PD-L1 항체 또는 당화 PD-L1 폴리펩티드는 또한 다른 단백질과의 융합 단백질로서 발현되거나 다른 모이어티에 화학적으로 접합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 아이소타입 또는 서브클래스에 의해 변화될 수 있는 Fc 부분을 가지며, 키메라 또는 하이브리드일 수 있으며, 및/또는 예를 들어, 이펙터 기능을 개선하고 반감기 또는 조직 접근성을 조절하고, 안정성과 같은 생물물리학적 특징을 증대시키고, 비용 감소와 연합될 수 있는 생성물의 효율을 개선하기 위하여 변형될 수 있다. 융합 단백질의 제작에서 유용한 많은 변형 및 그들의 제조 방법은 예를 들어, Mueller, J.P et al., 1997, Mol Immun. 34(6):441-452; Swann, P.G., 2008, Curr. Opin. Immunol, 20:493-499; 및 Presta, L.G., 2008, Curr. Opin. Immunol, 20:460-470에 의해 보고된 대로 본 기술분야에 알려져 있다. 일부 실시양태에서, Fc 영역은 항체의 천연 IgG1, IgG2, 또는 IgG4 Fc 영역이다. 일부 실시양태에서, Fc 영역은 하이브리드, 예를 들어, IgG2/IgG4 Fc 불변 영역을 함유한 키메라이다. Fc 영역에의 변형은 Fc 감마 수용체 및 보체에의 결합을 방지하기 위하여 변형된 IgG4; 하나 이상의 Fc 감마 수용체에의 결합을 개선하기 위해 변형된 IgG1; 이펙터 기능을 최소화하기 위해 변형된 IgG1(아미노산 변화); 변경된/무 글리칸을 가진 IgG1(전형적으로 발현 숙주의 변화에 의함); 및 FcRn에의 변경된 pH-의존성 결합을 가진 IgG1을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. Fc 영역은 항체의 전체 힌지 영역, 또는 전체 힌지 영역보다 적게 포함할 수 있다.
다른 실시양태는 FcR에의 결합이 감소되어 그들의 반감기가 증가된 IgG2-4 하이브리드 및 IgG4 돌연변이를 포함한다. 대표적인 IG2-4 하이브리드 및 IgG4 돌연변이는 예를 들어, Angal et al., 1993, Molec. Immunol., 30(1): 105-108; Mueller et al., 1997, Mol. Immun., 34(6):441-452; 및 미국 특허 6,982,323호에 개시되며; 이 모두는 그 전체가 참고로 본원에 통합된다. 일부 실시양태에서, IgG1 및/또는 IgG2 도메인은 결실된다. 예를 들어, Angal et al., Id.는 IgG1 및 IgG2 도메인이 세린 241이 프롤린으로 치환된 단백질을 개시한다. 일부 실시양태에서, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90 또는 적어도 100 아미노산을 가진 융합 단백질 또는 폴리펩티드가 고려된다.
일부 실시양태에서, 항-당화 PD-L1 항체 또는 당화 PD-L1 폴리펩티드는 적어도 하나의 모이어티에 연결되거나 공유 결합되거나 복합체를 형성한다. 그러한 모이어티는 진단 또는 치료 제제로서 항체의 효능을 증가시키는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 모이어티는 영상화 제제, 독소, 치료 효소, 항생제, 방사성-라벨링된 뉴클레오티드, 화학요법 제제 등일 수 있다.
일부 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체 또는 당화 폴리펩티드 또는 그의 일부에 접합되거나 융합되는 모이어티는 효소, 호르몬, 세포 표면 수용체, 독소(예를 들어, 제한없이 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소(즉, PE-40), 디프테리아 독소, 리신, 제로닌, 또는 미국자리공(pokeweed) 항바이러스 단백질), 단백질(예를 들어, 종양 괴사 인자, 인터페론(예를 들어, α-인터페론, β-인터페론), 신경 성장 인자(NGF), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 조직 플라스미노겐 활성자(TPA), 또는 어팝토시스 제제(예를 들어, 종양 괴사 인자-α, 종양 괴사 인자-β)), 생물 반응 개질제(예를 들어, 림포카인(예를 들어, 인터루킨-1("IL-1"), 인터루킨-2("IL-2"), 인터루킨-6("IL- 6")), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극 인자("G-CSF"), 또는 대식세포 콜로니 자극 인자("M-CSF")), 또는 성장 인자(예를 들어, 성장 호르몬("GH"))), 세포독소(예를 들어, 세포증식억제 또는 세포살해 제제, 예를 들어, 파클리탁셀, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미토잔트론, 미트라마이신, 액티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코콜티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀올, 모노메틸 아우리스타틴 F(MMAF), 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE; 예를 들어, 베도틴) 및 퓨로마이신 및 그 유사체 또는 상동체), 항대사물(예를 들어, 메토트렉세이트, 6-머캡토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제(예를 들어, 메클로르에타민, 티오에파클로람부실, 멜파란, BiCNU®(카르무스틴; BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 시클로포스파미드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조신, 미토마이신 C 및 시스디클로로다민 플래티늄(II)(DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린(예를 들어, 다우노루비신(이전에는 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예를 들어, 닥티노마이신(이전에는 액티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신 및 안트라마이신(AMC)), 및 항-유사분열 제제(예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴) 또는 그 조합일 수 있다.
구체적 실시양태에서, 항-glycPD-L1 항체는 항-glycPD-L1 항체-약물 접합체(ADC)를 생산하기 위하여, 전형적으로 불안정 결합을 가진 화학적 링커에 의해, 세포독성 또는 화학요법 제제, 또는 방사성핵종과 같은 생물학적 활성 약물 또는 제제에 접합될 수 있다. 따라서, 그러한 ADC가 세포 내로 내재화될 경우, 그들은 직접 세포를 사멸하기 위해 작용하거나 세포 내부의 분자를 표적화하여, 어팝토시스 또는 세포 사멸을 유도한다. 본 명세서에 개시된 항-glycPD-L1 항체, 특히 단일클론, 인간화, 키메라 또는 인간 항체를 포함하는 그러한 ADC는 종양 및 암 세포 상의 당화 PD-L1에의 항체의 특이적 표적화를 세포독성 약물의 암-사멸 능력과 조합하여, 항-glycPD-L1 항체를 이용한 치료 및 치료법을 위해 추가의 이점을 제공한다. ADC를 제조하고 이용하는 기술이 본 기술분야에 알려져 있으며 본 명세서에 개시된 항-glycPD-L1 항체에 대해 제한하고자 하는 것이 아니다(예를 들어, Valliere Douglass, J.F., et al., 2015, Mol. Pharm., 12(6): 1774-1783; Leal, M. et al., 2014, Ann. N. Y. Acad. Sci., 1321 :41-54; Panowski, S. et al., 2014, mAbs, 6(1):34-45; Beck, A. 2014, mAbs, 6(1):30-33; Behrens, C.R. et al., 2014, mAbs, 6(1):46-53; 및 Flygare, J.A. et al., 2013, Chem. Biol. Drug Des., 81(1): 113-121을 참고). 실시양태에서, 전술한 모이어티의 일부 또는 전부, 특히 독소 및 세포독소는 암을 치료하기 위한 효과적인 ADC를 생산하기 위하여 항-glycPD-L1 항체에 접합될 수 있다.
치료 또는 세포독성 모이어티를 항체에 접합시키는 기술은 잘 알려져 있다; 예를 들어, Amon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Reisfeld et al. (eds.), 1985, pp. 243-56, Alan R. Liss, Inc.); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in CONTROLLED DRUG DELIVERY (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), 1987, pp. 623-53, Marcel Dekker, Inc.); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in MONOCLONAL ANTIBODIES '84: BIOLOGICAL AND CLINICAL APPLICATIONS, Pinchera et al. (eds.), 1985, pp. 475-506); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in MONOCLONAL ANTIBODIES FOR CANCER DETECTION AND THERAPY, Baldwin et al. (eds.), 1985, pp. 303-16, Academic Press; Thorpe et al., Immunol. Rev. 62: 119-158 (1982); Carter et al., Cancer J. 14(3): 154-169 (2008); Alley et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 14(4):529- 537 (2010); Carter et al., Amer. Assoc. Cancer Res. Educ. Book. 2005(1): 147-154 (2005); Carter et al., Cancer J. 14(3): 154-169(2008); Chari, Acc. Chem Res. 41(1):98-107 (2008); Doronina et al., Nat. Biotechnol. 21(7):778-784(2003); Ducry et al., Bioconjug Chem. 21(1):5-13(2010); Senter, Curr. Opin. Chem. Biol. 13(3):235-244 (2009); 및 Teicher, Curr Cancer Drug Targets. 9(8):982-1004 (2009)를 참고한다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 항체 및 폴리펩티드는 정제를 촉진하기 위하여, 펩티드와 같은 마커에 접합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 마커는 헥사-히스티딘 펩티드, 즉, 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래된 에피토프에 해당하는 헤마글루티닌 "HA" 태그(Wilson, I. A. et al., Cell, 37:767-778 (1984)), 또는 "플래그(flag)" 태그(Knappik, A. et al., Biotechniques 17(4):754-761 (1994))이다.
다른 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 항체 및 폴리펩티드에 접합된 모이어티는 분석에서 검출될 수 있는 영상화 제제일 수 있다. 그러한 영상화 제제는 효소, 보결분자단, 방사성라벨, 비방사성 상자성 금속 이온, 합텐, 형광 라벨, 인광 분자, 화학발광 분자, 발색단, 발광 분자, 생물발광 분자, 광친화성 분자, 또는 착색된 입자 또는 리간드, 예를 들어, 비오틴일 수 있다. 실시양태에서, 적합한 효소는 고추냉이 퍼옥시다제, 알카라인 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스테라제를 포함하지만 이에 제한되지 않으며; 보결분자단 복합체는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함하지만 이에 제한되지 않으며; 형광 물질은 움벨리페론, 플루오르세인, 플루오르세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오르세인, 댄실클로라이드 또는 피코에리트린을 포함하지만 이에 제한되지 않으며; 발광 물질은 루미놀을 포함하지만 이에 제한되지 않으며; 생물발광 물질은 루시퍼라제, 루시페린 및 애쿼린을 포함하지만 이에 제한되지 않으며; 방사성 물질은 비스무스(213Bi), 탄소(14C), 크롬(51Cr), 코발트(57Co), 불소(18F), 가돌리늄(153Gd, 159Gd), 갈륨(68Ga,67Ga), 게르마늄(68Ge), 홀뮴(166Ho), 인듐(115In, 113In, 112In, 111In), 요오드(131I, 125I, 123I, 121I), 란타늄(140La), 루테튬(177Lu), 망간(54Mn), 몰리브덴(99Mo), 팔라듐(103Pd), 인(32P), 프라세오디뮴(142Pr), 프로메튬(149Pm), 레늄(186Re,188Re), 로듐(105Rh), 루테늄(97Ru), 사마륨(153Sm), 스칸듐(47Sc), 셀레늄(75Se), 스트론튬(85Sr), 황(35S), 테크네튬(99Tc), 탈륨(201Ti), 주석(113Sn, 117Sn), 트리튬(3H), 크세논(133Xe), 이테르븀(169Yb, 175Yb), 이트륨(90Y), 아연(65Zn)을 포함하지만 이에 제한되지 않으며; 다양한 양전자 방출 단층촬영을 이용하는 양전자 방출 금속, 및 비방사성 상자성 금속 이온을 포함한다.
영상화 제제는 본 기술분야에 알려진 기술을 이용하여 직접적으로 또는 중간체(예를 들어, 본 기술분야에 알려진 링커)를 통해 간접적으로 본 명세서에 개시된 항체 또는 폴리펩티드에 접합될 수 있다. 예를 들어, 진단제로서 사용을 위해 본 명세서 개시된 항체 및 다른 분자에 접합될 수 있는 금속 이온에 대해 보고하는 미국 특허 4,741,900호를 참고한다. 일부 접합 방법은 항체에 부착된, 예를 들어, 디에틸렌트리아민펜타아세트산 안하이드라이드(DTPA); 에틸렌트리아민테트라아세트산; N-클로로-p-톨루엔설폰아미드; 및/또는 테트라클로로-3-6α-디페닐글리코우릴-3과 같은 유기 킬레이팅 제제를 이용하는 금속 킬레이트 착물의 사용에 관련된다. 단일클론 항체는 또한 글루타르알데히드 또는 페리오데이트와 같은 커플링 제제의 존재하에서 효소와 반응될 수 있다. 플루오르세인 마커와의 접합체는 이들 커플링 제제의 존재하에서 또는 이소티오시아네이트와의 반응에 의해 제조될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 항-glycPD-L1 항체 또는 glycPD-L1 폴리펩티드는 두 번째 항체에 접합되어, 예를 들어, 미국 특허 4,676,980호에 개시된 대로, 항체 이종접합체를 형성할 수 있다. 그러한 이종접합체 항체는 부가적으로 합텐(예를 들어, 플루오르세인)에 또는 세포 마커(예를 들어, 제한없이 4-1-BB, B7-H4, CD4, CD8, CD14, CD25, CD27, CD40, CD68, CD163, CTLA4, GITR, LAG-3, OX40, TIM3, TIM4, TLR2, LIGHT, ICOS, B7-H3, B7-H7, B7-H7CR, CD70, CD47) 또는 사이토카인(예를 들어, IL-7, IL-15, IL-12, IL-4 TGF-베타, IL-10, IL-17, IFNγ, Flt3, BLys) 또는 케모카인(예를 들어, CCL21)에 결합할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 항-당화 PD-L1 항체 또는 당화 PD-1 폴리펩티드는 또한 고체 지지체에 부착될 수 있으며, 이는 표적 항원 또는 본 명세서에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편에의 결합을 통해 지지체에 고정된 표적 항원에 결합할 수 있는 다른 분자의 면역분석 또는 정제를 수행하기 위해 유용할 수 있다. 그러한 고체 지지체는 유리, 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리프로필렌을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
실시예
하기의 실시예는 비당화 PD-L1 및/또는 PD-L1 당화 돌연변이에 비하여 당화 PD-L1에 우선적으로 결합하는 항-glycPD-L1 항체에 관련되는 실시양태 및 본 명세서에 개시된 사용 방법을 보여주기 위하여 포함된다. 대표적인 항-glycPD-L1 항체가 예시된다. 개시된 항-glycPD-L1 항체가 예시이며 제한하고자 하는 것이 아님이 당업자에 의해 이해되어야 한다.
실시예 1. 재료 및 방법
세포 배양, 안정한 형질감염체 및 형질감염. 모든 세포는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)(ATCC)로부터 입수하였다. 이들 세포를 10% 태아 소 혈청(FBS)로 보충된 DMEM/F12 또는 RPMI 1640 배지에서 성장시켰다. MDA-MB-468, BT549 및 293T 세포에서 PD-L1 안정한 형질감염체를 퓨로마이신(인비보젠(InvivoGen), 미국 캘리포니아주 샌디에고)를 이용하여 선택하였다. 일시적 형질감염을 위하여, 세포를 SN 리포좀(Hu, M. C. et al., 2004, Cell, 117:225-237) 및 리포펙타민(lipofectamine)™ 2000(라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 미국 캘리포니아주 칼스바드)를 이용하여, PD-L1을 인코딩하는 DNA와 같은 DNA로 일시적으로 형질감염시켰다.
렌티바이러스 감염을 이용한 안정한 세포의 생성. 세포에서 PD-L1의 발현을 넉다운시키기 위해 사용되는 렌티바이러스계 shRNA(pGIPZ 플라스미드)(Shen, J. et al., 2013, Nature, 497:383-387)를 shRNA/ORF 코어 퍼실리티(Core Facility)(UT MD 앤더슨 암센터(Anderson Cancer Center))로부터 구매하였다. MDA-MB-231 또는 A431 세포에서 PD-L1 단백질 발현의 넉-다운 효율에 기초하여, 본 발명자들은 이 연구를 위해 두 개의 shPD-L1 클론을 선택하였다. 성숙 안티센스 서열은 다음과 같다: TCAATTGTCATATTGCTAC(shPD-L1 #1, 서열 번호 34), TTGACTCCATCTTTCTTCA(shPD-L1 #5, 서열 번호 35). 내인성 PD-L1을 넉다운시키고 동시에 Flag-PD-L1을 재구성하기 위하여 pGIPZ-shPD-L1/Flag-PD-L1 이중 발현 구조체를 이용하여, 본 발명자들은 내인성 PD-L1 넉다운 및 Flag-PD-L1 WT 또는 4NQ 돌연변이 발현 세포주를 확립하였다. PD-L1 및 Flag-PD-L1을 위한 렌티바이러스-발현 shRNA를 생성하기 위하여, 본 발명자들은 퓨진(FuGENE) 6 형질감염 시약을 이용하여 293T 세포를 pGIPZ-비-침묵(벡터 대조군 바이러스를 위해), pGIPZ-shPD-L1, 또는 pGIPZ-shPD-L1/PD-L1 WT, 또는 pGIPZ-shPD-L1/PD-L1 4NQ 돌연변이로 형질감염시켰다. 형질감염 후 24시간에 배지를 교환한 후, 24-시간 간격으로 배지를 수집하였다. 렌티바이러스를 함유한 수집된 배지를 원심분리하여 세포 파편을 제거하고, 0.45-㎛ 필터를 통해 여과하였다. 세포를 감염 전 12시간에 50% 컨플루언스(confluence)에서 접종하고, 배지를 렌티바이러스를 함유한 배지로 교환하였다. 24시간 동안 감염 후, 배지를 새 배지로 교환하고 감염된 세포를 1 ㎍/ml 퓨로마이신(인비보젠)으로 선택하였다.
플라스미드. 인간 PD-L1 클론을 shRNA/ORF 코어 퍼실리티(UT MD 앤더슨 암센터, 미국 텍사스주 휴스턴)로부터 입수하고 공지의 분자 생물학 기술을 이용하여 pCDH 렌티바이러스 발현 벡터 내로 클로닝하여 PD-L1-Flag 또는 PD-L1-Myc 발현 세포주를 확립하였다. 또한, 인간 PD-L1 핵산도 일시적 형질감염을 위하여 pEGFP-N1 및 pCMV-HA 포유류 세포 발현 벡터 내로 클로닝하였다. pCDH/PD-L1-Flag 발현 벡터를 주형으로 이용하여 하기 표 4에 제시된 프라이머를 이용하여 부위 지시된 돌연변이유발을 수행하여 PD-L1-Flag NQ 돌연변이 N35Q, N192Q, N200Q, N219Q, 및 4NQ(N35Q/N192Q/N200Q/N219Q)를 생성하였다. 내인성 PD-L1을 넉 다운시키고 동시에 Flag-PD-L1을 재구성하기 위한 pGIPZ-shPD-L1/Flag-PD-L1 이중 발현 구조체를 생성하기 위하여, PD-L1 mRNA의 3≫-UTR 영역을 표적화하는 shPD-L1 구조체(shPD-L1 #5)를 선택하였다. Flag-PD-L1 야생형(WT) 또는 4NQ 돌연변이 DNA를 내인성 PD-L1에 대해 특이적인 shRNA를 발현하는 pGIPZ-shPD-L1(써모 사이언티픽(Thermo Scientific), 미국 펜실베니아주 피츠버그) 내로 클로닝하였다. 모든 구조체는 효소 분해 및 DNA 시퀀싱을 이용하여 확인하였다.
Figure pct00009
표 4. 부위 지시된 돌연변이유발을 위한 프라이머
qRT-PCR 분석을 수행하여 mRNA의 발현을 측정하였다(Shen et al., 2013, Nature, 497:383-7; 및 Chang et al., 2011, Nature cell biology, 13:317-23)(하기 표 5 참고). 세포를 PBS로 2회 세척하고 즉시 퀴아졸(QIAzol)에서 용해시켰다. 용해된 샘플을 알엔이지 미니 키트(RNeasy Mini Kit)(퀴아젠(Qiagen), 독일 힐덴)을 이용하여 총 RNA 추출을 거쳤다. mRNA의 발현을 측정하기 위하여, 제조사의 설명서에 따라 무작위 헥사머(라이프 테크놀로지스)를 이용하여 수퍼스크립트(Superscript) III 퍼스트-스트랜드(First-Strand) cDNA 합성 시스템에 의해 1 ㎍의 정제된 총 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 실시간 PCR 기계(iQ5, 바이오라드(BioRad), 미국 캘리포니아주 허큘레스)를 이용하여 qPCR을 수행하였다. 모든 데이터 분석은 비교 Ct 방법을 이용하여 수행하였다. 결과는 먼저 내부 대조군 β-액틴 mRNA에 정규화시켰다.
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표 5. qRT - PCR을 위한 프라이머
항체 및 화학물질. 하기 항체를 실시예에 개시된 실험에서 이용하였다: Flag (F3165; 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미국 미주리주 세인트루이스); Myc (11667203001; 로쉐 다이아그노틱스(Roche Diagnostics), 미국 인디애나주 인디아나폴리스); HA(11666606001; 로쉐 다이아그노틱스); PD-L1 (13684; 셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology), 미국 매사추세츠주 댄버스); PD-L1 (329702; 바이오레전드(BioLegend), 미국 캘리포니아주 샌디에고); PD-L1 (GTX117446; 제네텍스(GeneTex), 미국 캘리포니아주 얼바인); PD-L1(AF156; 알앤디 시스템즈(R&D Systems), 미국 미네소타주 미네아폴리스); PD-1(ab52587; 앱캠(Abcam), 미국 매사추세츠주 캠브리지); α-튜불린(B-5-1-2; 시그마-알드리치); 및 β-액틴(A2228; 시그마-알드리치).
면역블롯 분석, 면역세포화학 및 면역침전. 면역블롯 분석은 이전에 개시된 대로 수행하였다(Lim et al., 2008, Gastroenterology, 135:2128-2140; 및 Lee et al., 2007, Cell, 130:440-455). 영상 획득 및 밴드 강도의 정량은 오디세이(Odyssey)® 적외선 영상화 시스템(리-코르 바이오사이언시즈(LI-COR Biosciences), 미국 네브래스카주 링컨)을 이용하여 수행하였다. 면역침전의 경우, 세포를 버퍼(50 mM Tris HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 5 mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 및 0.5% 노니데트(Nonidet) P-40(NP-40))에서 용해시키고 30분 동안 16,000 x g에서 원심분리하여 파편을 제거하였다. 깨끗해진 용해물을 항체와의 면역침전을 거쳤다. 면역세포화학을 위하여, 세포를 실온에서 15분 동안 4% 파라포름알데히드에서 고정시키고, 5분 동안 5% Triton X-100에서 투과성으로 만든 후, 일차 항체를 이용하여 염색하였다. 사용된 이차 항체는 항-마우스 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488 또는 594 염료 접합체 및/또는 항-토끼 알렉사 플루오르 488 또는 594 염료 접합체(라이프 테크놀로지스)이다. 핵을 4', 6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI 블루)(라이프 테크놀로지스)로 염색하였다. 봉입 후, 다광자 공초점 레이저-주사 현미경(칼 자이스(Carl Zeiss), 미국 뉴욕주 톤우드)을 이용하여 시각화하였다.
PD-L1 및 PD-1(PD-L1/DP-1) 상호작용 분석. PD-1 단백질과 PD-L1 단백질의 상호작용을 측정하기 위하여, 세포를 15분 동안 실온에서 4% 파라포름알데히드에서 고정시킨 후 1시간 동안 재조합 인간 PD-1 Fc 키메라 단백질(알앤디 시스템즈)과 항온처리하였다. 사용된 이차 항체는 항-인간 알렉사 플루오르 488 염료 접합체(라이프 테크놀로지스)였다. 핵을 4', 6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI 블루)(라이프 테크놀로지스)로 염색하였다. 그 후 알렉사 플루오르 488 염료의 형광 강도를 미세플레이트 판독기 시너지 네오(Synergy Neo)(바이오텍(BioTeK), 미국 버몬트주 위누스키)를 이용하여 측정하고 전체 단백질 양에 의한 강도에 정규화시켰다. 영상을 찍기 위하여, 봉입 후, 세포를 공초점 레이저-주사 현미경(칼 자이스)를 이용하여 시각화하였다.
PD-L1의 당화 분석. PD-L1 단백질의 당화를 확인하기 위하여, 세포 용해물을 제조사에 의해 개시된 대로 효소 PNGase F, Endo H, O-글리코시다제(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England BioLabs), 미국 매사추세츠주 입스위치)로 처리하였다. 당화 PD-L1 단백질을 염색하기 위하여, 정제된 PD-L1 단백질을 제조사에 의해 개시된 대로 당단백질 염색 키트(페얼스(Peirce)/써모 사이언티픽)을 이용하여 염색하였다.
N- 당펩티드의 확인. 정제된 His 태그를 가진 PD-L1 단백질을 1시간 동안 37℃에서 10 mM 디티오트레이톨(DTT)로 환원시키고, 실온에서 암실에서 1시간 동안 25 mM 암모늄 바이카보네이트 버퍼 내의 50 mM 이오도아세트아미드로 알킬화시킨 후, 37℃에서 1:50의 효소-대-기질 비율로 시퀀싱 등급 트립신으로 밤새 처리하였다. 분해된 생성물을 이어서 포름산으로 0.1%의 최종 농도로 희석하고, LC-MS/MS 분석 전에 짚팁(ZipTip) C18(밀리포어(Milipore))에 의해 더 깨끗이 하였다. LC-MS/MS 데이터는 IBC의 아카데미아 시니카 질량 분석법 설비(Academia Sinica Mass Spectrometry Facility)에서 획득하였다. 트랩 컬럼 어클레임 펩맵(trap column Acclaim PepMap) 100(2 cm x 100 ㎛ i.d)(디오넥스(Dionex))를 가진 얼티메이트(UltiMate) 3000 RSLCnano 시스템(디오넥스)에 커플링된 올비트랩 퓨전 트리브리드(Orbitrap Fusion Tribrid)(써모 사이언티픽)에서의 나노스프레이 LC-MS/MS에 의해 펩티드 혼합물을 분석하였다. 펩티드 혼합물을 어클레임 펩맵 RSLC 25 cm x 75 ㎛ i.d. 컬럼(디오넥스) 상에 로딩하고, 60분 동안 5%에서 35% 용매 B(0.1% 포름산을 가진 100% 아세토니트릴)의 구배를 이용하여 500 nL/min의 유속으로 분리하였다. 용매 A는 물 중의 0.1% 포름산이었다. CID 모드와 평행인 HCD하에서의 MS 및 MS/MS 데이터 획득을 위해 사용된 파라미터는 하기와 같았다: 3s 사이클 시간을 가진 전속력 모드; FTMS: 스캔 범위(m/z) = 400-2000; 해상도 = 120 K; AGC 표적 = 2 x 105; 최대 주입 시간(ms) = 50; FTMSn(HCD): 분리 모드 = 4중극자; 분리 윈도우 = 1.6; 충돌 에너지(%) = 단계적 충돌 에너지(stepped collision energy) 5%를 가진 30; 해상도 = 30 K; AGC 표적 = 5 x 104; 최대 주입 시간(ms) = 60; ITMSn(CID): 분리 모드 = 4중극자; 분리 윈도우 = 1.6; 충돌 에너지(%) = 30; AGC 표적 = 1 x 104. 미가공 데이터를 프로테옴 디스커버러(Proteome Discoverer) 1.4에 의해 마스코트 제너릭 포맷(Mascot generic format)(MGF)로 전환시켰다. 당펩티드 확인을 위하여, 하기의 조사 파라미터를 가지고 비오닉(Byonic)(버젼 2.0-25)을 이용하여 HCD MS2 데이터를 조사하였다: 펩티드 관용(tolerance) = 2 ppm; 단편 관용 = 6 ppm; 누락된 절단(missed cleavages) = 1; 변형: 카르브아미도메틸 시스테인(고정됨), 메티오닌 산화(일반 2), N에서 탈아미드화(희귀 1). 비오닉에 의해 제안된 당펩티드 히트를 HCD와 CID MS2 결과를 조합하여 수동으로 추가로 확인하였다.
통계 분석. 막대 그래프의 데이터는 3회의 독립적 실험의 표준 편차를 가지고 미처리군 또는 대조군에 대한 평균 배수 변화를 나타낸다. 통계 분석은 SPSS(Ver. 20, SPSS, 미국 일리노이주 시카고)를 이용하여 수행하였다. 단백질 발현과 BLBC 서브세트 사이의 상관성은 스피어맨스 상관성(Spearman's correlation) 및 맨-휘트니 시험(Mann-Whitney test)를 이용하여 분석하였다. 실험 데이터에 대하여 스튜던츠 t 테스트를 수행하였다. P 값 < 0.05이 통계적으로 유의한 것으로 고려되었다.
실시예 2. PD-L1 단백질 발현 분석
PD-L1의 근본적인 기전을 밝히기 위하여, 인간 종양 조직 및 암 세포주에서 PD-L1의 단백질 발현을 검사하였다. 도 1a 및 1b와 도 2a-2d는 웨스턴 블롯 분석에 의한 폐, 유방, 결장 및 난소 암 세포주에서 단백질 발현을 보여주며; 도 3a는 상이한 PD-L1 항체에 의한 세포 내의 PD-L1 단백질의 결합을 보여준다. 대부분의 PD-L1 단백질이 ~45 kDa(흑색 원)에서 검출되지만, 작은 분획이 또한 33 kDa(흑색 화살표)에서 나타난 것으로 관찰되었다. 코딩 서열(shPD-L1#l) 또는 3'UTR(shPD-L1#5)를 표적화하는 렌티바이러스 짧은-헤어핀 RNA(shRNA)에 의한 PD-L1 넉다운은 PD-L1의 33- 및 45-kDa 형태 둘 모두의 발현을 하향조절하였다(도 3b). PD-L1의 재구성은 shPD-L1#5 클론에서 두 형태 모두의 발현을 회복하였다(도 1c; 도 3c는 벡터 디자인을 보여줌). 이들 결과는 웨스턴 블롯 상의 두 밴드 모두가 PD-L1 단백질이며 더 높은 분자량 형태의 PD-L1이 번역후 변형을 나타냄을 보여주었다.
PD-L1의 고분자량(~ 45 kDa)에 대해 관찰된 것처럼, 당화 단백질은 웨스턴 블롯에서 이질성 패턴을 종종 생성한다. PD-L1에 대해 관찰된 당화 패턴이 당화 형태에 해당하는지 여부를 시험하기 위하여, MDA-MB 231 및 HeLa 세포를 재조합 글리코시다제(펩티드-N-글리코시다제 F; PNGase F)로 처리하여 N-글리칸 구조를 제거한 후 웨스턴 블롯 분석을 거쳤다. 도 3d에 나타난 대로, 상당한 부분의 45-kDa PD-L1이 PNGase F 처리시에 PD-L1의 33-kDa 형태로 감소되었다. 일치하게, 글리칸 구조의 양성 염색이 정제된 His-태그를 가진 PD-L1에서 관찰되었으나, PNGase F의 존재하에서는 관찰되지 않았다(도 1d). 이들 결과는 고분자량의 PD-L1이 사실상 PD-L1 단백질의 당화 형태임을 보여준다.
세포에서 PD-L1 단백질의 발현을 요약하기 위하여, 다양한 과발현 구조체를 생성시켜 단백질의 내인성 발현을 모방하였다. N-말단 시그널링 펩티드에서의 가능한 절단을 피하기 위하여, 상이한 태그 서열을 N- 또는 C-말단에서 융합시켰다(도 4a 및 4b, 블롯 위). 내인성 PD-L1 발현 분석으로부터의 결과와 유사하게, 모든 GFP-, HA-, Flag- 또는 Myc-태그를 가진 PD-L1의 일시적 형질감염이 웨스턴 블롯에서 그의 실제 크기로부터 ~15 kDa 분자량 이동을 가졌다(도 1e 및 4a와 4b). PD-L1 단백질 상의 N-글리칸 구조 전부를 제거하는 PNGase F 처리와 대조적으로, 재조합 글리코시다제인 엔도글리코시다제 H(Endo H)의 추가는 PD-L1 당화를 단지 부분적으로 감소시켜, N-연결 글리칸 구조의 복합체 타입(고 만노스 및 하이브리드 타입 둘 모두를 함유함)이 PD-L1 상에 주로 존재함을 제안한다(Stanley, P., 2011, Cold Spring Harbor perspectives in biology, 3). 또한, PD-L1의 당화는 세포가 N-연결 당화 억제제인 투니카마이신(TM)으로 처리되었을 때 완전히 억제되었으나(도 1f 및 4a-4d), O-글리코시다제에서는 그렇지 않았다(도 4e). 다함께, 이들 결과는 PD-L1이 시험된 세포에서 광범위하게 N-연결 당화됨을 나타낸다(Heifetz, A., et al., 1979, Biochemistry, 18:2186-2192).
실시예 3. 당화 분석
두 가지의 PD-L1-특이적 항체(항-PD-L1 및 항-hB7-H1)을 이용한 웨스턴 블롯 분석은 PD-L1 당화가 그의 세포외 도메인(ECD, 항-hB7-H1에 의해 인식됨) 상에서 발생하지만 그의 세포내 도메인(ICD, 항-PD-L1에 의해 인식됨) 상에서는 발생하지 않음을 나타낸다(도 1f 및 4c). 당화 부위를 정확히 찾아내기 위하여, 상이한 종으로부터의 PD-L1 아미노산 서열의 서열 배열을 수행하여 진화적으로 보존된 NXT 모티프인 컨센서스 N-당화 인식 서열을 조사하였다(Schwarz, F. et al., 2011, Current opinion in structural biology, 21, 576-582). 이전의 예측과 일치하게(Cheng et al., 2013, The Journal of biological chemistry, 288: 11771-85; 및 Vigdorovich et al., 2013, Structure, 21 :707-17), 4개의 NXT 모티프가 확인되었다(도 1g 및 도 5a 및 5b). 이들 서열이 사실상 당화되는지를 확인하기 위하여, 정제된 인간 PD-L1의 트립신분해 펩티드를 nano LC-MS/MS에 의해 분석하였다. 복합체 타입 N-글리칸을 보유한 당펩티드가 4 N-당화 부위의 각각에 대해 확인되어(도 6a-6h), Endo H 처리에 대한 겉보기 저항과 일치하였다(도 1e). PD-L1 단백질 상의 특정 당화 부위(들)을 결정하기 위하여 아스파라긴(N)에서 글루타민(Q)으로의 치환 시리즈를 생성하였다. 모든 4가지 돌연변이 N35Q, N192Q, N200Q, 및 N219Q가 WT PD-L1과 비교하여 당화에서 어느 정도의 감소를 나타냈다(도 1h, 레인 2, 3, 4, 및 5). 3가지의 비-NXT NQ PD-L1 돌연변이에 대해서는 검출가능한 당화의 차이가 관찰되지 않았다(도 1h, 레인 11, 12, 및 13). 또한, PD-L1 당화는 45 kDa에서의 당화 형태에 해당하는 시그널의 부재에 의해 나타내지는 대로 모든 4 아스파라긴이 글루타민으로 돌연변이된 PD-L1 4NQ 변이체에서는 완전히 제거되었다(도 1h, 레인 10 (4NQ) 및 레인 14(WT)). PD-1/PD-L1 복합체의 결정 구조에 기초하여(Lin, D.Y. et al., 2008, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 105, 3011-3016), PD-L1의 이들 4 당화 부위(N35, N192, N200 및 N219)는 단백질의 표면 상에 노출된다. PD-L1 당화 부위의 돌연변이(PD-L1 4NQ)는 예측에 기초한 전체 구조에 영향을 주지 않았다. 이들 결과는 PD-L1이 세포에서 절대적으로 N-당화 당단백질로서 존재하며 모든 4 NXT 모티프가 당화됨을 제안한다.
실시예 4. PD-L1 당표현형의 기능성
PD-L1 WT 및 4NQ 돌연변이를 내인성 PD-L1-고갈 MDA-MB-468 및 BT549 세포에서 안정하게 발현시켰다. 이들 세포주를 이용하여, PD-1 및 PD-L1 결합 친화성을 분석하였다. 나타난 대로, 당화 변이체 PD-L1 4NQ 및 PD-1 사이의 연합이 감소되었다(도 7a). 시험관내 결합 실험은 당화가 PD-L1 및 PD-1 연합을 위해 요구됨을 추가로 입증하였다(도 7b). BT549 PD-L1 WT 및 PD-L1 4NQ 발현 안정한 세포주를 인간 일차 T 세포와 공동배양하여 T 세포-매개 종양 세포 사멸을 시험관내에서 측정하였다(시간-경과 현미경). PD-1 결합의 상실과 일치하게, PD-L1 4NQ 안정한 세포주는 암세포의 T 세포-매개 사멸을 더 많이 나타냈다(도 7c). 또한, PD-L1의 면역억제 기능을 생체내에서 동계 4T1 마우스 모델에서 측정하였으며 여기서는 PD-L1 WT 또는 PD-L1 4NQ 발현 4T1 세포가 주어진 BALB/c 마우스에서 종양 성장을 측정하였다. PD-L1 WT를 발현한 세포를 가진 마우스와 비교하여, PD-L1 4NQ를 발현한 세포를 가진 마우스는 감소된 종양 크기 및 더욱 활성화된 세포독성 T 세포를 나타냈다(도 7d 및 7e). 다함께, 이들 데이터는 PD-L1 당화의 상실이 PD-1과의 그의 상호작용을 손상시키며 PD-l/PD-L1 상호작용이 종양 세포가 T 세포에 의한 면역 감시를 회피하도록 하는 능력을 손상시킴을 보여준다. 따라서, PD-L1이 당화되지 않거나 또는 비정상적으로 당화되는 종양 세포는 기능성 이펙터 T-세포에 의해 사멸되기 쉬운 표적을 제공한다. 그들의 막-발현된 PD-L1의 손상된 당화에 의해 종양 세포가 T-세포 면역 감시를 피하는 것을 방지하거나 차단하는 이 기전은 PD-L1 당표현형의 완전성이 그의 면역억제 기능을 위해 요구됨을 추가로 확증한다.
실시예 5. 당화 PD-L1-결합 단일클론 항체의 생산 및 스크리닝
표준 프로토콜에 따라 SP2/0 쥐 골수종 세포를 인간 PD-L1-면역된 BALB/c 마우스(n=6)(안티바디 솔루션, 인크.(Antibody Solution, Inc.))로부터 분리된 비장 세포와 융합시켜 당화 인간 PD-L1에 대해 생성된 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 수득하였다. 융합 전에, 면역된 마우스로부터의 혈청을 FACS 분석을 이용하여 PD-L1 면역원에의 결합에 대해 확인하였다. 단일클론 항체(MAb)-생산 하이브리도마가 생성되었다. 모든 MAb의 아이소타입은 IgG1이었다. 항체를 생산한 하이브리도마를 다시 특이성에 대해 시험하였다.
당화 PD-L1 항원에 대해 특이적이며 비-당화 PD-L1에 비하여 우선적으로 당화 PD-L1 항원에 결합하는 항-glycPD-L1 MAb(즉, 당화 PD-L1 특이적 MAb)를 확인하기 위하여, 상이한 타입의 분석을 수행하였다. 당화 PD-L1에의 MAb의 우선적 결합을 검출하기 위한 스크리닝 분석에서, 항체 결합은 (세포막 결합된 단백질을 이용한) FACS 분석을 통한 형광 강도의 측정에 기초하여 결정하였다. 예로서, BT549 인간 유방암 세포주를 이용하여 분석을 수행하였다. 예시적으로, PD-L1 WT(완전히 당화됨)를 과발현하는 BT549 세포를 종래의 절차에 따라 비오틴으로 라벨링하고, 그 후 PD-L1 4NQ(완전히 비당화 PD-L1 변이체)를 과발현하는 BT549 세포와 혼합하였다. 혼합된 세포를 항-PD-L1 항체, 예를 들어, 항-glycPD-L1 항체와 항온처리하고, 검출 제제로서 FITC와 접합된 이차 항체와 더 항온처리하였다. 세척 후, 형광 강도(측정된 형광 강도, MFI)를 FACS/유동세포측정 분석을 통해 측정하여 막 결합된 PD-L1 WT(세포 상) 또는 4NQ PD-L1(세포 상)에의 항-PC-L1 항체의 상대적 결합을 평가하였다. 4NQ PD-L1에 비하여 WT PD-L1에서 유의하게 더 높은 MFI를 나타낸 항체를 추가 평가를 위하여 선택하였다. STM004 및 STM115 MAb의 형광 결합 분석을 위한 결과가 하기 표 6에 제시되며, 표 6은 야생형(당화) PD-L1을 발현하는 BT549 세포(BT549PD-L1WT 세포)에의 항체 결합 대 변이체(비-당화 4NQ) PD-L1을 발현하는 BT549 세포(BT549PD-L1 4NQ 세포)에의 항체 결합을 위한 MFI 값을 보여준다. 표 6의 실험 결과는 BT549PD-L1 4NQ 세포(비-당화 PD-L1-발현 세포)에 비교하여BT549PD-L1WT 세포(당화 PD-L1-발현 세포)에의 STM004 MAb 결합을 위해 대략 5-배 더 높은 MFI 값을 보여준다. BT549PD-L1 4NQ 세포에 비교하여 BT549PD-L1WT 세포에의 STM115 결합을 위해 2-배 이상 더 높은 MFI 값이 결정되었다.
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표 6. 항- glycPD -L1 MAb를 위해 측정된 형광 강도 값
결합 분석에 기초하여, 42개의 후보 MAb-생산 하이브리도마를 선택하고, ADCF 배지에서 성장시키고, 단일클론 항체를 함유한 그들의 상등액을 농축하고 정제하였다.
일부 경우에, 정제된 MAb를 살아있는 세포 영상화 분석인 인큐사이트(Incucyte)™(에센 바이오사이언스(Essen Bioscience))를 이용하여 PD-L1과 PD-1 사이의 상호작용(PD-L1/PD-1 상호작용)을 중화하거나 억제하는 그들의 능력에 대해 추가로 시험하였다. 이 분석을 위해, PD-L1을 발현하는 BT-549 세포를 항-인간 PD-L1 항체와 그리고 형광-라벨링된 PD-1-Fc 융합 단백질과 항온처리하였다. 리간드 및 수용체 결합을 제조사의 설명서에 따라 매 시간마다 인사이사이트(Incycyte)™줌(Zoom)에 의해 정량하였다. 이 분석에 기초하여, 시험된 42개 MAb 중에, 15개 MAb가 PD-1에의 PD-L1의 결합을 완전히 차단하는 것으로 밝혀졌다. 강한 차단 효능을 나타낸 15개 MAb 중 일부는 또한 비-당화 PD-L1에 어느 정도 결합하였다.
다른 분석에서, 당화 인간 PD-L1 단백질 및 비-당화 PD-L1, 즉, PNGase F로 처리된 PD-L1 단백질 둘 모두를 고체상 위에 코팅하고 MAb의 PD-L1 항원에 대한 결합 친화성에 대해 시험하였다. "PD-L1 항원"이 "PD-L1 단백질"과 동의어임이 이해될 것이다. MAb 중 12개가 비-당화 PD-L1 단백질(PNGase F 처리된 단백질)에 비하여 당화 PD-L1 단백질과 더 높은 친화성 상호작용을 나타냈다. 추가의 특이성 분석을 위하여, 선택된 MAb를 웨스턴 블롯 및 FACS 유동세포측정 분석에 의해 분석하였다. 다양한 분석으로부터, STM004 및 STM115와 같은 MAb가 PD-L1의 비-당화 형태에 비하여 PD-L1의 당화 형태에 특이적으로 결합함이 밝혀졌으며, 이는 당화 PD-L1 항원에 대한 이들 MAb의 특이성을 더 확증하였다.
실시예 6. 특이적 당화 PD-L1-결합 항체의 결합 영역의 확인
당화 PD-L1에 결합한 단일클론 항-glycPD-L1 항체의 영역을 확인하기 위하여, 야생형(당화) PD-L1(PD-L1 WT), 및 당화 변이체 단백질 N35/3NQ, N192/3NQ, N200/3NQ, 및 N219/3NQ(위치 35, 192, 200 또는 219의 당화 부위 중 하나가 그 위치에서 야생형 아스파라긴(N)이고 다른 세 위치는 글루타민(Q)로 돌연변이되어 당화되지 않음)(도 8a)를 PD-L1 넉다운 BT549 세포에서 과발현시켰다. 웨스턴 블롯에 의해 결정할 때, 일부 MAb는 다른 PD-L1 돌연변이에 비하여 더 높은 수준의 결합으로 특정 PD-L1 돌연변이를 인식하여, 그러한 MAb가 부위-특이적임을 입증하였다. 예를 들어, MAb STM004는 N35/3NQ 돌연변이를 인식하고 결합하였으나, N192/3NQ, N200/3NQ, 또는 N219/3Q 돌연변이에 결합하지 않아, 이 항체가 PD-L1의 N35 영역에 결합하였음을 입증하였다(도 8b). 또한, 간암세포 용해물을 이용한 웨스턴 블롯 분석 또한 STM004와 같은 대표적인 항-glycPD-L1 항체를 위한 상이한 패턴의 PD-L1 당화를 밝혔다(도 8c).
이들 MAb의 병리조직학적 관련성은 면역조직화학(IHC) 염색에 의해 추가로 입증되었다. 세포원심분리기 염색 분석에서, 항-glycPD-L1 단일클론 항체는 일관되게 PD-L1 단백질의 당화 부분을 인식하고 결합하였으나, 비당화 PD-L1 단백질에는 결합하지 않았다. 인간 삼중 음성 유방암 환자 샘플에서, 항-glycPD-L1 단일클론 항체는 또한 1:30 비율로 막과 세포질 염색을 나타냈다. 이들 데이터는 항-glycPD-L1 단일클론 항체가 바이오마커로서 당화 PD-L1의 검출을 위한 바이오마커 분석에서 사용될 수 있음을 입증하였다.
실시예 7. 당화 PD-L1-결합 항체의 에피토프 맵핑
마우스 단일클론 항-glycPD-L1 항체 STM004를 위한 에피토프 맵핑을 코발엑스 에이지(CovalX AG)(스위스)에 의해 수행하였다. 일반적으로 항-glycPD-L1 항체 그리고 특히 STM004 MAb에 의해 인식되는 에피토프의 특성, 예를 들어, 선형 또는 형태적임을 결정하기 위하여, 표적 항원으로서 PD-L1 단백질과 항-glycPD-L1 항체 사이의 상호작용이 PD-L1 항원의 단백질분해에 의해 생성되는 비구조화 펩티드에 의해 억제될 수 있는지를 평가하기 위한 연구를 수행하였다. 만일 PD-L1 항원의 완전한 단백질분해에 의해 생성된 펩티드가 항체에 의한 항원의 결합을 억제할 수 있다면, 상호작용은 형태에 기초하지 않으며 에피토프는 선형이다. 항원의 서열로부터 생성된 중복되는 펩티드 뱅크를 이용한 간단한 경쟁 분석이 에피토프의 서열을 결정하기 위해 충분하다. 대안적으로, 만일 PD-L1 항원의 완전한 단백질분해에 의해 생성된 펩티드가 항체에 의한 항원의 결합을 억제할 수 없다면, 표적의 형태가 상호작용을 위해 필요한 것으로 결정되며, 에피토프는 형태적이며, 예를 들어 연속적(루프와 같은 특별한 형태를 가짐) 또는 불연속적(삼차 구조로 인함)이다. 형태적 에피토프에의 결합을 더 자세히 설명하기 위하여, 공유적 라벨링, 펩티드 맵핑 및 고해상도 질량 분석법도 이용하였다.
경쟁 분석은 PD-L1 항원으로부터 생성된 펩티드가 대표적인 MAb STM004와 같은 본 명세서에 개시된 항-glycPD-L1 단일클론 항체의 PD-L1 항원에의 결합을 억제하지 않음을 보여주어, 이들 항체 및 대표적인 STM004 MAb에 의해 인식되는 PD-L1의 에피토프 영역이 형태적이며 선형이 아님을 확인하였다. 화학적 가교결합, 고질량 MALDI 질량 분석법 및 nLC-Orbitrap 질량 분석법을 이용하여, PD-L1 단백질과 항체 사이의 상호작용 표면을 규명하였다. PD-L1의 펩신 단백질분해, 결과적인 펩신-생성된 PD-L1 펩티드와 항체 및 그대로의 PD-L1 단백질의 혼합물 및 공지 방법에 의한 항원/항체 상호작용의 분석을 이용한 경쟁 분석은 PD-L1 펩티드에 의한 STM004 단일클론 항체의 PD-L1 항원에의 결합의 검출가능한 억제를 나타내지 않았다. 따라서, 항-PD-L1 MAb STM004에 의해 인식된 PD-L1 상의 에피토프는 형태적이며 선형이 아닌 것으로 결정되었다.
STM004는 PD-L1 상의 에피토프에 결합하며 서열 번호 1의 잔기 48 내지 78 이내의 위치 Y56, K62 및 K75(서열 번호 1에서 넘버링된 대로임)의 아미노산 잔기와 접촉하는 것으로 결정되었다.
STM115는 PD-L1 상의 에피토프에 결합하며 서열 번호 1의 잔기 61 내지 78 이내의 위치 K62, H69 및 K75(서열 번호 1에서 넘버링된 대로임)의 아미노산 잔기와 접촉하는 것으로 결정되었다.
실시예 8. T 세포 사멸 분석
본 명세서에 개시된 항-glycPD-L1 단일클론 항체의 종양 세포에 대한 세포독성 활성을 결정하기 위하여 T 세포 사멸 분석을 이용하였다. 이용한 프로토콜은 다음과 같다: 제0일에, 당화 야생형 PD-L1-(PD-L1 WT)발현 BT549 RFP 표적 세포 배양물로부터 혈청-함유 배지를 제거하고 PBS로 2회 부드럽게 린스하였다. 세포를 수집하고 계수하였다. 세포 현탁액을 원심분리하고(1000 RPM, 4분) 세포 펠렛을 50,000 세포/mL로 배양 배지내에 재현탁시켰다. 수동 다채널 피펫을 이용하여, 세포를 평탄-바닥 미세플레이트의 모든 웰에 접종하였다(100 μL/웰, 즉, 5000 세포/웰). 플레이트를 30분 동안 주위 온도에서 둔 후, 인큐사이트 줌® 생-세포 영상화기 내에 위치시키고 첫번째 스캔 일정 이전에 20분 동안 평형화시켰다. 24시간 반복 스캐닝(1Ox 대물렌즈(objective))을 3시간 마다 계획하였으며, 첫번째 스캔을 즉시 수행하였다. 원하는 컨플루언스(예를 들어, 20%)가 이루어질 때까지 다음 18시간동안(밤새) 세포 컨플루언스를 모니터하였다.
분석일인 다음날 아침(즉, 제1일), 인큐사이트™ 카스파제 3/7 어팝토시스 녹색 형광 검출 시약(에센 바이오사이언스 4440)의 10 μΜ 용액을 분석 배지(4x 2.5 μΜ의 최종 분석 농도)에서 제조하고 인큐베이터에서 37℃로 가온하였다. 항-CD3 항체(100 ng/mL) + IL-2(10 ng/mL) T 세포 활성자 처리를 분석 배지에서 4x 최종 분석 농도로 준비하고 37℃로 가온하였다. 시험 MAb 또한 준비하였다. 인큐베이터로부터 표적 세포 플레이트를 제거하고 세포층을 손상시키지 않도록 주의하면서 배지를 흡입시켰다. 다채널 피펫을 이용하여, 25 μL의 가온된 카스파제 3/7 용액을 각 웰 내로 옮겼다. 그 후, 25 μL의 가온된 항-CD3 항체 + IL-2, 및 항체를 세포 플레이트의 적절한 웰 내에 두었다. 이펙터 세포(PBMC 또는 전체 T 세포)를 함유한 추가의 50 μL 배지를 총 분석 부피가 100 μL가 되도록 첨가하였다. 기포가 제거된 세포 플레이트를 인큐사이트 줌® 장비내에 위치시키고 첫번째 스캔 전에 20분 동안 평형화시켰다. 최대 5일 동안 매 2 내지 3 시간마다 24-시간 반복 스캐닝을 계획하였다. (대물렌즈 1Ox; 용기 타입: 코닝(Corning) 3596; 스캔 모드: 표준; 스캔 패턴: 웰 당 2 영상; 채널: 상(Phase) + "녹색" (+ 만일 눅라이트(NucLight)™레드(Red) 표적 세포가 사용되었으면 "적색").
분석을 위하여, 시간에 걸쳐 시야에서 "거대" 녹색-형광 물체(핵)의 총 수를 계수하여 인큐사이트™ 소프트웨어에서 표적-세포 어팝토시스를 정량하였다. 표적 세포의 증식을 적색 세포 핵의 수에 해당하는, 적색 물체 카운트로부터 측정하였다. 데이터를 형광 물체의 수/mm2로서 표현하였다. 데이터는 본 명세서에 개시된 항체, 구체적으로 STM004의 추가가 종양 세포 사멸을 향상시켰음을 보여주었다(도 9).
실시예 9. 결합 분석
본 명세서에 개시된 항-glycPD-L1 단일클론 항체가 PD-1과 PD-L1의 상호작용을 특이적으로 억제하는지를 결정하기 위하여, 하기 결합 분석을 수행하였다. 분석의 제0일에, PD-L1-발현 BT549 표적 세포 배양물로부터 혈청-함유 배지를 제거하고 D-PBS로 2회 부드럽게 린스하였다. 세포를 수집하고 계수하였다. 세포 현탁액을 원심분리하고(1000 RPM, 5분) 세포 펠렛을 50,000 세포/mL로 배양 배지내에 재현탁시켰다. 수동 다채널 피펫을 이용하여, 세포를 평탄-바닥 미세플레이트의 모든 웰에 접종하였다(100 μL/웰, 즉, 5000 세포/웰). 플레이트를 30분 동안 주위 온도에서 두었다. 그 후, 세포를 함유한 플레이트를 5% CO2 인큐베이터에서 밤새 항온처리하였다.
분석의 제1일(즉, 다음날 아침)에, 1 μg/mL PD-1/Fc 및 알렉스 플루오르 488-염소 항-인간 IgG의 1:400 희석액을 함유한 배양 배지를 준비하고 인큐베이터에서 37℃로 가온하였다. 세포 플레이트를 인큐베이터로부터 제거하고 세포층을 손상시키지 않도록 주의하면서 배지를 흡입시켰다. 50 μL의 시험 항체를 투여량-의존 방식으로 각 웰에 첨가하였다. PD-1/Fc 및 알렉스 플루오르 488-염소 항-인간 IgG를 함유한 배양 배지 50 μL를 각 웰에 첨가하였다. 세포 플레이트를 인큐사이트 줌® 장비내에 위치시키고 첫번째 스캔 전에 20분 동안 평형화시켰다. 24-시간 자동화 반복 스캐닝(1Ox)을 최대 24시간 동안 매 1-2시간마다 계획하였다. 대물렌즈: 1Ox; 용기 타입: 코닝 3596; 스캔 모드: 표준; 스캔 패턴: 웰 당 4 영상; 채널: 상 + "녹색".
도 10a는 대표적인 MAb STM004가 투여량 의존 방식으로, PD-L1을 발현하는 세포에의 PD-1/Fc의 결합을 억제하였음을 보여준다. 대조군 분석의 결과는 도 10b에 나타난다.
본 명세서에 개시되고 청구된 모든 방법은 본 명세서에 비추어 과도한 실험없이 이루어지고 수행될 수 있다. 조성물과 방법이 실시양태 및 바람직한 실시양태 측면에서 개시되었지만, 개시된 개념, 사상 및 범주를 벗어나지 않고서 본 명세서에 개시된 방법 및 방법의 단계 또는 단계의 순서에서 변형이 이루어질 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적으로 그리고 생리학적으로 관련되는 일부 제제가 동일하거나 유사한 결과를 이루면서 본 명세서에 개시된 제제를 위해 치환될 수 있음이 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 모든 그러한 유사한 대체물 및 변형은 첨부된 청구의 범위에 의해 정의된 개시된 실시양태의 사상, 범주 및 개념 이내인 것으로 간주된다.
본 명세서에서 인용된 모든 특허, 공개된 특허 출원 및 다른 간행물은 본 ㅊ출원에서 참고로 본원에 통합된다.
SEQUENCE LISTING <110> STCUBE & CO., INC. BOARD OF REGENTS, THE UNIVERSITY OF TEXAS SYSTEM <120> ANTIBODIES SPECIFIC TO GLYCOSYLATED PD-L1 AND METHODS OF USE THEREOF <130> 24258.105003PCT <140> <141> <150> 62/140,135 <151> 2015-03-30 <160> 100 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 290 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu 1 5 10 15 Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr 20 25 30 Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu 35 40 45 Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile 50 55 60 Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser 65 70 75 80 Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn 85 90 95 Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr 100 105 110 Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val 115 120 125 Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val 130 135 140 Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr 145 150 155 160 Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser 165 170 175 Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn 180 185 190 Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr 195 200 205 Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu 210 215 220 Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His 225 230 235 240 Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr 245 250 255 Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys 260 265 270 Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu 275 280 285 Glu Thr 290 <210> 2 <211> 342 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 2 caggttcagc tgcaacagtc tgacgctgag ttggtgaaac ctggggcttc agtgaagata 60 tcctgcaagg cttctggcta caccttcagt gaccatgcta ttcactgggt gaaacagagg 120 cctgaacagg gcctggaatg gattggatgt atttctcccg gaagtggtga tattacttat 180 aatgagaaat tcaagggcaa ggccaccctg actgcagaca aatcctccag cactgcctac 240 atgcagctca acagcctgac atctgaggat tctgcagtgt atttctgtaa aagatggggg 300 cttgactact ggggccaagg aaccactctc acagtctcct ca 342 <210> 3 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 3 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp His 20 25 30 Ala Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Cys Ile Ser Pro Gly Ser Gly Asp Ile Thr Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Lys Arg Trp Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 4 Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 5 Asp His Ala Ile His 1 5 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 6 Ser Pro Gly Ser Gly Asp 1 5 <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 7 Cys Ile Ser Pro Gly Ser Gly Asp Ile Thr Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 8 Trp Gly Leu Asp Tyr 1 5 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 9 Lys Arg Trp Gly Leu Asp 1 5 <210> 10 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 10 gacattgtgc tcacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagagccacc 60 atctcctgca gagccagtga aagtgttgaa ttttatggca caactttaat gcagtggtac 120 caacagaaac caggacagcc acccagactc ctcatctatg ctgcatccaa cgtagaatct 180 ggggtccctg ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcagcct caacatccat 240 cctgtggagg acgatgatat tgcaatgtat ttctgtcagc aaagtaggaa ggttccgtac 300 acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaa 333 <210> 11 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 11 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Phe Tyr 20 25 30 Gly Thr Thr Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Asp Asp Asp Ile Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Arg 85 90 95 Lys Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 12 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 12 Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Phe Tyr Gly Thr Thr Leu Met Gln 1 5 10 15 <210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 13 Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Phe Tyr Gly Thr Thr Leu Met Gln 1 5 10 15 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 14 Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser 1 5 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 15 Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 16 Gln Gln Ser Arg Lys Val Pro Tyr Thr 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 17 Gln Gln Ser Arg Lys Val Pro Tyr Thr 1 5 <210> 18 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 18 gaagtgatgc tggtggagtc tgggggagcc ttagtggagc ctggagggtc cctgaaactc 60 tcctgtgtag cctctggatt cactttcagt aactatgcca tgtcttgggt tcgccagact 120 ccagagagga ggctggagtg ggtcgcatcc attactaatg gtggtactta cacctactat 180 ccagacagtg tgaagggtcg attcaccatc tccagagaca atgccaggaa caccctgtac 240 ctccaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccatgt atttctgtgc aagaccgctc 300 cattactacg gtggtagcca ctttgactac tggggccaag gcaccactct cacggtctcc 360 tca 363 <210> 19 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 19 Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Glu Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Arg Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Thr Asn Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Leu His Tyr Tyr Gly Gly Ser His Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 20 Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 1 5 <210> 21 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 21 Asn Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 22 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 22 Thr Asn Gly Gly Thr Tyr 1 5 <210> 23 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 23 Ser Ile Thr Asn Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 1 5 10 15 Lys Gly <210> 24 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 24 Pro Leu His Tyr Tyr Gly Gly Ser His Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 25 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 25 Pro Leu His Tyr Tyr Gly Gly Ser His Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 26 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 26 gaaattgtgc tcacccagtc tccagcactc atggctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60 atcacctgca gtgtcagttc aagtataagt tccaacactt tgcactggta ccagcagaag 120 tcagaaattt cccccaaacc ctggatttat ggcacatcca acctggcttc tggagtccct 180 gttcgcttca gtggcagtgg atctgggacc tcttattctc tcacaatcag cagcatggag 240 gctgaagatg ctgccactta ttactgtcaa cagtggagta gttacccact cacgttcgga 300 ggggggacca agctggaaat aaaa 324 <210> 27 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 27 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ala Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Asn 20 25 30 Thr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Glu Ile Ser Pro Lys Pro Trp 35 40 45 Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 28 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 28 Ser Val Ser Ser Ile Ser Ser Asn Thr Leu His 1 5 10 <210> 29 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 29 Ser Val Ser Ser Ile Ser Ser Asn Thr Leu His 1 5 10 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 30 Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 31 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 31 Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 32 Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 33 Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 34 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 34 tcaattgtca tattgctac 19 <210> 35 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 35 ttgactccat ctttcttca 19 <210> 36 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 36 gtggtagagt atggtagcca aatgacaatt gaatgcaaa 39 <210> 37 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 37 tttgcattca attgtcattt ggctaccata ctctaccac 39 <210> 38 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 38 gagaggagaa gcttttccag gtgaccagca cactgag 37 <210> 39 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 39 ctcagtgtgc tggtcacctg gaaaagcttc tcctctc 37 <210> 40 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 40 gaccagcaca ctgagaatcc agacaacaac taatgagat 39 <210> 41 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 41 atctcattag ttgttgtctg gattctcagt gtgctggtc 39 <210> 42 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 42 gagagaggag aagcttttcc aagtgaccag cacactgaga 40 <210> 43 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 43 tctcagtgtg ctggtcactt ggaaaagctt ctcctctctc 40 <210> 44 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 44 gcataacgaa cctaaccctc ag 22 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 45 gcccaatgtc cactgtgata 20 <210> 46 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 46 gtaacctcag tcacctgcc 19 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 47 attccgctcc acaatctctg 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 48 tcttcaacct cacgctcaag 20 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 49 gtgtgcaaag acgtcatcat c 21 <210> 50 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 50 caccatcacc ctcctttcta ttc 23 <210> 51 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 51 gaacaacagg tctgggattt ct 22 <210> 52 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 52 gccttttgcc atcgacatg 19 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 53 agtcagattc ttgcatccct g 21 <210> 54 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 54 caaggagagc attaggacca ag 22 <210> 55 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 55 ccccattaaa cctcaggact g 21 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 56 tcgtcatggt gtggtattcc 20 <210> 57 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 57 caggaagatg ggctgatcc 19 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 58 gaccgcactc atcttacacc 20 <210> 59 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 59 ggaggttggc tgaaggaata c 21 <210> 60 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 60 tcccctgctt taaccatcg 19 <210> 61 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 61 ttgtcaccta tactggcgtt g 21 <210> 62 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 62 ctgagtgatg gaacgagtga g 21 <210> 63 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 63 tagagatgac cagatgcaac g 21 <210> 64 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 64 gagtccaact tcacggctta t 21 <210> 65 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 65 agtggtccag gaagacatag a 21 <210> 66 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 66 tgtgagggaa agatcaagtg g 21 <210> 67 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 67 gctctccaag gtaaatgagg ac 22 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 68 ccactgagtt cgtcaagagg 20 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 69 acttccttgc catctgtcac 20 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 70 tggctcgctg ataagttctg 20 <210> 71 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 71 gtgagtctgg tttgggagaa g 21 <210> 72 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 72 gcaaagacct gtacgccaac a 21 <210> 73 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 73 tgcatcctgt cggcaatg 18 <210> 74 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic consensus sequence <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Ile, Met or Leu <220> <221> MOD_RES <222> (32)..(32) <223> Asp or Asn <400> 74 Ala Phe Thr Ile Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly 1 5 10 15 Ser Asn Val Thr Xaa Glu Cys Arg Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Xaa 20 25 30 Leu Leu Ala Leu Val Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Lys Ile Ile 35 40 45 Gln Phe Val Asn Gly 50 <210> 75 <211> 53 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75 Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly 1 5 10 15 Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp 20 25 30 Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile 35 40 45 Gln Phe Val His Gly 50 <210> 76 <211> 53 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 76 Ala Phe Thr Ile Thr Ala Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly 1 5 10 15 Ser Asn Val Thr Met Glu Cys Arg Phe Pro Val Glu Arg Glu Leu Asp 20 25 30 Leu Leu Ala Leu Val Val Tyr Trp Glu Lys Glu Asp Glu Gln Val Ile 35 40 45 Gln Phe Val Ala Gly 50 <210> 77 <211> 53 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 77 Ala Phe Thr Ile Thr Ala Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly 1 5 10 15 Ser Asn Val Thr Met Glu Cys Arg Phe Pro Val Glu Gln Lys Leu Asp 20 25 30 Leu Leu Ala Leu Val Val Tyr Trp Glu Lys Glu Asp Lys Glu Val Ile 35 40 45 Gln Phe Val Glu Gly 50 <210> 78 <211> 53 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 78 Ala Phe Thr Ile Thr Val Ser Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly 1 5 10 15 Ser Asn Val Thr Leu Glu Cys Arg Phe Pro Val Asp Lys Gln Leu Asn 20 25 30 Leu Leu Val Leu Val Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Lys Ile Ile 35 40 45 Gln Phe Val Asn Gly 50 <210> 79 <211> 53 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 79 Ala Phe Thr Ile Thr Val Pro Lys Asp Met Tyr Glu Val Glu Tyr Gly 1 5 10 15 Ser Asn Val Thr Leu Glu Cys Arg Phe Pro Val Asp Lys Gln Leu Asn 20 25 30 Leu Leu Ala Leu Val Val Tyr Trp Glu Met Lys Asp Lys Lys Ile Ile 35 40 45 Gln Phe Val Asn Gly 50 <210> 80 <211> 53 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 80 Ala Phe Thr Ile Thr Val Thr Lys Asp Leu Tyr Val Val Asp Tyr Gly 1 5 10 15 Ser Asn Val Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Glu Pro Leu Asn 20 25 30 Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asn Lys Lys Ile Ile 35 40 45 Gln Phe Val Asn Gly 50 <210> 81 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 81 Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys 1 5 10 15 Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln 20 <210> 82 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 82 Lys Leu Phe Asn Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile 1 5 10 <210> 83 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 83 Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr Phe Arg Arg 1 5 10 15 <210> 84 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 84 Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile Pro 1 5 10 15 Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr 20 25 <210> 85 <211> 398 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 85 atggaatgca gctgggttat tctcttcttc ctgtcagtac tacaggtgtc cactcccagg 60 ttcagctgca acagtctgac gctgagttgg tgaaacctgg ggcttcagtg aagatatcct 120 gcaaggcttc tggctacacc ttcagtgacc atgctattca ctgggtgaaa cagaggcctg 180 aacagggcct ggaatggatt ggatgtattt ctcccggaag tggtgatatt acttataatg 240 agaaattcaa gggcaaggcc accctgactg cagacaaatc ctccagcact gcctacatgc 300 agctcaacag cctgacatct gaggattctg cagtgtattt ctgtaaaaga tgggggcttg 360 actactgggg ccaaggaacc actctcacag tctcctca 398 <210> 86 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 86 Met Glu Cys Ser Trp Val Ile Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Ser Asp His Ala Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Cys Ile Ser Pro Gly Ser Gly Asp Ile Thr Tyr Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Phe Cys Lys Arg Trp Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 115 120 125 Leu Thr Val Ser Ser 130 <210> 87 <211> 393 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 87 atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ctccactggt 60 gacattgtgc tcacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagagccacc 120 atctcctgca gagccagtga aagtgttgaa ttttatggca caactttaat gcagtggtac 180 caacagaaac caggacagcc acccagactc ctcatctatg ctgcatccaa cgtagaatct 240 ggggtccctg ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcagcct caacatccat 300 cctgtggagg acgatgatat tgcaatgtat ttctgtcagc aaagtaggaa ggttccgtac 360 acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaa 393 <210> 88 <211> 131 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 88 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala 20 25 30 Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser 35 40 45 Val Glu Phe Tyr Gly Thr Thr Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser 85 90 95 Leu Asn Ile His Pro Val Glu Asp Asp Asp Ile Ala Met Tyr Phe Cys 100 105 110 Gln Gln Ser Arg Lys Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys 130 <210> 89 <211> 420 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (30)..(30) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 89 atggacttcg ggctaaactg ggttttcctn gtccttattt taaaaggtgt ccagtgtgaa 60 gtgatgctgg tggagtctgg gggagcctta gtggagcctg gagggtccct gaaactctcc 120 tgtgtagcct ctggattcac tttcagtaac tatgccatgt cttgggttcg ccagactcca 180 gagaggaggc tggagtgggt cgcatccatt actaatggtg gtacttacac ctactatcca 240 gacagtgtga agggtcgatt caccatctcc agagacaatg ccaggaacac cctgtacctc 300 caaatgagca gtctgaggtc tgaggacacg gccatgtatt tctgtgcaag accgctccat 360 tactacggtg gtagccactt tgactactgg ggccaaggca ccactctcac ggtctcctca 420 <210> 90 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 90 Met Asp Phe Gly Leu Asn Trp Val Phe Leu Val Leu Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Glu 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Asn Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Arg Arg Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Ser Ile Thr Asn Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Arg Pro Leu His Tyr Tyr Gly Gly Ser His Phe Asp 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 91 <211> 390 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 91 atggattttc atgtgcagat tttcagcttc atgctaatca gtgtcacagt catttcgtcc 60 agtggagaaa ttgtgctcac ccagtctcca gcactcatgg ctgcatctcc aggggagaag 120 gtcaccatca cctgcagtgt cagttcaagt ataagttcca acactttgca ctggtaccag 180 cagaagtcag aaatttcccc caaaccctgg atttatggca catccaacct ggcttctgga 240 gtccctgttc gcttcagtgg cagtggatct gggacctctt attctctcac aatcagcagc 300 atggaggctg aagatgctgc cacttattac tgtcaacagt ggagtagtta cccactcacg 360 ttcggagggg ggaccaagct ggaaataaaa 390 <210> 92 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 92 Met Asp Phe His Val Gln Ile Phe Ser Phe Met Leu Ile Ser Val Thr 1 5 10 15 Val Ile Ser Ser Ser Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu 20 25 30 Met Ala Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Asn Thr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Glu 50 55 60 Ile Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly 65 70 75 80 Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu 85 90 95 Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 100 105 110 Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 115 120 125 Ile Lys 130 <210> 93 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 93 Leu Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn 1 5 10 15 Ile Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His 20 25 30 <210> 94 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic consensus sequence <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Ile or Val <220> <221> MOD_RES <222> (44)..(44) <223> Leu, Ala, Val or Tyr <220> <221> MOD_RES <222> (45)..(45) <223> Ala, Thr, Pro, Leu, Val or Ile <220> <221> MOD_RES <222> (46)..(46) <223> His, Arg, Asp or Val <220> <221> MOD_RES <222> (48)..(48) <223> Pro or Ala <400> 94 Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr Ser Thr Leu Arg Xaa Asn Ala Thr Ala 1 5 10 15 Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr Phe Arg Arg Leu Gly Pro Glu Glu Asn 20 25 30 His Thr Ala Glu Leu Val Ile Pro Glu Ile Pro Xaa Xaa Xaa Pro Xaa 35 40 45 Asn Lys Arg Thr His 50 <210> 95 <211> 53 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 95 Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr 1 5 10 15 Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn 20 25 30 His Thr Ala Glu Leu Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro 35 40 45 Asn Glu Arg Thr His 50 <210> 96 <211> 53 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 96 Gly Met Leu Leu Asn Val Thr Ser Ser Leu Arg Val Asn Ala Thr Ala 1 5 10 15 Asn Asp Val Phe Tyr Cys Thr Phe Trp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asn 20 25 30 His Thr Ala Glu Leu Ile Ile Pro Glu Leu Pro Ala Thr His Pro Pro 35 40 45 Gln Asn Arg Thr His 50 <210> 97 <211> 53 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 97 Glu Lys Leu Leu Asn Val Thr Ser Val Leu Arg Val Asn Ala Thr Ala 1 5 10 15 Asn Asp Val Phe His Cys Thr Phe Trp Arg Val His Ser Gly Glu Asn 20 25 30 His Thr Ala Glu Leu Ile Ile Pro Glu Leu Pro Val Pro Arg Leu Pro 35 40 45 His Asn Arg Thr His 50 <210> 98 <211> 52 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 98 Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Ala 1 5 10 15 Asp Lys Ile Phe Tyr Cys Thr Phe Arg Arg Leu Gly His Glu Glu Asn 20 25 30 Asn Thr Ala Glu Leu Val Ile Pro Glu Pro Tyr Leu Asp Pro Ala Lys 35 40 45 Lys Arg Asn His 50 <210> 99 <211> 52 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 99 Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr Ser Thr Leu Arg Val Asn Ala Thr Thr 1 5 10 15 Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr Phe Arg Arg Leu Gly Pro Glu Glu Asn 20 25 30 Ser Thr Ala Val Leu Val Ile Pro Glu Pro Tyr Val Asp Pro Ala Arg 35 40 45 Lys Arg Thr His 50 <210> 100 <211> 52 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 100 Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Ala Thr Ala 1 5 10 15 Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr Phe Arg Arg Ser Gly Leu Glu Glu Asn 20 25 30 Ser Thr Ala Glu Leu Val Ile Pro Glu Pro Leu Ile Val Pro Ala Asn 35 40 45 Lys Arg Thr His 50

Claims (63)

  1. 비당화 PD-L1에 비하여 당화 PD-L1에 선택적으로 결합하며 PD-1에의 당화 PD-L1의 결합을 억제하는 분리된 항체.
  2. 제1항에 있어서, 재조합적으로 조작되거나, 키메라, 인간화 항체 또는 완전히 인간 항체인 분리된 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체가 비당화 PD-L1에 비하여 서열 번호 1의 아미노산 위치 35, 192, 200 및/또는 219를 포함하는 PD-L1 단백질의 영역 이내의 아미노산 잔기에 선택적으로 결합하는 분리된 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 비당화 PD-L1에의 항체 결합에 의해 나타내진 Kd의 절반 미만의 Kd로 당화 PD-L1에 결합하는 분리된 항체.
  5. 제4항에 있어서, 항체가 비당화 PD-L1에의 항체 결합에 의해 나타내진 Kd 보다 적어도 10분의 1 이하의 Kd로 당화 PD-L1에 결합하는 분리된 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 5-20 nM의 친화성으로 당화 PD-L1에 결합하는 분리된 항체.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 형광 라벨에 의해 직접 또는 간접적으로 검출가능한 항체가 세포 유동세포측정 분석에서 비당화 PD-L1을 발현하는 세포에의 항체 결합에 의해 나타내진 측정된 형광 강도(MFI) 보다 2-배 내지 10-배 높은 MFI로 당화 PD-L1 발현 세포에 우선적으로 결합하는 분리된 항체.
  8. 제7항에 있어서, 항체가 비당화 PD-L1을 발현하는 세포에의 항체 결합에 의해 나타내진 MFI 보다 3-배 내지 5-배 이상 높은 MFI로 당화 PD-L1 발현 세포에 우선적으로 결합하는 분리된 항체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1의 아미노산 56, 62, 69 및 75 중 적어도 하나를 포함하는 당화 PD-L1의 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합하는 분리된 항체.
  10. 제9항에 있어서, 에피토프가 서열 번호 1의 영역 L48 내지 H78 이내의 아미노산을 포함하는 분리된 항체.
  11. 제9항에 있어서, 에피토프가 서열 번호 1의 영역 D61 내지 H78 이내의 아미노산을 포함하는 분리된 항체.
  12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 단일클론 항체(MAb) STM004 또는 MAb STM115에 의해 인식되는 PD-L1의 에피토프에 특이적으로 결합하는 분리된 항체.
  13. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 당화 PD-L1에의 특이적 결합을 위하여 MAb STM004 또는 MAb STM115와 경쟁하거나 교차 경쟁하는 분리된 항체.
  14. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, MAb STM004 또는 MAb STM115의 중쇄 가변(VH) 도메인 또는 경쇄 가변(VL) 도메인을 포함하는 분리된 항체.
  15. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, MAb STM004 또는 MAb STM115로부터의 중쇄 CDR 1-3 및/또는 경쇄 CDR 1-3을 포함하는 분리된 항체.
  16. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, VH 도메인이 서열 번호 3 또는 서열 번호 19의 아미노산 서열을 가지는 분리된 항체.
  17. 제1항 내지 제8항 또는 제16항 중 어느 한 항에 있어서, VL 도메인이 서열 번호 11 또는 서열 번호 27의 아미노산 서열을 가지는 분리된 항체.
  18. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, VH 도메인이 서열 번호 3의 아미노산 서열을 가지고 VL 도메인은 서열 번호 11의 아미노산 서열을 가지는 분리된 항체.
  19. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, VH 도메인이 서열 번호 19의 아미노산 서열을 가지고 VL 도메인은 서열 번호 27의 아미노산 서열을 가지는 분리된 항체.
  20. 제1항 내지 제8항 또는 제17항 중 어느 한 항에 있어서, VH 도메인이 서열 번호 3 또는 서열 번호 19의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 분리된 항체.
  21. 제1항 내지 제8항, 제16항 또는 제20항 중 어느 한 항에 있어서, VL 도메인이 서열 번호 11 또는 서열 번호 27의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 분리된 항체.
  22. 제14항 또는 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 불변 도메인(human constant domain)을 포함하는 분리된 항체.
  23. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 4의 아미노산 서열을 가진 CDR H1, 서열 번호 6의 아미노산 서열을 가진 CDR H2, 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 가진 CDR H3을 포함하는 VH 도메인, 또는 서열 번호 5의 아미노산 서열을 가진 CDR H1, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 가진 CDR H2, 및 서열 번호 9의 아미노산 서열을 가진 CDR H3을 포함하는 VH 도메인을 가진 분리된 항체.
  24. 제1항 내지 제8항 또는 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 12의 아미노산 서열을 가진 CDR L1, 서열 번호 14의 아미노산 서열을 가진 CDR L2, 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 가진 CDR L3을 포함하는 VL 도메인을 가진 분리된 항체.
  25. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 20의 아미노산 서열을 가진 CDR H1, 서열 번호 22의 아미노산 서열을 가진 CDR H2, 및 서열 번호 24의 아미노산 서열을 가진 CDR H3을 포함하는 VH 도메인, 또는 서열 번호 21의 아미노산 서열을 가진 CDR H1, 서열 번호 23의 아미노산 서열을 가진 CDR H2, 및 서열 번호 25의 아미노산 서열을 가진 CDR H3을 포함하는 VH를 가진 분리된 항체.
  26. 제1항 내지 제8항 또는 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 28의 아미노산 서열을 가진 CDR L1, 서열 번호 30의 아미노산 서열을 가진 CDR L2, 및 서열 번호 32의 아미노산 서열을 가진 CDR L3을 포함하는 VL 도메인을 가진 분리된 항체.
  27. 제1항 내지 제8항 또는 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 각각 서열 번호 4, 서열 번호 6, 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 갖거나 각각 서열 번호 5, 서열 번호 7, 및 서열 번호 9의 아미노산 서열을 가진 1, 2, 또는 3 CDR에서 1, 2, 3, 4 또는 5 아미노산 치환을 가진 아미노산 서열을 가진 CDR H1, H2 및 H3을 포함하는 VH 도메인을 가진 분리된 항체.
  28. 제1항 내지 제8항, 제23항 또는 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 각각 서열 번호 12, 서열 번호 14, 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 가진 1, 2, 또는 3 CDR에서 1, 2, 3, 4 또는 5 아미노산 치환을 가진 아미노산 서열을 가진 CDR L1, L2 및 L3을 포함하는 VL 도메인을 가진 분리된 항체.
  29. 제1항 내지 제8항 또는 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 각각 서열 번호 20, 서열 번호 22, 및 서열 번호 24, 또는 각각 서열 번호 21, 서열 번호 23, 및 서열 번호 25의 아미노산 서열을 가진 1, 2, 또는 3 CDR에서 1, 2, 3, 4 또는 5 아미노산 치환을 가진 아미노산 서열을 가진 CDR H1, H2 및 H3을 포함하는 VH 도메인을 가진 분리된 항체.
  30. 제1항 내지 제8항, 제25항 또는 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 각각 서열 번호 28, 서열 번호 30, 및 서열 번호 32의 아미노산 서열을 가진 1, 2, 또는 3 CDR에서 1, 2, 3, 4 또는 5 아미노산 치환을 가진 아미노산 서열을 가진 CDR L1, L2 및 L3을 포함하는 VL 도메인을 가진 분리된 항체.
  31. 제15항 또는 제23항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 골격 영역(human framework region)을 가진 분리된 항체.
  32. 제15항 또는 제23항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 아미노산 치환을 가진 중쇄 또는 경쇄 인간 골격 영역을 가진 분리된 항체.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 IgG, IgM, IgA 항체, 또는 그의 항원 결합 단편인 항체.
  34. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 Fab', F(ab')2, F(ab')3, 1가 scFv, 2가 scFv, 또는 단일 도메인 항체인 항체.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 영상화 제제, 화학요법 제제, 독소 또는 방사성핵종에 접합되는 항체.
  36. 서열 번호 2 또는 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
  37. 서열 번호 10 또는 26의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
  38. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 항체의 VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
  39. 약학적 허용 담체, 희석제, 부형제 또는 비히클 내에 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 조성물.
  40. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 항체의 유효량을 암을 가진 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 개체에서 PD-L1 양성 암을 치료하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 개체는 인간인 방법.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서, 암이 유방암, 폐암, 두경부암, 전립선암, 식도암, 기관암, 피부암, 뇌암, 간암, 방광암, 위암, 췌장암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 고환암, 결장암, 직장암 또는 피부암인 방법.
  43. 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 혈액암인 방법.
  44. 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 약학적 허용 조성물로 투여되는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 항체가 전신성, 정맥내, 피내, 종양내, 근육내, 복강내, 피하, 또는 국소 투여되는 방법.
  46. 제38항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 개체에게 적어도 두 번째 항암 약물 및/또는 항암 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  47. 제46항에 있어서, 두 번째 항암 치료법이 수술 치료법, 화학요법, 방사선요법, 냉동요법, 호르몬요법, 면역요법 또는 사이토카인요법인 방법.
  48. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 항체와 생물학적 샘플을 접촉시키는 것을 포함하며, 상기 항체의 결합의 검출은 샘플이 당화 PD-L1을 포함함을 나타내는, 생물학적 샘플에서 당화 PD-L1의 존재를 분석하는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 샘플이 세포 샘플인 방법.
  50. 제49항에 있어서, 세포 샘플이 개체의 암 또는 종양으로부터 오는 방법.
  51. 서열 번호 1의 위치 N35, N192, N200 또는 N219에 해당하는 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 인간 PD-L1의 적어도 7 연속 아미노산의 단편을 포함하며, PD-L1의 위치 N35, N192, N200 또는 N219에 해당하는 아미노산 중 적어도 하나는 당화되는 분리된 폴리펩티드.
  52. 제51항에 있어서, 폴리펩티드가 인간 PD-L1의 적어도 8-20 연속 아미노산을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서, 폴리펩티드가 서열 번호 1의 위치 N35, N192, N200 및/또는 N219에 해당하는 당화 아미노산을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
  54. 제51항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 그의 아미노 또는 카르복시 말단에서 면역원성 폴리펩티드에 융합되거나 접합되는 폴리펩티드.
  55. 약학적 허용 담체, 부형제, 희석제 또는 비히클 내에 제51항 내지 제54항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
  56. 제55항 있어서, 면역원성인 조성물.
  57. 제56항에 있어서, 아쥬반트(adjuvant)를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  58. 제1항의 항체의 VH 도메인을 인코딩하며 서열 번호 2 또는 18의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90-98% 동일한 뉴클레오티드 서열, 및/또는 제1항의 항체의 VL 도메인을 인코딩하며 서열 번호 19 또는 26의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90-98% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
  59. 제58항에 있어서, VH 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 서열 번호 2 또는 18과 95-99% 동일하고 및/또는 VL 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 10 또는 26과 95 내지 99% 동일한 분리된 핵산 분자.
  60. PD-1과 PD-L1의 결합을 차단하는 제제를 이용한 치료를 위한 후보 암환자를 동정하는 방법으로서, 상기 방법이 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 항체를 이용하여 환자의 암세포의 샘플로부터 유래된 세포 상의 당화 PD-L1의 존재에 대해 시험하는 것을 포함하며, 만일 상기 세포가 당화 PD-L1에 대해 양성이면 상기 환자는 상기 치료를 위한 후보인 방법.
  61. 제60항에 있어서, PD-1에의 당화 PD-L1의 결합을 방지하는 제제의 유효량을 후보 암환자로 확인된 환자에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  62. 제61항에 있어서, PD-1에의 당화 PD-L1의 결합을 방지하는 제제가 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 분리된 항체인 방법.
  63. 제62항에 있어서, 분리된 항체가 다른 항암 약물 또는 치료제와 조합되어 투여되는 방법.
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