CN105392800B

CN105392800B - 抗cxcl1、cxcl7和cxcl8抗体及其应用

Info

Publication number: CN105392800B
Application number: CN201480028264.6A
Authority: CN
Inventors: G·帕格斯; R·格雷潘
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite de Nice Sophia Antipolis UNSA
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite de Nice Sophia Antipolis UNSA
Priority date: 2013-05-17
Filing date: 2014-05-19
Publication date: 2020-07-31
Anticipated expiration: 2034-05-19
Also published as: WO2014184384A1; EP2997042A1; EP2997042B1; JP6416224B2; CA2911600A1; SG11201509284VA; US20160108117A1; CN105392800A; US10047156B2; AU2014267171A1; JP2016528170A; KR20160021125A

Abstract

本发明提供一种分离的抗体或其片段，其针对人的趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8，正如通过表面等离子体共振所确定的，所述抗体或其片段能够以至多16nM的平衡解离常数(K_D)结合人趋化因子CXCL1、以至多5nM的平衡解离常数(K_D)结合人趋化因子CXCL7以及以至多45nM的平衡解离常数(K_D)结合人趋化因子CXCL8。本发明还提供所述分离的抗体的一些应用。

Description

抗CXCL1、CXCL7和CXCL8抗体及其应用

技术领域

本发明涉及预防和治疗趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关疾病的领域，尤其是病理性血管生成性疾病的领域。

具体地，本发明涉及针对趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8的抗体，以及它们的应用，特别是用作药物用于治疗和/或预防趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关的疾病，尤其是病理性血管生成性疾病。

背景技术

在20世纪70年代早期，Judah Folkman提出靶向血管生成来治疗癌症。许多临床前研究和临床研究证实了这种最初的假设，并且导致许多治疗性化合物的开发，包括人源化的单克隆抗体和大量激酶抑制剂。

血管生成最重要的因子之一是VEGF(血管内皮生长因子)。几乎在VEGF发现的20年后，贝伐单抗(Hurwitz等人，2004)(一种靶向VEGF的人源化单克隆抗体)才得到了食品与药物监督管理局(FDA)的批准，联合标准的化疗剂伊立替康用于治疗结肠癌。

也已经开发了其它许多抗血管生成的化合物，包括酪氨酸激酶受体抑制剂，如苹果酸舒尼替尼(Choueiri等人，2008)和索拉非尼甲苯磺酸盐(酯)(Eisen等人，2008)，还有细胞内激酶的抑制剂，如坦西莫司(Motzer等人，2008)和非受体丝氨酸苏氨酸激酶抑制剂。

尽管采用这些疗法使得无进展生存显著增加，仍观察到了不可避免的复发和疾病发展成为死亡。一些最近的论文描述了一种称作治疗逃逸(treatment evasion)的新现象，以及在使用酪氨酸激酶抑制剂进行治疗的情况下选择具有增加转移潜能的更加侵袭性的细胞(Ebos等人，2009，Paez-Ribes等人，2009)。

以这种方式，靶向VEGF用于RCC抗血管生成疗法；然而，单独靶向VEGF仅仅有一部分取得成功。尽管使用VEGF的中和性人源化抗体(即贝伐单抗)显著增加了无进展生存(Yang等人，2003)(Escudier等人，NEJM 2007)，2009年ASCO会议上提出的关键AVOREN研究中报道在安慰剂和贝伐单抗治疗的患者之间没有显著差异(Escudier等人，2010)。不同的机制都可能引起治疗逃逸，包括血管生成冗余、或者由于存在VEGF的抗血管生成形式(称为VEGFxxxb)而导致的无疗效(inefficacy)，该VEGF的抗血管生成形式是VEGF前mRNA的选择性剪接所导致的(Harper,2008)。

WO 2008/130969公开了通过将所述五种抗原的混合物注射至小鼠而得到的单克隆抗体，所述抗体能够结合五种抗原：人IL-8(CXCL8)、Gro-α(CXCL1)、Gro-β(CXCL2)、Gro-γ(CXCL3)和ENA-78(CXCL5)，并公开了所述抗体在非人灵长类动物的吸入性LPS急性肺部炎症模型中的用途。然而，WO 2008/130969没有披露结合CXCL1、CXCL7和CXCL8的单克隆抗体。

WO 2011/100271公开了能够结合人IL-8(CXCL8)、Gro-α(CXCL1)、Gro-β(CXCL2)、Gro-γ(CXCL3)、GCP2、NAP2(CXCL7)和ENA-78(CXCL5)的单克隆抗体。然而，WO 2011/100271没有公开所述单克隆抗体针对所述抗原的亲和性。

因此，本领域仍然明显需要新型的且改进的抗血管生成化合物，其增加患者寿命并避免复发和疾病进展到死亡。通过本文所公开的本发明，本发明人向前迈出了显著的一步。

本发明的目的在于通过提供新型化合物来满足这种需要，所述的化合物使得能够解决全部或部分上述问题。

出乎意料地，本发明人证实他们新开发的针对趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8的抗体能够有效地抑制肿瘤的生长，特别是在RCC的小鼠模型中(透明细胞型肾细胞癌)。RCC是用于研究抗血管生成疗法最相关的模型之一，因为RCC是高度血管化的肿瘤(由于vonHippel Lindau基因中的突变而产生)。

这些结果是出乎意料的，因为最近的几篇论文描述抑制趋化因子(包括CXCL8)不能抑制反而促进肿瘤生长。在这方面，Yao等人(2007)证明了CXCL-8的抑制促进裸鼠体内的肿瘤生长。

令人惊奇的是，这些新开发的抗体能够比单独或组合使用的市售抗CXCL1、抗CXCL7和抗CXCL8抗体更有效地抑制肿瘤的生长。这些结果真是令人惊奇，因为本发明人证明市售抗CXCL7和抗CXCL8抗体的组合(有或没有市售抗CXCL1抗体)对肿瘤生长的抑制不能够获得加和的效果。与此相反，本发明人已经表明在肿瘤生长的抑制方面，市售抗CXCL7和抗CXCL8抗体的组合使用没有单独使用它们时有效，并在RCC小鼠模型中具有促肿瘤效应。

发明内容

因此，在一方面，本发明涉及分离的抗体或其片段，其针对人趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8，正如通过表面等离子体共振所确定的，尤其是在25℃，更特别是根据实施例中描述的

等离子体共振分析，所述的抗体或其片段能够以至多16nM的平衡解离常数(K_D)结合人趋化因子CXCL1、以至多5nM的平衡解离常数(K_D)结合人趋化因子CXCL7以及以至多45nM的平衡解离常数(K_D)结合人趋化因子CXCL8。

可以通过用肽免疫动物(如大鼠)来获得本发明的抗体，其中所述的肽是人CXCL7所特异的，但是和人CXCL1和8具有相似性，尤其是使用序列SDLYAELRCMCIKTTSGIHPKNIQS(SEQ ID NO：20)的肽免疫动物，随后通过筛选方法分离抗体。可以使用不同的筛选方法来分离抗体，包括Bourcier等人描述的(2011)在偶联到钥孔血蓝蛋白的所述肽上面进行的ELISA测试、以及在表达CXCR2的细胞中抑制CXCL-7诱导的ERK激活的抗体能力的测试。

在一个具体的实施方式，本发明还涉及通过包括以下步骤的方法获得的或者易于获得的抗体：

i)用至少一种肽免疫至少一种动物，其中所述肽是人CXCL7所特异的，但是与人CXCL1和8具有相似性，尤其是采用序列SDLYAELRCMCIKTTSGIHPKNIQS(SEQ ID NO：20)的肽，

ii)通过本领域技术人员已知的任何方法产生单克隆抗体，比如从所述动物中分离B细胞，并将所述B细胞与骨髓瘤细胞融合形成能够分泌单克隆抗体的永生杂交瘤细胞，

iii)进行筛选方法来分离能够结合序列SEQ ID N°20的肽的抗体、或者能够结合偶联至钥孔血蓝蛋白的序列SEQ ID N°20的肽的抗体、和/或能够在表达CXCR2的细胞中抑制CXCL-7诱导的ERK激活的抗体，特别是在Bourcier等人描述的分析中(2011)。

根据本发明的抗体特别具有以下优点：

-它们是针对多个CXCL趋化因子的独特描述的抗体，特别是CXCL1、CXCL7和CXCL8；

-相较于市售可获得的仅仅针对所述趋化因子之一的抗体而言，它们对每个趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8的亲和性是重要的；

-相较于在实验模型中增加肿瘤生长的贝伐单抗(针对VEGF的抗体)而言(Escudier等人，2010)，本发明的抗体抑制肿瘤生长；

-本发明的抗体靶向与经典VEGF/VEGFR途径不同的独立的血管生成途径，。CXCL趋化因子途径既是血管生成性的又是炎性的。此外，CXCL趋化因子诱导自分泌增殖途径，因为肿瘤细胞表达其受体CXCR1和CXCR2。因此，通过抑制相关的CXCL趋化因子(CXCL1、CXCL7和CXCL8)，血管生成、炎症和增殖被本发明的抗体抑制。

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语和相关领域技术人员所通常理解的具有相同的含义。

为方便起见，提供了说明书和权利要求中使用的某些术语和短语的含义。

如本文所用的术语“抗体”旨在包括单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)。更具体地，抗体(或“免疫球蛋白”)由糖蛋白组成，糖蛋白包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链。

每条重链包含重链可变区(或结构域)(本文中缩写为V_H)和重链恒定区(以下称C_H)。重链分为γ、μ、α、δ或ε，并将抗体的同种型分别定义为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。免疫球蛋白IgG、IgD和IgA的重链恒定区(分别为γ、δ和α链)包含三个结构域(CH1、CH2和CH3)和增加柔性的铰链区，而免疫球蛋白IgM和IgE的重链恒定区包含4个结构域(CH1、CH2、CH3和CH4)。

本发明的抗体可以是IgG、IgM、IgA、IgD和IgE同种型，这取决于它重链的结构。然而，在一个优选的实施方式中，本发明的抗体是IgG同种型，也就是说它的重链是gamma(γ)类型。

按照它们在血清中的丰度顺序，IgG抗体被分为四个不同的亚型，即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4(IgG1最丰富)。γ链中铰链区的结构赋予这些亚型的每一个独特的生物谱(尽管它们的Fc区之间有大约95％的相似性，铰链区的结构相对不同)。

本发明的抗体可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型。

然而，在一个优选的实施方式中，本发明的抗体是IgG1亚型或IgG2亚型。

每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为V_L)和仅包含一个结构域的轻链恒定区C_L。在哺乳动物中有两种类型的轻链：kappa(κ)链，其由2号染色体上的免疫球蛋白kappa基因座编码，以及lambda(λ)链，其由22号染色体上的免疫球蛋白lambda基因座编码。在一个优选的实施方式中，本发明的抗体具有kappa轻链。

V_H和V_L区可以进一步细分为高变区，称为“互补决定区”(CDR)，其主要负责结合抗原的表位，并且穿插在更保守的区域(称为“框架区“(FR))之间。每个V_H和V_L由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端按照下面的顺序排布：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。按照公知的惯例将氨基酸序列指定至各结构域(CHOTHIA等人，J.Mol.Biol.,1987；CHOTHIA等人，Nature,1989)。抗体结合特定抗原的功能能力取决于每个轻/重链对的可变区，很大程度上决定于CDR。不同B细胞产生的抗体当中重链可变区是不同的，但是单个B细胞或B细胞克隆(或杂交瘤)产生的所有抗体是相同的。

与此相反，抗体的恒定区介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一成分(Clq)。

如本文所用，术语“抗体片段”旨在指定Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFv,ds-scFv、二聚体、微型抗体、双抗体及其多聚体和双特异性抗体片段，只要它们表现出所需的生物活性(即它们针对趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8)。可以用常规技术将抗体片段化。已经开发了各种技术用于生成抗体片段。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体得到这些片段。例如，可通过胃蛋白酶处理抗体产生F(ab')2片段。将所得的F(ab')2片段进行处理以还原二硫桥，从而产生Fab'片段。木瓜蛋白酶消化可以导致Fab片段的形成。也可以通过重组技术合成Fab、Fab'和F(ab')2、scFv、dsFv、ds-scFv、二聚体、微型抗体、双抗体、双特异性抗体片段和其它片段。

在本发明的上下文中，如果抗体对肽具有大于10⁷M^-1，优选大于5.10⁷M^-1，更优选大于10⁸M^-1的亲和性常数K_a(平衡解离常数的倒数，即1/K_D)，则说所述抗体“针对”或“结合”所述肽。

亲和性常数被用于描述抗体(Ab)对肽或抗原(Ag)的结合，它是解离常数的倒数，定义如下：

例如通过平衡透析、通过荧光淬灭或通过表面等离子体共振，可以测量这种亲和性，这些技术在本领域中是常规使用的。具体地，可以通过表面等离子体共振根据实施例中描述的方法确定平衡解离常数(K_D)和亲和性常数(K_a)。

具体地，正如通过表面等离子体共振所确定的，尤其是在25℃，更特别是根据实施例中描述的

等离子体共振分析，本发明的分离的抗体或其片段能够以至多16nM的平衡解离常数(K_D)结合人趋化因子CXCL1、以至多4nM的平衡解离常数(K_D)结合人趋化因子CXCL7以及以至多45nM的平衡解离常数(K_D)结合人趋化因子CXCL8。

等离子体共振分析，本发明的分离的抗体或其片段，能够以至多12nM的平衡解离常数(K_D)结合人趋化因子CXCL1、以至多5nM的平衡解离常数(K_D)结合人趋化因子CXCL7以及以至多20nM的平衡解离常数(K_D)结合人趋化因子CXCL8。

如本文所用，术语“CXCL1”涉及也被称为生长调节致癌基因α(GRO-α)的CXC趋化因子。

优选，人CXCL1涉及由SEQ ID NO°17所示序列编码的趋化因子(NCBI参考序列：NM_001511)。

如本文所用，术语“CXCL7”涉及也称为嗜中性粒细胞激活肽-2(NAP-2)的CXC趋化因子。

优选，人CXCL7涉及由SEQ ID NO°18所示序列编码的趋化因子(GenBank：NM_002704)。

如本文所用，术语“CXCL8”涉及也称为白细胞介素8(IL-8)的CXC趋化因子。

优选，人CXCL8涉及由SEQ ID NO°19所示序列编码的趋化因子(GenBank：NM_000584)。

在本发明的描述中，进行参考的同一性百分比是基于待比较序列的全局比对而确定的，也就是说使用例如Needleman和Wunsch 1970的算法，在其整个长度的范围比对序列。例如使用needle软件通过使用等于10.0的参数“开放空位”、等于0.5的参数“延伸空位”以及矩阵“BLOSUM 62”，可以完成这种序列比较。软件如needle可在世界范围内在网站ebi.ac.uk获得，名称为“needle”。

尤其是，根据本发明针对人趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8的分离的抗体或其片段包含至少一个，特别是至少两个、至少三个、至少四个、至少五个以及更具体地6个互补决定区(CDR)，其选自包含或由以下组成的序列的CDR：SEQ ID No:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、在SEQ ID NO:1整个长度范围内和SEQ ID NO:1具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，在SEQ ID NO:2整个长度范围内和SEQ ID NO:2具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，在SEQ IDNO:3整个长度范围内和SEQ ID NO:3具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，在SEQ ID NO:4整个长度范围内和SEQID NO:4具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，在SEQ ID NO:5整个长度范围内和SEQ ID NO:5具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，在SEQ ID NO:6整个长度范围内和SEQ ID NO:6具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，在SEQ ID NO:7整个长度范围内和SEQ ID NO:7具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，在SEQ ID NO:8整个长度范围内和SEQ ID NO:8具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，在SEQ ID NO:9整个长度范围内和SEQ ID NO:9具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，在SEQ ID NO:10整个长度范围内和SEQ ID NO:10具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，在SEQ ID NO:11整个长度范围内和SEQID NO:11具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列或者在SEQ ID NO:12整个长度范围内和SEQ ID NO:12具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，尤其是选自由以下组成的序列的CDR：SEQ ID No:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12。

具体地，根据本发明针对人趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8的分离的抗体或其片段包含6个互补决定区(CDR)，其选自选自以下序列的CDR：

-SEQ ID No:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、在SEQ ID NO:1整个长度范围内和SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的序列、在SEQ IDNO:2整个长度范围内和SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的序列、在SEQ ID NO:3整个长度范围内和SEQ ID NO:3具有至少90％同一性的序列、在SEQ ID NO:4整个长度范围内和SEQID NO:4具有至少90％同一性的序列、在SEQ ID NO:5整个长度范围内和SEQ ID NO:5具有至少90％同一性的序列、在SEQ ID NO:6整个长度范围内和SEQ ID NO:6具有至少90％同一性的序列、在SEQ ID NO:7整个长度范围内和SEQ ID NO:7具有至少90％同一性的序列、在SEQ ID NO:8整个长度范围内和SEQ ID NO:8具有至少90％同一性的序列、在SEQ ID NO:9整个长度范围内和SEQ ID NO:9具有至少90％同一性的序列、在SEQ ID NO:10整个长度范围内和SEQ ID NO:10具有至少90％同一性的序列、在SEQ ID NO:11整个长度范围内和SEQID NO:11具有至少90％同一性的序列、在SEQ ID NO:12整个长度范围内和SEQ ID NO:12具有至少90％同一性的序列，尤其是SEQ ID No:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQID NO:11、SEQ ID NO:12。

具体地，根据本发明针对人趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8的分离的抗体或其片段包含：

-至少一个，特别是至少两个，更特别的是3个CDR，其选自包含或由以下组成的序列的CDR：SEQ ID No:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9、在SEQ ID NO:1整个长度范围内和SEQ ID NO:1具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，在SEQ ID NO:2整个长度范围内和SEQ ID NO:2具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，在SEQ ID NO:3整个长度范围内和SEQ ID NO:3具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，在SEQ ID NO:7整个长度范围内和SEQ ID NO:7具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，在SEQ IDNO:8整个长度范围内和SEQ ID NO:8具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列或者在SEQ ID NO:9整个长度范围内和SEQ ID NO:9具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，尤其选自由以下组成的序列的CDR：SEQ ID No:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9；以及

-至少一个，特别是至少两个，更特别的是3个CDR，其选自包含或由以下组成的序列的CDR：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12、在SEQ ID NO:4整个长度范围内和SEQ ID NO:4具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，在SEQ ID NO:5整个长度范围内和SEQ ID NO:5具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，在SEQ ID NO:6整个长度范围内和SEQ IDNO:6具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，在SEQ ID NO:10整个长度范围内和SEQ ID NO:10具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，在SEQ ID NO:11整个长度范围内和SEQ ID NO:11具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列或者在SEQ ID NO:12整个长度范围内和SEQ ID NO:12具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，尤其选自由以下组成的序列的CDR：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12。

具体地，根据本发明的针对人趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8的分离的抗体或其片段包含：

-至少一个，特别是至少两个，更特别的是3个CDR，其选自包含或由以下组成的序列的CDR：SEQ ID No:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、在SEQ ID NO:1整个长度范围内和SEQID NO:1具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，在SEQ ID NO:2整个长度范围内和SEQ ID NO:2具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，在SEQ ID NO:3整个长度范围内和SEQ ID NO:3具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，尤其选自由以下组成的序列的CDR：SEQ ID No:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3；或

-至少一个，特别是至少两个，更特别的是3个CDR，其选自包含或由以下组成的序列的CDR：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、在SEQ ID NO:7整个长度范围内和SEQID NO:7具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，在SEQ ID NO:8整个长度范围内和SEQ ID NO:8具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列或者在SEQ ID NO:9整个长度范围内和SEQ ID NO:9具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，尤其选自由以下组成的序列的CDR：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9；以及

-至少一个，特别是至少两个，更特别的是3个CDR，其选自包含或由以下组成的序列的CDR：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、在SEQ ID NO:4整个长度范围内和SEQID NO:4具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，在SEQ ID NO:5整个长度范围内和SEQ ID NO:5具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，在SEQ ID NO:6整个长度范围内和SEQ ID NO:6具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，尤其选自由以下组成的序列的CDR：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6；或者

-至少一个，特别是至少两个，更特别的是3个CDR，其选自包含或由以下组成的序列的CDR：SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、在SEQ ID NO:10整个长度范围内和SEQ ID NO:10具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，在SEQ ID NO:11整个长度范围内和SEQ ID NO:11具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列或者在SEQ ID NO:12整个长度范围内和SEQ ID NO:12具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，尤其选自由以下组成的序列的CDR：SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12。

-至少一个，特别是至少两个，更特别的是3个CDR，其选自包含或由以下组成的序列的CDR：SEQ ID No:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、在SEQ ID NO:1整个长度范围内和SEQID NO:1具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，在SEQ ID NO:2整个长度范围内和SEQ ID NO:2具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，在SEQ ID NO:3整个长度范围内和SEQ ID NO:3具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，尤其选自由以下组成的序列的CDR：SEQ ID No:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3；以及

-至少一个，特别是至少两个，更特别的是3个CDR，其选自包含或由以下组成的序列的CDR：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、在SEQ ID NO:4整个长度范围内和SEQID NO:4具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，在SEQ ID NO:5整个长度范围内和SEQ ID NO:5具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，在SEQ ID NO:6整个长度范围内和SEQ ID NO:6具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，尤其选自由以下组成的序列的CDR：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6。

具体地，根据本发明的针对人趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8的分离的抗体或其片段包含六个CDR，其选自包含或由以下组成的序列的CDR：SEQ ID No:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、在SEQ ID NO:1整个长度范围内和SEQID NO:1具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，在SEQ ID NO:2整个长度范围内和SEQ ID NO:2具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，在SEQ ID NO:3整个长度范围内和SEQ ID NO:3具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，在SEQ ID NO:4整个长度范围内和SEQ ID NO:4具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，在SEQ ID NO:5整个长度范围内和SEQ ID NO:5具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，在SEQ ID NO:6整个长度范围内和SEQ ID NO:6具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，尤其选自由以下组成的序列的CDR：SEQ ID No:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6。

具体地，根据本发明的针对人趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8的分离的抗体或其片段包含六个CDR，其选自包含或由以下组成的序列的CDR：SEQ ID No:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、在SEQ ID NO:7整个长度范围内和SEQ ID NO:7具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，在SEQ ID NO:8整个长度范围内和SEQ ID NO:8具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，或者在SEQ ID NO:9整个长度范围内和SEQ ID NO:9具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，在SEQ ID NO:10整个长度范围内和SEQ ID NO:10具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，在SEQ ID NO:11整个长度范围内和SEQID NO:11具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列或者在SEQ ID NO:12整个长度范围内和SEQ ID NO:12具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，尤其选自由以下组成的序列的CDR：SEQ ID No:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12。

在本发明的抗体的另一个实施方式中，轻链可变区(V_L)包含：

-轻链CDR1(LC-CDR1)，其序列是SEQ ID NO：1、或SEQ ID NO：7、或在SEQ ID NO:1整个长度范围内和SEQ ID NO:1具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列、或者在SEQ ID NO:7整个长度范围内和SEQID NO:7具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，尤其是序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：7；和/或

-轻链CDR2(LC-CDR2)，其序列是SEQ ID NO：2、或SEQ ID NO：8、或在SEQ ID NO:2整个长度范围内和SEQ ID NO:2具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列、或者在SEQ ID NO:8整个长度范围内和SEQID NO:8具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，尤其是序列SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：8；和/或

-轻链CDR3(LC-CDR3)，其序列是SEQ ID NO：3、或SEQ ID NO：9、或在SEQ ID NO:3整个长度范围内和SEQ ID NO:3具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列、或者在SEQ ID NO:9整个长度范围内和SEQID NO:9具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，尤其是序列SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：9；以及

其中所述的重链可变区(VH)包含：

-重链CDR1(HC-CDR1)，其序列是SEQ ID NO：4、或SEQ ID NO：10、或在SEQ ID NO:4整个长度范围内和SEQ ID NO:4具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列、或者在SEQ ID NO:10整个长度范围内和SEQID NO:10具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，尤其是序列SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：10；和/或

-重链CDR2(HC-CDR2)，其序列是SEQ ID NO：5、或SEQ ID NO：11、或在SEQ ID NO:5整个长度范围内和SEQ ID NO:5具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列、或者在SEQ ID NO:11整个长度范围内和SEQID NO:11具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，尤其是序列SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：11；和/或

-重链CDR3(HC-CDR3)，其序列是SEQ ID NO：6、或SEQ ID NO：12、或在SEQ ID NO:6整个长度范围内和SEQ ID NO:6具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列、或者在SEQ ID NO:12整个长度范围内和SEQID NO:12具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，尤其是序列SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：12。

尤其是，根据本发明的抗体的轻链可变区(V_L)包含：

-序列SEQ ID NO:1的轻链CDR1(LC-CDR1)；以及

-序列SEQ ID NO:2的轻链CDR2(LC-CDR2)；以及

-序列SEQ ID NO:3的轻链CDR3(LC-CDR3)。

尤其是，根据本发明的抗体的重链可变区(V_H)包含：

-序列SEQ ID NO:4的重链CDR1(HC-CDR1)；以及

-序列SEQ ID NO:5的重链CDR2(HC-CDR2)；以及

-序列SEQ ID NO:6的重链CDR3(HC-CDR3)。

尤其是，根据本发明的抗体的轻链可变区(V_L)包含：

-序列SEQ ID NO:7的轻链CDR1(LC-CDR1)；以及

-序列SEQ ID NO:8的轻链CDR2(LC-CDR2)；以及

-序列SEQ ID NO:9的轻链CDR3(LC-CDR3)。

尤其是，根据本发明的抗体的重链可变区(V_H)包含：

-序列SEQ ID NO:10的重链CDR1(HC-CDR1)；以及

-序列SEQ ID NO:11的重链CDR2(HC-CDR2)；以及

-序列SEQ ID NO:12的重链CDR3(HC-CDR3)。

尤其是，根据本发明的抗体的轻链可变区(V_L)包含：

-轻链CDR1(LC-CDR1)，其序列是SEQ ID NO：1、或在SEQ ID NO:1整个长度范围内和SEQ ID NO:1具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，尤其是序列SEQ ID NO：1；和

-轻链CDR2(LC-CDR2)，其序列是SEQ ID NO：2、或在SEQ ID NO:2整个长度范围内和SEQ ID NO:2具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，尤其是序列SEQ ID NO：2；和

-轻链CDR3(LC-CDR3)，其序列是SEQ ID NO：3、或在SEQ ID NO:3整个长度范围内和SEQ ID NO:3具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，尤其是序列SEQ ID NO：3；和

所述的重链可变区(VH)包含：

-重链CDR1(HC-CDR1)，其序列是SEQ ID NO：4、或在SEQ ID NO:4整个长度范围内和SEQ ID NO:4具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，尤其是序列SEQ ID NO：4；和

-重链CDR2(HC-CDR2)，其序列是SEQ ID NO：5、或在SEQ ID NO:5整个长度范围内和SEQ ID NO:5具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，尤其是序列SEQ ID NO：5；和

-重链CDR3(HC-CDR3)，其序列是SEQ ID NO：6、或在SEQ ID NO:6整个长度范围内和SEQ ID NO:6具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，尤其是序列SEQ ID NO：6。

尤其是，根据本发明的抗体的轻链可变区(V_L)包含：

-序列SEQ ID NO:1的轻链CDR1(LC-CDR1)；以及

-序列SEQ ID NO:2的轻链CDR2(LC-CDR2)；以及

-序列SEQ ID NO:3的轻链CDR3(LC-CDR3)；以及

所述重链可变区(VH)包含：

-序列SEQ ID NO:4的重链CDR1(HC-CDR1)；以及

-序列SEQ ID NO:5的重链CDR2(HC-CDR2)；以及

-序列SEQ ID NO:6的重链CDR3(HC-CDR3)。

尤其是，根据本发明的抗体的轻链可变区(V_L)包含：

-轻链CDR1(LC-CDR1)，其序列是SEQ ID NO：7、或在SEQ ID NO:7整个长度范围内和SEQ ID NO:7具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，尤其是序列SEQ ID NO：7；和

-轻链CDR2(LC-CDR2)，其序列是SEQ ID NO：8、或在SEQ ID NO:8整个长度范围内和SEQ ID NO:8具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，尤其是序列SEQ ID NO：8；和

-轻链CDR3(LC-CDR3)，其序列是SEQ ID NO：9、或在SEQ ID NO:9整个长度范围内和SEQ ID NO:9具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，尤其是序列SEQ ID NO：9；和

所述的重链可变区(VH)包含：

-重链CDR1(HC-CDR1)，其序列是SEQ ID NO：10、或在SEQ ID NO:10整个长度范围内和SEQ ID NO:10具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，尤其是序列SEQ ID NO：10；和

-重链CDR2(HC-CDR2)，其序列是SEQ ID NO：11、或在SEQ ID NO:11整个长度范围内和SEQ ID NO:11具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，尤其是序列SEQ ID NO：11；和

-重链CDR3(HC-CDR3)，其序列是SEQ ID NO：12、或在SEQ ID NO:12整个长度范围内和SEQ ID NO:12具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列，尤其是序列SEQ ID NO：12。

尤其是，根据本发明的抗体的轻链可变区(V_L)包含：

-序列SEQ ID NO:7的轻链CDR1(LC-CDR1)；以及

-序列SEQ ID NO:8的轻链CDR2(LC-CDR2)；以及

-序列SEQ ID NO:9的轻链CDR3(LC-CDR3)；以及

所述重链可变区(VH)包含：

-序列SEQ ID NO:10的重链CDR1(HC-CDR1)；以及

-序列SEQ ID NO:11的重链CDR2(HC-CDR2)；以及

-序列SEQ ID NO:12的重链CDR3(HC-CDR3)。

尤其是，轻链可变区(V_L)的序列包含或者由以下组成：序列SEQ ID NO：13、或在SEQ ID NO:13整个长度范围内和SEQ ID NO:13具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列；和/或重链可变区(V_H)的序列包含或者由以下组成：序列SEQ ID NO：14、或在SEQ ID NO:14整个长度范围内和SEQ IDNO:14具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列。

在一个实施方式中，轻链可变区(V_L)的序列由序列SEQ ID NO:13组成以及重链可变区(V_H)的序列由序列SEQ ID NO：14组成。

尤其是，轻链可变区(V_L)的序列包含或者由以下组成：序列SEQ ID NO：15、或在SEQ ID NO:15整个长度范围内和SEQ ID NO:15具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列；和/或重链可变区(V_H)的序列包含或者由以下组成：序列SEQ ID NO：16、或在SEQ ID NO:16整个长度范围内和SEQ IDNO:16具有至少80％、尤其是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列。

在另一个实施方式中，轻链可变区(V_L)的序列由序列SEQ ID NO:15组成以及重链可变区(V_H)的序列由序列SEQ ID NO：16组成。

本发明的抗体可以是多克隆或单克隆抗体。

本文所用的“多克隆抗体”是指从不同的B细胞源获得的抗体。它典型地包括针对靶抗原的不同决定簇或表位的各种抗体。可在动物中产生这些抗体。分子生物学、微生物学和重组DNA技术的常规技术在本领域的技术范围内。这些技术在文献中有充分的解释。例如，可以通过以下常规方法来制备本发明的抗体。可以用在哺乳动物中引起抗体反应的CXCL1、CXCL7和CXCL8的免疫原性形式免疫哺乳动物(例如小鼠、仓鼠、或兔)。用于在多肽上赋予免疫原性的技术包括缀合到载体上或本领域中公知的其它技术。例如，在佐剂存在下施用该多肽。可通过检测血浆或血清中的抗体滴度来监测免疫的进程。可以采用标准的ELISA或其它免疫分析程序，同时用免疫原作为抗原用于评估抗体水平。免疫接种后，可以得到抗血清，如果需要，从血清中分离多克隆抗体。

如本文所用的“单克隆抗体”是指从几乎同质的抗体群体所产生的抗体。更具体地，除了少数可能的天然发生的突变以最小的比例存在之外，群体中的主体抗体是相同的。换句话说，单克隆抗体由单细胞克隆(例如杂交瘤，转染有编码同质抗体的DNA分子的真核宿主细胞、转染有编码同质抗体的DNA分子的原核宿主细胞等)生长所产生的同质抗体组成，通常特征在于有且只有一种同种型和亚型的重链以及仅有一种类型的轻链。此外，与多克隆抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原的单一表位。

为了产生单克隆抗体，可以从如上所述的被免疫的动物中收获产生抗体的细胞(淋巴细胞)，通过标准的体细胞融合程序与骨髓瘤细胞融合，从而将这些细胞永生化，并产生杂交瘤细胞。这样的技术是本领域公知的(例如最初由Kohler和Milstein(1975)开发的杂交瘤技术以及其它技术，例如人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等人，1983)，EBV-杂交瘤技术以产生人单克隆抗体(Cole等人，Methods Enzymol,121；140-67(1986))，以及组合抗体文库的筛选(Huse等人，Science 246；1275(1989)))。可以通过免疫化学筛选杂交瘤细胞，用于产生与靶多肽特异性反应的抗体，从而只分离结合所述多肽的单克隆抗体。

尤其是，本发明的抗体是单克隆抗体。

本发明的抗体可以是人的、嵌合的、人源化的、鼠的、CDR接枝的、噬菌体展示的、细菌展示的、酵母展示的、转基因小鼠产生的、诱变的、和随机化的。

嵌合抗体是这样一种分子，在其中不同的部分来自不同的动物物种，例如具有源自鼠单克隆抗体(mAb)的可变区和人免疫球蛋白恒定区的那些(见，例如Cabilly等人(美国专利号4,816,567)、和Boss等人(美国专利号4,816,397))。单链抗体具有抗原结合位点并且由单个多肽组成。它们可通过本领域已知的技术来生产，例如使用Ladner等人描述的方法(美国专利号4946778)。

本发明抗体的人源化形式是包含源自非人免疫球蛋白的最少序列的嵌合抗体。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体高变区的残基被来自非人物种(供体抗体)(如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类)高变区的残基替换，这样的残基具有所需特异性、亲和性和能力。在一些情况下，人免疫球蛋白(受体抗体)的框架区(FR)残基被供体抗体的相应非人残基替换。此外，人源化抗体可包含未见于受体抗体或供体抗体的残基。在一般情况下，人源化抗体可包含基本上全部的至少一个、通常两个可变结构域，其中全部或基本上全部的高变环对应着非人免疫球蛋白的那些(具有所需特异性、亲和性和能力的供体抗体)，以及全部或基本上全部的FR是人免疫球蛋白序列的那些。在一个实施方式中，人源化抗体包含人源化的FR，所述人源化的FR与受体(非人)FR(例如鼠FR)表现出至少65％的序列同一性。人源化抗体还可以包含免疫球蛋白(具体地人免疫球蛋白)恒定区(Fc)的至少一部分。用于将非人抗体人源化的方法在本领域中已有描述。优选，人源化抗体具有一个或更多个引入其中的来自非人来源的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称作“输入”残基，它们通常取自“输入”可变结构域。可以基本上通过用高变区序列取代相应的人抗体序列进行人源化。因此，这种人源化抗体是嵌合的，其中基本上小于完整的人可变结构域的部分被取代为来自非人物种的相应序列。在实践中，人源化抗体通常是人抗体，其中一些高变区残基和可能一些FR残基被啮齿类抗体中类似位点的残基取代。用来制备人源化抗体的人可变结构域(无论轻链还是重链)的选择，对于减少抗原性是非常重要的。其它方法一般涉及将供体的CDR结合亲和性赋予抗体受体的可变区框架。一种方法包括同时接枝和优化可变区结合片段的结合亲和性。另一种方法涉及优化抗体可变区的结合亲和性。

多特异性抗体是具有至少两个特异性结合不同抗原的抗原结合位点的抗体分子。可以通过本领域中已知的技术来生产这种分子，例如使用Segal、美国4,676,980或美国6,121,424中描述的方法。通过用感兴趣的多肽筛选重组的组合免疫球蛋白文库(例如，抗体噬菌体展示文库)，可以鉴定并分离针对趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8的单克隆抗体。可商购用于产生和筛选噬菌体展示文库的试剂盒。此外，方法和试剂的示例，尤其是适用于产生和筛选抗体展示文库的方法和试剂，可见于例如美国5,223,409、WO 92/18619和WO 91/17271。

通过公知的技术，在生产后可分离抗体(例如，从动物血液或血清)或合成并且进一步纯化抗体。通过亲和层析、ELISPOT或ELISA，可以选择或纯化特异于蛋白的抗体。例如，趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8可以共价或非共价偶联到固体支持物，如例如，层析柱。然后该柱可用于从含有针对大量不同表位的抗体的样本中，纯化针对趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8的抗体，由此产生基本上纯化的抗体组合物，也就是说基本上没有污染性抗体的抗体组合物。“基本上纯化的抗体组合物”是指，在这种情况下，抗体样本含有至多只有30％(按干重计)针对Strep-Tag II序列以外的表位的污染性抗体，并且优选样本的至多20％，更优选至多10％和最优选至多5％(按干重计)是污染性抗体。“纯化的抗体组合物”是指组合物中至少99％的抗体针对趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8。

本发明的抗体可以按照其“裸露”或未缀合的形式被施用，或者可以具有缀合至其上的其它试剂。例如，抗体可以是可被检测到的标记形式。抗体可以通过使用放射性同位素、亲和标记(例如生物素、抗生物素蛋白等)、酶标记(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)、荧光标记(如FITC或罗丹明等)、顺磁性原子等进行可检测地标记。用于实现这种标记的程序是本领域公知的。

在另一个实施方式中，本发明的抗体是冻干的。在这样的实施方式中，在施用时将冻干的抗体与载体或稀释剂(如上所述的那些)混合。在又一个实施方式中，本发明的抗体缀合至化合物(如聚合物)。在一个实施方式中，聚合物是聚亚烷基二醇。在一个实施方式中，聚亚烷基二醇是聚乙二醇，或PEG。

为了用于治疗中，适当地，将抗体与可药用赋形剂一起配制。适用于预防或治疗性治疗的制剂可以胃肠外施用，优选动脉内、腹膜内、静脉内、皮下、肌内或经由气雾剂施用，它们将包含有效量的抗体。所述的量取决于患者的整体情况、疾病进展和其它因素。

尤其是，以CNCM I-4617的编号于2012年4月25日保藏在法国国家微生物培养物保藏中心(CNCM)的杂交瘤(也被本发明人指定为12A10-13)生产本发明的抗体。

尤其是，以CNCM I-4618的编号于2012年4月25日保藏在法国国家微生物培养物保藏中心(CNCM)的杂交瘤(也被本发明人指定为35B11-8)生产本发明的抗体。

通过用人CXCL7所特异的但是与人CXCL1和8具有相似性的肽，即序列SDLYAELRCMCIKTTSGIHPKNIQS(SEQ ID NO：20)的肽免疫LOU-M大鼠获得杂交瘤CNCM I-4617和CNCM I-4618。不同的筛选分析用来分离这两个杂交瘤，即Bourcier等人(2011)描述的在偶联到钥孔血蓝蛋白的所述肽上进行的ELISA检测以及测试抗体在表达CXCR2的细胞中抑制CXCL-7诱导的ERK激活的能力。

这些杂交瘤生产高产量的本发明的抗体。

本发明还涉及分离的核酸分子，其编码根据本发明的抗体或其片段。

术语“核酸分子”是指核苷酸的聚合形式，无论是脱氧核糖核苷酸还是核糖核苷酸，或其类似物。

本发明还涉及载体，其包含编码根据本发明的抗体或其片段的核酸分子。所述载体可适用于半稳定或稳定的表达。

具体地，根据本发明的所述载体是克隆载体或表达载体。

载体可以是病毒载体，如噬菌体或非病毒如质粒。

本发明还涉及一种宿主细胞，其包含编码根据本发明的抗体或其片段的核酸分子，或包含所述核酸分子的载体。

本发明还涉及一种药物组合物，其包含选自以下的至少一种化合物：

-根据本发明的抗体及其片段，

-编码根据本发明的抗体或其片段的分离的核酸分子；和

-包含所述核酸分子的载体。有利的实施方式是如上文所定义的。

术语“药物”和“药物组合物”可互换使用，并且在本文中具有最广泛的含义。

这种化合物(尤其选自：根据本发明的抗体及其片段、编码根据本发明的抗体的分离的核酸分子以及包含所述核酸分子的载体)可以按照治疗有效量(活性的且非毒性的量)存在于根据本发明的药物组合物或药物中。治疗有效量是指缓和症状或病症的化合物的量。可以通过标准的药学程序在细胞培养或实验动物中来确定治疗效果和毒性，例如ED50(在50％的群体中有效治疗的量)和LD50(50％的群体致死的剂量)。毒性相对于治疗效果的量的比例是治疗指数，可以表示为比例LD50/ED50。显示大的治疗指数的药物组合物是优选的。

例如，尤其是可以通过静脉内的方式，按照0.1μg/kg至100mg/kg范围内的量、具体地从1mg/kg至50mg/kg所述患者体重，至少每个月、具体地至少每3周、更具体地至少每两周以及甚至更具体地至少每周，将根据本发明的抗体施用至患者。

可以通过任何数目的途径施用根据本发明的药物组合物，包括但不限于口服、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、透皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下、直肠的方式或眼部。

除了活性成分，本发明的药物组合物可以含有合适的药学可接受的载体，包括赋形剂和助剂，其有助于将活性化合物加工成可用于药学的制剂。尤其是，根据本发明的药物组合物配制在药学上可接受的载体中。药学上可接受的载体是本领域技术人员公知的。配制和施用的进一步技术细节可见于最新版本的Remington’s Pharmaceutical Sciences(Maack Publishing Co.,Easton,Pa.)。

尤其是，药物上可接受的载体包含或者是等渗溶液。

本发明还涉及用作药物的根据本发明的抗体或其片段。有利的实施方式如上文所定义。

本发明还涉及一种用作药物的分离的核酸分子，其编码根据本发明的抗体或其片段。有利的实施方式如上文所定义。

本发明还涉及一种用作药物的载体，其包含编码根据本发明的抗体的核酸分子。有利的实施方式如上文所定义。

本发明还涉及根据本发明的抗体或其片段，其用于治疗和/或预防趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关的疾病，尤其是病理性血管生成性疾病。有利的实施方式如上文所定义。

本发明还涉及编码根据本发明的抗体或其片段的分离的核酸分子，其用于治疗和/或预防趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关的疾病，尤其是病理性血管生成性疾病。有利的实施方式如上文所定义。

本发明还涉及包含编码根据本发明的抗体或其片段的分离的核酸分子的载体，其用于治疗和/或预防趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关的疾病，尤其是病理性血管生成性疾病。有利的实施方式如上文所定义。

如本文所用，术语“趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关的疾病”是指，在其中涉及至少一个、尤其至少两个、更尤其是所有所述趋化因子的任何疾病。趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关的疾病包括病理性血管生成性疾病和炎症性疾病。例如，趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关的炎症性疾病可以是眼科疾病，如青光眼、湿性年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病。炎症性疾病还包括哮喘和类风湿性关节炎(其也是血管生成性疾病)。

如本文所用，术语“病理性血管生成性疾病”是指，其中内皮细胞的异常增生导致血管网的病理学进展的任何疾病。病理性血管生成性疾病的示例描述于Carmeliet等人2000的一篇文章中。血管生成可以用作治疗性靶标，来对抗特征在于血管系统异常的疾病，因此表述“病理性血管生成性疾病”、“病理性血管生成性病症”、“特征在于不期望的过度血管新生的疾病”、“特征在于不期望的过度血管新生的病症”、“涉及不期望的病理性血管生成的疾病”、“涉及不期望的病理性血管生成的病症”、“需要抑制血管生成的疾病”或“需要抑制血管生成的病症”可以互换使用。

尤其是，病理性血管生成性疾病、特征在于不期望的过度血管新生的疾病选自：

-伴有异常血管生成的癌症，尤其是伴有异常血管生成的实体瘤，更尤其是肾癌，包括透明细胞型肾细胞癌、乳癌、卵巢癌、肺癌、胰腺癌和结肠癌；

-伴有异常血管生成的眼科疾病，尤其是年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病、色素性视网膜炎和葡萄膜炎；

-类风湿性关节炎；

-银屑病；

-血管瘤；

-子宫内膜异位症；

-以及，Kaposi肉瘤。

尤其是，所述病理性血管生成性疾病是透明细胞型肾细胞癌。

本发明还涉及至少一种选自以下的化合物：

-根据本发明的抗体及其片段，

-编码根据本发明的抗体或其片段的分离的核酸分子；和

-包含所述核酸分子的载体；

用来制备用于治疗和/或预防趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关疾病的药物的用途，尤其是病理性血管生成性疾病，或者特征在于不期望的过度血管新生的疾病。

本发明还涉及治疗和/或预防趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关疾病的方法，尤其是病理性血管生成性疾病、或特征在于不期望的过度血管新生的疾病，所述方法包括向有需求的患者施用治疗性或预防性量的至少一种化合物的步骤，所述化合物选自以下：

-根据本发明的抗体及其片段，

-编码根据本发明的抗体或其片段的分离的核酸分子；和

-包含所述核酸分子的载体。

根据本发明的治疗方法可以进一步包括向有需求的患者施用治疗性或预防性量的至少另一种兴趣化合物(例如抗肿瘤剂、抗血管生成化合物、抗炎化合物)的步骤。

如本文所用，术语“抗肿瘤剂”指的是阻止肿瘤生长或促进肿瘤萎缩的任何化合物。抗肿瘤剂可以是抗血管生成的化合物、DNA嵌入剂/交联剂(如奥沙利铂、米托蒽醌)、DNA合成抑制剂(例如胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷、5-氟尿嘧啶)、DNA-RNA转录调节剂(多柔比星、放线菌素D)、微管抑制剂(紫杉醇、诺考达唑)。

如本文所用，术语“抗血管生成的化合物”是指抑制病理性血管网的进展的任何化合物。尤其是，抗血管生成的化合物能抑制促血管生成因子的受体，如VEGF受体和CXCL/ELR+趋化因子(例如CXCR1和CXCR2)的受体。

如本文所用，术语“抗炎化合物”指的是减少炎症的任何化合物。尤其是，抗炎化合物可以是类皮质激素和非类固醇抗炎剂布洛芬衍生物。

尤其是，抗血管生成化合物选自：

-抗VEGF抗体，如贝伐单抗(尤其用于治疗和/或预防癌症)和兰尼单抗(尤其用于治疗和/或预防年龄相关性黄斑变性)；

-抗EGF受体抗体，如西妥昔单抗；

-参与血管生成的受体(包括VEGFR1、2、3、CSFR、PDGFR)抑制剂，如舒尼替尼、索拉非尼、阿西替尼、瑞格非尼；

-m-TOR抑制剂，如依维莫司、坦西莫司；

-EGF受体抑制剂，如埃罗替尼。

根据本发明的所述抗体、核酸分子和/或所述载体可以和所述兴趣化合物同时、分开或顺序施用。

本发明还涉及一种组合产品，其包含：

-至少一种化合物，其选自：根据本发明的抗体及其片段、编码根据本发明的抗体或其片段的分离的核酸分子以及包含所述核酸分子的载体；以及

-至少另一种兴趣化合物；

同时、分开或顺序使用而用作药物。

有利的实施方案如上文所定义。

尤其是，所述另一种兴趣化合物是抗血管生成化合物。

本发明还涉及根据本发明的组合产品，用于预防和/或治疗趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关的疾病，尤其是病理性血管生成性疾病。

本发明还涉及一种用于检测样本中至少一种选自CXCL1、CXCL7和CXCL8的趋化因子的方法，包括将所述样本与本发明的抗体和/或其片段孵育的步骤。

尤其是，所述样本是生物样本。

术语“生物样本”包括多种获自生物体的样本类型，其可用于诊断或监测分析。术语包括血液和生物来源的其它液体样本、固体组织样本，例如活检标本或组织培养物或其衍生细胞及其后代。另外，术语可涵盖循环肿瘤或其它细胞。术语尤其涵盖临床样本，并且还包括细胞培养物中的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、血清、血浆、尿、羊水、生物流体包括用于眼样本的房水和玻璃液、以及组织样本。术语还包括获取之后按照任何方式操纵的样本，比如用试剂处理、增溶、或针对特定组分进行的富集。

有利的是，生物样本可以选自：体液、其部分、组织提取物和细胞提取物。尤其是，所述生物样本可选自：血浆样本和肿瘤提取物。

尤其是，根据本发明的用于检测样本中趋化因子的方法还包括检测根据本发明的抗体和至少一种趋化因子结合的步骤，所述趋化因子选自：CXCL1、CXCL7和CXCL8。

根据本发明的用于检测样本中趋化因子的方法可以基于本领域技术人员公知的各种技术，包括但不限于：

-western印迹分析(存在于细胞裂解物中或固定在膜上的溶液中的趋化因子或其片段，然后在本领域公知的适当条件下将所述膜和本发明的抗体孵育，优选标记的抗体)，

-ELISA分析(趋化因子或其片段被固定在微量滴定板上，随后在本领域公知的适当条件下将所述板和本发明的抗体孵育，优选标记的抗体)，

-免疫组织化学分析(重组抗体，优选标记的重组抗体，用于对含有表达趋化因子或其片段的固定的细胞或组织的样本进行染色)，

-流式细胞术分析(重组抗体，优选标记的重组抗体，用于在本领域公知的适当条件下对含有表达趋化因子或其片段的固定的或活细胞的样本进行染色)，

在根据本发明用于检测样本中趋化因子的方法的一个实施方式中，本发明的抗体包被在固体支持物上。

这些检测技术充分描述在Sambrook,Fritsch和Maniatis–“Molecular Cloning–ALaboratory Manual”第二版Cold Spring Harbor Laboratory,1989中。本文涵盖需要利用抗体的任何其它检测技术。由于这些技术，可确定所述趋化因子在所述样本中的存在和最终的量。这些技术中的一些需要用可检测的标记物(优选，如上所公开的荧光或发光标记)标记本发明的抗体。

本发明还涉及用于从样本中纯化选自趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8的趋化因子的方法，包括将所述样本和根据本发明的抗体和/或其片段孵育的步骤。

根据本发明的用于从样本中纯化趋化因子的方法，可以基于本领域技术人员公知的各种技术，包括但不限于流式细胞术分析、免疫沉淀分析。这些检测技术充分描述在Sambrook,Fritsch和Maniatis–“Molecular Cloning–A Laboratory Manual”第二版ColdSpring Harbor Laboratory,1989中。

本发明还涉及试剂盒，其用于实施根据本发明的在样本中检测趋化因子以及从样本中纯化趋化因子的方法；所述试剂盒包含：

-根据本发明的至少一种抗体和/或其片段；和

-至少一种用于检测根据本发明的所述抗体和/或其片段的试剂。

用于检测根据本发明的所述抗体的所述试剂可选自ELISA试剂、Western印迹试剂和斑点印迹试剂。

本发明还涉及体外或离体诊断和/或预后方法，并且尤其涉及体外诊断和/或预后受试者中趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关疾病的方法，尤其是病理性血管生成性疾病，尤其是透明细胞型肾细胞癌，所述方法包括：

使用根据本发明的至少一种抗体和/或其片段，确定所述受试者生物样本中选自CXCL1、CXCL7和CXCL8的至少一种人趋化因子的表达和/或表达水平。事实上，本发明人已表明趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8是患者总体生存的预后因子，所述患者患有趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关的疾病、病理性血管生成性疾病、透明细胞型肾细胞癌。尤其是，本发明人已经表明，这些趋化因子尤其是CXCL1和CXCL7的过度表达，是总体生存预后不良的一个因素。

尤其是，可以通过进一步使用针对一个趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8的至少一种标记的第二抗体来进行步骤i)，其中所述趋化因子识别本发明的抗体和/或其片段。

例如，可以通过ELISA分析进行步骤i)，其中本发明的抗体或其片段被固定在微量滴定板上，随后在本领域公知的适当条件下，所述板和针对一个趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8的至少一种标记的第二抗体孵育，其识别根据本发明的抗体和/或其片段。根据本实施方式，可同时确定三种趋化因子的表达水平。

本发明的方法可以进一步包括将步骤i)确定的所述表达水平和对照水平进行比较，并确定所述受试者是否患有趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关疾病的步骤ii)，尤其是病理性血管生成性疾病，更尤其是透明细胞型肾细胞癌。

在优选的实施方案中，本发明的方法包括将步骤i)确定的所述表达水平和对照水平进行比较，并确定所述步骤i)确定的表达水平是否显著高于所述对照水平的步骤ii)，所述显著更高的表达水平表明受试者患有趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关的疾病，尤其是病理性血管生成性疾病，更尤其是透明细胞型肾细胞癌；其中所述对照水平是来自健康受试者的或者来自未患有趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关的疾病，尤其是未患有病理性血管生成性疾病，更尤其是未患有透明细胞型肾细胞癌的受试者的至少一种生物样本中确定的所述至少一种趋化因子的表达水平。

本发明还涉及确定受试者中趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关疾病的恶化(pejorative)结果的体外或离体方法，尤其是病理性血管生成性疾病，更尤其是透明细胞型肾细胞癌，所述方法包括：

a)使用根据本发明的至少一种抗体和/或其片段确定所述受试者生物样本中选自CXCL1、CXCL7和CXCL8中至少一种人趋化因子的表达和/或表达水平。

本发明的方法可以进一步包括将步骤a)确定的所述表达水平和对照水平进行比较并且确定所述受试者是否经历趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关疾病的恶化结果的步骤b)，尤其是病理性血管生成性疾病，更尤其是透明细胞型肾细胞癌。

尤其是，通过进一步使用针对一个趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8的至少一种标记的第二抗体来进行步骤a)，其识别本发明的抗体和/或其片段。

例如，可以通过ELISA分析进行步骤a)，其中本发明的抗体或其片段被固定在微量滴定板上，随后在本领域公知的适当条件下将所述板和针对一个趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8的至少一种标记的第二抗体进行孵育，其识别根据本发明的抗体和/或其片段。根据本实施方式，可同时确定三种趋化因子的表达水平。

适宜的“对照水平”包括在至少一个参考样本中确定的所述至少一种趋化因子的表达水平和参考阈值。

“参考样本”是一种生物样本，其来自具有已知的趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关疾病的状态的受试者，尤其是已知的病理性血管生成性疾病的状态，更尤其是已知的透明细胞型肾细胞癌的状态，或者来自健康受试者，或来自未患有趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关疾病，尤其是未患有病理性血管生成性疾病，更尤其是未患有透明细胞型肾细胞癌的受试者。

优选地，对照水平是来自若干受试者的若干参考样本中确定的所述至少一种趋化因子的平均表达水平。

优选，参考样本是与步骤i)或a)的所述生物样本相同类型的生物样本(即，相应的生理性质的生物样本)。

在优选实施方式中，本发明的方法包括将步骤a)确定的所述表达水平和对照水平进行比较并且确定所述步骤a)确定的表达水平是否显著高于所述对照水平的步骤b)；所述显著更高的表达水平表明所述受试者中趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关的疾病，尤其是病理性血管生成性疾病，更尤其是透明细胞型肾细胞癌的恶化结果；其中所述对照水平是来自健康受试者的或者来自未患有趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关的疾病，尤其是未患有病理性血管生成性疾病，更尤其是未患有透明细胞型肾细胞癌的受试者的至少一种生物样本中确定的所述至少一种趋化因子的表达水平。

适宜的“对照水平”包括健康受试者的、未患有趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关的疾病，尤其是未患有病理性血管生成性疾病，更尤其是未患有透明细胞型肾细胞癌的受试者的相同类型生物样本中确定的所述至少一种趋化因子的表达水平。

优选地，对照水平是来自若干健康受试者的、未患有趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关的疾病，尤其是未患有病理性血管生成性疾病，更尤其是未患有透明细胞型肾细胞癌的若干受试者的相同类型生物样本中确定的所述至少一种趋化因子的平均表达水平。

所述至少一种趋化因子的所述显著更高的表达水平，可以对应于所述对照水平的至少10％以上，15％以上，20％以上，25％以上，30％以上，优选35％以上的表达增加。

这样的参考阈值可以根据待测试生物样本的类型和用于确定所述至少一种趋化因子表达水平的方法而变化。然而，对于特定的实验条件下(相同的待测试生物样本的类型、同样的用于确定所述至少一种趋化因子表达水平的方法)，可以基于患者的参考池(pool)来确定所述阈值，患者的参考池包含患有稳定的趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关疾病，尤其是稳定的病理性血管生成性疾病，更尤其是稳定的透明细胞型肾细胞癌的患者群体(活的患者)以及经历了趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关疾病，尤其是病理性血管生成性疾病，更尤其是透明细胞型肾细胞癌的恶化结果的患者群体(已故患者)。通过测量这些患者的所述至少一种趋化因子的表达水平，可以通过以下特征确定参考阈值T：

-患有稳定的趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关疾病，尤其是稳定的病理性血管生成性疾病，更尤其是稳定的透明细胞型肾细胞癌的全部或大部分参考患者(活的患者)具有至少一种小于T的趋化因子的表达水平值；以及

-经历了趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关疾病，尤其是病理性血管生成性疾病，更尤其是透明细胞型肾细胞癌的恶化结果的全部或大部分参考患者(已故患者)具有至少一种大于T的趋化因子的表达水平值。

在这种情况下，如果步骤i)确定的所述表达水平显著高于所述阈值T，则表示所述受试者中趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关疾病，尤其是病理性血管生成性疾病，更尤其是透明细胞型肾细胞癌的恶化结果。

尤其是，如果待测试的生物样本是血浆样本，参考阈值可包括：

-对于CXCL7，265至1825ng/ml的范围内，优选450至800ng/ml和更优选640ng/ml；

-对于CXCL8，在0至30pg/ml的范围内，优选5至15pg/ml，以及更优选11pg/ml。

尤其是，如果测试的生物样本是肿瘤裂解物样本，参考阈值可包括：

-对于CXCL1，总蛋白的50至150pg/mg的范围内，优选75至125pg/mg和更优选96pg/mg；

-对于CXCL7，总蛋白的800至1400pg/mg的范围内，优选1000至1200pg/mg和更优选1152pg/mg；

-对于CXCL8，总蛋白的50至350pg/mg的范围内，优选150至250pg/mg和更优选206pg/mg。

在本发明的确定受试者中病理性血管生成性疾病尤其是透明细胞型肾细胞癌的恶化结果的方法的一个实施方式中，所述受试者经历抗血管生成疗法。

抗血管生成疗法可以包括向所述受试者施用抗血管生成化合物。

如本文所用，术语“确定”可以表示定性检测和定量化。

术语“表达”通常是指这样一种过程，通过这种过程多核苷酸序列进行成功的转录和翻译，从而表达可检测水平的氨基酸序列或蛋白。在本文的某些情况下，表达是指mRNA的生产。在其它情况下，表达是指蛋白或其片段的生产。可通过正常或患病条件特有的酶促切割或生物过程来生产片段。

任何各种已知的方法可用于检测所述个体的所述生物样本中所述至少一种趋化因子，包括但不限于使用根据本发明的抗体或其片段进行的免疫分析，如通过酶联免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)等。

本发明还涉及一种试剂盒，其用于实施本发明的在受试者中趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关疾病，尤其是病理性血管生成性疾病的体外或离体外诊断和/或预后方法，所述试剂盒包含至少一种根据本发明的抗体和/或其片段。

在具体的实施方式中，本发明还涉及一种试剂盒，其用于实施受试者中趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关疾病，尤其是病理性血管生成性疾病或者特征在于不期望的过度血管新生的疾病或病症的体外诊断和/或预后方法，所述试剂盒包含至少一种根据本发明的抗体和/或其片段。

所述试剂盒可提供额外的用于本发明方法的成分，包括但不限于缓冲液、显影试剂、标签、反应性表面、用于检测的装置、对照样本、标准物、说明书、以及用于确定受试者是否患有趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关疾病，尤其是病理性血管生成性疾病，更尤其是透明细胞型肾细胞癌的解释性信息。

试剂盒还可以包含：

-至少一种用于检测根据本发明的所述抗体或其片段的试剂。

本发明还涉及一种试剂盒，其用于实施本发明的方法用来确定根据本发明的受试者中趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关疾病，尤其是病理性血管生成性疾病，更尤其是透明细胞型肾细胞癌的恶化结果，所述试剂盒包含至少一种根据本发明的抗体和/或其片段。

所述试剂盒可提供额外的用于本发明方法的成分，包括但不限于缓冲液、显影试剂、标签、反应性表面、用于检测的装置、对照样本、标准物、说明书、以及用于确定受试者中趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关疾病，尤其是病理性血管生成性疾病，更尤其是透明细胞型肾细胞癌恶化结果的解释性信息。

试剂盒还可以包含：

-至少一种用于检测根据本发明的所述抗体或其片段的试剂。

本发明还涉及一种方法，其包括：

i”)诊断和/或预后受试者中趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关疾病，尤其是病理性血管生成性疾病，更尤其是透明细胞型肾细胞癌，尤其是根据本发明的方法；以及

iii”)用抗炎和/或抗血管生成疗法，治疗患有趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关疾病，尤其是患有病理性血管生成性疾病，更尤其是患有透明细胞型肾细胞癌的受试者，尤其是向患有趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关疾病，尤其是患有病理性血管生成性疾病的所述受试者施用抗炎化合物和/或抗血管生成化合物(尤其是至少一种选自以下的化合物：根据本发明的抗体、其片段、核酸分子、载体)。

尤其是，所述方法包括：

-i”)诊断和/或预后受试者中趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关疾病，尤其是病理性血管生成性疾病，更尤其是透明细胞型肾细胞癌，包括确定所述受试者生物样本中至少一种选自CXCL1、CXCL7和CXCL8的人趋化因子的表达和/或表达水平；以及

-iii”)用抗炎和抗血管生成疗法，治疗患有趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关疾病，尤其是患有病理性血管生成性疾病，更尤其是患有透明细胞型肾细胞癌的受试者，包括向患有趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关疾病，尤其是患有病理性血管生成性疾病的所述受试者施用至少一种选自以下的化合物：根据本发明的抗体、其片段、核酸分子、载体。这样的方法具有更好地个性化患者(具有过度表达的趋化因子CXCL1、CXCL7和/或CXCL8)治疗的优点，因此避免对患者用抗VEGF疗法进行不必要的治疗(因此避免复发和疾病进展到死亡)。在一个优选的实施方式中，本发明的所述方法还包括将步骤i”)确定的所述表达水平和对照水平进行比较，并确定步骤i”)确定的所述表达水平是否显著高于所述对照水平的步骤ii”)；所述显著更高的表达水平表明所述受试者中趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关的疾病，尤其是病理性血管生成性疾病，更尤其是透明细胞型肾细胞癌的恶化结果；其中所述对照水平是来自健康受试者的或者来自未患有趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关的疾病，尤其是未患有病理性血管生成性疾病，更尤其是未患有透明细胞型肾细胞癌的受试者的至少一种生物样本中确定的所述至少一种趋化因子的表达水平。

本发明还涉及一种方法，包括：

i””)确定受试者中趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关疾病，尤其是病理性血管生成性疾病，更尤其是透明细胞型肾细胞癌的恶化结果，尤其是根据本发明的方法；

-iii””)用抗炎治疗和/或抗血管生成疗法，治疗经历趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关疾病，尤其是病理性血管生成性疾病，更尤其是透明细胞型肾细胞癌恶化结果的受试者，尤其是向经历趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关疾病，尤其是病理性血管生成性疾病恶化结果的所述受试者施用抗炎化合物和/或抗血管生成化合物(尤其是至少一种选自以下的化合物：根据本发明的抗体、其片段、核酸分子、载体)。

尤其是，所述方法包括：

i””)确定受试者中趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关疾病，尤其是病理性血管生成性疾病，更尤其是透明细胞型肾细胞癌的恶化结果，包括确定所述受试者生物样本中至少一种选自CXCL1、CXCL7和CXCL8的人趋化因子的表达和/或表达水平；以及

iii””)用抗炎治疗和抗血管生成疗法，治疗经历趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关疾病，尤其是病理性血管生成性疾病，更尤其是透明细胞型肾细胞癌恶化结果的受试者，包括向经历趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关疾病，尤其是病理性血管生成性疾病恶化结果的所述受试者施用至少一种选自以下的化合物：根据本发明的抗体、其片段、核酸分子、载体。这样的方法具有更好地个性化患者(具有过度表达的趋化因子CXCL1、CXCL7和/或CXCL8)治疗的优点，因此避免对患者用抗VEGF疗法进行不必要的治疗(因此避免复发和疾病进展到死亡)。在一个优选的实施方式中，本发明的所述方法还包括将步骤i””)确定的所述表达水平和对照水平进行比较，并确定步骤i””)确定的所述表达水平是否显著高于所述对照水平的步骤ii””)；所述显著更高的表达水平表明所述受试者中趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关的疾病，尤其是病理性血管生成性疾病，更尤其是透明细胞型肾细胞癌的恶化结果；其中所述对照水平是至少来自健康受试者的或者来自未患有趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关的疾病，尤其是未患有病理性血管生成性疾病，更尤其是未患有透明细胞型肾细胞癌的受试者的生物样本中确定的所述至少一种趋化因子的表达水平。

本发明还涉及选自以下的肽：

-包含序列SEQ ID NO：20或由序列SEQ ID NO：20组成的序列的肽，以及包含或由在SEQ ID NO:20整个长度范围内和SEQ ID NO:20具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一性的序列组成的序列的肽。

本发明还涉及选自以下的至少一种本发明的肽作为免疫原性肽的用途：

如本文所用，术语“免疫原性肽”涉及一种用于免疫动物的肽，其被T细胞启动的(primed)免疫所识别。

通过和免疫原性的载体进行交联或偶联，或者通过采用合适的佐剂，可提高所述肽的免疫原性。确定合适的免疫原性载体或合适的佐剂在本领域技术人员能力之内。免疫原性载体的示例包括但不限于匙孔血蓝蛋白(KHL)、破伤风类毒素(TT)、牛血清白蛋白(BSA)、卵白蛋白(OVA)、牛甲状腺球蛋白(BTG)、谷胱甘肽S转移酶(GST)、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂，使用双功能或衍生剂，例如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基进行缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCL₂、或R¹N＝C＝NR，其中R¹和R是不同的烷基，尤其是匙孔血蓝蛋白(KLH)。

本发明还涉及免疫原性组合物，其包含选自以下的至少一种本发明的肽：

本发明还涉及选自以下的本发明的肽用作药物，尤其是用于预防和/或治疗趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关的疾病，尤其是病理性血管生成性疾病，更尤其是透明细胞型肾细胞癌：

为了用于预防或治疗，将所述肽适当地与药学上可接受的赋形剂一起配制。预防或治疗性治疗适合的制剂可以是口服或胃肠外施用的，优选皮下或肌肉内施用，它们将包含有效量的肽。所述量应能够引发针对选自CXCL1、CXCL7和CXCL8中的在至少一种趋化因子的体液或细胞介导的免疫应答，并且根据患者的整体情况、疾病进展和其它因素的不同而变化。

在另一个实施方式中，冻干本发明的肽。在这样的实施方式中，在施用时将本发明冷干的肽与载体或稀释剂混合，如上所述的那些。在又一个实施方式中，本发明的抗体缀合至化合物(如聚合物)。在一个实施方式中，聚合物是聚亚烷基二醇。在一个实施方式中，聚亚烷基二醇是聚乙二醇，或PEG。

本发明还涉及一种药物组合物，其包含选自以下的本发明的肽：

本发明还涉及选自以下的本发明的肽：

-包含序列SEQ ID NO：20或由序列SEQ ID NO：20组成的序列的肽，以及包含或由在SEQ ID NO:20整个长度范围内和SEQ ID NO:20具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一性的序列组成的序列的肽，

所述肽用来制备用于预防和/或治疗趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关疾病的药物，尤其是病理性血管生成性疾病，更尤其是透明细胞型肾细胞癌。

本发明还涉及治疗和/或预防趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关疾病的方法，尤其是治疗和/或预防病理性血管生成性疾病的方法，所述方法包括向有需求的患者施用治疗性或预防性量的至少一种选自以下的本发明的肽：

包含序列SEQ ID NO：20或由序列SEQ ID NO：20组成的序列的肽，以及包含或由在SEQ ID NO:20整个长度范围内和SEQ ID NO:20具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一性的序列组成的序列的肽。

本发明还涉及制备针对趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8的抗体的方法，包括以下步骤：

α)通过重复施用至少一种选自以下的肽来免疫非人动物：

包含序列SEQ ID NO：20或由序列SEQ ID NO：20组成的序列的肽，以及包含或由在SEQ ID NO:20整个长度范围内和SEQ ID NO:20具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一性的序列组成的序列的肽；

和/或至少一种表达载体，其包含启动子控制下编码所述至少一种肽的核苷酸序列，其中所述启动子在所述非人动物细胞中是有效的；以及

β)从所述免疫的非人动物收集所得的血清，以获得针对所述至少一种肽的抗体；

χ)体外或离体确定所述步骤β)获得的所述抗体特异性结合趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8的能力；并最终

δ)选择能够特异性结合所述趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8的抗体。

优选地，用于制备针对趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8的抗体的方法，进一步包括将所述血清抗体固定在支持(backing)基质上，优选固体支持物，最优选聚苯乙烯固体支持物。

合适的非人动物包括但不限于小鼠、大鼠、绵羊、山羊、仓鼠、兔，优选小鼠。

步骤α)中用作免疫原性肽的肽可包含完整的肽、或其片段及其衍生物，其能够引发针对趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8的体液免疫应答。

对所述动物的血清进行采样来评价抗体滴度。当达到最佳滴度时，对所述动物进行放血以产生合适体积的特异性血清。所需抗体纯化程度取决于预期的应用。对于某些目的，完全不需要进行纯化，但是在其它情况下，例如当抗体要被固定到固体支持物上的时候，可以采取纯化步骤以除去不需要的材料，并减少或消除非特异性结合。

体外或离体确定所述步骤β)获得的所述抗体特异性结合趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8能力的步骤χ)，可以容易地由本领域技术人员确定，例如通过如下文所述的Scatchard分析(1949)或表面等离子共振分析。

术语“启动子控制下编码所述至少一种肽的核苷酸序列，其中所述启动子在所述非人动物细胞中是有效的”是指一种核苷酸序列，其编码所述至少一种肽，所述核苷酸序列可操作地连接到启动子上，启动子指导所述核苷酸序列在所述非人动物细胞中的表达。

在一般情况下，可用于本发明的载体包括但不限于质粒、噬菌粒、病毒、源自病毒或细菌来源的其它运载体(vehicle)，通过插入或并入编码所述至少一种肽的核苷酸序列来操纵所述载体。

分别利用稳定或瞬时表达载体，所述至少一种肽的表达可以是稳定或瞬时的表达。瞬时表达载体的示例包括质粒。稳定表达载体的示例包括慢病毒载体。优选，所述至少一种肽的表达是稳定的。

使用组成型或诱导型启动子，所述至少一种肽的表达也可以是组成型或诱导型的，这是本领域技术人员公知的。组成型启动子的示例包括哺乳动物或病毒启动子，如β-肌动蛋白启动子、肌肉肌酸激酶启动子、人延伸因子、来自猴病毒的启动子(例如SV40)、乳头状瘤病毒、腺病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、巨细胞病毒(CMV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)、乙型肝炎病毒(HBV)、莫洛尼白血病病毒及其它逆转录病毒的长末端重复序列(LTR)和单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子。人们可以容易地使用其它未被命名但在本领域中公知的组成型启动子。

可用于本发明的启动子还包括诱导型启动子，其在诱导剂的存在下进行表达。例如，在某些金属离子存在下，诱导金属硫蛋白启动子以促进转录和翻译。

优选，所述至少一种肽的表达是组成型的。

尤其是，步骤δ)可以包括筛选能够以至多16nM的平衡解离常数(K_D)结合人趋化因子CXCL1、以至多5nM的平衡解离常数(K_D)结合人趋化因子CXCL7以及以至多45nM的平衡解离常数(K_D)结合人趋化因子CXCL8的抗体，平衡解离常数是通过表面等离子体共振所确定的。

本发明还涉及一种筛选用于治疗趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8相关疾病，尤其是病理性血管生成性疾病的抗体的方法，所述方法包括步骤：

a”)通过重复施用选自以下的至少一种肽免疫非人动物：

和/或至少一种表达载体，其包含启动子控制下编码所述至少一种的核苷酸序列，其中所述启动子在所述非人动物细胞中是有效的；以及

b”)从所述免疫的非人动物收集所得的血清，以获得针对所述至少一种肽的抗体；

c”)体外或离体确定所述步骤b)获得的所述抗体特异性结合趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8的能力；并最终

d”)选择能够特异性结合趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8的抗体。

尤其是，步骤d”)可以包括选择能够以至多16nM的平衡解离常数(K_D)结合人趋化因子CXCL1、以至多5nM的平衡解离常数(K_D)结合人趋化因子CXCL7以及以至多45nM的平衡解离常数(K_D)结合人趋化因子CXCL8的抗体，平衡解离常数是通过表面等离子体共振所确定的。

附图说明

图1(A-E)说明本发明的抗体(两个杂交瘤CNCM I-4617(本发明人也称之为12A10-13)和CNCM I-4618(本发明人也称之为35B11-8)所生产的)抑制肿瘤生长的能力。

图1A：提供用于免疫的肽(指定为pCXCL7)。还显示了该CXCL7结构域和显示出最大相似性的CXCL细胞因子其它结构域的比较。

图1B：将3.10⁶786-O^LUC+细胞皮下注射到裸鼠(每组n＝10)。注射后十五天，所有的小鼠形成肿瘤，每周用PBS作为对照或者用15mg/kg由两个杂交瘤12A10-13或35B11-8产生的抗体进行处理。按照(Grepin等人，2012)所描述的每周测量生物发光。数据是平均值±SD。对照和处理的小鼠的肿瘤大小之间的统计学差异表示为：*p<0.05。

图1C：平均体积±SD以及统计学分析：*p<0.05；**p<0.01。

图1D：荷瘤小鼠的代表性图像。

图1E：通过ELISA检测的CXCL1、7、8以及VEGF肿瘤内的量。数据是平均值±SD。统计学差异是：*p<0.05；**p<0.011。

图2说明市售可获得的针对CXCL7或CXCL8的抗体对裸鼠中实验性ccRCC生长的影响。将3.10⁶786-O^LUC+细胞皮下注射到裸鼠(每组n＝7)。注射后十五天，所有的小鼠形成肿瘤，每周用PBS作为对照或者用15mg/kg市售可获得的抗CXCL7抗体或抗CXCL8抗体(

500M33和500M08)或者两种抗体的组合进行处理。按照(Grepin等人，2012)所描述的每周测量生物发光。统计学差异表示为：*p<0.05。

图3说明市售可获得的针对CXCL1、CXCL7或CXCL8的抗体的组合相对于两个杂交瘤12A10-13(CNCM I-4617)和35B11-8(CNCM I-4618)产生的本发明抗体在裸鼠中对实验性ccRCC生长的影响的比较。将3.10⁶786-O^LUC+细胞皮下注射到裸鼠(每组n＝10)。注射后十五天，所有的小鼠形成肿瘤，每周用PBS作为对照、或者用15mg/kg由两个杂交瘤12A10-13或35B11-8产生的抗体、或者用15mg/kg市售可获得的抗CXCL1、抗CXCL7和抗CXCL8抗体(

500P92、500M33和500M08)的组合进行处理。用卡尺测量肿瘤，体积计算为以下(v＝L x l²x 0.52，Auerbach等人，1978)。统计学显著差异显示为：*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

图4表示由两个杂交瘤12A10-13(CNCM I-4617)、35B11-8(CNCM I-4618)生产的本发明的抗体和市售可获得的抗体

的结合和解离常数。

图5表示由两个杂交瘤12A10-13(CNCM I-4617)和35B11-8(CNCM I-4618)生产的抗体的同种型。这些抗体的特征在于杂交瘤12A10-13所产生的抗体为IgG2C，而杂交瘤35B11-8产生的抗体为IgG1。

图6表示肾细胞癌患者总体生存的Kaplan-Meier估计。CXCL1(第三四分位数值96.2pg/mg蛋白)(图6A)和CXCL7(第一四分位数值1152pg/mg蛋白)(图6B)和CXCL8(中位数值206pg/mg)的基线水平(图6C)与总体生存的相关性。从CXCL1基线水平小于或大于第三四分位数的患者亚组或者CXCL7的基线水平小于或大于第一四分位数的患者亚组计算总体生存。

图7显示患者的临床和生物参数和单变量分析。

图8显示患者的临床和生物参数和多变量分析。

图9(A-C)说明两个杂交瘤12A10-13(CNCM I-4617)和35B11-8(CNCM I-4618)产生的本发明抗体在激光诱导的脉络膜血管新生(ChNV)大鼠模型中的作用。使用532nm氩激光的光凝固器(6个75μm大小的斑点，于150mW持续100ms)在第0天在大鼠右眼中诱导脉络膜血管新生(ChNV)。两个杂交瘤12A10-13(CNCM I-4617)(12A)和35B11-8(CNCM I-4618)(35B)产生的本发明抗体在第0天进行玻璃体内施用(30μg/眼)以及生理血清作为阴性对照(运载体-VEH)。

图9A表示在(激光处理之后)第23天病变大小的评价。数据是平均值±SEM。统计分析：*p<0.05。

图9B表示在(激光处理之后)第14天血管造影的评价。数据是平均值±SEM。统计分析：*p<0.05；**p<0.01。第14天通过在血管造影片上(Heidelberg视网膜血管造影)给病变荧光强度计分来评价右眼眼底新生的血管。

图9C表示在(激光处理之后)第21天血管造影的评价。数据是平均值±SEM。统计分析：*p<0.05；**p<0.01。第21天通过在血管造影片上(Heidelberg视网膜血管造影)给病变荧光强度计分来评价右眼眼底新生的血管。

将利用下面内容中的实施例详细说明本发明，但本发明的技术范围并不限于这些实施例。

具体实施方式

实施例

I.材料与方法

人肾脏样本

患者的临床特征以及正常组织和肿瘤组织的血管生成谱之前已经由Grepin R等人(2012)描述。

细胞系和分子生物学

通过慢病毒转导(pLenti6/V5-D-TOPO，Invitrogen，法国)和杀稻瘟菌素筛选(10μg/ml)获得786-O^LUC+、RCC-10^LUC+和ACHN^LUC+细胞。

异种移植瘤的形成和大小评估

将786-O^LUC+、RCC-10^LUC+或ACHN^LUC+细胞(3.10⁶至10.10⁶细胞)皮下注射到5周龄裸鼠(nu/nu)雌性小鼠(Janvier，法国)的侧腹。根据制造商的说明，使用体内成像系统(IVIS,Caliper LifeSciences,法国)对生物发光进行定量。用卡尺平行确定肿瘤体积(v＝L xl²x 0.52(Auerbach等人，1978))。生物发光的值与肿瘤体积之间存在线性关系。

测量细胞因子

根据制造商的建议(PeproTech，Neuilly-sur-Seine，法国)使用PeproTech的ELISA试剂盒测量CXCL细胞因子、FGF、人和小鼠VEGF。使用人DuoSet ELISA试剂盒测量VEGF-C，使用Quantikine ELISA试剂盒(R&D Systems,明尼阿波利斯,USA)测量VEGF-D。

统计分析

统计分析是双侧的，并使用针对Windows的R-2.12.2进行。对于定性数据，使用Chi-2检验或Fisher精确检验进行统计比较，对于定量数据采用学生t检验或Wilcoxon检验以及对于删失数据采用对数秩检验。

分析的材料和方法

设备

3000 SPR(表面等离子体共振)生物传感器，包括CM5传感器芯片、

3000控制软件4.1版本和BIAevaluation软件4.1版本(GE Healthcare)。

试剂

胺偶联试剂盒，其包含N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N-乙基-N'-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和盐酸乙醇胺NaOH，pH8.5。

HBS-EP缓冲液，含有0.01M的HEPES、pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05％(v/v)表面活性剂P20的含水缓冲液。

小鼠抗体捕获试剂盒，其含有捕获抗体(多克隆兔抗鼠免疫球蛋白抗体)、固定化缓冲液(10mM的醋酸钠pH5.0溶液)和再生溶液(10mM甘氨酸-HCl pH 1.7溶液)。

由GE Heathcare提供所有这些试剂。

抗原和抗体

多克隆兔抗小鼠IgG抗体(小鼠抗体捕获试剂盒，GE Healthcare)，1mg/mL的储备浓度。

自制单克隆大鼠IgG抗体：Mc12A10-13和Mc35B11-8，分别为30.5μg/μL和32μg/μL(储备浓度)。

市售单克隆小鼠IgG抗体：McCXCL1、McCXCL7、McCXCL8、McPan CXCL1-2-3。用过滤的去离子水(mQ)溶解这些抗体以分别获得以下储备浓度2mg/mL、1mg/mL、1mg/mL和0.5mg/mL。

测试抗原是细胞因子CXCL1、CXCL3、NAP2、IL8，用过滤的去离子水溶解以获得1mg/mL的储备浓度。

捕获抗体固定在CM5传感芯片的表面

采用标准胺偶联化学，按照GE Healthcare提供的实验规程将多克隆兔抗小鼠抗体(小鼠抗体捕获试剂盒)共价固定在CM5传感器芯片上。

第一，通过持续7分钟注射1：1比例的0.4M EDC和0.1M NHS激活CM5表面的羧甲基葡聚糖。然后将按照30μg/mL稀释于固定化缓冲液(小鼠抗体捕获试剂盒)中的多克隆兔抗小鼠抗体固定在通过7分钟注射激活的表面上。通过注射7分钟的1M盐酸乙醇胺NaOH封闭剩余激活的羧甲基葡聚糖基团。此注射还去除非共价结合的抗体。

在25℃下、以10μL/分钟的流速并采用HSP-EP运行缓冲液进行这些固定化步骤。

采用

3000，在CM5传感器表面设计4个通道(canal)(流动池)。多克隆兔抗小鼠IgG抗体共价偶联于第二、第三和第四流动池(FC)，第一FC(FC1)留作空白以供参考扣除。仅仅激活(EDC/NHS)和失活(盐酸乙醇胺NaOH)第一FC(FC1)，无需注射捕获抗体。

结合分析(配体捕获和分析物结合)

使用向导(wizard)方法尤其是“使用捕捉分子的结合”进行结合分析。

首先配体(兴趣抗体)被固定化抗体捕获。以5μL/分钟的流速注射3分钟，固定在CM5传感芯片上的多克隆兔抗小鼠IgG抗体捕获稀释的抗体Mc12A10-13(5μg/mL)、Mc35B11-8(8μg/mL)、McCXCL1(2μg/mL)、McCXCL7(1μg/mL)、McCXCL8(3μg/mL)、McPan CXCL1-2-3(5μg/mL)。注射分析物(细胞因子)前，复合物“捕获抗体-配体”在10分钟内是稳定的。这种捕获是非共价的相互作用。

然后一定浓度范围的细胞因子(分析物)注入捕获抗体(配体)。按照0到10μg/mL的浓度范围，以20μg/mL的流速将细胞因子CXCL1、CXCL3、NAP2、IL8注入捕获配体。形成复合物“配体/分析物”。分别持续约3分钟和2.5分钟监测结合和解离相。以RU(共振单位)为单位测量诱导的信号。

再生步骤在注射每种细胞因子(分析物)之间进行以便除去复合物“配体-分析物”。该步骤包括以20μL/分钟的流速注射再生缓冲液(小鼠抗体捕获试剂盒)。根据所测试的“配体-分析物”对，再生注射的持续时间在30秒至3分钟之间变化。再生步骤结束时，最少在5分钟内稳定CM5传感器芯片(根据所测试的“配体-分析物”对，5至7分钟)。

再生之后，仅捕获抗体(多克隆兔抗小鼠IgG抗体)保留在CM5传感器芯片上。芯片再次准备好用于新的一轮结合分析。

用HBS-EP运行缓冲液进行抗体和细胞因子稀释。

在25℃、用HBS-EP运行缓冲液进行所有这些结合分析。只在FC1和FC2上监测结合分析。由于FC1是对照(空白)，在FC2中测量的信号减去FC1上获得的信号。此外，各个浓度细胞因子得到的信号减去运行缓冲液注射(0μg/mL细胞因子)得到的信号。

材料和方法-脉络膜血管新生

使用532nm氩激光的光凝固器(6个75μm大小的斑点，于150mW持续100ms)在第0天在大鼠右眼中诱导脉络膜血管新生(ChNV)。

着色的(pigmented)Brown Norway大鼠分为8只动物的三组，各组对应于三种不同的处理(在第0天在激光诱导的脉络膜血管新生大鼠模型的玻璃体内施用)：

-30μg/眼的杂交瘤12A10-13(CNCM I-4617)(12A)产生的本发明抗体；

-30μg/眼的杂交瘤35B11-8(CNCM I-4618)(35B)产生的本发明抗体；

-生理血清作为阴性对照(运载体-VEH)。

在(激光处理之后)第23天评价病变大小。

第14和21天通过在血管造影片上(Heidelberg视网膜血管造影)给病变荧光强度计分来评价右眼眼底的新生血管。

II.结果

II.1针对CXCL1、CXCL7和CXCL8的抗体降低肿瘤生长

利用ELR+CXCL的蛋白序列相似性来开发同时(concomitantly)识别参与肿瘤生长的细胞因子CXCL1、7和8的抗体。

为了这个目的，本发明人采用序列SDLYAELRCMCIKTTSGIHPKNIQS(SEQ ID NO：20)的特异于人CXCL7的肽免疫Lou/M大鼠。然而，这种肽与CXCL1、2、3和8共享相似性，如图1A所示。

不同的筛选方法被用于分离两种不同的杂交瘤12A10-13(CNCM I-4617)、35B11-8(CNCM I-4618)：Bourcier等人之前描述的(2011)在偶联到钥孔血蓝蛋白的序列SEQ IDNO：20的肽上面进行的ELISA测试、以及这些抗体在表达CXCR2的细胞中抑制CXCL-7诱导的ERK激活的能力的测试。

通过

等离子体共振分析，确定这些抗体针对主要兴趣CXCL的平衡解离常数K_D和亲和性常数Ka，并示于图4。这些结果证明两种抗体对不同细胞因子特别是对CXCL7、CXCL1和CXCL8的多重特异性。此外，本发明的抗体(由两个杂交瘤12A10-13/CNCM I-4617、35B11-8/CNCM I-4618产生)能够以高于市售可获得的抗CXCL7抗体的亲和性结合人趋化因子CXCL7。

这些抗体的特征在于，对于杂交瘤12A10-13(CNCM I-4617)所产生的抗体为IgG2C，而对于杂交瘤35B11-8(CNCM I-4618)产生的抗体为IgG1(图5)。已使用特定的试剂盒(大鼠同种型分型试剂盒，AbD Serotec,参考:RMT1)进行这种表征。

通过分析这些抗体在裸鼠中对ccRCC异种移植肿瘤进展的影响，评价本发明的抗体抑制肿瘤生长的能力。

图1B、C和D清楚地表明，两种抗体强烈抑制肿瘤生长。

此外，两种抗体降低参与肿瘤侵袭性的主要细胞因子CXCL1、CXCL7和CXCL8在肿瘤内的量。用这些抗体治疗荷瘤小鼠也减少VEGF的表达，突出了其强大的抗血管生成作用(图1E)。

相较于单独使用或组合使用的市售抗CXCL1、抗CXCL7和抗CXCL8抗体，这些新开发的抗体能够更有效地抑制肿瘤的生长(图1B、1C、2和3)。这些结果真的令人惊奇，因为市售抗CXCL7和抗CXCL8抗体的组合(有或没有市售抗CXCL1抗体)对肿瘤生长的抑制不能够获得加和的效果。与此相反，本发明人已经表明在肿瘤生长的抑制方面，市售抗CXCL7和抗CXCL8抗体的组合使用没有单独使用它们时有效，并在RCC小鼠模型中具有促肿瘤效应(图2)。

II.2CXCL1、CXCL7和CXCL8是透明细胞型肾细胞癌患者总体生存的预后因子

为了研究趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8是否与患者结果有关，确定了患有透明细胞型肾细胞癌(ccRCC)的51例患者的总体生存(Grepin R等人(2012))和肿瘤内不同趋化因子的量之间的关系。总共，22名患者(43％)在随访期间死亡。值得注意的是，显示出CXCL1水平超过第三四分位数(96.2pg/mg)的患者或显示出CXCL7水平超过第一四分位数(1152pg/mg)的患者有显著更高的死亡率(图6A和B)。显示出CXCL8水平超过中位数(206pg/mg)的患者有更高的死亡率(图6C)。

单变量生存分析显示，CXCL1和CXCL7表达是总体生存预后不良的因子(分别为p＝0.017和p＝0.0015)(图7)。此外，诊断转移和Fürhman等级，两者均已知是患者结果预后不良的因子，也显著与总体生存相关(p＝<10^-3和0.001)。

然后在多变量Cox回归模型中分析CXCL1的水平、CXCL7的水平、总体生存方面的诊断转移和Fürhman等级的预后显著性(图8)。CXCL7的表达被鉴定为总体生存的独立预后参数(p＝0.014)，而CXCL1没有达到统计学显著性(p＝0.059)。就总体生存方面而言，对于诊断转移和Fürhman等级得到类似的结果(p＝0.0005和0.007；图8)。

这些结果表明，尤其是使用本发明的抗体检测趋化因子CXCL1、CXCL7和CXCL8的过度表达，是患有病理性血管生成性疾病、透明细胞型肾细胞癌患者总体生存的预后因子。

II.3针对CXCL1、CXCL7和CXCL8的抗体在激光诱导的脉络膜血管新生大鼠模型中显著减少病变大小并降低血管渗漏

为了研究针对CXCL1、CXCL7和CXCL8的抗体在年龄相关性黄斑变性中的作用，在激光诱导的脉络膜血管新生大鼠模型中进行实验。

使用532nm氩激光在第0天在大鼠右眼中诱导脉络膜血管新生(ChNV)。

着色的Brown Norway大鼠分为8只动物的三组，各组对应于三种不同的处理(在第0天在激光诱导的脉络膜血管新生大鼠模型的玻璃体内施用)：

-30μg/眼的杂交瘤12A10-13(CNCM I-4617)(12A)产生的本发明抗体；

-30μg/眼的杂交瘤35B11-8(CNCM I-4618)(35B)产生的本发明抗体；

-生理血清作为阴性对照(运载体-VEH)。

在(激光处理之后)第23天评价病变大小。如图9A所示，在用本发明的两种抗体治疗后第23天，病变的大小急剧减少(12A10-13(CNCM I-4617)(12A)：p＝0.0014；35B11-8(CNCM I-4618)(35B)p＝0.004)。

第14和21天通过在血管造影片上(Heidelberg视网膜血管造影)给病变荧光强度计分来评价右眼眼底新生的血管。结果示于图9B和9C。

在运载体处理组(阴性对照-VEH)，激光损伤后14和21天，诱导的眼睛显示出一致性的荧光素渗漏。在第14天，平均荧光素渗漏为2.8±0.2(平均值±SD，n＝8，中位数＝2.8)，以及在21天是2.8±0.4(平均值±SD，n＝8；中位数＝3.0)，其中78％出现严重渗漏的斑点(3分)，这表明ChNV的形成和持久性。

相较于运载体组，玻璃体内注射30μg杂交瘤12A10-13(CNCM I-4617)(12A)产生的本发明抗体则在第14和21天显示出血管渗漏32％的减少(分别p＝0.002和0.0046)，而在注射有30μg杂交瘤35B11-8(CNCM I-4618)(35B)产生的本发明抗体的眼中，观察到了倾向于抑制渗漏的趋势。

这些结果清楚地表明，本发明的抗体在激光诱导的脉络膜血管新生大鼠模型中降低病变大小和减少血管渗漏的效率。

文献参考

Auerbach R,Morrissey LW,Sidky YA.Regional differences in theincidence and growth of mouse tumors following intradermal or subcutaneousinoculation.Cancer Res.1978；38:1739-44.

Bourcier C,等人2011.Constitutive ERK activity induces downregulationof tristetraprolin,a major protein controlling interleukin8/CXCL8mRNAstability in melanoma cells.Am J Physiol Cell Physiol 301(3):C609-618.

Carmeliet P,Jain RK.2000.Angiogenesis in cancer and otherdiseases.Nature.Sep14；407(6801):249-57.

Chothia C,Lesk AM.1987.nonical structures for the hypervariableregions of immunoglobulins.J Mol Biol.Aug 20；196(4):901-17.

Chothia C,Lesk AM,Tramontano A,Levitt M,Smith-Gill SJ,Air G,SheriffS,Padlan EA,Davies D,Tulip WR,等人Conformations of immunoglobulinhypervariable regions.Nature.Dec 21-28；342(6252):877-83.综述.

Choueiri TK,Plantade A,Elson P,Negrier S,Ravaud A,Oudard S,Zhou M,Rini BI,Bukowski RM,Escudier B.2008Efficacy of sunitinib and sorafenib inmetastatic papillary and chromophobe renal cell carcinoma.J Clin Oncol.Jan 1；26(1):127-31.

Cole等人1986Methods Enzymol,121；140-67.

Ebos JM,Lee CR,Cruz-Munoz W,Bjarnason GA,Christensen JG,KerbelRS.2009.Accelerated metastasis after short-term treatment with a potentinhibitor of tumor angiogenesis.Cancer Cell.Mar 3；15(3):232-9.

Eisen T,Oudard S,Szczylik C,Gravis G,Heinzer H,Middleton R,Cihon F,Anderson S,Shah S,Bukowski R,Escudier B；TARGET研究小组.2008Sorafenib forolder patients with renal cell carcinoma:subset analysis from a randomizedtrial.J Natl Cancer Inst.Oct 15；100(20):1454-63.

Escudier B,Bellmunt J,Négrier S,Bajetta E,Melichar B,Bracarda S,Ravaud A,Golding S,Jethwa S,Sneller V.Phase III trial of bevacizumab plusinterferon alfa-2a in patients with metastatic renal cell carcinoma(AVOREN):final analysis of overall survival.J Clin Oncol.2010May 1；28(13):2144-50.doi:10.1200/JCO.2009.26.7849.Epub 2010Apr 5.

Grepin R等人(2012)Acceleration of clear cell renal cell carcinomagrowth in mice following bevacizumab/Avastin treatment:the role of CXCLcytokines.Oncogene31(13):1683-1694.

Harper SJ,Bates DO.2008VEGF-A splicing:the key to anti-angiogenictherapeutics？Nat Rev Cancer；8(11):880-7.

Hurwitz H,Fehrenbacher L,Novotny W,Cartwright T,Hainsworth J,Heim W,Berlin J,Baron A,Griffing S,Holmgren E,Ferrara N,Fyfe G,Rogers B,Ross R,Kabbinavar F.2004Bevacizumab plus irinotecan,fluorouracil,and leucovorin formetastatic colorectal cancer.N Engl J Med.Jun 3；350(23):2335-42.

Huse WD,Sastry L,Iverson SA,Kang AS,Alting-Mees M,Burton DR,BenkovicSJ,Lerner RA.1989.Generation of a large combinatorial library of theimmunoglobulin repertoire in phage lambda.Science.Dec 8；246(4935):1275-81.

G,Milstein C.1975Continuous cultures of fused cells secretingantibody of predefined specificity.Nature.Aug 7；256(5517):495-7.

Kozbor,D.&Roder,J.C.1983.The production of monoclonal antibodies fromhuman lymphocytes.Immunology Today,4,72-79.

Motzer RJ,Escudier B,Oudard S,Hutson TE,Porta C,Bracarda S,GrünwaldV,Thompson JA,Figlin RA,Hollaender N,Urbanowitz G,Berg WJ,Kay A,Lebwohl D,Ravaud A；RECORD-1研究小组.2008Efficacy of everolimus in advanced renal cellcarcinoma:a double-blind,randomised,placebo-controlled phase IIItrial.Lancet.Aug9；372(9637):449-56.

Pàez-Ribes M,Allen E,Hudock J,Takeda T,Okuyama H,

F,Inoue M,Bergers G,Hanahan D,Casanovas O.2009Antiangiogenic therapy elicits malignantprogression of tumors to increased local invasion and distantmetastasis.Cancer Cell.Mar 3；15(3):220-31.

Sambrook,Fritsch和Maniatis–“Molecular Cloning–A Laboratory Manual”Second Edition Cold Spring Harbor Laboratory,1989.

Yao C,Lin Y,Ye CS,Bi J,Zhu YF,Wang SM.2007.Role of interleukin-8inthe progression of estrogen receptor-negative breast cancer.Chin Med J(Engl).Oct20；120(20):1766-72。

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