CN1544463A - 一种肝癌转移相关蛋白质分子ck19的筛选及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明通过高低转移能力肝细胞癌细胞株MHCC97－H和MHCC97－L的差异表达蛋白，筛选得到与肝癌转移相关的蛋白质分子CK19，Western blot和免疫荧光也证实CK19在两种细胞株中的差异表达。据此，本发明提出CK19在制备抗肝癌药物中的应用，具体可作为治疗肝癌的药物中的靶分子。另外，放射免疫酶标法分析发现CK19的片段分子CYFRA21－1在裸鼠血清中随着肿瘤的发展而升高，特别是在肝细胞癌移植后第5周肺转移发生时有显著升高。因此，作为CYFRA21－1的一种应用，可作为肝癌诊断的标记和预测肿瘤转换和预后的标记。

Description

一种肝癌转移相关蛋白质分子CK19的筛选及其应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种肝癌转移相关蛋白质分子CK19的筛选及其应用。

背景技术

肝内外转移复发是目前肝细胞癌临床诊疗的主要难点问题。有资料显示，肝癌根治性手术切除后的5年复发率高达61.5％[1]。因此，阐明肝癌转移复发的分子机制，并由此提出新的预防和诊疗措施是基础和临床研究的热点。

肝癌的转移复发是一个多分子参与的多步骤的过程，前期研究已提示：p16、p53、H-ras、c-erbB-2、mdm2，TGFα、EGF-R、MMP-2、uPA及其受体uPA-R、ICAM-1、VEGF、bFGF等基因和分子可能对肝癌的转移复发有正向调节作用，而nm23-H1、Kai-1、TIMP-2、integrinα5、E-cadherin等则起负调控效应[2]，但相关的研究多为对单一分子的独立研究，较少的系统研究则为基因表达谱检测[3]，缺乏在蛋白水平对肝细胞癌的分子机制进行系统性探讨。近几年，以双向电泳和质谱分析为主的蛋白质组学的方法和技术为在整体的蛋白表达谱水平研究疾病的发生发展过程提供了良好的手段[4]。

肝癌转移复发的细胞和动物模型可促进对肝细胞癌复发转移机制的研究，由复旦大学肝癌研究所建立的肝癌转移系列细胞系和相应的裸鼠动物模型是一大突破，为在多层次系统研究肝癌复发转移机制创造了理想的条件[5]。

发明内容

本发明的目的在于筛选一种与肝癌转移相关的蛋白质分子，并进一步提出该蛋白质分子的应用。

本发明运用双向电泳方法对高低转移能力的肝癌细胞系进行了蛋白表达谱的比较分析，得到数个差异位点，经质谱鉴定筛选得其中一个为细胞角蛋白19(cytokerain 19，CK19)。该差异表达结果得到了Western blot和免疫荧光的证实，且Western blot结果显示：在转移能力逐步提高的肝癌细胞系中CK19的表达逐渐升高。临床102例肝细胞癌的免疫组化结果表达，8例CK19表达阳性，且阳性病例的转移性更高。据此，本发明提出KC19在制备治疗肝癌药物中的应用。具体可将其作为治疗的一个靶分子。

另外，本发明进一步在肝细胞癌的裸鼠模型和临床肝癌病人中，分析血清中CK19片段分子CYFRA21-1的浓度与肝细胞癌进展和转移复发的关系。在裸鼠模型里，可以看到CYFRA21-1的浓度随肝细胞癌的进展而升高，特别是在第5周肺转移发生时，CYFRA-21-1的浓度大量升高。108例临床肝癌病人和正常对照的血清分析结果表明，和常用的肝癌诊断分子标记AFP相比，CYFRA21-1可以提高肝癌诊断率11.1％。此外，肝癌病人血清中CYFRA21-1的升高和已肝病毒感染、血清中的AFP水平、和门静脉癌栓、肿瘤分级有显著关系。因此，可以把CYFAA21-1作为检测肝癌细胞的标记，或预测肿瘤转换的标记。

附图说明

图1为双向电泳图谱。

A：MHCC97-L银染后的双向电泳图谱；

B：点SSP7615双向电泳图谱。

图2为点SSP7615酶解后质谱分析图谱。

图3为Western blot差异表达图谱。

其中，图3(a)为A：MHCC97-H和MHCC97-L细胞裂解液Western blot差异表达图谱，图3(b)为B：Western blot检测CK19在转移能力逐步提高的细胞系HCCLM 1-5中的表达图谱。

图4为免疫荧光验证CK19的差异表达图谱。

图5为健康人的血清中CYFRA21-1的浓度分布。

具体实施方式

细胞系：采用分别具有高低转移能力的肝癌细胞系MHCC97-H和MHCC97-L，它们来自同一母细胞系-MHCC97。两者orthotopic接种裸鼠后的自发性Pulmonary转移率分别为100％和40％[6]。转移能力逐步提高的细胞系HCCLM 1-5由MHCC97-H在裸鼠体内反复选择得到[7]。细胞系的培养条件为含10％胎牛血清的DMEM，5％CO₂。

肝癌标本：102例肝细胞癌标本来自东方肝胆外科医院，由2个病理科医生明确为肝细胞癌。男性52 8，女性8名，中位年龄52岁(从26-72)。92(90.2％)例血清检测hepatitis B病毒感染阳性。AFP高于25μg/L的42例(75.5％)；72例肿瘤大于5cm.。82例(80.4％)伴肝硬化；27例(26.5％)in TNM分级I和II，75(73.5％)为III级和IV级；64例有包膜侵犯，9例有巨检门静脉癌栓，镜检血管癌栓19例；卫星灶发现12例。

主要试剂和仪器

尿素、3[(3 cholamidopropyl)dimethylammonio]lpropanesulfonate(CHAPS)、十二烷基磺酸钠(SDS)、二硫苏糖醇(DTT)购自Sigma公司；碘乙酰胺(IAA)、丙烯酰胺、N，N甲叉双丙烯酰胺等购自Fluka公司。非线性固相pH梯度预制胶条(Immobiline TMDry Stip pH3 10NL，18cm)、过硫酸胺、TEMED等为Bio-Rad产品。ELISA-CYFRA-21-1购自CIS bio international，法国。

实施例1.蛋白质组分析高低转移能力肝癌细胞系的蛋白表达和CK19差异表达

(1)样品制备[8]：细胞培养至90％汇合率时，以0.25％胰酶消化，收集后以蛋白双向电泳专用洗液洗3遍，最后细胞沉淀溶于适量裂解液(8mol/L尿素、4％CHAPS，40mmoll/LTris和65mmmol/L DTT)中，超声细胞破碎仪(Soniprep 150，英国，MSE)冰浴间歇超声2min，25000g、4C离心1h。取上清，改良的Bradford法(F1，[9])蛋白定量，分装，-80C保存。

(2)双向电泳：双向电泳主要按Sanchez等人(F2、[10])的改进方法进行。50ug蛋白与重泡涨液((8mol/L尿素、2％CHAPS，0.5％IPG缓冲液，18mmol/L DTTh和痕量缓冲液)混合，总体积250ul，以pH3-10(非线性)胶条，Bio-Rad等电聚焦系统一相分离一相总Vh范围为47000--50000vh；等电聚焦后胶条依次在平衡液I(6M Urea，30％Glycerol，2％SDS，1％DTT)和平衡液II(平衡液I中DTT以2.5％IAA代替)平衡，每次15min。胶条转移至SDS-PAGE系统(12.5％)，电泳条件为10mA/胶x30min，然后25mA/胶保持至溴芬蓝离胶下缘0.5cm。蛋白用质谱兼容银染法检测([11])。对制备性电泳，上样量为400ug，总Vh为90000-120000，采用可与质谱兼容的银染法检测，其它与分析性方法相同。

(3)蛋白分析：银染后胶以GS-710图像扫描仪(Bio-Rad)透射模式扫描，分辨率84.7μm/pixel。点的检测和匹配用PDQuest软件(Version 7.0，Bio-Rad)分析.。一些鉴定点的理论等电点pI和分子量M_r作为Marker，输入软件用于分析其它蛋白的pI and M_r。

(4)检测和鉴定：MALDI-TOF质谱蛋白鉴定：按文献报道进行[12]。蛋白点由经质谱兼容的银染的胶手工切取，在30mM KCN/100mM Na₂S₂O₃ 1∶1(v/v)中脱色20min，Milli-Q水洗至胶变无色。0.2M NH₄HCO₃中保持20min，真空离心，消化(12.5ng trypsin/μL in0.1M NH₄HCO₃)过夜。抽提蛋白(50％ACN、0.1％TFA)，真空离心浓缩。取0.5μL与HCCAmatrix(sigma，St.Louis，MO)混合，Bruker REFLEX III MALDI-TOF mass spectrometer(Bruker-Franzen Analytik，Bremen，German)分析。用Mascot(http：//www.matrixscience.com/，MatrixSicence Ltd，UK)软件分析确定蛋白序列。本发明共制备三批高低转移肝癌细胞系，每批样品重复3次进行双向电泳，银染后用PDQuest软件分析。图1A显示MHCC97-L银染后的图谱，MHCC97-H和MHCC97-L可检测到的蛋白点平均分别为1020个和1140个。两种细胞系的蛋白匹配率为0.81，表明两种细胞系的绝大部分蛋白表达相同。在制备性银染胶上，用MALDI-TOF-MS共鉴定了35蛋白点(其中包括保守蛋白和差异表达蛋白)，部分见图1A。其中，点SSP7615(pH，MW)仅表达于MHCC97-H，酶解后质谱分析得到个肽段，数据库搜索18个肽段与cytokeratin19相符，得分值为240，蛋白覆盖率为50％(图1b and 图2)。

实施例2.CK19差异表达的Western blot验证及CK19在转移能力逐步提高肝癌细胞系的表达：Western blot按常规方法进行，15ug蛋白10％SDS-PAGE分离，转移至Immobilon-Pmembrane(Millipore，Bedford)，以鼠抗人CK19单抗(DAKO，1∶2000)，enhancedchemiluminescence(ECL，Amersham).法检测。为确认CK19在双向电泳中的差异表达，MHCC97-H和MHCC97-L细胞裂解液进行Western blot分析，结果与双向电泳结果一致(图3A)。进一步用Western blot检测CK19在转移能力逐步提高的细胞系HCCLM 1-5中的表达，结果表明，随着转移能力的升高，CK19的表达同步同向增加(图3B)。

实施例3：免疫荧光验证CK19的差异表达：荧光免疫组化分析方法：玻片上培养MHCC97-H和MHCC97-L以PBS洗3遍，甲醇-20℃固定5min。一抗(monoclonal mouseanti-human Cytokeratin 8，18，and 19 primary antibodies，DAKO，1∶100 dilution forCK8 and CK18，1∶50 dilution for CK19)37℃孵育30min at，换成FITC-藕联抗鼠二抗(1∶300，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)室温30min。PBS洗3min X3，荧光显微镜(Zeiss，Germany，450-nm波长)下观察和摄影。显示MHCC97-H和MHCC97-L的CK8和CK18(肝细胞表达的另两种角蛋白)表达行为一致，CK19在MHCC97-H细胞上呈网状结构分布，而在MHCC97-L上基本未见(图4)。

实施例4：临床HCC标本免疫组化分析：方法：H-E染色切片(两份)脱蜡至水，3％过氧化氢孵育10min，一抗(mouse anti-human CK19，1∶2000)，4℃过夜，二抗(兔抗鼠，1∶2000)，30min，37℃，DAB(1∶200，DAKO，Denmark)显色，中性树胶封片。显微镜下观察(10×10)，随机挑取5个视野，以癌细胞核染成明显可辩的棕黄色为阳性，计算阳性染色细胞数，根据阳性细胞数的多少分级为：0-4％染色计为阴性，5％-75％计为阳性，75％-100％为强阳性。

以上结果表明CK19仅表达于高转移肝细胞癌细胞系MHCC97-H，且表达水平与转移能力呈正相关，说明CK19的表达与肝细胞癌细胞的转移能力有关。为进一步证实这种结论，检测了经临床确诊为HCC的102例标本的CK19的表达情况及与临床指标的关系。结果显示，13例(13/102，12.7％)呈阳性(阳性细胞比例大于25％)。对结果进行临床病理指标分析，结果显示：CK19阳性病例与阴性病例相比，分化程度更差[grade III/IV tumors13/13(100.0％)vs 62/89(69.7％)，P＜0.001]，肝内转移性更强[卫星灶5/13(38.5％)vs 7/89(7.9％)，P＜0.05；癌拴11/13(87.5％)vs 17/89(19.1％)，P＜0.001].，而两组在年龄、肿瘤大小、血管浸润和HBsAg血清阳性率等方面无显著差异(p＞0.05)(Table1)。

                                    表1

                        CK19阳性              CK19阴性            P值

                        (n＝13)               (n＝89)

年龄(岁，平均值)        54.7                  49.9                ＞0.05*

HBsAg^Δ阴性            92.3％(12/13)         89.9％(80/89)       ＞0.05^

肿瘤大小

＞5cm                   69.2％(9/13)          70.8％(63/89)

≤5cm                   30.8.％(4/13)         29.2％(26/89)       ＞0.05^

AFP(＞25μg/L)          69.2％(9/13)          76.4％(68/89)       ＞0.05^

TNM分级

III/IV                  100.0％(13/13)        69.7％(62/89)

I/II                    0.0％(0/13)           30.3％(27/89)       ＜0.001^

血管浸润                61.5％(8/13)          62.9％(56/89)       ＞0.05^

卫星灶                  38.5％(5/13)          7.9％(7/89)         ＜0.05^

癌栓^*                  84.6％(11/13)         19.1％(17/89)       ＜0.001^

^*包括门静脉和小血管癌栓

^ΔB型肝炎表面抗原

*Student’s t-test

Fisher’s exact test

实施例5：人肝癌转移裸鼠模型中的CK19分析

方法：高转移人肝癌裸鼠模型用于来研究血清中CK19片段分子CYFRA-21-1的水平和肿瘤进展的关系。5×106 cells/0.2ml的HCCLM3细胞株皮下注射到30只4周龄的雄性BALB/C-nu/nu裸鼠(购自中科院上海动物中心)中。肿瘤细胞移植后，老鼠被随机分成6组，依次在第2，3，4，5，6，7周的周末用深度麻醉法(注射3％的苯巴比妥)处死老鼠，学员10000g离心10分钟后分出血清，然后保存在-80度。记录每只老鼠的肿瘤重量，肺固定在10％的中性福尔马林中，用于传统的病理学检测。肺转移用以前的方法记录(5)，血清中CYFRA-21-1的浓度用试剂盒(ELISA-CYFRA21-1，CIS bio international，France)检测。

结果：当HCCLM3肝癌细胞注射到裸鼠模型以后，肿瘤一周后开始表现侵袭性生长，第三周肿瘤生长开始加速，第五周裸鼠身体明显表现出衰退。肺部的病理学研究表明，第五周开始有明显的肺转移发生。肿瘤生长和血清CYFRA21-1的关系如表2所示，可以看到，第五周肺转移灶发生时，血清中CYFRA21-1的水平大量升高。

                                                表2

                     2周           3周           4周          5周           6周           7周

肿瘤重量(g)          0.31±0.13    0.61±0.12    1.43±0.37   2.38±0.92    3.74±0.96    4.85±1.02

肺转移率(％)         0             0             20           100           100           100

肺转移平均值         0             0             0^a)         81            118           150

血清CK19(μg/L)      4.79±1.16    5.06±1.21    8.55±1.25   40.71±9.87   76.29±20.00  95.94±19.68

                                                              ^{b)           b)           b)}

a)：4周内仅有一例老鼠发生肺转移，并且肺转移总数小于5，所以平均转移数为0。

b)：P＜0.01，对比4周内的血清CK19水平(ANOVA and q test)。

实施例6：肝癌临床病人和正常对照病人的CK19分析

方法：101例上海某医院的体检职工的血清被收集，且保存在-80度。这些人均体检合格，年龄在29-76岁之间，67名男性和34名女性。108例某医院肝癌研究所的临床肝癌病人的血清被收集和保存在-80度，用于检测CK19和AFP。这些病人从2002年6月到12月接受临床手术治疗，有82名男性和26名女性，年龄在28到76岁之间。94例病人有HBV感染。肿瘤直径大小从1到13.5厘米。有77例TNM I/II期的病人，31名III/IV期病人。血清中CYFRA-21-1的浓度用试剂盒(ELISA-CYFRA21-1，CIS bio international，France)检测。

结果：为了确定正常中国人的血清中的CK19浓度范围，我们检测了101例健康人的血清中CYFRA21-1的浓度，平均值为1.47±0.42μg/L，如图5所示。我们用95％的置信水平作为检测上限，相应浓度为2.29μg/L，作为临界值。108例临床肝癌病人的血清中，78(74.2％)例AFP的水平为35μg/L-2009μg/L，24例(22.2％)CK19的范围为2.37μg/L-45.54μg/L，94例(87.0％)病人血清中CK19或CYFRA21-1的浓度大于临界值。12例(11.1％)肝癌病人的CK19浓度异常升高，但AFP浓度处于正常范围。统计学分析发现，CK19和AFP浓度的异常升高明显相关(P＜0.05)，但CK19浓度高病人HBV感染率比正常CK19浓度范围的低(P＜0.05)，提示CK19的异常升高和HBV感染没有明显关系。另外CK19浓度的升高和病理指标门静脉癌栓，肿瘤分期明显相关(P＜0.05)。如表3所示。

         表格3.108 HCC病人*血清CK19水平和临床病理特征的相关性.

                      CK19大于正常          CK19正常        P value

                      (n＝24)               (n＝108)

年龄(岁)

范围                  39-76                 28-70

Mean±SD              55±12                50±9           ＞0.05**

性别

男性                  19(79.2％)            63(75％)

女性                  5(20.8％)             21(25％)

血清AFP水平

＞25μg/L             13(54.2％)            65(77.4％)

＜25μg/L             11(45.8％)            19(22.6％)      ＜0.05

血清HBV状态

阳性                  16(66.7％)            78(92.9％)

阴性                  8(33.3％)             6(7.1％)        ＜0.05

肝硬化

阳性                  19(79.2％)            77(91.7％)

阴性                  5(20.8％)             7(7.3％)        ＞0.05

肿瘤大小

＜5cm                 12(50％)              31(36.9％)

5-10cm                5(20.9％)             23(27.4％)

＞10cm                7(29.1％)             30(35.7％)      ＞0.05

肝内转移

是                    6(33.3％)             10(11.9％)

否                    18(66.7％)            74(88.1)        ＞0.05

门静脉癌栓

是                    6(33.3％)             5(6.0％)

否                    18(66.7％)            79(94.0％)      ＜0.05

TNM分级

I/II                  11(45.8％)            66(78.6％)

III/IV                13(54.2％)            18(21.4％)      ＜0.05

*血清来自于病理学确定的肝细胞癌住院病人，采用自动化ELISA kit测定。

**t test.

Chi-square test.

统计学分析方法：用SPSS 8.0软件的t-test和Fisher’s exact test判断CK19表达与临床病理指标的相关性，取p＜0.05为差异有显著性意义。血清中CK19片段分子CYFRA-21-1的差异比较采用变异分析(ANOVA)和q test.

实施例7，CK19在制备防止肝癌转移药物中的应用。例如，可以制成一种药物组合物，其中含有细胞角蛋白19以及在药学上可接受的载体。这种药物组合物可用于制备防止肝癌转移的药物中。

实施例8，CK19的片段分子CYFRA21-1作为检测肝癌细胞的标志，或预测肿瘤细胞转移的标记。例如，可以做成一种检测试盒，其中含有细胞角蛋白19的片断分子CYFRA21-1。

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Claims (8)

1、一种肝癌转移相关蛋白质分子，其特征在于该蛋白质分子为细胞角蛋白19。

2、一种筛选肝癌转移相关蛋白质分子的方法，其特征在于运用双向电泳方法对高低转移能力的肝癌细胞系进行蛋白表达谱比较分析，得到数个差异位点，经质谱鉴定，筛选得一个蛋白质分子为细胞角蛋白19，并经Westem blot和/或免疫荧光证实。

3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述具有高转移能力的肝癌细胞系为MHCC97-H和MHCC97-L。

4、一种细胞角蛋白19在制备防止肝癌转移药物中的应用。

5、一种细胞角蛋白19的片断分子CYFRA21-1作为检测肝癌细胞的标记，或预测肿瘤转移的标记。

6、一种检测试剂盒，其特征在于它含有权利要求1所述的细胞角蛋白19。

7、一种组合物，其特征在于含有权利要求1所述的细胞角蛋白19和药学上可接受的载体。

8、一种如权利要求7所述的组合物在制备防止肝癌转移的药物中的应用。

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