CN1851454A

CN1851454A - 一种测定血清蛋白质指纹图谱的方法

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Publication number: CN1851454A
Application number: CN 200510025339
Authority: CN
Inventors: 刘银坤; 崔杰锋; 康晓南; 汤钊猷
Original assignee: Zhongshan Hospital Fudan University
Current assignee: Zhongshan Hospital Fudan University
Priority date: 2005-04-22
Filing date: 2005-04-22
Publication date: 2006-10-25
Anticipated expiration: 2025-04-22
Also published as: CN1851454B

Abstract

本发明属生物技术领域，涉及应用血清蛋白质组学的方法测定血清蛋白质指纹图谱的方法。具体涉及血清蛋白质的表面增强激光解析离子化－飞行时间质谱测定和肝病的特异性蛋白峰比较识别的方法。经对查体各项指标正常的正常健康人，ELISA或HBVDNA核实的慢性肝炎病人，和确诊有影像学诊断依据(B超或CT)的肝硬化病人及手术后肿瘤标本均经病理检验证实的肝癌病人进行测定，结果表明，本方法能为筛查乙肝病人、肝硬化病人及肝癌病人提供特异性技术手段，且简易可行，适用于大规模人群如体检、流行病调查等。亦可用于临床对病人的鉴别诊断。

Description

一种测定血清蛋白质指纹图谱的方法

技术领域：

本发明属生物技术领域，涉及应用血清蛋白质组学的方法测定血清蛋白质指纹图谱的方法。具体涉及血清蛋白质的表面增强激光解析离子化-飞行时间质谱测定和肝病的特异性蛋白峰比较识别的方法。

背景技术：

蛋白质指纹图谱技术由蛋白芯片技术和质谱鉴定技术组成，而后者又分为基质辅助的激光解析离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和电喷雾质谱(ESI-MS)，近来又发展了表面增强的激光解析离子化飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)可直接应用血清等体液样本，具有需要样本量少(如血清0.5ul-500ul，细胞约2000个)，可检测低丰度(1fmol)、低分子量的未知蛋白，由于以上特点，比较适合临床应用。

SELDI-TOF-MS技术目前已广泛应用于肿瘤、新药开发、传染病、神经、精神疾病等领域。关于肿瘤诊断的研究结果于2002年Lancet上由美国FDA和NCI合作研究的卵巢癌的早期诊断上(Lancet 2002，359(2)：590-7)，与传统的CA125单项指标相比(阳性预测值仅35％)，仅蛋白质指纹图谱的多项指标诊断模型的敏感度在100％，阳性预测值高达94％，以后的几年中，该方法已用于如小细胞肺癌(Lancet 2003，362(9382)：433-9)、前列腺癌(J Urol 2004，172(4pt)：1302-5)、肾癌(Iht J Mol Med 2005。15(2)：285-90)、乳腺癌(Breast Cancer ResTreat2004，86(3)：281-91)、头颈部肿瘤(Clin Cancer Res 2004，10(14)：4806-12)国内已开展此项技术，如上海华山医院用于膀胱癌(Clin Biochem 2004，37(9)：772-9)和神经胶质瘤研究；瑞金医院用于胰腺癌和血液病研究，浙江大学用于结肠癌(Clin Cancer Res 2004，10(14)：8380-5)等。展现了广阔的临床应用前景。

发明内容：

本发明的目的是提供一种测定血清蛋白质指纹图谱特异性的方法。本方法可用于提高鉴别诊断肝病包括乙型肝炎、肝硬化和肝癌的特异性。

本发明的技术方案主要采用表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)，包括血清样本的采集标准，化学芯片的选择、处理和阅读，测定条件的优化；判别模式及验证。

本方法经对查体各项指标正常的正常健康人，ELISA或HBVDNA核实的慢性肝炎(乙型肝炎)病人，和确诊有影像学诊断依据(B超或CT)的肝硬化病人及手术后肿瘤标本均经病理检验证实的肝癌病人进行测定，结果表明，本方法能为筛查乙肝病人、肝硬化病人及肝癌病人提供特异性技术手段，且简易可行，适用于大规模人群如体检、流行病调查等。亦可用于临床对病人的鉴别诊断。

表1是筛查乙肝病人、肝硬化病人及肝癌病人的血清蛋白质指纹图谱总结表。

表1

组别	判别用蛋白质峰(M/Z)	模型判别符合率(％)	验证及应用
组别	判别用蛋白质峰(M/Z)	模型判别符合率(％)	验证及应用	乙型肝炎	2284129572049	病人 95.1正常 94.3	诊断敏感性85.29％诊断特异性84.21％阳性预期值82.86％阴性预期值86.49％总有效率84.72％
肝硬化	20493166	病人 91.6正常 94.3		乙型肝炎	2284129572049	病人 95.1正常 94.3	诊断敏感性85.29％诊断特异性84.21％阳性预期值82.86％阴性预期值86.49％总有效率84.72％
肝硬化	20493166	病人 91.6正常 94.3		肝癌	23381280402918	病人 94.8正常 94.3	诊断敏感性90.48％诊断特异性89.36％阳性预期值88.37％阴性预期值91.30％总有效率89.89％

附图说明

图1，血清样品检测的重复性分析结果。

图2，3，4，血清蛋白质指纹图谱中有判别意义的蛋白质峰，

蛋白质峰1：M/Z 22842；蛋白质峰2：M/Z 2957；蛋白质峰3：M/Z 2049其中：第1、2行：正常人血清；第3、4行：HBV病人血清。

图5，正常人和乙型肝炎病人的血清蛋白质图谱的判别模式(决策树模型)。

图6，7，正常人与原发性肝癌病人血清蛋白质指纹图谱中有判别意义的蛋白质峰，

蛋白质峰1：M/Z 23381；蛋白质峰2：M/Z 28040；蛋白质峰3：M/Z2018

其中：第1、2行：HCC病人血清；第3、4行：正常人血清。

图8.区分正常人和原发性肝癌病人的血清蛋白质图谱的判别模式(决策树模型)。

图9，10，正常人与肝硬化病人血清蛋白质指纹图谱中有判别意义的蛋白质峰，

蛋白质峰1：M/Z 2049

蛋白质峰2：M/Z 3166

其中：第1、2行：肝硬化病人血清；第3、4行：血清正常人血清。

图11，区分正常人和肝硬化病人病人的血清蛋白质图谱的判别模式(决策树模型)。

具体实施方式

实施例1

表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)实验：

1.标本来源：正常健康人为查体各项指标正常，且血脂、血糖、肝肾功能，乙肝五项化验均正常。慢性肝炎(乙型肝炎)病人均经ELISA或HBVDNA核实。

肝硬化病人确诊均有影像学诊断依据(B超或CT)。肝癌病人的手术后肿瘤标本均经病理检验证实。

2.标本收集：空腹静脉抽血5-10ml，室温静置30分钟左右，6000rpm-1000rpm离心15分钟，收集上清(血清)分装，-80℃保存。避免溶血和脂血标本。

3.芯片选择：优先选择蛋白指纹峰分布和表达均理想的WCX2蛋白芯片对血清的蛋白谱进行检测。

4.血清样品前处理

(1)从-80℃冰箱中取出血清样品，置冰盒上融解；

(2)以10000rpm，4℃离心2分钟；

(3)每个芯片点需要血清3ul，将血清用2倍体积U9缓冲液(9M urea，2％CHAPS，50mM Tris-Hcl，1％DTT，pH 9.0)稀释。稀释时注意不要用取液器反复吹吸，避免产生大量气泡，用手指轻敲样品管底部(或振荡器上)，将样品充分混匀；

(4)将以上样品冰浴振荡30分钟(或每隔5分钟用手指轻弹混匀一次)；

(5)将9ul上述变性后样品加入108ul相应的结合缓冲液，使得血清的总稀释倍数达到约40倍。混匀，避免气泡产生；

(6)将处理好的血清样品上样到芯片上。

5，实验操作：

(1)取出WCX2的芯片，在其背后标记时间，芯片种类，操作者的姓名等资料；

(2)将芯片装入生物芯片处理器(Bioprocessor)，注意不触碰加样孔，同时将芯片“A”头放在外端，密封；

(3)每孔加入200ul结合缓冲液(50mM NaAC，pH 4.0，或试剂盒中的bindingbuffer)，置振荡器(MS1 Minishaker)400-600转/分震荡5分钟，甩掉缓冲液。重复上述操作一次，保持芯片无气泡及每点的表面湿润；

(4)上样，在芯片处理器每孔中加入100ul处理好的样品，置振荡器(MS1Minishaker)400-600转/分，4℃震荡1小时。

(5)甩出样品，生物样品(如血液，尿样，脑脊液，癌细胞液等)甩入预装消毒剂的容器。

(6)每孔加入200ul的结合缓冲液(50mM NaAc，pH 4.0或试剂盒中的bindingbuffer)，室温置振荡器(MS1 Minishaker)400-600转/分震荡5分钟，甩去孔中液体(，再次加入结合缓冲液200ul，重复操作一次。

(7)每孔加入200ul HPLC水，甩出。

(8)拆开芯片处理器，取出芯片，待干后，每加样孔加SPA 0.5ul，待干后，重复加SPA 0.5ul一次。

(9)待干后，上机测定。

6，设置芯片阅读参数

(1)设定最高质量5000道尔顿，最适范围2000-20000道尔顿；

(2)设定初始激光强度为185；

(3)设定检测敏感度为8；

(4)校正聚焦点于孔中央；

(5)设定质量检测器为1000道尔顿；

(6)设置数据处理为SELDI位置；

(7)设定SELDI参数为22delta至4转换，终点为82；

(8)设定湿热位置至2，强度为10；

(9)置入样品。

7，血清样品检测的重复性分析(SELDI-TOF-MS/WCX2蛋白芯片)，结果表明，组内重复性差异CV＜18％，组间重复性差异CV＜18％。

8，在上述基础上，建立正常人血清与乙型肝炎病人蛋白指纹图谱的鉴别模式，

1)建模组：正常人血清35份，乙型肝炎病人血清41份。

2)获得的血清蛋白质指纹图谱中有判别意义的蛋白质峰(图2，3，4)。

蛋白质峰1：M/Z 22842；

蛋白质峰2：M/Z 2957；

蛋白质峰3：M/Z 2049。

建立区分正常人和乙型肝炎病人的血清蛋白质图谱的判别模式(决策树模型，图5)，通过血清中M/Z为22842、2957和2049三个蛋白质即可将肝炎病人鉴别出来，其准确率对肝炎而言为95.1％(39/41)，正常人为94.28％(33/35)。

9，验证(盲筛结果)

共72份标本，病理和临床证实含正常人标本38例，乙肝病人例34例，

38例判别为正常人中，32例被证明为正常(真阴性)，6判断为乙肝病人(假阳性)

34例判别为乙肝病人标本中，29列被证明为病人(真阳性)，5判断为正常人(假阴性)

诊断敏感性＝29/(29+5)＝85.29％

诊断特异性＝32/(32+6)＝84.21％

阳性预期值＝29/(29+6)＝82.86％

阴性预期值＝32/(32+5)＝86.49％

总有效率＝(29+32)/72＝84.72％。

实施例2 确定正常人与原发性肝癌患者血清蛋白指纹图谱鉴别模式在实施例1的基础上，

1)建模组：正常人血清35份，原发性肝癌病人血清39份。

2)获得的血清蛋白质指纹图谱中有判别意义的蛋白质峰：

蛋白质峰1：M/Z 23381

蛋白质峰2：M/Z 28040

蛋白质峰3：M/Z 2018

3)建立区分正常人和原发性肝癌病人的血清蛋白质图谱的判别模式(决策树模型)，通过血清中M/Z为23381、28040和2018三个蛋白质即可将肝癌病人鉴别出来，其准确率对原发性肝癌病人而言为94.8％(37/39)，正常人为94.28％(33/35)。

4)验证(盲筛结果)

共89份标本，(病理及临床证实其中含正常人标本47例，HCC病人例42例)

46例被判别为正常人中，42例被证明为正常(真阴性)，4例HCC病人被判断为正常人(假阴性)6例被判断为病人(假阳性)，

43例被判别为HCC病人中，38例被证明为病人(真阳性)，5例被判断为正常人(假阳性)，

诊断敏感性＝38/(38+4)＝90.48％

诊断特异性＝42/(42+5)＝89.36％

阳性预期值＝38/(38+5)＝88.37％

阴性预期值＝42/(42+4)＝91.30％

总有效率＝(42+38)/89＝89.89％。

实施例3 确定正常人与肝硬化患者血清蛋白指纹图谱鉴别模式在实施例1的基础上，

1).建模组：正常人血清35份，肝硬化病人血清36份。

2)获得的血清蛋白质指纹图谱中有判别意义的蛋白质峰

蛋白质峰1：M/Z 2049

蛋白质峰2：M/Z 3166

3)建立区分正常人和肝硬化病人病人的血清蛋白质图谱的判别模式(决策树模型)，通过血清中M/Z为2049和3166二个蛋白质即可将肝硬化病人鉴别出来，其准确率对原发性肝硬化病人而言为91.6％(33/36)，正常人为94.28％(33/35)。

Claims

1、一种测定血清蛋白质指纹图谱的方法，其特征是采用表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术，包括血清样本的采集标准，化学芯片的选择、处理和阅读，测定条件的优化；判别模式及验证步骤，所述的芯片阅读参数设置为：

1)设定质量范围2000-20000道尔顿；

2)设定初始激光强度为185；

3)设定检测敏感度为8；

4)校正聚焦点于孔中央；

5)设定质量检测器为1000道尔顿；

6)设置数据处理为SELDI位置；

7)设定SELDI参数为22delta至4转换，终点为82；

8)设定湿热位置至2，强度为10。

2、根据权利要求1的测定血清蛋白质指纹图谱的方法，其中所述的芯片选择WCX2蛋白芯片。

3、根据权利要求1的测定血清蛋白质指纹图谱的方法，其中所述的芯片阅读参数设置1)，设定最高质量5000道尔顿。

4、根据权利要求1的测定血清蛋白质指纹图谱的方法，其特征是所述的判别模式是正常人与乙型肝炎病人鉴别的血清蛋白质M/Z：22841，2957，2049及决策树的判别模式，和/或正常人与原发性肝癌病人鉴别的血清蛋白质M/Z：23381，28040，2918及决策树的判别模式，和/或正常人与肝硬化病人鉴别的血清蛋白质M/Z：2049，3166及决策树的判别模式。