CN207047239U - 高效能mRNA标记侦测装置 - Google Patents
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Abstract
一种高效能mRNA标记侦测装置，其包括一检体处理单元、一与该检体处理单元连接的生物素标定单元、一寡核苷酸芯片制备单元、以及一与该生物素标定单元与该寡核苷酸芯片制备单元连接的mRNA侦测反应单元。藉此，本实用新型不但可有效提高敏感度及特异性，且经实验结果显示，本实用新型比传统肿瘤标记‑癌胚抗原更能有效帮助医师评估追踪临床上癌症患者的治疗计划，达到利用一种简单检测方式，协助医师进行更多不同治疗方式。
Description
技术领域
本实用新型有关于一种高效能mRNA(信使核糖核酸)标记侦测装置(CRC芯片)，尤涉及一种可协助医师进行更多不同治疗方式的高效能mRNA标记侦测装置。
背景技术
近30年来美国大肠直肠癌(Colorectal cancer,CRC)患者五年存活率已自50％提升至65％，然国际抗癌联盟(UICC)第二期与第三期接受过病灶切除治疗的患者，仍有30％到40％会复发或死亡。由此可知，实际上患者的存活率仍然偏低，这意谓疾病的复发系属于早期复发。因此寻找具敏感性及特异性的早期诊断方法极为重要。
数十年来，肿瘤侵犯深度、局部淋巴结转移、以及是否有末梢转移，已成为预测美国癌症协会/国际抗癌联盟(AJCC/UICC)病患术后复发的主要预测方式。因此发展早期复发诊断方式能有效预测病人愈后复发状况。在2009年Nannini等人的研究报告指出，以具特异性的大肠癌分子标记与疾病监控方式可有效提升早期复发的诊断及后续疗程。由先前的研究可以看出无法检测的微转移会造成大肠直肠癌手术失败。在2010年Rahbari等人建议，血液中的游离性肿瘤细胞可提供大肠直肠癌术后患者进行早期复发预测。大肠直肠癌患者的早期复发，主因系极恶性的肿瘤(如不良性基因型、肿瘤侵犯深度、淋巴结转移以及末期癌症)以及化疗无效者。在早期复发案例中，存活率始终偏低，因此发展术后早期预测因子将极有价值。然而临床上，部分一至三期患者在依照标准方式治疗下仍产生转移情形，因此必须尽力发展早期预测方式来改善患者愈后照顾方式，但目前并无有效方法区分早期复发及非早期复发患者。故，一般已用者无法符合使用者于实际使用时以一种简单检测方式协助医师进行更多不同治疗方式所需。
实用新型内容
本实用新型主要目的在于，克服已知技艺所遭遇的上述问题并提供一种不但可有效提高CRC芯片敏感度及特异性，且更能有效帮助医师评估追踪临床上癌症患者的治疗计划，达到利用简单检测协助医师进行更多不同治疗方式的高效能mRNA标记侦测装置。
为达以上之目的，本实用新型系一种高效能mRNA标记侦测装置，系包括：一检体处理单元，系具有一前处理反应区及一与该前处理反应区连接的第一试剂存放区，系将一待测检体置于该前处理反应区，并自该第一试剂存放区中加入所需溶液进行细胞溶解、及RNA萃取的前处理，将DNA去除取得一RNA溶液；一生物素标定单元，系与该检体处理单元连接，其具有一标定反应区及一与该标定反应区连接的第二试剂存放区，系将该RNA溶液置于该标定反应区，并自该第二试剂存放区中加入一生物素标定溶液进行生物素标定反应，使mRNA反转录cDNA并完成生物素标定，取得一标定完成的cDNA溶液；一寡核苷酸芯片制备单元，其具有一点渍区及一与该点渍区连接的UV光源，系于该点渍区中置放一热塑性复合材料，将一包含多种目标基因的寡核苷酸片段点渍在该热塑性复合材料上，并以该UV光源照射固定，完成在该热塑性复合材料上被覆有mRNA特异型寡核苷酸序列的寡核苷酸芯片的制备；以及一mRNA侦测反应单元，系与该生物素标定单元与该寡核苷酸芯片制备单元连接，其具有一侦测反应区、一与该侦测反应区连接的第三试剂存放区、及一与该侦测反应区连接的分析处理区，系于该侦测反应区中将该cDNA溶液直接与该寡核苷酸芯片反应，完成杂合反应后自该第三试剂存放区中加入一呈色溶液，直至该待测检体中的mRNA讯号显现，经该分析处理区计算后，取得侦测结果。
于本实用新型上述实施例中，该第一试剂存放区包含蛋白酶酵素K、硫氰酸胍(Guanidium thiocyanate)溶液、带正电的磁珠溶液、绝对酒精、TE缓冲液、及DNA酶。
于本实用新型上述实施例中，该第二试剂存放区中的生物素标定溶液系由寡脱氧胸苷酸引子(oligo dT)、6碱基随机引物(random hexamer)、脱氧核苷三磷酸(dNTP)、生物素化脱氧三磷酸尿苷(biotin-dUTP)、莫洛尼氏鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶、及核醣核酸酶抑制剂(RNAse inhibitor)所组成的群组。
于本实用新型上述实施例中，该第三试剂存放区包含聚乙二醇(PEG 6000)溶液、清洗液、链抗生物素蛋白-碱性磷酸酶(strep-avidin AP)溶液、及硝基蓝四氮唑(nitroblue tetrazolium,NBT)/5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate,BCIP)呈色液。
于本实用新型上述实施例中，该热塑性复合材料为聚丙烯(Polypropylene,PP)。
于本实用新型上述实施例中，该寡核苷酸芯片能检测出大肠直肠癌病患的外围血液(约每106个白血球细胞中，就有1个肿瘤细胞)中，每1毫升约5个细胞(cells)的循环癌细胞(circulating tumor cells,CTCs)。
本实用新型不但可有效提高CRC芯片敏感度及特异性，且经实验结果显示，本实用新型CRC芯片比传统肿瘤标记-癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)更能有效帮助医师评估追踪临床上癌症患者的治疗计划，达到利用一种简单检测装置协助医师进行更多不同治疗方式的目的。
附图说明
图1，系本实用新型高效能mRNA标记侦测装置的结构方块示意图。
图2，系本实用新型高效能mRNA标记侦测工作流程示意图。
图3，系本实用新型分析CRC芯片与复发情形关联性示意图。
图4，系本实用新型比较CRC芯片与传统血液CEA提早检测出大肠直肠癌患者复发情况的示意图。
组件标号对照：
检体处理单元 1；
前处理反应区 11；
第一试剂存放区 12；
生物素标定单元 2；
标定反应区 21；
第二试剂存放区 22；
寡核苷酸芯片制备单元 3；
点渍区 31；
UV光源 32；
mRNA侦测反应单元 4；
侦测反应区 41；
第三试剂存放区 42；
分析处理区 43；
步骤 s111～s115。
具体实施方式
请参阅图1～图4所示，分别为本实用新型高效能mRNA标记侦测装置的方块示意图、本实用新型高效能mRNA标记侦测流程示意图、本实用新型分析CRC芯片与复发情形关联性示意图、及本实用新型比较CRC芯片与传统血液CEA提早检测出大肠直肠癌患者复发情况的示意图。如图所示：本实用新型系一种高效能mRNA标记侦测装置(CRC芯片)，其包括一检体处理单元1、一生物素标定单元2、一寡核苷酸芯片制备单元3、以及一mRNA侦测反应单元4所构成。
上述所提的检体处理单元1具有一前处理反应区11及一与该前处理反应区11连接的第一试剂存放区12。该第一试剂存放区12包含蛋白酶酵素K、硫氰酸胍(Guanidiumthiocyanate)溶液、带正电的磁珠溶液、绝对酒精、TE缓冲液及DNA酶。
该生物素标定单元2与该检体处理单元1连接，其具有一标定反应区21及一与该标定反应区21连接的第二试剂存放区22。该第二试剂存放区22中包含生物素标定溶液，其系由寡脱氧胸苷酸引子(oligo dT)、6碱基随机引物(random hexamer)、脱氧核苷三磷酸(dNTP)、生物素化脱氧三磷酸尿苷(biotin-dUTP)、莫洛尼氏鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶、及核醣核酸酶抑制剂(RNAse inhibitor)所组成的群组。
该寡核苷酸芯片制备单元3具有一点渍区31及一与该点渍区31连接的UV光源32。
该mRNA侦测反应单元4与该生物素标定单元2与该寡核苷酸芯片制备单元3连接，其具有一侦测反应区41、一与该侦测反应区41连接的第三试剂存放区42、及一与该侦测反应区41连接的分析处理区43。该第三试剂存放区42包含聚乙二醇(PEG 6000)溶液、清洗液、链抗生物素蛋白-碱性磷酸酶(strep-avidin AP)溶液、及硝基蓝四氮唑(nitrobluetetrazolium,NBT)/5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate,BCIP)呈色液。如是，藉由上述揭露的结构构成一全新的高效能mRNA标记侦测装置。
当以上述所提高效能mRNA标记侦测装置进行侦测时，其包含下列步骤：
步骤s111：系于点渍区31中置放一热塑性复合材料，例如聚丙烯(Polypropylene,PP)，将一包含多种目标基因的寡核苷酸以点渍机点渍在该热塑性复合材料上，其后，将其放置于无菌烘箱中烘干2小时，随后以UV光源32照射固定，完成一在该热塑性复合材料上被覆有mRNA特异型寡核苷酸序列的寡核苷酸芯片的制备。
步骤s112：系将一待测检体置于该前处理反应区11，并自该第一试剂存放区12中加入所需溶液进行细胞溶解及RNA萃取的前处理，其中该细胞溶解系将该待测检体先经超音波震碎或以液态氮急速冷冻，随即放入42℃水浴箱中解冻，如此反复数次，直至细胞碎裂；而该RNA萃取系将细胞溶出液先与蛋白酶酵素K及硫氰酸胍溶液以4:1比例混合均匀，并于37℃置放1小时之后，加入带正电的磁珠溶液于震荡水浴箱中反应30分钟直至该待测检体中的核酸完全吸附于磁珠上，再将装有磁珠反应液的试管放置于磁座上使磁珠固定于试管底部，吸除磁珠以外的液体，而后以绝对酒精反复冲洗磁珠三次，再以TE缓冲液(TEbuffer)溶出磁珠上吸附的核酸，并在核酸析出液中加入DNA酶，于37℃反应15分钟后，置入95℃加热5分钟使DNA去除，以取得一RNA溶液。
步骤s113：系将反应后的RNA溶液置于该标定反应区21，并自该第二试剂存放区22中加入由oligo dT、random hexamer、dNTP、Biotin-dUTP、MMLV反转录酶、及RNAseinhibitor所组成的生物素标定溶液，于37℃反应2小时，随后重复加入上述群组组成的生物素标定溶液，并于37℃的震荡水浴箱中反应1小时，使mRNA反转录cDNA并完成生物素的标定，标定完成的cDNA溶液随后置于95℃加热5分钟。
步骤四s114：于该侦测反应区41中将反应后的cDNA-dUTP溶液直接与该寡核苷酸芯片反应，于42℃烘箱中反应2小时，之后于该第三试剂存放区42中加入PEG 6000溶液于45℃下震荡反应1小时，以确定杂合反应完成。
步骤五s115：将反应后的寡核苷酸芯片于清洗液中清洗数次，随后加入链抗生物素蛋白-碱性磷酸酶(strep-avidin AP)溶液，再以硝基蓝四氮唑(nitrobluetetrazolium,NBT)/5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate,BCIP)呈色，直至该待测检体中的mRNA讯号显现，经该分析处理区43计算后，取得侦测结果。
于具体实施例中，所有临床病患都由同一个医疗中心同一组手术团队于2015年6月至2016年3月采集而来。追踪工作主要系以欧洲肿瘤医学会(European Society forMedical Oncology,ESMO)的临床诊疗指引(Clinical Practice Guideline,CPG)为根据。术后监测的项目包括患者病史、健康检查及各项临床追踪项目。患者每个月进行一次腹部超音波(ultrasonography)或计算机断层摄影(computed tomography,CT)，每3个月则进行一次胸部平片(chest plain film)。大肠直肠癌患者于接受手术后产生新的或转移的病灶则定义为术后复发。追踪时间则直至患者死亡或是追踪至2016年4月15日为止。
当运用时，系以上述步骤进行侦测，所得侦测结果的统计分析，系将所有资料以SPSS 14.0版进行分析，数据以平均值±标准差(mean±SD)方式呈现，两组间放射线及化学药物治疗结果及基因表现结果以卡方检定分析，结果若P<0.05则有显著差异。
自2015年6月至2016年3月共收集253位大肠直肠癌患者，其中34位患者有早期复发情况发生。未复发组男生120人，女生99人，平均年龄64.5±11.6岁；复发组男生17人，女生17人，平均年龄66.6±11.7岁。结果如表一所示，显示癌胚抗原(carcinoembryonicantigen,CEA)检测结果阳性(≧5ng/mL)及CRC芯片检测结果阳性，在两组间皆存在着显著差异(P＝0.012；P<0.0001)，而在CRC芯片检测结果与复发情形关联性分析中，系利用Cox回归分析(Cox-regression analysis)分析CRC芯片与复发情形关联性，结果如图3所示，显示患者接受CRC芯片检测，结果呈阳性的病患复发率显著高于芯片反应呈阴性的病患。另外，如表二所示，经过统计分析，CEA及CRC芯片两项检测方法对于预测大肠直肠癌复发的敏感性与特异性分别为26.47％与88.24％，以及89.04％与91.78％。其中，LR+：阳性概似比(Positive likelihood ratio)；LR-：阴性概似比(Negative likelihood ratio)；以及CI：信赖区间(Confidence interval)。
表一
表二
并且，由图4亦可发现，CRC芯片检测方法比较于传统CEA检测法可更显著提早检测出大肠直肠癌患者复发情况。
由上述各实验可知，使用CEA及CRC芯片检测方式对于预测大肠直肠癌复发结果中，显示使用CRC芯片检测对于预测大肠直肠癌复发的特异性及敏感性，显著比CEA方法高。证实本实用新型所提CRC芯片确实具有潜力可作为预测大肠直肠癌复发的有效工具。
综上所述，本实用新型系一种高效能mRNA标记侦测装置，可有效改善已用的种种缺点，所制备的寡核苷酸芯片采用多种标记检验，能检测出大肠直肠癌(Colorectalcancer,CRC)病患的外围血液(约每106个白血球细胞中，就有1个肿瘤细胞)中，每1毫升约5个细胞(cells)的循环癌细胞(circulating tumor cells,CTCs)，透过改良芯片基材及基因标定、杂合反应的反应配方及时间，不但可有效提高敏感度及特异性，且经实验结果显示，本实用新型CRC Chip比传统肿瘤标记-癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)更能有效帮助医师评估追踪临床上癌症患者的治疗计划，达到利用一种简单检测装置，以协助医师进行更多不同治疗方式，进而使本实用新型的产生能更进步、更实用、更符合使用者所须，确已符合实用新型专利申请要件，爰依法提出专利申请。
但以上所述，仅为本实用新型较佳实施例而已，当不能以此限定本实用新型实施范围；故，凡依本实用新型权利要求书及说明书内容所作的简单的等效变化与修饰，皆应仍属本实用新型专利涵盖范围内。
Claims (1)
1.一种高效能mRNA标记侦测装置，其特征在于包括：
一检体处理单元，其具有一前处理反应区，以及一与该前处理反应区连接的第一试剂存放区；
一生物素标定单元，与该检体处理单元连接，其具有一标定反应区及一与该标定反应区连接的第二试剂存放区；
一寡核苷酸芯片制备单元，其具有一点渍区及一与该点渍区连接的UV光源；以及
一mRNA侦测反应单元，系与该生物素标定单元与该寡核苷酸芯片制备单元连接，其具有一侦测反应区、一与该侦测反应区连接的第三试剂存放区、及一与该侦测反应区连接的分析处理区。
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