CN101398423B - 一种用于检测肝癌特征蛋白质谱模型的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出一种用于检测肝癌血清特征蛋白的质谱模型及其制备方法。本发明采用肝癌患者与正常人具有差异的多个特征蛋白组合进行对肝癌血清的检测，并采用了传统统计学与现代生物信息学方法相结合的方法进行数据处理，通过利用质谱仪测定肝癌患者、肝功能异常患者和健康人血清样本的蛋白质组谱图，并筛选出相应的8个肝癌特征蛋白的肿瘤标志物，从而制备检测肝癌血清特征蛋白的质谱模型，为寻找新的更理想的肿瘤标志物提供了基础和资源。

Description

一种用于检测肝癌特征蛋白质谱模型的制备方法

技术领域

本发明涉及恶性肿瘤检测领域，为一种全新的非入侵性检测方法，在体外对肝癌进行早期的发现和检测，其敏感性和特异性均达到95％以上。

背景技术

肝癌是常见的恶性肿瘤，而且是癌症中恶性程度很高的一种。肝癌具有起病隐匿、潜伏期长、高度恶性、进展快、侵袭性强、易转移、预后差等特点。其发病率有逐年上升趋势。我国是肝癌发病大国，发病率占全球的45％。肝癌的早期诊断及早期治疗十分重要提高病人生活质量。早期诊断方法除了发病历史外，就是测定甲种胎儿球蛋白，它的诊断正确性达到70％左右。新兴的技术比如CT检查，X线检查等，能提高诊断率达90％，但是这个时候肿瘤已经很明显，不再是早期。现在国内外还没有早期的肝癌的诊断方法，我们应用基于质谱的蛋白质组学技术提供一种可用于早期诊断的方法。

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱，其原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比(M/Z)与离子的飞行时间成正比，检测离子。尽管MALDI-TOF的准确度高达0.1％～0.01％，远远高于目前常规应用的SDS电泳与高效凝胶色谱技术，但在肿瘤标志物尤其是肝癌标志物的应用中仍然存在一些缺陷，因此国内迄今为止尚无采用MALDI-TOF-MS技术获得检测肝癌标志物或肝癌血清特征蛋白的报道。

发明内容

本发明目的是为了克服已有对肝癌标志物或肝癌血清特征蛋白检测技术的不足之处，提出一种用于检测肝癌血清特征蛋白的质谱模型及其制备方法。

本发明的第一个发明目是提供一组用于检测肝癌特征蛋白的肿瘤标志物，其特征在于利用质谱仪测定肝癌患者和健康人血清样本的蛋白质组谱图，并筛选出相应的肿瘤标志物，其中所 述的肿瘤标志物由具有以下质荷比峰的8个肝癌特征蛋白组成：2990.52m/z，5336.81m/z，4963.91m/z，1886.96m/z，2951.85m/z，5005.54m/z，4058.45m/z，4468.01m/z

在第一个具体实施方案中，其中所述的质谱仪是基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪，所述的筛选方法是采用弱阳离子结合表面(WCX)芯片和Cu芯片检测肝癌患者和健康人的蛋白质质谱；在第二个实施方案中，其中所述的质谱仪是基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪，所述的筛选方法是采用弱阳离子结合表面(WCX)芯片和Cu芯片检测肝癌患者和肝功能异常患者的蛋白质质谱。

本发明的第二个发明目是提供通过上述肿瘤标志物制备质谱模型的方法。

在另一个具体实施方案中，所述的质谱模型的建立方法，包括：

1)收集多例临床确诊的肝癌患者血清和正常对照人员的血清作为两组血清标本，进行低温冷冻备用；

2)对血清蛋白进行质谱前预处理：

3)对预处理过的两组血清蛋白进行质谱检测读取，获得两组血清多肽的指纹图谱；

4)对所有的肝癌患者和正常人血清多肽的指纹图谱进行标准化处理，并收集数据；

5)对所得数据进实验质控处理，筛选出具有下列质荷比峰的8个肝癌特征蛋白：2990.52m/z，5336.81m/z，4963.91m/z，1886.96m/z，2951.85m/z5005.54，4058.45，4468.01。

其中通过比较肝癌和正常对照比较，筛选出2990.52m/z，5336.81m/z，4963.91m/z，1886.96m/z，2951.85m/z；通过比较肝癌和肝功能异常，筛选出5005.54m/z，4058.45m/z，4468.01m/z；

6)将所述8个肝癌特征蛋白作为肿瘤标志物，建立用于检测肝癌的质谱模型。

在一个具体实施方案中，所述的步骤2)包括使用磁珠纯化和稳定样品中的血清蛋白或多肽。

在另一个具体实施方案中，步骤3)指采用WCX2芯片对两组血清蛋白进行吸附，并对结合在弱阳离子WCX2芯片上的两组血清蛋白进行读取，获得肝癌和正常人两组血清多肽的指纹图谱；采用Cu芯片对两组血清蛋白进行吸附，并对结合在弱阳离子Cu芯片上的两组血清蛋白进行读取，获得肝癌和肝功能异常两组血清多肽的指纹图谱。

在另一个具体实施方案中，结合生物信息学方法筛选出相应的肿瘤标志物并建立检测模型进行分析检测，所述的生物信息学方法包括对指纹图谱进行标准化处理、对所得数据进实 验质控处理、筛选期望的血清特征蛋白并建立质谱模型，以及可选择地包括使用遗传算法结合最近邻算法建立并验证质谱模型等。其中，所述的实验质控处理指保留峰数量大于50的质谱图谱数据，并采用标准血清(Sigma血清)的组内变异系数来保证实验的一致性，从而根据变异系数满足一致性的允许范围来进行筛选。本发明中，变异系数优选为10.0％。

本发明的第三个发明目的是提供所述的肿瘤标志物组成的质谱模型，在检测肝癌中的应用。其中，所述的应用包括建立血清特征蛋白质谱模型在肝癌早期检测和筛查中的应用。

本发明的第四个发明目的是由所述的肿瘤标志物组成的质谱模型，或者上述方法所制备的质谱模型，在检测肝癌中的应用。其中，所述的应用包括血清特征蛋白质谱模型在肝癌早期检测和筛查中的应用。

有益效果

本发明与其它肝癌的检测方法比较，具有以下优点：

第一，本发明采用肝癌患者与正常人，肝癌患者与肝功能异常患者具有差异的多个特征蛋白组合进行对肝癌血清的检测，并采用了传统统计学与现代生物信息学方法相结合的方法进行数据处理，从而得到肝癌患者和健康人，肝癌患者与肝功能异常患者血清蛋白质指纹图谱检测模型，并且所发现的一系列蛋白质质荷比峰为寻找新的更理想的肿瘤标志物提供了基础和资源。

第二，与以往的血清学检测方法比较具有较高的敏感性和特异性，并能用于筛选抗肝癌的药物中。

第三，本发明模型的构建方法设计合理可行，为提供肝癌的临床治愈率提供了新的筛查方法，同时也为探索肿瘤发生发展的机制提供了新的思路。

第四，利用本发明分析了203份血清样品，1)实施例一第一部分肝癌与正常人分析中肝癌训练组54例，验证组64例，验证结果显示63例判断正确，检出率为98.5％；2)实施例一第二部分肝癌与肝功能异常患者分析中，训练组75例，验证组10例，验证结果显示10例全部判断正确，检出率100％，因此本发明可对肝癌作出早期的诊断，提高病人的存活率和生活质量。

附图说明

图1为使用WCX芯片部分健康人血清和肝癌患者血清的多肽图谱，其中A-C为正常(normal)人血清，D-F为肝癌患者(cancer)血清。

图2为使用Cu芯片部分肝功能异常血清和肝癌患者血清的多肽图谱，其中A-C为肝功能异常人(abnormal)血清，D-F为肝癌患者(cancer)血清。

图3重复做样的5个标准血清(Sigma)质谱指纹图。

图4-A为肝癌组与正常组血清蛋白比较时，蛋白峰在所有建模型样品中的表达水平展示，箭头指向为用于建模型的荷质比为5336.81m/z的肝癌特征蛋白峰；图4-B表示根据蛋白峰进行蛋白的模拟凝胶电泳图，其中箭头指向建模型的5336.81m/z的特征蛋白带。

图5-A为肝癌组与肝功能异常患者蛋白峰在所有建模型样品中的表达水平展示，箭头指向为用于建模型的荷质比为4058.45m/z的肝癌特征蛋白峰；图5-B表示根据蛋白峰进行蛋白的模拟凝胶电泳图，其中箭头指向建模型的4058.45m/z的特征蛋白带。

图6-A为肝癌组与肝功能异常患者蛋白峰在所有建模型样品中的表达水平展示，箭头指向为用于建模型的荷质比为4468.01m/z的肝癌特征蛋白峰；图6-B表示根据蛋白峰进行蛋白的模拟凝胶电泳图，其中箭头指向建模型的4468.01m/z的特征蛋白带。

具体实施方式

本发明将结合具体实施例做进一步的说明，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。

实施例1肝癌质谱模型的建立

1.样本和仪器：

共203例血清样本，分两批获取。第一批作样149例，其中30例来自肝癌患者和24例正常人患者使用WCX磁珠处理；50例肝癌和25例肝功能异常患者使用Cu处理。第二批作样74例，其中64例用于肝癌和和正常人模型的验证，10例用于肝癌和肝功能异常模型的验证。所有肝癌患者均经术后病理报告确定。所有的血清样本均在清晨空腹下抽取，分离血清后储存在-80低温冰箱中。

基质辅助激光解析飞行时间质谱Autoflex II TOF/TOF及实验用的WCX磁珠试剂盒由美国Bruker公司研制。使用Bruker公司的数据分析软件Clinprotools做数据的预处理。

技术路线：

血清的采集：收集静脉血在BD管中，避免溶血。缓慢地上下振荡管五次，使血液中的凝结块混匀。室温(25℃)血凝结1小时，垂直放置。其中血液必须精确凝结一小时，否则，由于样品不同的凝结时间而导致不同的肽谱。室温下，用临床离心机以1.400-2.000g离心SST管(真空采血管，BD公司)十分钟。吸取血清(上清液)到对应的已标记管中。标记干净的0.5ml离心管，同一血清样品50ul一管，分装多管。立即冻存血清样品于-80℃。由于反复冻融血清样品易造成多肽沉淀，从而使得肽谱丢失部分多肽，应避免反复冻融。冻存血清分为永久保存和待分装的。血清分装后可在-80℃保存多年。

血清样品的磁珠处理：在进行ClinProt实验前，从低温冰箱提取分装的血清样品各1管，放于湿冰上。化冻60—90分钟。取出10ul磁珠结合缓冲液(BS)，10ul混匀的磁珠(WCX或Cu)悬浮液，5ul血清样品至样品管，混匀。室温静置5min后，将样品管放入磁珠分离器。使磁珠贴壁1分钟，磁珠与悬浮的液体分离，吸去悬浮的液体，再向样品管中加入100ul磁珠清洗缓冲液(WS)，在磁珠分离器前后相邻两孔间反复移动样品管10次。最后一次使样品管在磁珠分离器上静置，磁珠与悬浮的液体分离，吸去悬浮的液体。重复从加100ul磁珠清洗缓冲液，到最后吸去悬浮液体的操作步骤共3次。从磁珠分离器上取下样品管，并向样品管中加入5ul磁珠洗脱缓冲液(ES)，溶解贴壁的磁珠，样品管放入磁珠分离器，磁珠贴壁2min，磁珠与悬浮的液体充分分离后，将上清液移入干净的刚加入5ul磁珠稳定缓冲液(SS)0.5ml样品管。

3.生物信息学方法

(一)质谱数据采集

应用Autoflex II TOF/TOF质谱仪。激光能量50％时，10shots去杂，36％时50shots采集一个样品结晶点的某一个点，平均每个样品结晶点收集8次共400shots。激光频率：50Hz。数据收集范围：1-20KDa。在每8个样品结晶点收集数据前用标准品进行外标校正，平均分子量偏差小于100ppm。参见图1，图2。图1中为血清多肽指纹谱图，前三个(normalA-C)为健康人的，后三个为肝癌患者的；图2中为血清多肽指纹谱图，前三个(abnormalA-C)为肝功能异常患者的，后三个为肝癌患者的。

实验质控：(1)对于每一张采集到的原始图谱，我们设定S/N>＝5的峰数量做为评判图 谱质量的一个标准；对于峰数量大于50的图谱才保存，舍弃峰数量小于50的图谱。(2)针对整个实验操作，采用标准血清(Sigma血清)的组内变异系数保证实验的一致性，本实例方法的变异系数为10.0％，满足一致性允许范围，说明实验一致性良好，参见表1、图3。表1为标准血清(Sigma血清)中9个蛋白峰的变异系数值；图3为实验中5个标准血清(SigmaA-E血清)的指纹图谱。

表1标准血清(Sigma血清)的组内变异系数

质荷比峰(m/z)		变异系数(CV％)
			1772.16		10.0
2462.95		10.2
			2968.91		10.9

4153.6		10.0
			5020.61		7.6
5574.89		11.0
			6537.99		12.4
7543.22		9.5
			8192.22		8.5
平均值		10.0

(二)原始数据预处理

原始数据经Bruker公司数据分析软件Clinprotools处理，800-10K的峰值经由Top hat方法做基线校准，最小基线宽度10％，以10％最小阀值聚类；然后用总离子流方法做归一化处理。

(三)肝癌特征蛋白的选择

每个质荷比蛋白峰对各类样本的区分的相对重要性都不同，这里运用了T检验P值评价每个蛋白峰的相对重要性。

(四)遗传算法

遗传算法(Genetic Algorithm，缩写为GA)是一种有效的解决最优化问题的方法。利用遗传算法解最优化问题，首先应对可行域中的点进行编码(一般采用二进制编码)，然后在可行域中随机挑选一些编码组成作为进化起点的第一代编码组，并计算每个解的目标函数值，也就是编码的适应度。接着就像自然界中一样，利用选择机制从编码组中随机挑选编码作为繁殖过程前的编码样本。选择机制应保证适应度较高的解能够保留较多的样本；而适应度较低的解则保留较少的样本，甚至被淘汰。在接下去的繁殖过程中，遗传算法提供了交叉和变异两种算子对挑选后的样本进行交换。交叉算子交换随机挑选的两个编码的某些位，变异算子则直接对一个编码中的随机挑选的某一位进行反转。这样通过选择和繁殖就产生了下一代编码组。重复上述选择和繁殖过程，直到结束条件得到满足为止。进化过程最后一代中的最优解就是用遗传算法解最优化问题所得到的最终结果。分类函数采用最近邻算法(KNN)。

在利用遗传算法和最近邻算法对训练样本建立质谱数据分类模型后，利用验证样本来检验所建立模型的分类能力。

(5)有监督的神经网络模型

人工神经网络模型在生物信息学上有着广泛的应用，本发明的人工神经网络运用Clinprotools中的固有算法，设置循环次数为1000次，并选择自动选择原型进行分类。

(6)交叉验证

在模型算法训练过程中引入了交叉验证的过程，这里采用随机选择样本中的80％来建立模型，余下的20％作为验证。它可以监督训练过程，避免建立的模型出现对建模样本表现好，对预测样本表现差的“过学习“现象。

实施例2肝癌检测

应用实例1的方法对健康人群24例，肝癌患者80例，25例肝功能异常患者的血清蛋白质图谱作了检测分析。

1、肝癌和正常对照血清蛋白指纹图诊断模型

为了寻找能鉴别肝癌患者和肝功能异常患者的潜在标志物，30个来源于肝癌患者的样品和24个来源于正常人群的样品蛋白质表达图谱相比较：峰值分析后得到96个荷质比峰利用遗传算法结合最近邻算法建立最终的诊断模型。进一步用遗传算法筛选出2990.52m/z，5336.81m/z，4963.91m/z，1886.96m/z，2951.85m/z等五个蛋白峰。

图4中为蛋白荷质比峰5336.81m/z的健康组与肝癌组样品图谱。在每个图中上面部分的为训练样本中蛋白峰表达水平图，下面的是对应蛋白峰的模拟凝胶图，其中箭头指向为肝癌的特征蛋白带。

这样模型定为采用5个输入变量，分别是：2990.52m/z，5336.81m/z，4963.91m/z，1886.96m/z，2951.85m/z。模型训练识别率为96.25％。并采用随机选择方法进行交叉验证，验证结果为86.62％。模型具有很好的预测能力，参见表2。

表2模型训练结果

样本	例数	预测肝癌组	预测正常组	预测率％
					肝癌组	30	29	1	96.67
正常组	24	1	23	95.83
					总计	87	30	24

从表2中可以看出对训练样本的结果为：24例正常组中的23例判断正确，特异性95.83％；30例肝癌组中的29例判断正确，敏感性为96.67％。

模型训练完成后，建立起了一个有五个输入变量的模型，接着用这个模型对64个验证样本来预测，并判断出样本的类别。结果表明，64例肝癌患者中的63例被准确预测，详见表3。

表3验证样本预测结果

样本	例数	预测肝癌组	预测正常组	预测率％
					肝癌组	64	63	1	98.5
总计	64	63	1

从表3中可以看出对训练样本的结果为：64例肝癌组中的63例判断正确，敏感性为98.5％。

2、肝癌和肝功能异常患者血清蛋白指纹图诊断模型

为了寻找能鉴别肝癌患者和肝功能异常患者的潜在标志物，50个来源于肝癌患者的样品和25个来源于肝功能异常患者的样品蛋白质表达图谱相比较：峰值分析后得到107个荷质比峰，进一步用神经网络筛选出5005.54m/z，4058.45m/z，4468.01m/z。图5中为蛋白荷质比峰4058.45m/z的健康组与肝癌组样品图谱。在每个图中A部分的为训练样本中蛋白峰表达水 平图，B部分是对应蛋白峰的模拟凝胶图，其中箭头指向为肝癌的特征蛋白带。

表4肝癌和肝功能异常比较的建模蛋白的均值、标准差和P值

质荷比峰(m/z)	肝功能异常(均值±标准差)	肝癌(均值±标准差)	P
				5005.54	31.93±8.21	3.88±3.72	<E-06
4058.45	420.56±135.42	58.31±37.53	<E-06
				4467.99	281.55±102.55	52.91±49.42	<E-06

这样模型定为采用3个输入变量，分别是：5005.54m/z，4058.45m/z，4468.01m/z。模型训练识别率为100％。并采用随机选择方法进行交叉验证，验证结果为98.39％。模型具有很好的预测能力。

表5模型训练结果

样本	例数	预测肝癌组	预测肝功能异常组	预测率％
					肝癌组	50	50	0	100
肝功能异常组	25	0	25	100
					总计	75	50	25

从表5中可以看出对训练样本的结果为：25例正常组中的全部判断正确，特异性100％；50例肝癌组中全部判断正确，敏感性为100％。

模型训练完成后，建立起了一个有三个输入变量的模型，接着用这个模型对10个样本来预测，并判断出样本的类别。结果表明，7例肝癌患者全部，3例正常组中的全部都被准确预测，详见表6。

表6验证样本预测结果

样本	例数	预测肝癌组	预测正常组	预测率％
					肝癌组	7	7	0	100
肝功能异常组	3	0	3	100
					总计	7	7	3

从表6中可以看出对训练样本的结果为：3例正常组中全部判断正确，特异性100％；7例肝癌组中全部判断正确，敏感性为100％。

实施例3与其他肝癌检测方法的比较

肝癌起病常隐匿，多在肝病随访中或体检普查中应用AFP及B型超检查偶然发现肝癌，此时病人既无症状，体格检查亦缺乏肿瘤本身的体征，此期称之为亚临床肝癌。一旦出现症状而来就诊者其病程大多已进入中晚期。年肝癌病人接受肝癌切除后的存活率显著增加，八十年代病人的五年存活率少于两成，现时上升至五成二。对于肝癌的诊断，迫切需要一种更早期的诊断方法。而本发明方法原理不同于以上的检测方法，并且本发明方法的结果表明，采用血清多肽检测肝癌也不失为一个效果非常好的诊断手段，对于更早期的肝癌诊断大有裨益。

参考文献： 

1.L lovet JM，Bruix J.Systematic review of randomized trials for unresectable hepatocellularcarcinoma：Chemoembolization imp roves survival.Hepatology，2003，37(2)：429 

2.Chou YY，ChengAL，Hsu HC.Exp ression of P-glycop rotein and p53 in advancedhepatocellular carcinoma treated by single agent chemotherapy：Clinical correlation.J GastroeterolHepatol，1997，12(8)：569 

3.Bokemeyer C，KynastB，Harstrick A，et al.No synergistic activity of ep irubicin and interferon-alpha 2b in the treatment of hepatocellular carcinoma.Cancer Chemother Pharmacol，1995，35(4)：334 

4.Schwartz JD，SungM，SchwartzM，et al.Thalidomide in advanced hepatocellular carcinoma withop tional low-dose interferon-α2a upon p rogression.Oncologist，2005，10(9)：718 

5.SchuchmannM，Schulze-Bergkamen H，Fleischer B，et al.Histone deacetylase inhibition byvalp roic acid down-regulates c-FL IP/CASH and sensitizes hepatoma cells to wards CD95-andTRA IL recep tor-mediated apop tosis and chemotherapy.Oncology Rep，2006，15(1)：227 

6.Zhang Q，Tang X，Lu QY，et al.Resveratrol inhibits hypoxia-induced accumulation of hypoxia-inducible factor-1alpha and VEGF exp ression in human tongue squamous cell carcinoma andhepatoma cells.Mol Cancer Ther，2005，4(10)：1465 

7.Schepelmann S，Hallenbeck P，et al.Systemic gene-directed enzyme p rodrug therapy of hepatocellular carcinoma using a targeted adenovirus armed with carboxypep tidase G2.Cancer Res，2005，65(12)：5003 

8.Zhou J，Gao Q，Ma D.Novel oncolytic adenovirus selectively targets tumor-associated polo-like kinase 1 and tumor cell viability.Clin Cancer Res，2005，11(23)：8431 

9.王成红，樊颍，朱红英等.康莱特联合介入治疗肝癌的近期疗效观察.齐鲁肿瘤杂志，1998，5(3)：218 

10.胡水华，王伟炳，等.康莱特治疗中晚期原发性肝癌30例.齐鲁肿瘤杂志，1999，6(2)：157 

11.刘雪梅.榄香烯乳介入治疗肝癌30例临床观察.国际医药卫生导报，2001，6：8912.Gao Q，Zhou J，Huang X.Selective targeting of checkpoint kinase 1 in tumor cells with a novelpotent oncolytic denovirus.Mol Ther，2006，[Epub ahead of p rint] 

13.Fleischer B，Schulze-Bergkamen H，Schuchmann M，et al.Mcl-1 is an anti-apop totic factorfor human hepatocellular carcinoma.Int J Oncol，2006，28(1)：25

14.顾公望肝癌防治研究上海，上海科学技术出版社1991：1～120 

15.Pawlik TM，Izzo F，Cohen DS，et al1Combined resection and radiofrequency ablation foradvanced hepatic malignancies：results in 172 patients[J]1Ann Surg Oncol，2003，10(9)：1059210691 

16.Boige V，Barbare JC，Rosmorduc O，et al1 Use of sorafenib(Nexavar)in the treatment ofhepatocellular carcinoma：PROD IGE AFEF recommendations[J]1 Gastroenterol Clin Biol，2008，32(1 Pt 1)：3271 

17.吴孟超，陈汉，沈锋1原发性肝癌的外科治疗—附5524例报告[J]1中华外科杂志，2001，39(1)：252291 

18.李伟道.原发性肝癌诊断、分型、分期标准的探讨。中华肝病杂志，1997，5(3)：129-130

Claims (3)

1.一种用于检测肝癌的质谱模型的制备方法，包括以下步骤：

1)收集多例临床确诊的肝癌患者血清和正常对照人员的血清，肝癌患者血清和肝功能异常对照人员血清作为四组血清标本，进行低温冷冻备用；

2)对血清蛋白进行质谱前预处理：

3)采用WCX2芯片对四组血清蛋白进行吸附，并对结合在弱阳离子WCX2芯片上的两组血清蛋白进行读取，获得四组血清多肽的指纹图谱；

4)对所有的肝癌患者和正常人血清多肽，肝癌患者和肝功能异常患者的指纹图谱进行标准化处理，并收集数据；

5)保存峰数量大于50的质谱图谱数据，并对所得数据采用标准Sigma血清的组内变异系数来保证实验的一致性，从而根据变异系数满足一致性的允许范围来进行筛选进行实验质控处理，筛选出具有下列质荷比峰的肝癌特征蛋白：

通过比较肝癌和正常对照比较，筛选出2990.52m/z，5336.81m/z，4963.91m/z，1886.96m/z，2951.85m/z，和

通过比较肝癌和肝功能异常，筛选出5005.54m/z，4058.45m/z，4468.01m/z；

6)将所述8个肝癌特征蛋白作为肿瘤标志物，建立用于检测肝癌的质谱模型。

2.权利要求1所述的制备方法，其中步骤2)包括使用磁珠纯化和稳定样品中的血清蛋白或多肽。

3.权利要求2所述的制备方法，其中变异系数为10.0％。

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