CN117275588A - 一种免疫相关性肺炎的可视化在线预测系统及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种免疫相关性肺炎的可视化在线预测系统及其构建方法，利用MALDI‑TOF‑MS、HPLC‑MS/MS技术定性挖掘潜在生物标志物、ELISA方法定量检测生物标志物表达量，最终发现，SERPINA5、AKAP6、TUBA4A、COL1A2和Pro‑SHAP均在CIP患者中高表达，生物学功能主要集中于免疫微环境和物理微环境。五种蛋白的预测准确性大多超过85％，可作为预测CIP发生的特异性生物标志物。基于此结果，本发明还利用R语言，以上述五种蛋白为建模要素，利用机器学习算法，开发了一种CIP的可视化在线预测系统，其ROC曲线的AUC可达0.996，特异性和敏感性分别为97.6％和95.5％，该预测系统具有便携、可视化、操作简单的巨大优势，方便模型的临床转化应用，对于实现CIP高危人群的筛选和增加免疫治疗的安全性提供了新策略和新方法。

Description

一种免疫相关性肺炎的可视化在线预测系统及其构建方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种免疫相关性肺炎的可视化在线预测系统及其构建方法。
背景技术
恶性肿瘤，一直是人类医学发展史中无法彻底攻克的难题。随着人口的快速增长和老龄化程度的加重，全球恶性肿瘤患者患病率和死亡率也在逐年上升，已成为人类重大疾病负担。随着人类医学事业的发展，多种新型的抗肿瘤治疗手段快速发展，如靶向治疗、免疫治疗等，显著提高了人类对抗肿瘤的能力。其中，免疫治疗开辟了肿瘤治疗新纪元。自从2011年首个CTLA-4抗体——伊匹木单抗被批准用于恶性黑色素瘤的治疗后，肿瘤免疫治疗领域迎来了一次又一次伟大复兴(Nat Rev Drug Discov,2016,15:235-247.)。近年来，多项药物临床试验已在全球广泛开展，并显示出了巨大的抗肿瘤效力。以PD-1/PD-L1抑制剂为代表的免疫检查点抑制剂(ICIs)已在多种肿瘤中广泛应用，取得了令人满意的疗效，开辟了抗肿瘤治疗新时代，如恶性黑色素瘤(N Engl J Med,2017,377:1345-1356.)、肾细胞癌(N Engl J Med,2019,380:1116-1127.)、非小细胞肺癌(N Engl J Med,2018,379:2040-2051.)等。
但人们对于免疫治疗的热情很大程度上是基于其带来的长期临床获益，而这种长期临床获益却只发生在少数患者身上，即仅约20％-40％的患者对免疫治疗敏感(J ClinOncol,2019,37:2518-2527.)。并且，免疫治疗的临床获益不仅取决于有效性，其带来的与作用机制相关的独特不良反应也不容忽视，严重的免疫相关性不良反应极大地阻碍免疫治疗的临床应用，其中免疫相关性肺炎(Checkpoint immune pneumonitis，CIP)是一种最常见的致死性最高的不良反应之一(JAMA Oncol,2016,2:1346-1353.)。既往报道文献及发明人课题组前期研究显示，CIP的发病率可达10％-20％(J Thorac Oncol,2018,13:1930-1939.)，重症CIP的病死率高达14％-35％(JAMA Oncol,2018,4:1721-1728.)，严重的CIP不仅会对患者造成不可逆的损害，缩短患者生存期，还花费巨大，消耗了大量的医疗资源。影像学检查被认为是诊断CIP的黄金手段，但CIP影像学改变滞后、复杂、特异性差，且早期CIP临床症状不明显，难以与其他呼吸道疾病进行鉴别，容易漏诊或发展为重症CIP而危及生命。因此，早期筛选CIP高危患者，积极探索特异性更高的、预测效能更强的全新途径变得迫在眉睫，这对于降低CIP的发病率和病死率是至关重要的。
多项研究试图探索CIP的危险因素和生物标志物。既往研究表明，男性、年龄较大、吸烟、大剂量化疗史、联合治疗史、既往存在间质性肺疾病以及肺气肿的患者更易发生CIP(JAMA Oncol,2018,4:1721-1728.；J Thorac Oncol,2018,13:1930-1939.；J ThoracOncol,2018,13:1138-1145.；Cancer Immunol Immunother,2020,69:15-22.)。其他研究表明，治疗期间，基线时绝对嗜酸性粒细胞计数和中性粒细胞-淋巴细胞比率的增加也表明CIP风险较高(Lung Cancer,2020,150:76-82.；Sci Rep,2021,11:1324.)。虽然上述因素可以在一定程度上预测CIP的发生，但单一维度的预测各有偏重，且目前的CIP预测性标志物的研究仅限于临床特征和非特异性血液学指标，缺乏特异性蛋白组学的研究，并且其识别CIP的ROC曲线下面积仅约为0.60-0.70(Lung Cancer,2020,150:76-82.；Clin LungCancer,2019,20:442-450.e4.)，存在准确性、特异性差、稳定性低的缺点，无法实现“精准预测”的目标，且尚缺乏强有力的循证医学证据。为了规避上述宏观特征的缺点，基于微观组学开发更加准确有效的生物标志物和预测模型是实现高危人群筛选和CIP早期预警的有效方法。
CIP的发生机制目前尚不清楚，是多种因素共同作用的结果。以生物化学信号为主的免疫学机制被认为是经典的机制假说。有研究表明，CIP可能是肿瘤和炎症器官之间的共同抗原的存在导致的ICIs抗肿瘤过程中对肺部炎症器官的“误伤”(N Engl J Med,2016,375:1749-1755；JAMA Oncol,2019,5:1043-1047.)。此外，抗肿瘤反应产生的自身反应性T细胞、自身抗体和多种炎性细胞因子作用于肺部导致肺部炎性细胞的浸润也是潜在的发生CIP的机制(NEngl J Med,2018,378:158-168.)。Suresh等人发现，CIP患者的肺泡灌洗液中CD4+T细胞显著增加(J Clin Invest,2019,129:4305-4315.)。Suzuki等报道CIP患者的BALF中PD-1、Tim-3和TIGHIT阳性的CD8+T细胞比例显著升高(Int Immunol,2020,32:547-557.).无独有偶，Franken等人也发现BALF中CD4+和CD8+T细胞富集，尤其是致病性T辅助17.1细胞的增加，高表达TBX21和RORC，IFN-G，IL-17A，CSF2(GM-CSF)和细胞毒性相关基因(J Immunother Cancer,2022,10:undefined.)。总而言之，ICIs导致的免疫失调以及过度的免疫反应造成了对正常组织的损害，导致了CIP的发生和发展。但生物化学机制还不能完全解释CIP的发生，CIP作为一种典型的纤维化疾病，力学生物学机制也可能发挥着至关重要的作用。成纤维细胞的激活、ECM重塑和内皮细胞功能障碍是不同组织类型纤维化形成的共同病理改变(Cells,2021,10:undefined.)。肺泡细胞外基质是发挥力学响应的关键媒介。ECM的病理改变破坏了机械稳态，胶原蛋白分泌增多导致组织硬度增加，可介导肺纤维化(Elife,2018,7:undefined.)。另外，有研究指出，肺部机械张力升高会激活肺泡干细胞中的TGF-β信号循环，从而驱动肺纤维化进展(Cell,2021,184:845-846.)。总而言之，力学生物学可能参与了CIP的发生，但仍需进一步的研究。
近年来飞速发展的质谱分析法已被认为是蛋白质研究领域和生物大分子研究领域中最重要的分析技术，具有灵敏度高、准确性强、分辨率高的巨大优势，不仅能够检测蛋白质多肽的分子量和氨基酸序列，还能发现蛋白质的结合位点以及翻译后修饰情况，可以大规模鉴定蛋白质和评估蛋白质的表达水平高低,有助于进一步认识细胞和分子机制,提供疾病和药物治疗的新的生物标记物。在临床应用中，凭借其更可靠、更灵敏、更特异的血清生物标志物筛查优势，将基于蛋白组学的临床血清生物标志物筛查推上了舞台，正在成为精准医学新的发展趋势。这说明针对蛋白组学的质谱分析有可能成为预测CIP发生的全新检测手段，利用蛋白组学的质谱分析技术筛查CIP可量化的生物学指标、生物标志物的鉴定，不仅有利于其早期筛查及诊断，对该病发病机制的探讨、诊断标准的制定及治疗药物的研制亦具有重要的意义。
但是，目前尚无任何基于蛋白组学质谱分析技术获得高特异性的预测CIP发生的生物标志物的研究报道。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种免疫相关性肺炎的可视化在线预测系统及其构建方法。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明公开了一种免疫相关性肺炎的可视化在线预测系统，包括：
血清蛋白标志物表达水平检测模块，用于检测待测者血清中的蛋白标志物表达水平；
智能预测模块，用于根据蛋白标志物表达水平，采用智能预测模型计算待测者发生免疫相关性肺炎的概率；
结果输出模块，用于通过可视化在线交互输出结果。
优选地，血清中的蛋白标志物包括SERPINA5、AKAP6、TUBA4A、COL1A2和Pro-SHAP。
进一步优选地，所述智能预测模块，还包括：
差异蛋白获取单元，用于获取血清样本中的差异蛋白表达量；
智能预测模型构建单元，根据差异蛋白表达量绘制差异蛋白的ROC曲线并依据最大约登指数求取差异蛋白的最佳截断值，然后根据最佳截断值将血清样本表达水平进行分类，构建Logistics回归方程，获得智能预测模型。
优选地，对采集的血清样本利用质谱获得一级质谱得到差异峰，二级质谱鉴定差异峰，并通过ELISA验证差异蛋白的表达量。
优选地，血清蛋白标志物SERPINA5预测免疫相关性肺炎的最佳截断值为642.27pg/mL，ROC曲线AUC为0.908，p＜0.0001；
血清蛋白标志物AKAP6预测免疫相关性肺炎的最佳截断值为1050.88pg/mL，ROC曲线AUC为0.857，p＜0.0001；
血清蛋白标志物TUBA4A预测免疫相关性肺炎的最佳截断值为226.32ng/L，ROC曲线AUC为0.874，p＜0.0001；
血清蛋白标志物COL1A2预测免疫相关性肺炎的最佳截断值为894.83pg/mL，ROC曲线AUC为0.825，p＜0.0001；
血清蛋白标志物Pro-SHAP预测免疫相关性肺炎的最佳截断值为198.01pg/mL，ROC曲线AUC为0.865，p＜0.0001。
优选地，构建的Logistics回归方程为：
P＝1/(1+e-(-25.4216+8.5143*A+1.9459*B+9.1706*C+15.7390*D+7.7367*E))；
其中，P为罹患CIP风险的概率；A、B、C、D和E分别代表SERPINA5、AKAP6、TUBA4A、COL1A2和Pro-SHAP的表达水平。
本发明还公开了一种免疫相关性肺炎的可视化在线预测系统的构建方法，包括：
采集血清样本，利用质谱仪通过一级质谱得到差异峰，二级质谱鉴定差异峰，ELISA验证差异蛋白的表达量；
绘制差异蛋白的ROC曲线，并依据最大约登指数求取差异蛋白的最佳截断值；
利用最佳截断值将血清样本表达水平进行分类，构建Logistics回归方程；
通过Logistics回归方程构建在线交互式可视化预测模型。
优选地，所述差异蛋白包括血清蛋白标志物：SERPINA5、AKAP6、TUBA4A、COL1A2和Pro-SHAP。
进一步优选地，血清蛋白标志物SERPINA5预测免疫相关性肺炎的最佳截断值为642.27pg/mL，ROC曲线AUC为0.908，p＜0.0001；
血清蛋白标志物AKAP6预测免疫相关性肺炎的最佳截断值为1050.88pg/mL，ROC曲线AUC为0.857，p＜0.0001；
血清蛋白标志物TUBA4A预测免疫相关性肺炎的最佳截断值为226.32ng/L，ROC曲线AUC为0.874，p＜0.0001；
血清蛋白标志物COL1A2预测免疫相关性肺炎的最佳截断值为894.83pg/mL，ROC曲线AUC为0.825，p＜0.0001。
血清蛋白标志物Pro-SHAP预测免疫相关性肺炎的最佳截断值为198.01pg/mL，ROC曲线AUC为0.865，p＜0.0001。
进一步优选地，构建的Logistics回归方程为：
P＝1/(1+e-(-25.4216+8.5143*A+1.9459*B+9.1706*C+15.7390*D+7.7367*E))；
其中，P为罹患CIP风险的概率；A、B、C、D和E分别代表SERPINA5、AKAP6、TUBA4A、COL1A2和Pro-SHAP的表达水平。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种基于血清蛋白组学质谱分析技术获得的五种特异性预测蛋白组合而成的可预测CIP发生的可视化在线预测系统，五种特异性预测蛋白为：SERPINA5、AKAP6、TUBA4A、COL1A2和Pro-SHAP。利用ELISA方法定量检测验证集中实验组和对照组各差异蛋白的表达量，最终发现，SERPINA5、AKAP6、TUBA4A、COL1A2和Pro-SHAP在实验组和对照组中存在显著差异，五种均在CIP患者中高表达。五种蛋白的预测准确性大多超过85％，可作为预测CIP发生的特异性生物标志物。基于此结果，本发明还利用R语言，以SERPINA5、AKAP6、TUBA4A、COL1A2和Pro-SHAP为建模要素，利用机器学习算法，开发了一种免疫相关性肺炎的可视化在线预测系统，其ROC曲线的AUC可达0.996，特异性和敏感性分别为97.6％和95.5％。后重新利用新纳入的21例患者形成模型验证集(对照组：12例患者；实验组：9例患者)，验证集的ROC曲线的AUC可达0.968。
本发明利用机器学习算法构建的由SERPINA5、AKAP6、TUBA4A、COL1A2和Pro-SHAP五种特异性强的蛋白联合而成的可视化在线预测系统可实现CIP的高效特异性预测，利用R语言开发的在线交互形式具有便携、可视化、操作简单的巨大优势，方便模型的临床转化应用，对于实现CIP高危人群的筛选和增加免疫治疗的安全性提供了新策略。
附图说明
图1：本发明的研究路线图；
图2：基于MALDI-TOF-MS质谱分析技术鉴定出的CIP患者相较于未患CIP患者差异表达的蛋白多肽峰图；
图3：SERPINA5(A)、AKAP6(B)、TUBA4A(C)、COL1A2(D)和Pro-SHAP(E)在CIP患者(红色)和未患CIP患者(绿色)中的表达差异；
图4：SERPINA5(A)、AKAP6(B)、TUBA4A(C)、COL1A2(D)和Pro-SHAP(E)的凝胶色谱分离结果；
图5：SERPINA5(A)、AKAP6(B)、TUBA4A(C)、COL1A2(D)和Pro-SHAP(E)的ELISA定量分析结果；
图6：SERPINA5、AKAP6、TUBA4A、COL1A2(D)和Pro-SHAP(E)鉴别CIP发生的ROC曲线；
图7A为可预测CIP发生的nomogram综合预测模型；图7B为举例说明在线交互式可视化综合预测模型的应用；图7C为预测模型的ROC曲线；图7D为预测模型的校准曲线；图7E为预测模型的决策曲线；图7F为预测模型验证集的ROC曲线；图7G为预测模型验证集的校准曲线；图7H为预测模型验证集的决策曲线。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
本发明提供了一种基于血清蛋白组学质谱分析技术获得的五种特异性预测蛋白组合而成的可预测CIP发生的可视化在线预测系统，五种特异性预测蛋白为：SERPINA5(人血浆丝氨酸蛋白酶抑制剂)、AKAP6(激酶锚蛋白6)、TUBA4A(微管蛋白α-4a链)、COL1A2(I型胶原α-2(I)链)和Pro-SHAP(Α-胰蛋白酶抑制因子重链2前体，又称人血清衍生透明质酸相关蛋白前体)。其中：
SERPINA5，其氨基酸序列为：
R.SARLNSQRLVFNRPFLMFIVDNNILFLGKVNRP.-(SEQ.ID.NO.1所示)；
AKAP6，其氨基酸序列为：
S.DVNVSMIVNVSCTSACTDDEDDSDLLSSSTLT.L(SEQ.ID.NO.2所示)；
TUBA4A，其氨基酸序列为：R.LISQIVSSITASLR.F(SEQ.ID.NO.3所示)；
COL1A2，其氨基酸序列为：GHAGLAGAR(SEQ.ID.NO.4所示)；
Pro-SHAP，其氨基酸序列为：FLHVPDTFEGHFDGVPVISKGQQK(SEQ.ID.NO.5所示)。
1.临床血清样本采集与处理
本发明的整体研究路线图如图1所示。本发明纳入2019.1.1-2021.12.31西安交通大学第一附属医院和空军军医大学唐都医院首次接受ICIs治疗的139例恶性肿瘤患者，采集患者在ICIs治疗前的基线全血，样本充分考虑了年龄、性别、采集时间、储存条件是否一致、有无基础疾病等因素，确保基线条件基本一致。被采集者晨起空腹采血，用真空采血管(红帽、有隔离胶，无任何促凝剂、抗凝剂等添加成分)采集全血5mL，4℃冰箱静置4h，8h内离心后获取血清，离心条件为：在4℃3.0rpm转速下，离心20分钟，将上层血清分装成100μL/管，立即保存于-80℃，避免反复冻融。所有患者进行随访，最少随访时间为6个月，依据我国专家发布的《免疫检查点抑制剂相关不良反应的管理专家共识》以及国际NCCN发布的免疫治疗相关毒性的管理指南(2021版)，联合三位副主任医师级别以上的有丰富临床经验的影像科医师对所纳入患者进行CIP的评估，最终分为实验组(即发生CIP的患者)以及对照组(即未发生CIP的患者)。患者排除标准为：(1)既往目标病变接受过免疫相关治疗或免疫介导治疗；(2)有超过一种的原发恶性肿瘤病史；(3)缺乏基线特征和影像学图像导致无法动态随访；(4)血样质量不佳，如溶血严重、含量太少等。最终该发明纳入117例恶性肿瘤患者(男性87例；女性30例)。分别随机选取54名患者作为质谱训练集(对照组：36例患者；实验组：18例患者)，63例患者作为ELISA验证集(对照组：41例患者；实验组：22例患者)。
这项研究是根据《赫尔辛基宣言》(2013年修订)进行的。在参与研究之前，所有患者或其法律代表均自愿签署了书面知情同意。本研究经西安交通大学第一附属医院伦理委员会批准(批准文号:XJTU1AF2021LSK-001)。
2.蛋白组学质谱分析及鉴定
2.1试剂与仪器
血清蛋白的提取采用厦门普睿迈格生物科技有限公司的磁珠试剂盒“铜离子型”(IMAC-Cu)，以及光谱纯(HPLC级)乙腈、三氟乙酸(德国Merck公司)、α-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)(美国Sigma公司)。
磁珠分离器、600/384AnchorChip靶板和AutoFlex III基质辅助激光解析电离飞行时间质谱MALDI-TOF-MS(德国Bruker Daltonics公司)。
血清蛋白样本的制备，运用铜离子型(IMAC-Cu)磁珠捕获血清蛋白多肽，具体操作步骤如下：
①用混匀器完全混匀磁珠悬浮液1min；
②加10μL IMAC-Cu结合液以及10μL IMAC-Cu磁珠至PCR管，混匀后加5μL血清，混匀至少5次，静置5min；
③将PCR管放入磁柱分离器，使磁珠贴壁1min，液体清澈后弃上清液；
④加100μL IMAC-Cu冲洗液，在磁柱分离器上前后移动10次PCR管，磁珠贴壁后弃上清液；
⑤重复步骤③、④两次；
⑥加5μL IMAC-Cu洗脱液洗涤贴壁的磁珠，并反复吹打10次，磁珠贴壁2min，将上清液移入干净的离心管；
⑦加5μL IMAC-Cu稳定液至离心管并混匀，提取的蛋白多肽可以用于直接MALDI-TOF-MS检测或者冻存于-20℃冰箱24h之内质谱分析。
2.2质谱分析
将分离收集得到的蛋白样本1μL与10μL的基质α-氰基-4-羟基肉桂酸混匀，取1μL点在Anchorchip靶板上(德国Bruker公司)，每个样本分别点三个靶点以作三次重复。待室温干燥后将靶板放入质谱仪进行分析，采用FlexControl 2.0(德国Bruker公司)软件进行标准品校正后开始样本检测，每个样本要经过总共300次激光打靶(5次点靶，每次打靶2×30次)之后生成质谱图，获得由不同质核比(M/Z)组成的蛋白多肽谱图。采用ClinProTools2.1软件(德国Bruker公司)结合遗传算法等生物统计学和生物信息学方法分析两组血清样本的蛋白多肽图谱。进行归一化平滑处理总离子流图，消除化学及电物理噪声；分析组间差异蛋白并计算差异大小，按差异大小由大到小排列，找出组间表达具有显著差异的蛋白多肽峰值(p<0.05)。
将CIP实验组和未患CIP对照组血清样本采用磁珠分离系统处理后，经过MALDI-TOF-MS分析后，对CIP实验组和未患CIP对照组的每个样本进行蛋白多肽图谱绘制，在分子量范围1000Da～10000Da共检测到129个蛋白多肽峰图，且每个样本的三次重复稳定性较高，如图2所示。
采用ClinProTools 2.1软件对质谱捕获的CIP实验组和未患CIP对照组的血清蛋白多肽图谱进行分析，将CIP患者血清多肽谱图与未患CIP患者进行比较分析，检测到分子量分别为3901.24道尔顿(SERPINA5)、3351.81道尔顿(AKAP6)、1488.72道尔顿(TUBA4A)、808.46道尔顿(COL1A2)和2682.71道尔顿(Pro-SHAP)的蛋白多肽峰在CIP患者血清中均显著高表达(CIP患者vs未患CIP患者：SERPINA5：1.66±0.63vs 1.37±0.40，p＝0.044；AKAP6：1.82±0.56vs 2.81±1.38，p<0.001；TUBA4A：2.99±1.09vs 2.32±0.67，p<0.001；COL1A2：957.15±74.54vs 847.45±94.54，p<0.001；Pro-SHAP：216.23±12.60vs 193.09±16.63，p<0.001。结果如图3所示，对M/Z：3901.24、3351.81、1488.72、808.46和2682.71在CIP患者(红色，峰值在上的曲线)和未患CIP患者(绿色，峰值在下的曲线)中的表达进行比较，发现其蛋白多肽峰图在CIP患者血清中均显著高表达。因此对以上五种蛋白多肽进行二级质谱序列鉴定。
具体采用液相色谱分离与质谱联用的技术对CIP血清多肽标志物M/Z：1488.72、3351.81、3901.24、808.46和2682.71进行鉴定，采用Waters公司Nano Acquity UPLC对经磁珠分离收集的质谱上样剩余的血清蛋白多肽进行二维凝胶色谱分离，收集15～30份肽段馏份：在收集液中检测到目的蛋白；再联用Thermo Fisher公司LTQ Orbitrap XL质谱系统对CIP患者血清中表达上调的蛋白多肽M/Z：1488.72、3351.81、3901.24、808.46和2682.71进行序列鉴定。
具体的操作步骤为：
2.3.1样本前处理
合并提取后的蛋白样，1300转，10分钟，取上清液，冷冻干燥仪干燥，使终体积在50μL，得到液体A，用安捷伦ziptip萃取柱，浓缩处理液体A。处理方法：①ziptip柱子用100％乙腈吹打5次，活化柱子；②活化好的ziptip在液体1中，反复吹吸10次，尽量避免气泡产生；③50％ACN 0.1％TFA水溶液，洗涤3次ziptip柱子；④ziptip柱子在0.1％TFA中反复吹吸，使样本洗脱，得到洗脱液2；⑤重复以上1-4步，30次；⑥合并30次的洗脱液2，冷冻干燥至10μL，用于质谱鉴定。
2.3.2色谱分离
原始样品加10μL流动相A，转移至进样瓶中，共20ul。
一维超高效液相系统：Waters公司Nano Aquity UPLC(Waters Corporation,Milford,USA)。色谱柱：
捕集柱：C18,5μm,180μm×20mm,nanoAcquityTMColumn
分析柱：C18,3.5μm,75μm×150mm,nanoAcquityTMColumn
流动相A：5％乙腈，0.1％甲酸的水溶液
流动相B：95％乙腈，0.1％甲酸的水溶液；所有溶液均为HPLC级。
捕集流速15μl/min，捕集时间3min，分析流速400nl/min；分析时间60min，色谱柱温度35℃；Partial Loop模式进样，进样体积18μL。
梯度洗脱程序如下表1所示。
表1
凝胶色谱分离结果如图4所示。色谱图中横坐标表示样本流出时间，纵坐标代表多肽相对丰度，色谱设定时间为60min，从10min开始收集收集馏分，多肽成分主要在15min后被分离并采用梯度洗脱方式，使洗脱效率提高，设定捕集时间收集馏分：收集15～30份肽段馏份。
2.3.3 LTQ-Orbitrap XL质谱分析
使用Thermo Fisher公司LTQ Obitrap XL质谱分析系统。Nano离子源(MichromBioresources,Auburn,USA)，喷雾电压1.8kV；质谱扫描时间60min；实验模式为数据依赖(Data Dependent)及动态排除(Dynamic Exclusion),在10秒内对母离子进行2次串级之后加入到排除列表内90秒；扫描范围400-2000M/Z；一级扫描(MS)使用Obitrap，分辨率设定为100000；CID及二级扫描使用LTQ；在MS谱图中选取强度最强的10个离子的单一同位素作为母离子进行MS/MS(单电荷排除，不作为母离子)。检测结果如图4所示。
数据分析：使用数据分析软件Bioworks Browser 3.3.1SP1进行SequestTM检索。母离子误差设定为100ppm，碎片离子误差设为1Da，酶切方式为非酶切,可变修饰为M(Methionine)甲硫氨酸氧化。检索结果参数设定为deltacn>＝0.10。检索结果为：
(1)M/Z：3901.24；蛋白ID：P05154；Gene Symbol＝SERPINA5；序列为R.SARLNSQRLVFNRPFLMFIVDNNILFLGKVNRP.-；
(2)M/Z：3351.81；蛋白ID：Q13023；Gene Symbol＝AKAP6；序列为S.DVNVSMIVNVSCTSACTDDEDDSDLLSSSTLT.L；
(3)M/Z：1488.72；蛋白ID：P68366；Gene Symbol＝TUBA4A；序列为R.LISQIVSSITASLR.F；
(4)M/Z：808.46；蛋白ID：P08123；Gene Symbol＝COL1A2；序列为；GHAGLAGAR；
(5)M/Z：2682.71；蛋白ID：P19823；Gene Symbol＝Pro-SHAP；序列为；FLHVPDTFEGHFDGVPVISKGQQK。
所分离的M/Z：3901.24称为人血浆丝氨酸蛋白酶抑制剂(SERPINA5)，其精确分子量为3901.24道尔顿，序列为R.SARLNSQRLVFNRPFLMFIVDNNILFLGKVNRP.-；所分离的M/Z：3351.81称为激酶锚蛋白6(AKAP6)，其精确分子量为3351.81道尔顿，序列为S.DVNVSMIVNVSCTSACTDDEDDSDLLSSSTLT.L；所分离的M/Z：1488.72称为微管蛋白α-4a链(TUBA4A)，其精确分子量为1488.72道尔顿，序列为R.LISQIVSSITASLR.F；所分离的M/Z：808.46称为I型胶原α-2(I)链(COL1A2)，其精确分子量为808.46道尔顿，序列为GHAGLAGAR；所分离的M/Z：2682.71称为α-胰蛋白酶抑制因子重链2前体，又称人血清衍生透明质酸相关蛋白前体(Pro-SHAP)，其精确分子量为2681.72道尔顿，序列为FLHVPDTFEGHFDGVPVISKGQQK。以上这些潜在生物标志物的功能主要集中于：(1)与补体和凝血级联反应、纤维蛋白酶相关通路、炎症反应相关的免疫-炎症机制，如SERPINA5；(2)与细胞外基质分泌、基质刚度相关的物理微环境机制，如COL1A2、Pro-SHAP；(3)与细胞结构稳定性、供能相关的细胞功能通路，如AKAP6和TUBA4A。
以上结果提示：SERPINA5、AKAP6、TUBA4A、COL1A2和Pro-SHAP是与CIP发生特异性相关的蛋白，可作为CIP的潜在预测性生物标志物，进一步通过ELISA定量检测来验证其作为预测性生物标志物的临床价值。
3.酶联免疫吸附反应(ELISA)定量验证分析
1)血清样本：收集发生CIP患者22例(男性14例，女性8例)，未患CIP患者41例(男性27例，女性14例)的血清进行ELISA定量验证分析。血清样本来自西安交通大学第一附属医院和空军军医大学唐都医院，采集时间为2019年1月～2021年12月。
2)检测方法：采用酶联免疫法(ELISA)检测发生CIP患者以及未患CIP患者的血清SERPINA5、AKAP6、TUBA4A、COL1A2和Pro-SHAP的表达水平，试剂盒购自美国R&D公司。试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)：往预先包被抗人的SERPINA5蛋白、TUBA4A蛋白、AKAP6蛋白、COL1A2蛋白和Pro-SHAP蛋白抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的SERPINA5蛋白、AKAP6蛋白、TUBA4A蛋白、COL1A2蛋白和Pro-SHAP蛋白呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样品浓度。具体实验步骤参照试剂盒说明书，阳性判定标准按照试剂盒说明书界定。
3)统计方法：采用GraphPad.Prism.v8(GraphPad Software,La Jolla,CA,USA)软件进行单因素方差分析(ANOVA)以及独立样本的T检验；采用IBM SPSS Statistics 25(SPSS,Inc.,Chicago,IL,USA)软件进行ROC分析和最佳截断值的分析。
4)定量结果分析：ELISA定量分析结果表明SERPINA5、AKAP6、TUBA4A、COL1A2和Pro-SHAP在CIP患者以及未患CIP患者中的表达水平为：CIP患者vs未患CIP患者：SERPINA5：738.25±58.2pg/ml(625.36～807.75pg/ml)vs609.24±27.19pg/ml(558.67～675.35pg/ml),p<0.001；AKAP6：1126.90±64.04pg/ml(1028.15～1232.52pg/ml)vs 1017.13±55.22pg/ml(914.41～1162.23pg/ml),p<0.001；TUBA4A：228.23±18.48ng/l(190.33～257.03ng/l)vs 201.93±10.08ng/l(184.53～233.67ng/l),p<0.001；COL1A2：957.15±74.54pg/ml(827.681～1084.242pg/ml)vs 847.45±94.54pg/ml(715.151～1079.28pg/ml)，p<0.001；Pro-SHAP：216.23±12.60pg/ml(191.219～240.751pg/ml)vs 193.09±16.63pg/ml(170.117～234.175pg/ml)，p<0.001。具体结果如表2，图5所示。以上结果表明，SERPINA5、AKAP6、TUBA4A、COL1A2和Pro-SHAP是与CIP发生密切相关的蛋白。
表2不同组别中血清蛋白生物标志物的表达水平
5)最佳截断值的分析：采用SPSS软件绘制SERPINA5、AKAP6、TUBA4A、COL1A2和Pro-SHAP的ROC曲线，并依据最大约登指数求取SERPINA5、AKAP6、TUBA4A、COL1A2和Pro-SHAP的最佳截断值，以获得SERPINA5、AKAP6、TUBA4A、COL1A2和Pro-SHAP对于CIP患者与未患CIP患者的鉴别能力(约登指数＝灵敏度+特异度-1)。最终SERPINA5、AKAP6、TUBA4A、COL1A2和Pro-SHAP的最佳截断值分别为：642.27pg/ml、1050.88pg/ml、226.32ng/L、894.83pg/ml和198.01pg/ml，对应的AUC分别为：0.908(p＜0.0001)、0.857(p＜0.0001)、0.874(p＜0.0001)、0.825(p＜0.0001)和0.865(p＜0.0001).具体结果如图6所示。以上结果表明，SERPINA5、AKAP6、TUBA4A、COL1A2和Pro-SHAP是预测CIP发生的可靠生物标志物，其疾病鉴别能力良好。
4.在线交互式可视化综合预测模型构建与验证
采用R语言V4.1.2(Vienna,Austria)软件构建预测模型。为了获得更优的预测效能，我们基于四种机器学习的人工智能建模方法分别进行了建模，包括随机森林算法、支持向量机(SVM)、LASSO回归算法和Logistics回归算法(表3)。比较其模型ROC后，最终结果显示，LASSO回归和Logistics回归算法对于CIP的鉴别能力是最大的，均可达到0.996。但考虑到模型的可视化和临床应用的方便性，我们最终选择利用Logistics回归算法构建基于免疫-物理微环境的nomogram预测模型，构建在线交互式可视化nomogram预测模型，在线交互式预测模型网址为：https：//mass-cip.shinyapps.io/DynNomapp/，预测模型如图7中A-B所示，其ROC曲线AUC可达0.996(图7中C)，表明其对于CIP的疾病鉴别能力优秀，其校准曲线表明，预测值和实际值的一致性良好(图7中D)；临床决策曲线显示，综合模型相较于每一种单一因素预测，其临床净获益率是最大的(图7中E)。利用21例患者组成的验证集对模型进行验证，验证集的ROC曲线的AUC为0.968(图7中F)，校准曲线显示验证集的预测值和实际值一致性也良好(图7中G)，决策曲线支持综合模型的临床净获益率最大(图7中H)。经验证后，该预测模型对CIP的临床预测价值良好，该在线交互式可视化综合预测模型具有检测成本低、使用便捷、可视化展示、临床应用价值高、易于推广等显著优势，可作为预测CIP发生的高效预测模型来实现恶性肿瘤患者接受ICIs治疗前CIP高危人群的筛选，从而增加免疫治疗的安全性。
表3四种机器学习的人工智能建模方法的对比
机器学习算法 AUC
随机森林 0.944(0.880-1.000)
SVM 0.965(0.915-1.000)
LASSO 0.996(0.986-1.000)
Logistics回归 0.996(0.976-1.000)
举例说明该在线预测系统的临床应用：
以临床收治的恶性肿瘤患者甲和患者乙为例，依据指南推荐考虑使用ICIs治疗前，需要先评估该患者日后罹患CIP的风险。具体做法：采集患者甲的空腹血清，检测血清中SERPINA5、AKAP6、TUBA4A、COL1A2和Pro-SHAP的表达量，并根据5个建模蛋白质的最佳截断值(分别为：SERPINA5642.27pg/ml、AKAP6 1050.88pg/ml、TUBA4A 226.32ng/L、COL1A2894.83pg/ml和Pro-SHAP 198.01pg/ml)将患者甲的蛋白质表达水平分为高水平和低水平(即高于最佳截断值为高水平，用“1”表示，否则为低水平，用“0”表示)。最终患者甲的5个建模蛋白质表达水平分别为：SERPINA5“1”、AKAP6“0”、TUBA4A“1”、COL1A2“0”和Pro-SHAP“1”，将此结果输进预测网站https：//mass-cip.shinyapps.io/DynNomapp/中后，可以得出患者甲在使用ICIs治疗后罹患CIP的风险：50.1％，也就是说，患者甲日后有50.1％的可能会罹患CIP，可以酌情考虑是否接受ICIs治疗。类似的，患者乙的5个建模蛋白质表达水平分别为：SERPINA5“1”、AKAP6“0”、TUBA4A“1”、COL1A2“1”和Pro-SHAP“1”，那么患者B罹患CIP的风险高达99.9％，也就是说，患者乙日后有99.9％的可能会发生CIP，不建议临床使用免疫检查点抑制剂治疗。
为了进一步评估该可视化在线预测系统的预测能力，本发明根据训练集中每位患者在模型评分系统中的得分，得到了评分系统的临界值，并据此将患者分为高危组和低危组。分析结果显示，该预测系统得分的最佳截断值为155分，即高于155分的患者是高危人群，否则为低危组。单因素回归分析表明，高危组患者罹患CIP的风险显著高于低危组(训练集：OR＝0.024,95％CI＝0.004-0.169,p<0.001；验证集：OR＝0.125,95％CI＝0.018-0.863,p＝0.005)。以上结果显示，本发明所构建的CIP的可视化在线预测系统可以很好的将CIP的高危人群筛选出来。
综上所述，本发明公开了一种恶性肿瘤患者免疫治疗前可预测CIP发生风险的在线交互式可视化综合预测模型及其临床应用，其建模要素分别为SERPINA5(最佳截断值为：642.27pg/ml)、AKAP6(最佳截断值为：1050.88pg/ml)、TUBA4A(最佳截断值为：226.32ng/L)、COL1A2(最佳截断值：894.83pg/ml)和Pro-SHAP(最佳截断值：198.01pg/ml)，其在CIP患者中均高表达。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种免疫相关性肺炎的可视化在线预测系统，其特征在于，包括：
血清蛋白标志物表达水平检测模块，用于检测待测者血清中的蛋白标志物表达水平；
智能预测模块，用于根据蛋白标志物表达水平，采用智能预测模型计算待测者发生免疫相关性肺炎的概率；
结果输出模块，用于通过可视化在线交互输出结果。
2.根据权利要求1所述的免疫相关性肺炎的可视化在线预测系统，其特征在于，血清中的蛋白标志物包括SERPINA5、AKAP6、TUBA4A、COL1A2和Pro-SHAP。
3.根据权利要求2所述的免疫相关性肺炎的可视化在线预测系统，其特征在于，所述智能预测模块，还包括：
差异蛋白获取单元，用于获取血清样本中的差异蛋白表达量；
智能预测模型构建单元，根据差异蛋白表达量绘制差异蛋白的ROC曲线并依据最大约登指数求取差异蛋白的最佳截断值，然后根据最佳截断值将血清样本表达水平进行分类，构建Logistics回归方程，获得智能预测模型。
4.根据权利要求3所述的免疫相关性肺炎的可视化在线预测系统，其特征在于，对采集的血清样本利用质谱获得一级质谱得到差异峰，二级质谱鉴定差异峰，并通过ELISA验证差异蛋白的表达量。
5.根据权利要求3所述的免疫相关性肺炎的可视化在线预测系统，其特征在于，血清蛋白标志物SERPINA5预测免疫相关性肺炎的最佳截断值为642.27pg/mL，ROC曲线AUC为0.908，p＜0.0001；
血清蛋白标志物AKAP6预测免疫相关性肺炎的最佳截断值为1050.88pg/mL，ROC曲线AUC为0.857，p＜0.0001；
血清蛋白标志物TUBA4A预测免疫相关性肺炎的最佳截断值为226.32ng/L，ROC曲线AUC为0.874，p＜0.0001；
血清蛋白标志物COL1A2预测免疫相关性肺炎的最佳截断值为894.83pg/mL，ROC曲线AUC为0.825，p＜0.0001；
血清蛋白标志物Pro-SHAP预测免疫相关性肺炎的最佳截断值为198.01pg/mL，ROC曲线AUC为0.865，p＜0.0001。
6.根据权利要求3所述的免疫相关性肺炎的可视化在线预测系统，其特征在于，构建的Logistics回归方程为：
P＝1/(1+e-(-25.4216+8.5143*A+1.9459*B+9.1706*C+15.7390*D+7.7367*E))；
其中，P为罹患CIP风险的概率；A、B、C、D和E分别代表SERPINA5、AKAP6、TUBA4A、COL1A2和Pro-SHAP的表达水平。
7.一种免疫相关性肺炎的可视化在线预测系统的构建方法，其特征在于，包括：
采集血清样本，利用质谱仪通过一级质谱得到差异峰，二级质谱鉴定差异峰，ELISA验证差异蛋白的表达量；
绘制差异蛋白的ROC曲线，并依据最大约登指数求取差异蛋白的最佳截断值；
利用最佳截断值将血清样本表达水平进行分类，构建Logistics回归方程；
通过Logistics回归方程构建在线交互式可视化预测模型。
8.根据权利要求7所述的一种免疫相关性肺炎的可视化在线预测系统的构建方法，其特征在于，所述差异蛋白包括血清蛋白标志物：SERPINA5、AKAP6、TUBA4A、COL1A2和Pro-SHAP。
9.根据权利要求8所述的一种免疫相关性肺炎的可视化在线预测系统的构建方法，其特征在于，血清蛋白标志物SERPINA5预测免疫相关性肺炎的最佳截断值为642.27pg/mL，ROC曲线AUC为0.908，p＜0.0001；
血清蛋白标志物AKAP6预测免疫相关性肺炎的最佳截断值为1050.88pg/mL，ROC曲线AUC为0.857，p＜0.0001；
血清蛋白标志物TUBA4A预测免疫相关性肺炎的最佳截断值为226.32ng/L，ROC曲线AUC为0.874，p＜0.0001；
血清蛋白标志物COL1A2预测免疫相关性肺炎的最佳截断值为894.83pg/mL，ROC曲线AUC为0.825，p＜0.0001；
血清蛋白标志物Pro-SHAP预测免疫相关性肺炎的最佳截断值为198.01pg/mL，ROC曲线AUC为0.865，p＜0.0001。
10.根据权利要求8所述的一种免疫相关性肺炎的可视化在线预测系统的构建方法，其特征在于，构建的Logistics回归方程为：
P＝1/(1+e-(-25.4216+8.5143*A+1.9459*B+9.1706*C+15.7390*D+7.7367*E))；
其中，P为罹患CIP风险的概率；A、B、C、D和E分别代表SERPINA5、AKAP6、TUBA4A、COL1A2和Pro-SHAP的表达水平。
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