CN101403740B - 用于检测肝癌特征蛋白的质谱模型及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出一种用于检测肝癌血清特征蛋白的质谱模型及其制备方法。本发明采用肝癌患者与正常人具有差异的多个特征蛋白组合进行对肝癌血清的检测，并采用了传统统计学与现代生物信息学方法相结合的方法进行数据处理，通过利用质谱仪测定肝癌患者和健康人血清样本的蛋白质组谱图，并筛选出相应的5个肝癌特征蛋白的肿瘤标志物，从而制备检测肝癌血清特征蛋白的质谱模型，为寻找新的更理想的肿瘤标志物提供了基础和资源。

Description

用于检测肝癌特征蛋白的质谱模型及制备方法

技术领域

本发明涉及恶性肿瘤肝癌检测领域，为一种全新的非入侵性检测方法，在体外对肝癌进行早期的发现和检测，其敏感性和特异性均达到100％。

背景技术

原发性肝癌(下称肝癌)是我国高发癌症之一。不仅东南沿海地区发病率甚高，西北地区发病率亦不低。究其原因大致与乙型肝炎在我国广泛流行有关。现乙肝疫苗接种已在我国逐步推广。据初步报道，在曾接受乙肝疫苗接种的青少年中，肝癌的发病率已见明显下降。但肝癌高发于中、老年，故我国肝癌发病率的全面下降尚需假以时日。近30多年来，由于诊断技术的进步，肝癌被早期发现、早期诊断的明显增多，加以手术经验的积累、围手术期处理的改善，使手术切除率明显提高、预后改善。自上个世纪80年代初，介入治疗兴起后，近20多年来各种非手术疗法层出不穷，并且都有一定的疗效。^①

目前肝癌的诊断都是依据每6个月用甲胎蛋白和超声检查，但用AFP及B超进行筛查有局限性，AFP对部分肝癌的敏感性和特异性相对较低，特别是对AFP阴性的患者；而B超在小肝癌的诊断方面尚有缺陷。

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱，其原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比(M/Z)与离子的飞行时间成正比，检测离子。尽管MALDI-TOF的准确度高达0.1％～0.01％，远远高于目前常规应用的SDS电泳与高效凝胶色谱技术，但在肿瘤标志物尤其是肝癌标志物的应用中仍然存在一些缺陷，因此国内迄今为止尚无采用MALDI-TOF-MS技术获得检测肝癌标志物或肝癌血清特征蛋白的报道。

发明内容

本发明目的是为了克服已有对肝癌标志物或肝癌血清特征蛋白检测技术的不足之处，提出一种用于检测肝癌血清特征蛋白的质谱模型及其制备方法。

本发明的第一个发明目是提供一组用于检测肝癌特征蛋白的肿瘤标志物，其特征在于利用质谱仪测定肝癌患者和健康人血清样本的蛋白质组谱图，并筛选出相应的肿瘤标志物，其中所述的肿瘤标志物由具有以下质荷比峰的5个肝癌特征蛋白组成：6432.74m/z 3192.67m/z8862.78m/z 4054.13m/z 2724.35m/z

在一个具体实施方案中，其中所述的质谱仪是基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪，所述的筛选方法是采用弱阳离子结合表面(WCX)芯片检测肝癌患者和健康人的蛋白质质谱。

本发明的第二个发明目是提供通过上述肿瘤标志物制备质谱模型的方法。

在另一个具体实施方案中，所述的质谱模型的建立方法，包括：

1)收集多例临床确诊的肝癌患者血清和正常对照人员的血清作为两组血清标本，进行低温冷冻备用；

2)对血清蛋白进行质谱前预处理：

3)对预处理过的两组血清蛋白进行质谱检测读取，获得两组血清多肽的指纹图谱；

4)对所有的肝癌患者和正常人血清多肽的指纹图谱进行标准化处理，并收集数据；

5)对所得数据进实验质控处理，筛选出具有下列质荷比峰的5个肝癌特征蛋白：6432.74m/z  3192.67m/z  8862.78m/z  4054.13m/z  2724.35m/z

6)将所述5个肝癌特征蛋白作为肿瘤标志物，建立用于检测肝癌的质谱模型。

在一个具体实施方案中，所述的步骤2)包括使用磁珠纯化和稳定样品中的血清蛋白或多肽。

在另一个具体实施方案中，步骤3)指采用WCX芯片对两组血清蛋白进行吸附，并对结合在弱阳离子WCX芯片上的两组血清蛋白进行读取，获得两组血清多肽的指纹图谱。

在另一个具体实施方案中，结合生物信息学方法筛选出相应的肿瘤标志物并建立检测模型进行分析检测，所述的生物信息学方法包括对指纹图谱进行标准化处理、对所得数据进实验质控处理、筛选期望的血清特征蛋白并建立质谱模型，以及可选择地包括使用遗传算法结合最近邻算法建立并验证质谱模型等。其中，所述的实验质控处理指保留峰数量大于50的质谱图谱数据，并采用Sigma血清的组内变异系数来保证实验的一致性，从而根据变异系数满足一致性的允许范围来进行筛选。本发明中，变异系数优选为13.1％。

本发明的第三个发明目的是提供所述的肿瘤标志物组成的质谱模型，在检测肝癌中的应用。其中，所述的应用包括建立血清特征蛋白质谱模型在肝癌早期检测和筛查中的应用。

本发明的第四个发明目的是由所述的肿瘤标志物组成的质谱模型，或者上述方法所制备的质谱模型，在检测肝癌中的应用。其中，所述的应用包括血清特征蛋白质谱模型在肝癌早期检测和筛查中的应用。

有益效果

本发明与其它肝癌的检测方法比较，具有以下优点：

第一，本发明采用肝癌患者与正常人具有差异的多个特征蛋白组合进行对肝癌血清的检测，并采用了传统统计学与现代生物信息学方法相结合的方法进行数据处理，从而得到肝癌患者和健康人血清蛋白质指纹图谱检测模型，并且所发现的一系列蛋白质质荷比峰为寻找新的更理想的肿瘤标志物提供了基础和资源。

第二，与以往的血清学检测方法比较具有较高的敏感性和特异性，并能用于筛选抗肝癌的药物中。

第三，本发明模型的构建方法设计合理可行，为提供肝癌的临床治愈率提供了新的筛查方法，同时也为探索肿瘤发生发展的机制提供了新的思路。

第四，利用本发明分析了109份血清样品，训练组79例，验证组30例，验证结果结果显示，49例判断正确，检出率达94.35％，特异性为100％，灵敏性为100％，因此本发明可对肝癌作出早期的诊断，提高病人的存活率和生活质量。

附图说明：

图1为部分健康人血清的多肽图谱，其中正常(normal)A-E为健康人血清。

图2为部分肝癌患者血清的多肽图谱，其中肝癌(cancer)F-J为肝癌患者血清。

图3重复做样的5个标准血清(Sigma K-O)血清质谱指纹图。

图4表示根据正常血清曲线和肝癌血清曲线的蛋白峰的平均图谱；箭头指向为用于建模型的荷质比为2724.35m/z的肝癌特征蛋白峰。

图5表示根据正常血清曲线和肝癌血清曲线的蛋白峰进行蛋白的平均图谱；箭头指向为用于建模型的荷质比为3192.67m/z的肝癌特征蛋白峰；。

图6表示根据正常血清曲线和肝癌血清曲线的蛋白峰进行蛋白的平均图谱；箭头指向为用于建模型的荷质比为4054.13m/z的肝癌特征蛋白峰。

图7表示根据正常血清曲线和肝癌血清曲线的蛋白峰进行蛋白的平均图谱；箭头指向为用于建模型的荷质比为6432.74m/z的肝癌特征蛋白峰。

图8表示根据正常血清曲线和肝癌血清曲线的蛋白峰进行蛋白的平均图谱；箭头指向为用于建模型的荷质比为8862.78m/z的肝癌特征蛋白峰。

具体实施方式

本发明将结合具体实施例做进一步的说明，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。

实施例1  肝癌质谱模型的建立

1.样本和仪器：

共109例血清样本，分两批获取。第一批作样79例，其中49例来自肝癌患者，另外30例来自健康人群。本批79例样品作为训练组。第二批作样30例，其中20例肝癌患者，10例来自健康人群，本批30例样品作为测试组。所有69例肝癌患者均经术后病理报告确定。所有的血清样本均在清晨空腹下抽取，分离血清后储存在-80低温冰箱中。

基质辅助激光解析飞行时间质谱Autoflex II TOF/TOF及实验用的WCX磁珠试剂盒由美国Bruker公司研制。使用Bruker公司的数据分析软件Clinprotools做数据的预处理，处理后的数据采用统计分析软件R2.6.2的遗传算法包genalg进行处理。

2.技术路线：

血清的采集：收集静脉血在BD管中，避免溶血。缓慢地上下振荡管五次，使血液中的凝结块混匀。室温(25℃)血凝结1小时，垂直放置。其中血液必须精确凝结一小时，否则，由于样品不同的凝结时间而导致不同的肽谱。室温下，用临床离心机以1.400-2.000g离心SST管(真空采血管，BD公司)十分钟。吸取血清(上清液)到对应的已标记管中。标记干净的0.5ml离心管，同一血清样品50ul一管，分装多管。立即冻存血清样品于-80℃。由于反复冻融血清样品易造成多肽沉淀，从而使得肽谱丢失部分多肽，应避免反复冻融。冻存血清分为永久保存和待分装的。血清分装后可在-80℃保存多年。

血清样品的磁珠处理：在进行ClinProt实验前，从低温冰箱提取分装的血清样品各1管，放于湿冰上。化冻60—90分钟。取出10ul磁珠结合缓冲液(BS)，10ul混匀的磁珠悬浮液，5ul血清样品至样品管，混匀。室温静置5min后，将样品管放入磁珠分离器。使磁珠贴壁1分钟，磁珠与悬浮的液体分离，吸去悬浮的液体，再向样品管中加入100ul磁珠清洗缓冲液(WS)，在磁珠分离器前后相邻两孔间反复移动样品管10次。最后一次使样品管在磁珠分离器上静置，磁珠与悬浮的液体分离，吸去悬浮的液体。重复从加100ul磁珠清洗缓冲液，到最后吸去悬浮液体的操作步骤共3次。从磁珠分离器上取下样品管，并向样品管中加入5ul磁珠洗脱缓冲液(ES)，溶解贴壁的磁珠，样品管放入磁珠分离器，磁珠贴壁2min，磁珠与悬浮的液体充分分离后，将上清液移入干净的刚加入5ul磁珠稳定缓冲液(SS)0.5ml样品管。

3.生物信息学方法

(一)质谱数据采集

应用Autoflex II TOF/TOF质谱仪。激光能量50％时，10shots去杂，36％时50shots采集一个样品结晶点的某一个点，平均每个样品结晶点收集8次共400shots。激光频率：50Hz。数据收集范围：1-20KDa。在每8个样品结晶点收集数据前用标准品进行外标校正，平均分子量偏差小于100ppm。参见图1，图1中为血清多肽指纹谱图。

实验质控：(1)对于每一张采集到的原始图谱，我们设定S/N≥5的峰数量做为评判图谱质量的一个标准；对于峰数量大于50的图谱才保存，舍弃峰数量小于50的图谱。(2)针对整个实验操作，采用Sigma血清的组内变异系数保证实验的一致性，本实例方法的变异系数为13.1％，满足一致性允许范围，说明实验一致性良好，参见表1、图3。表1为Sigma血清中12个蛋白峰的变异系数值；图3为实验中5个Sigma A-E血清的指纹图谱。

表1 Sigma血清的组内变异系数

 

质荷比峰(m/z)	变异系数(cv％)
		2793.24	0.144987
2997.39	0.139226
		3016.98	0.110459
3362.56	0.116892
		3818.83	0.125375
4060.66	0.145923
		4126.56	0.082257
4140.26	0.12656
		4281.34	0.093212
4587.71	0.127029
		5018.41	0.141053
5075.55	0.122969
		5571.03	0.141472
5712.25	0.103009
		7088.19	0.143747
7326.2	0.136262
		7923.04	0.110151
6002.35	0.208379
		8862.28	0.176563
变异系数平均值	0.131343

(二)原始数据预处理

原始数据经Bruker公司数据分析软件Clinprotools处理，800-10K的峰值经由Top hat方法做基线校准，最小基线宽度10％，以10％最小阀值聚类；然后用总离子流方法做归一化处理。

(三)肝癌特征蛋白的选择

每个质荷比蛋白峰对各类样本的区分的相对重要性都不同，这里综合运用了T检验P值和受试者接受曲线(ROC)的方法来评价每个蛋白峰的相对重要性。

(四)遗传算法

遗传算法是一种很有效的全局随机化搜索算法，它借鉴了生物界自然选择和自然遗传的机制，其主要特点是群体搜索策略和群体中个体之间的信息交搜索不依赖于梯度信息。遗传算法对多个个体组成的群体进行操作，通过遗传算子可以使个体间的信息得以交换，这样的群体中的个体一代一代地得以优化，并逐步逼近最优解。它尤其适用于处理传统搜索方法难以解决的复杂和非线性问题，可广泛用于涉及高维空间的组合优化领域。本发明方法的遗传算法从统计差异蛋白子集形成的特征空间中搜索次优特征子集。分类函数采用最近邻算法(KNN)。

在训练遗传算法集合最近邻算法分类的过程中引入了交叉验证的过程，这里采用随机选择样本中的80％来建立模型，余下的20％作为验证。它可以监督训练过程，避免建立的模型出现对建模样本表现好，对预测样本表现差的“过学习“现象。

在利用遗传算法和最近邻算法对训练样本建立质谱数据分类模型后，利用验证样本来检验所建立模型的分类能力。

实施例2  肝癌检测

应用实例1的方法对健康人群30例，肝癌患者49例的血清蛋白质图谱作了检测分析。用初步初步筛选的质荷比峰按照P值小于0.05为统计差异显著的差异蛋白峰，在这些蛋白峰按照受试者接受曲线下面积(ROC)进行从大到小排序，选择其中ROC AUC>＝0.7蛋白作为特征空间，利用遗传算法结合最近邻算法建立最终的诊断模型。

健康人群40例，肝癌患者49例样本经过实施例二中的方法共产生88个分子量的峰值，进一步用神经网络筛选出6432.74m/z  3192.67m/z  8862.78m/z  4054.13m/z  2724.35m/z等5个蛋白峰，以下表2是这五个蛋白峰在疾病组和正常组中的平均峰的对照。

表2  健康人和肝癌比较的五个建模蛋白峰的比较

 

质荷比峰(m/z)	正常人(均值±标准差)	肝癌(均值±标准差)	P	ROC AUC
					2724.35m/z	47.57±42.72	39.5±17.28	0.216	0.603401
3192.67m/z	65.46±26.25	41.18±21.65	0.00046	0.771429
					4054.13m/z	104.18±60.71	100.25±68.34	0.89	0.512245
6432.74m/z	113.62±51.82	29.25±19.22	<0.000001	0.970068
					8862.78m/z	14.55±4.54	11.27±4.57	0.00464	0.723129

这样模型采用6432.74m/z  3192.67m/z  8862.78m/z  4054.13m/z  2724.35m/z五等个蛋白峰建立模型。模型识别率：100％。并采用随机选择方法进行交叉验证，验证结果为：94.35％。模型具有很好的预测能力。

表3  模型训练结果

 

样本	例数	预测肝癌	预测正常组	预测率％
					肝癌	49	49	30	100
正常组	30	0	0	100
					总计	79	49	30

表3中对于训练样本的结果为：49例肝癌全部判断正确，特异性100％；30例正常组全部判断正确，敏感性为100％。

模型训练完成后，建立起了一个有十二个输入变量的模型，接着用这个模型对30个验证样本来预测，并判断出样本的类别。结果表明，18例肝癌患者中的16例，特异性88.9％；10例正常组中的10例被准确预测，敏感性为100％。详见表4。

表4  验证样本预测结果

 

样本	例数	预测验证肝癌组	预测验证正常组	验证率％
					肝癌	18	16	0	88.9
正常	10	2	10	100％
					总计	30	18	10

实施例3  与其他肝癌检测方法的比较

对于肝癌的诊断，根据其生物学特征、年龄、性别、病发部位及临床过程进行分析，在病史及体征基础上，采用AFP、超声波等对肝癌的诊断和治疗总体上取得了显著进步。然而，对肝癌的治疗似乎并没有突破性进展，患者大多在确诊后很快死亡，迫切需要一种更早期的诊断方法。而本发明方法原理不同于以上的检测方法，并且本发明方法的结果表明，采用血清多肽检测肝癌也不失为一个效果非常好的诊断手段，对于更早期的肝癌诊断大有裨益。

参考文献：

1.杨秉辉.目前肝癌综合治疗模式的选择.中国普外与临床杂志.2004.11(5)

2.Chen DS，Chen CJ，Hsu HM，et al.Effects of neonatal hepatitis B vaccination on theprevalence of hepatocellular carcinoma.Abstracts of 11th International Symposium on ViralHepatitis &，Liver Disease[C].Sydney Australia，2003:19～21

3.杨秉辉.原发性肝癌的临床诊断与分期标准(J).中华肝病杂志.2001，6

4.黄宇琨、范学工等。肝细胞患者外周血单个核细胞端粒酶活性检测。中国普通外科杂志2004[13，3]

5.陈孝平、陈汉等。原发性肝癌外科治疗方法的选择(J).中国使用外科杂志，2001.10(2):99-101

6.杨秉辉.目前肝癌综合治疗模式的选择，中国普外基础与临床杂志，2004。

Claims (2)

1.一种用于检测肝癌特征蛋白的质谱模型的制备方法，包括以下步骤：

1)收集多例临床确诊的肝癌患者血清和正常对照人员的血清作为两组血清标本，进行低温冷冻备用；

2)对血清蛋白进行质谱前预处理；

3)采用WCX芯片对两组血清蛋白进行吸附，并对结合在弱阳离子WCX芯片上的两组血清蛋白进行读取，获得两组血清多肽的指纹图谱；

4)对所有的肝癌患者和正常人血清多肽的指纹图谱进行标准化处理，并收集数据；

5)保存峰数量大于50的质谱图谱数据，并对所得数据采用标准Sigma血清的组内变异系数来保证实验的一致性，从而根据变异系数满足一致性的允许范围来进行筛选进行实验质控处理，筛选出具有下列质荷比峰的5个肝癌特征蛋白：6432.74m/z、3192.67m/z、8862.78m/z、4054.13m/z、2724.35m/z，其中变异系数为13.1%；

6)将所述5个肝癌特征蛋白作为肿瘤标志物，建立用于检测肝癌特征蛋白的质谱模型。

2.权利要求1所述的制备方法，其中步骤2)包括使用磁珠纯化和稳定样品中的血清蛋白或多肽。

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