CN106770618A - 一种建立急性缺血性脑卒中特征蛋白的质谱模型的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于急性缺血性脑卒中早期诊断的特征蛋白的质谱模型及其构建方法，该质谱模型由质荷比为4247m/z和6429m/z的峰构成，模型中表征为质荷比4247m/z的蛋白和表征为质荷比6429m/z的蛋白是急性缺血性脑卒中早期诊断的特征蛋白，当表征为质核比4247m/z的蛋白显著降低和表征为质荷比6429m/z的蛋白上调表达时，预示为急性缺血性脑卒中或潜在患者。本发明的质谱模型，可用于急性缺血性脑卒中的筛查和早期检测，方法简单易于操作，准确性高。为急性缺血性脑卒中筛查和早期检测提供了新的思路。

Description

一种建立急性缺血性脑卒中特征蛋白的质谱模型的方法

技术领域

本发明涉及神经系统疾病领域，为一种全新的质谱模型及其构建方法，对急性缺血性脑卒中进行早期的筛查和早期检测，其敏感性和特异性均达到90％以上。

背景技术

据WHO的统计数据，全球每6秒，脑卒中夺去一个生命；每隔一秒，脑卒中袭击一个人；每年1500万人脑卒中，600万人死于脑卒中，3000万人因脑卒中而残疾。目前中国是老龄化最快的国家之一，因此脑卒中造成的死亡率仍在不断攀升。50-65％的脑卒中病例是由缺血性事件所引起。脑卒中病程进展快，带来的后果又十分严重，因此该疾病的早诊断早治疗对于预后有着重大的影响。目前，由于尚无快速简便的实验室血液检测方法用于该疾病的筛查和早期检测，耽误了最佳治疗时机或延误治疗，给神经系统带来不可恢复的损伤，甚至有8％的患者会发生再次卒中。

液体蛋白芯片-飞行时间质谱技术是为解决在不损害功能及不增加背景的条件下分离蛋白质的难题，根据色谱及探针的原理，磁珠(液体芯片)表面经化学(疏水、亲水、阳离子、阴离子及金属离子螯合等)或生物化学(抗体、受体、配体、酶、DNA等)处理，所获得蛋白经过选择性清洗，与加入的能量吸收分子(EAM)结合，形成晶体，样品被送入质谱仪，在特异的激光照射后，带电分子在通过电场时加速，不同质荷比的蛋白质在长度一定的真空管中飞行所需时间不同，蛋白质的质荷比(M/Z)与离子飞行时间的平方成正比。信号由高速的模拟数字转化并记录，被测定的蛋白质以一系列波峰的形式出现，并由此绘制出待测蛋白的质谱图。再采用软件进行质谱图的比对和分析，即可发现各样本间的蛋白质表达和含量的异同。主要用于从复杂体液如血清、血浆、尿液、唾液或脑脊液、组织裂解液、细胞培养上清液中发现潜在的生物标志物。

MALDI质谱技术具有高灵敏性、高特异性、高通量和快速检测的特点，使用MALDI质谱进行临床诊断5分钟即可测试一个样本，一台仪器即可达到全年3万6千例的筛查通量，可大大减少检测的时间耗费，达到早诊断、早治疗的效果。此外，由于MALDI质谱技术的特点，使其大大降低了筛查诊断的假阳性和假阴性。该技术已广泛应用于损伤和疾病早期诊断研究中。虽然近年，血清多肽组学已成功的应用于多种肿瘤的诊断研究，但对急性缺血性脑卒中的蛋白标记物的筛选和鉴定，较多采用液相色谱和双向电泳的方法，将质谱技术应用于寻找急性缺血性脑卒中的血清蛋白组/多肽模式诊断模式的报道极少。

发明内容

本发明目的在于提供一种用于检测急性缺血性脑卒中特征蛋白的质谱模型及其制备方法。

为实现上述目的，本发明首先提供一种用于检测急性缺血性脑卒中特征蛋白的质谱标记，该质谱标记是质荷比为4247m/z和6429m/z的峰。表征为质荷比4247m/z的蛋白和表征为质荷比6429m/z的蛋白是急性缺血性脑卒中血清特征蛋白，当表征为质核比4247m/z的蛋白显著降低和表征为质荷比6429m/z的蛋白上调表达时，预示为急性缺血性脑卒中或潜在患者。

进而本发明提供一种用于检测急性缺血性脑卒中特征蛋白的质谱模型，该质谱模型包括质荷比为4247m/z和6429m/z的峰，模型中表征为质荷比4247m/z的蛋白和表征为质荷比6429m/z的蛋白是急性缺血性脑卒中血清特征蛋白，当表征为质核比4247m/z的蛋白显著降低和表征为质荷比6429m/z的蛋白上调表达时，预示为急性缺血性脑卒中患者或潜在患者，其临界值为4247降低【21.62±5.54/84.45±21.62】、6429.97上调【18.19±8.68/6.28±4.78】。(数字表现形式：急性缺血性脑卒中组平均峰面积±标准差/正常对照组平均峰面积±标准差)

本发明质谱模型的构建方法包括如下步骤：

1)收集多例临床确诊的急性缺血性脑卒中患者血清和正常对照人员的血清作为两组血清标本，进行低温冷冻备用；

2)对血清蛋白进行质谱前预处理：

3)对预处理过的两组血清蛋白进行质谱检测读取，获得两组血清多肽的指纹图谱；

4)对所有的急性缺血性脑卒中患者和正常人血清多肽的指纹图谱进行标准化处理，并收集数据；

5)对所得数据进标准化处理，筛选出具有下列质荷比峰的2个急性缺血性脑卒中特征蛋白：4247m/z、6429m/z，根据这两个质荷比峰建立检测急性缺血性脑卒中特征蛋白的质谱模型。

上述方法其中步骤2)预处理的方法是采用MB-WCX磁珠对血清蛋白进行富集预处理。

上述的实验质控处理只保留峰数量大于50的质谱图谱数据。

本发明结合生物信息学方法筛选出相应的急性缺血性脑卒中标志并建立检测模型进行分析检测，所述的生物信息学方法包括对指纹图谱进行标准化处理、对所得数据进实验质控处理、筛选期望的血清特征蛋白并建立质谱模型，以及可选择地包括使用遗传算法结合最近邻算法建立并验证质谱模型等。其中，所述的实验质控处理只保留峰数量大于50的质谱图谱数据，并采用系统重复性验证(日间-日内重复性)来保证实验的一致性。

本发明检测急性缺血性脑卒中特征蛋白的质谱标记，可用于建立血清特征蛋白质谱模型以及应用于在急性缺血性脑卒中筛查和早期检测。本发明的质谱模型，可用于急性缺血性脑卒中筛查和早期检测。本发明与其它急性缺血性脑卒中的检测方法比较，具有以下优点：

第一，本发明采用急性缺血性脑卒中患者与正常人具有差异的两个特征蛋白组合进行对急性缺血性脑卒中血清的检测，并采用了传统统计学与现代生物信息学方法相结合的方法进行数据处理，从而得到急性缺血性脑卒中患者和健康人血清蛋白质指纹图谱检测模型，并且所发现的一系列蛋白质质荷比峰为寻找新的更理想的诊断标志物提供了基础和资源。

第二，与以往的血清学检测方法比较具有较高的敏感性和特异性，并能用于急性缺血性脑卒中筛查和早期检测中。

第三，本发明模型的构建方法设计合理可行，为提供急性缺血性脑卒中新的筛查和早期诊断方法，同时也为探索急性缺血性脑卒中早期预防提供了新的思路。

第四，利用本发明分析了89份血清样品，其中对照组40，验证结果显示两组间有明显差异，因此本发明可对急性缺血性脑卒中进行早期筛查和诊断，降低死亡率和致残率，提高患者的生活质量，减少经济负担。

附图说明

图1为急性缺血性脑卒中患者和正常对照组的血清多肽平均谱。

图2为急性缺血性脑卒中患者和正常对照组多肽分布散点图。

图3为蛋白峰在所有建模型样品中的表达水平展示。

图3-1表示用于建模型的荷质比为4247m/z的急性缺血性脑卒中显著降低的特征蛋白峰所有建模型样品中的表达水平。

图3-2表示用于建模型的荷质比为6429m/z的急性缺血性脑卒中特征蛋白峰在所有建模型样品中的表达水平。

图4急性缺血性脑卒中检测模型的验证散点图。

图5急性缺血性脑卒中特征蛋白的质谱模型的构建方法

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1急性缺血性脑卒中质谱模型的建立

1 样本和仪器：

1.1 共231例血清样本，病例组在出现脑卒中相关的神经系统症状后取样，对照组于安静状态取样。均抽取静脉血4ml，分离血清，标记并于-80℃保存。

1.2 基质辅助激光解析飞行时间质谱为autoflex speed III，α-氰基-4-羟基肉桂酸(α-CCA)基质，弱阳离子交换磁珠MB-WCX，普通384靶板和8位手动分离磁架均购自布鲁克·道尔顿公司。乙腈、无水乙醇、三氟乙酸，购自美国Sigma公司。

1.3 使用Bruker公司的数据分析软件Clinprotools做数据的预处理，处理后的数据采用统计分析软件R2.6.2的遗传算法包genalg进行处理。

2、血清采集及处理：

2.1 血清的采集：收集静脉血在BD管中，避免溶血。缓慢地上下振荡管五次，使血液中的凝结块混匀。室温(25℃)血凝结1小时，垂直放置。其中血液必须精确凝结1小时，否则，由于样品不同的凝结时间而导致不同的肽谱。室温下，用临床离心机以1.400-2.000g离心真空采血管(BD公司)十分钟。吸取血清(上清液)到对应的已标记管中。标记干净的0.5ml离心管，同一血清样品50ul一管，分装多管。立即冻存血清样品于-80℃。由于反复冻融血清样品易造成多肽沉淀，从而使得肽谱丢失部分多肽，应避免反复冻融。冻存血清分为永久保存和待分装的。血清分装后可在-80℃保存多年。

2.2 血清样品的磁珠处理：在进行ClinProt实验前，4℃冰箱取出磁珠试剂盒，取出弱阳离子磁珠悬浮液一管，手动上下摇动，完全混匀磁珠悬浮液，1分钟；取出10ul磁珠结合缓冲液(BS)加入200ul样品管中，再加入10ul磁珠至样品管，用加样枪上下吸打混匀，避免起泡；向样品管加5ul血清，用加样枪上下吸打混匀至少5次，避免起泡，室温静置5min；将样品管放入磁珠分离器。使磁珠贴壁1分钟，磁珠与悬浮的液体分离，液体应清澈；用加样枪吸去悬浮的液体，枪头应避免接触到磁珠，避免吸走磁珠，再向样品管中加入100ul磁珠清洗缓冲液(WS)，在磁珠分离器前后相邻两孔间反复移动样品管10次；使样品管在磁珠分离器上静置，磁珠贴壁，磁珠与悬浮的液体分离，液体应清澈；用加样枪吸去悬浮的液体，枪头应避免接触到磁珠，避免吸走磁珠；重复7-10步骤两次，最后一次加样枪吸去悬浮的液体时，要保证悬浮液完全被吸走；从磁珠分离器上取下样品管，并向样品管中加入5ul磁珠洗脱缓冲液(ES)，混匀贴壁的磁珠，反复吸打10次，吹打过程应避免起泡；样品管放入磁珠分离器，磁珠贴壁2min，磁珠与悬浮的液体充分分离后，将上清液移入干净的0.5ml样品管(先在管内加入5ul稳定缓冲液(SS)，用加样枪小心吸打混匀)

2.3 点靶

取1μl上面得到的液体样品与1μl预先配置好的HCCA基质溶液(四氢肉桂酸在40％乙腈与60％的0.1％三氟乙酸中的饱和溶液)充分混和，将其点在质谱样品靶上。待其自然干燥后，使用MALDI-TOF/TOF质谱仪在0～10000Da的质量范围进行检测，储存全部实验结果。

3、生物信息学方法

3.1 质谱数据采集

应用Autoflex II TOF/TOF质谱仪。激光能量50％时，10shots去杂，36％时100shots采集一个样品结晶点的某一个点，平均每个样品结晶点收集100次共1000shots。激光频率：30Hz。数据收集范围：1-10KDa。在每8个样品结晶点收集数据前用标准品进行外标校正，平均分子量偏差小于100ppm。

3.2 实验质控

3.2.1 对于每一张采集到的原始图谱，设定S/N＞＝5的峰数量做为评判图谱质量的一个标准；对于峰数量大于50的图谱才保存，合弃峰数量小于50的图谱。

3.2.2 针对整个实验操作，系统重复性验证(日间-日内重复性)为保证实验数据的可靠性和有效性，对MALDI-TOF-TOF系统检测和磁珠血清前处理体系统进行了稳定性的分析。应用多个样本混合，分成30份样本，每天选5份样本进行样本前处理和质谱检测，连续检测6天对系统日内重复性和日间重复性进行验证，通过评价几个峰的平均相对强度和变异系数，评价系统的重复性。

表1系统稳定性验证(日间-日内重复性)，MRI为平均相对强度，

3.3 原始数据预处理

原始数据经Bruker公司数据分析软件Clinprotools处理，800-10K的峰值经由Top hat方法做基线校准，最小基线宽度10％，以10％最小阀值聚类；然后用总离子流方法做归一化处理。

3.4 急性缺血性脑卒中特征蛋白的选择

每个质荷比蛋白峰对各类样本的区分的相对重要性都不同，这里综合运用了T检验P值和受试者接受曲线(ROC)的方法来评价每个蛋白峰的相对重要性。

3.5 遗传算法

遗传算法是一种很有效的全局随机化搜索算法，它借鉴了生物界自然选择和自然遗传的机制，其主要特点是群体搜索策略和群体中个体之间的信息交搜索不依赖于梯度信息。遗传算法对多个个体组成的群体进行操作，通过遗传算子可以使个体间的信息得以交换，这样的群体中的个体一代一代地得以优化，并逐步逼近最优解。它尤其适用于处理传统搜索方法难以解决的复杂和非线性问题，可广泛用于涉及高维空间的组合优化领域。本发明方法的遗传算法从统计差异蛋白子集形成的特征空间中搜索次优特征子集。分类函数采用遗传算法(GA)。在利用遗传算法对训练样本建立质谱数据分类模型后，利用验证样本(89份)来检验所建立模型的分类能力。

实施例2急性缺血性脑卒中检测

应用实例1的方法对健康人群54例，急性缺血性脑卒中患者90例的血清蛋白质图谱作了检测分析。用初步筛选的质荷比峰按照P值小于0.05为统计差异显著的差异蛋白峰，利用遗传算法建立最终的诊断模型。

对急性缺血性脑卒中患者49例，正常对照40例进行模型验证，验证结果显示模型对急性缺血性脑卒中患者的诊断敏感性为100％，特异性为92.5％，判断的正确率为96.3％。如图4所示，图中的黑点代表用于验证的正常对照组样本分布，其中，蓝色圆圈标注的是未被模型正确判断的样本。

实施例3与其他急性缺血性脑卒中检测方法的比较

目前，对于急性缺血性脑卒中的诊断，主要依赖于患者的临床表现和神经影像学资料，如CT或MRI。对于出血性脑卒中的诊断，CT检查是行之有效的方法，而对于缺血性脑卒中尤其是程度较轻的病例，CT的作用大不如前者；虽然脑部的MRI检查对于该疾病的诊断作用显而易见，但由于其价格昂贵、耗费时间长，且很多急诊医疗部门无能力配置如此庞大的设备，同时可能由于患者自身原因，如躁动不安，有心脏起搏器或其他金属植入物而无法进行检查，以上种种原因限制了MRI的广泛使用。本发明获得的生物学诊断模型为其早期诊断并及时选择适当的治疗方案提供快速准确的生物标记物，这对于急性缺血性脑卒中患者的治疗和预后将具有非常重大的意义，在很大程度上可以提高患者病后的生活质量，减轻家庭和社会的负担，节约医疗资源。如该发明能实现产业化，应用于高危人群的院外甚至家庭诊断，必将对急性缺血性脑卒中的预防和早期治疗产生深远影响。

Claims (5)

1.用于检测急性缺血性脑卒中特征蛋白的质谱标记，其包括质荷比为4247m/z和6429m/z的峰。

2.用于检测急性缺血性脑卒中特征蛋白的质谱模型，其特征在于，该质谱模型中有5个表达差异显著的蛋白峰4247，4265.66，1982.69，5979.9，6429.97，根据受试者工作特征ROC曲线下面积＞90％，选择质荷比为4247m/z和6429.97m/z的两个峰，其中4247m/z的峰在急性缺血性脑卒中显著降低，质荷比6429m/z的峰在急性缺血性脑卒中组明显上调。

3.建立权利要求2所述质谱模型的构建方法，包括如下步骤：

1)将多例临床确诊的急性缺血性脑卒中血清和正常对照人员的血清作为两组血清标本，进行低温冷冻备用；

2)对血清蛋白进行质谱前预处理：

3)对预处理过的两组血清蛋白进行质谱检测读取，获得两组血清多肽的指纹图谱；

4)对所有的急性缺血性脑卒中和正常人血清多肽的指纹图谱进行标准化处理，并收集数据；

5)对所得数据进行标准化处理，实验质控，筛选出具有下列质荷比峰的2个急性缺血性脑卒中特征蛋白：4247m/z和6429m/z，根据这两个质荷比峰建立检测急性缺血性脑卒中特征蛋白的质谱模型。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，其中步骤2)预处理的方法是采用MB-WCX磁珠对血清蛋白进行富集。

5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述的实验质控处理指保留峰数量大于50的质谱图谱数据。