CN104677974A - 急性缺血性脑卒中多种蛋白标志物联合诊断模型 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种急性缺血性脑卒中多种蛋白标志物联合诊断模型。本团队在国家自然基金支持下，运用质谱技术筛查急性缺血性脑卒中(AIS)血清蛋白标志物。与正常人群相比，AIS患者血清中19种蛋白的错误发现率小于0.05。其中，SHIP1 IGF1，SDRP，MBL，CAM1，CRP，LPa，MRC1 8种蛋白在剩余AIS患者和对照人群中经过Western Blot技术和EL ISA方法验证，血清含量表达具有明显差异(p<0.05)。其中SHIP1，SDRP，CAM1，MRC1为首次发现的与AIS发生有关的特意蛋白。本申请意在保护我们发现的8种蛋白质辅助诊断AIS的诊断模型。该模型对于AI S患者的早期诊断具有重要意义。

Description

急性缺血性脑卒中多种蛋白标志物联合诊断模型

技术领域

本发明涉及急性缺血性脑卒中领域，为一种全新的多种蛋白诊断模型，对急性缺血性脑卒中进行早期的筛查和早期检测，其敏感性和特异性均达到90％以上。

背景技术

据WHO的统计数据，全球每6秒，脑卒中夺去一个生命；每隔一秒，脑卒中袭击一个人；每年1500万人脑卒中，600万人死于脑卒中，3000万人因脑卒中而残疾。目前中国是老龄化最快的国家之一，因此脑卒中造成的死亡率仍在不断攀升。50-65％的脑卒中病例是由缺血性事件所引起。脑卒中病程进展快，带来的后果又十分严重，因此该疾病的早诊断早治疗对于预后有着重大的影响。目前，由于尚无快速简便的实验室血液检测方法用于该疾病的筛查和早期检测，耽误了最佳治疗时机或延误治疗，给神经系统带来不可恢复的损伤，甚至有8％的患者会发生再次卒中。

定量蛋白质组学，近年来获得了巨大的技术进步，主要体现在各类高分辨率质谱在蛋白质组学中的应用。以质谱为基础的定量蛋白质组学，主要可以分成两类，第一是稳定同位素标记的定量蛋白质组学，比如SILAC和iTRAQ；另一类是非标记的定量蛋白质组学技术，比如使用Maxquant软件进行的非标记蛋白质组学分析。

本团队采用非标记的定量蛋白质组学技术对部分急性缺血脑卒中和正常人群血清蛋白就行分析，特异蛋白经过Western Blot技术验证，最后经过ELLISA技术在剩余人群中分析寻找出有临床诊断意义的蛋白。

本发明目的在于提供一种用于急性缺血性脑卒中诊断的多种特征蛋白模型。

主要发现

(1)本团队过去三年，在国家自然科学基金和财政部专项资金的支持下，建立了质谱技术筛查急性缺血性脑卒中血清蛋白标志物的筛查和验证工作。在前期工作过程中，与正常对照人群相比较，急性缺血性脑卒中患者血清中29种蛋白有统计学差异(P ＜0.05)；其中19种蛋白的错误发现率(false discovery rate) 小于0.05其中，Phosphatidylinositol-3，4，5-trisphosphate 5-phosphatase 1(SHIP1)，Isoform 1 of Insulin-like growth factor I (IGF1)，Serum deprivation-response protein(SDRP)，Mannose-binding protein(MBL)， Intercellular adhesion molecule 1(CAM1)，C-reactive protein(CRP)，LPA Apolipoprotein(a)，Macrophage mannose receptor 1(MRC1)8种蛋白在剩余患者和对照人群中经过ELISA方法验证，血清含量表达具有明显差异(p＜0.05).

(2)其中，SHIP1，SDRP，CAM1，MRC1四种特异蛋白与急性缺血性脑卒中发病之间的关联性为本团队首次发现。

(3)8种蛋白联合诊断急性缺血性脑卒中的蛋白芯片试剂盒开发。

本发明检测急性缺血性脑卒中特征蛋白，可用于建立血清特征蛋白质模型以及应用于在急性缺血性脑卒中筛查和早期检测。

本发明与其它急性缺血性脑卒中的检测方法比较，具有以下优点：

第一，与以往的血清学检测方法比较具有较高的敏感性和特异性，并能用于急性缺血性脑卒中筛查和早期检测中。

第二，本发明模型的构建方法设计合理可行，为提供急性缺血性脑卒中新的筛查和早期诊断方法，同时也为探索急性缺血性脑卒中早期预防提供了新的思路。

第四，利用本发明分析了220份血清样品，其中对照组120，验证结果显示两组间有明显差异，因此本发明可对急性缺血性脑卒中进行早期筛查和诊断，降低死亡率和致残率，提高患者的生活质量，减少经济负担。

后期验证

(1)在小样本的前期分析过程中(162例AIS，120例正常对照)，我们发现：AIS血清SHIP-1浓度明显高于对照人群(图1)。血清SHIP-1含量与卒中的严重程度，梗死面积成明显正相关(图1)。此外根据受试者工作特征曲线(ROC curve)，用于诊断脑卒中的血清中SHIP1含量的最佳临界值为1550pg/ml，由此得到77.5％的灵敏度及88.3％的特异度(图1)。多变量分析结果表明在考虑了其他混合因素之后，SHIP-1水平高于1550pg/ml(OR 4.28，95％ CI：1.97-8.96)的患者AIS的风险升高。

(2)同期研究发现，AIS血清MBL浓度明显高于对照人群(图2)，(1332；IQR，996-2134ug/L and 897；IQR，678-1100ug/L，respectively).。血清MBL含量与卒中的严重程度成明显正相关(图2)，(r[spearman]＝0.608，p＜0.0001)。多元分析结果表明在排除其它影响因素之后血清MBL含量与AIS风险相关(OR 1.002，95％Cl：1.001-1.008；p＝0.000)。根据ROC曲线图预测用于诊断AIS的血清中MBL含量的最佳临界值为1033pg/ml，以此得到81.0％灵敏度和78％的特异度。曲线下面积为0.763(95％Cl，0.704-0.821，图2)。与Hs-CRP(AUC0.57(0.50-0.65)，P＝0.036)及HCY(AUC 0.69(0.62-0.77)，p＝0.01)相比MBL诊断的准确度更高。

(3)卒中患者血清Lp(a)水平明显高于对照人群(328[IQR，173-554]vs145[IQR，66-254]mg/L，respectively；P＝0.000)，图3.血清Lp(a)含量与卒中的严重程度，梗死面积成明显正相关(p＝0.000，图3).在整组中，排除其他可能的风险因素后，Lp(a)水平是一个独立的影响卒中风险的因素，血清Lp(a)含量大于300mg/L时相应AIS风险提高了2.23倍(p＝0.015)。另外上述关系在男性患者中表现更为明显。

附图说明

图1SHIP-1诊断急性缺血性脑卒中价值分析。

图2MBL诊断急性缺血性脑卒中价值分析。

图3Lpa诊断急性缺血性脑卒中价值分析。

目前，对于急性缺血性脑卒中的诊断，主要依赖于患者的临床表现和神经影像学资料，如CT或MRI。对于出血性脑卒中的诊断，CT检查是行之有效的方法，而对于缺血性脑卒中尤其是程度较轻的病例，CT的作用大不如前者；虽然脑部的MRI检查对于该疾病的诊断作用显而易见，但由于其价格昂贵、耗费时间长，且很多急诊医疗部门无能力配置如此庞大的设备，同时可能由于患者自身原因，如躁动不安，有心脏起搏器或其他金属植入物而无法进行检查，以上种种原因限制了MRI的广泛使用。本发明获得的生物学诊断模型为其早期诊断并及时选择适当的治疗方案提供快速准确的生物标记物，这对于急性缺血性脑卒中患者的治疗和预后将具有非常重大的意义，在很大程度上可以提高患者病后的生活质量，减轻家庭和社会的负担，节约医疗资源。如该发明能实现产业化，应用于高危人群的院外甚至家庭诊断，必将对急性缺血性脑卒中的预防和早期治疗产生深远影响。

Claims (2)

1.本团队过去三年，在国家自然科学基金和财政部专项资金的支持下，建立了质谱技术筛查急性缺血性脑卒中血清蛋白标志物的筛查和验证工作。在前期工作过程中，与正常对照人群相比较，急性缺血性脑卒中患者血清中29种蛋白有统计学差异(P＜0.05)；其中19种蛋白的错误发现率(false discoveryrate)小于0.05。其中，Phosphatidylinositol-3，4，5-trisphosphate5-phosphatase1(SHIP1)，Isoform 1 of Insulin-like growth factor I(IGF1)，Serum deprivation-response protein(SDRP)，Mannose-binding protein(MBL)，Intercellular adhesion molecule 1(CAM1)，C-reactive protein(CRP)，LPA Apolipoprotein(a)，Macrophage mannose receptor 1(MRC1)8种蛋白在剩余患者和对照人群中经过ELISA方法验证，血清含量表达具有明显差异(p＜0.05).其中SHIP1，SDRP，CAM1，MRC1为首次发现的与卒中发生有关的特意蛋白。

2.建立权利要求1所述的蛋白，包括如下内容：

1)SHIP1，SDRP，CAM1，MRC1四种特异蛋白与急性缺血性脑卒中发病之间的关联性为本团队首次发现。

2)8种蛋白联合诊断急性缺血性脑卒中的蛋白芯片试剂盒。