CN114252606A - 尿液半胱氨酸双加氧酶-1及其多肽片段在过敏性疾病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种尿液半胱氨酸双加氧酶‑1（CDO‑1 antigen）及其多肽片段的应用，具体为尿液半胱氨酸双加氧酶‑1及其多肽片段在制备用于过敏性疾病诊断、鉴别诊断、病情程度判断、治疗效果评价、监测、预后评估及机理研究等制剂的应用。本发明通过研究证实，与健康人（正常对照组）相比，尿液半胱氨酸双加氧酶‑1及其多肽片段在过敏性疾病患者中表达升高。可用于过敏性疾病患者的各种目的应用检测。本发明发挥尿液标本获取无创、可大规模重复取样、保存方便的优势，利用尿液标本检测尿液半胱氨酸双加氧酶‑1及其多肽片段。

Description

尿液半胱氨酸双加氧酶-1及其多肽片段在过敏性疾病中的 应用

技术领域

本发明涉及尿液半胱氨酸双加氧酶-1及其多肽片段的新用途，具体涉及尿液半胱氨酸双加氧酶-1及其多肽片段在过敏性疾病诊断、鉴别诊断、病情程度判断、治疗效果评价、监测、预后评估及机理研究等制剂的应用。

背景技术

过敏性疾病又称变态反应性疾病，典型的过敏性疾病包括过敏性鼻炎、支气管哮喘、变应性皮炎、湿疹、变应性结膜炎及过敏性休克等。据世界卫生组织统计，全球过敏人群数量庞大，约有三分之一的人曾遭受过过敏性疾病的侵害。近年来由于人们生活方式急剧变化、工业化程度显著提高以及大气污染的明显加重，过敏性疾病的发病率逐年上升，严重的过敏性疾病甚至危及生命，目前已成为全球公共卫生焦点问题。

目前临床上对于过敏性疾病的辅助检查主要包括皮肤点刺试验（skin pricktest, SPT）及血清sIgE检测等，但SPT试验患者较痛苦依从性差，易受药物影响，并且还可增加全身过敏症状发生的风险，不适于严重过敏体质及儿童与老年群体。sIgE检测也并非无创检测，常需患者反复抽血。为提高过敏性疾病患者的生活质量和依从性，减轻多次采血及点刺试验的痛苦，期望通过尿液蛋白或多肽研究，实现用无痛、方便、快捷、易重复的尿液检测辅助过敏性疾病的诊断，也为进一步尿液多肽检测试剂盒的研究奠定基础。

半胱氨酸双加氧酶-1（Cysteine dioxygenase type 1, CDO-1）发现于哺乳动物细胞内，在肝细胞内尤为丰富。CDO-1新陈代谢和生物转化中起着关键作用，除此之外，其作为一种金属蛋白酶，在机体内参与了许多重要的需氧生化反应，并在其中发挥着至关重要的作用。本研究过敏性疾病患者尿液CDO-1含量较健康人组出现表达上调，在尿液中含量升高。

与常用的临床血液样本相比，尿液可以完全无创、连续、大量收集；没有稳态调节，可累积更多种类、更大幅度的变化，机体的很多病理生理变化可能体现在尿液中。一些激素和细胞因子等分子量相对较小的蛋白多肽入血后，会很快被排泄进入尿液，这些蛋白和多肽在尿液中被检测到的概率比在血中大很多；尿液收集之前，尿中可能的蛋白降解过程已经完成，所以尿蛋白可在较长时间内保持稳定。为减轻过敏性疾病患者多次采血的痛苦，本实验在前期方法学摸索的基础上，期望通过尿液蛋白或多肽研究，实现用无痛、方便、快捷、易重复的尿液检测辅助过敏性疾病患者的诊断及病情监测，也为进一步尿液多肽检测试剂盒的研究奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种尿液半胱氨酸双加氧酶-1及其多肽片段在制备用于过敏性疾病诊断、鉴别诊断、病情程度判断、治疗效果评价、监测、预后评估及机理研究等制剂的应用。

优选地，所述尿液半胱氨酸双加氧酶-1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示(MEQTEVLKPR TLADLIRILH QLFAGDEVNV EEVQAIMEAY ESDPTEWAMY AKFDQYRYTR NLVDQGNGKFNLMILCWGEG HGSSIHDHTN SHCFLKMLQG NLKETLFAWP DKKSNEMVKK SERVLRENQC AYINDSIGLHRVENISHTEP AVSLHLYSPP FDTCHAFDQR TGHKNKVTMT FHSKFGIRTP NATSGSLENN）；或由SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列衍生的，且与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。

优选地，所述制剂为过敏性疾病患者尿液半胱氨酸双加氧酶-1及其多肽片段检测试剂盒。

优选地，所述试剂盒包括抗原抗体反应的免疫方法及其试剂盒如能够特异性结合半胱氨酸双加氧酶-1及其多肽片段的适配体抗体或抗体片段中的一种或多种。

优选地，所述检测方法包括直接检测半胱氨酸双加氧酶-1及其多肽片段的质谱等方法及其相关试剂盒。

优选地，所述检测方法包括直接检测半胱氨酸双加氧酶-1及其多肽片段的相关核酸检测等方法及其相关试剂盒。

优选地，所述试剂盒还包括选自下组的成分：固相载体，稀释液，对照品，标准品，质控品，检测抗体，第二抗体、第二抗体稀释液，发光试剂，洗涤液、显色液、终止液中的任意一种或几种的组合。

优选地，所述标准品包括半胱氨酸双加氧酶-1标准品、人源化标签抗体标准品；较佳地，所述质控品包括：半胱氨酸双加氧酶-1质控品、人源化标签抗体质控品；较佳地，所述固相载体包括：微粒、微球、玻片、试纸条、塑料珠、液相芯片、微孔板或亲和膜等以及同等功能的其他载体。

优选地，所述固相载体的材质为聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺、纤维素中的任意一种及具有类似功能的载体。

发明人首先收集了健康人、过敏性疾病患者的尿液标本，4000r/min离心5min后，吸取上清，采用Bradford法测定提取的蛋白浓度，进行SDS-PAGE酶解。尿液样本的Label-free质谱分析由OrbitrapFusion型质谱完成。将过敏性疾病组和正常对照组在质谱中得到的数据进行定量计算。以蛋白表达量差异在1.5倍以上且经统计检验P<0.05作为参考标准筛选差异性多肽。然后发明人对具有统计学意义的差异性多肽进行鉴定，利用数据库检索得到差异蛋白半胱氨酸双加氧酶-1。

本发明通过研究证实与健康人相比，半胱氨酸双加氧酶-1及其多肽片段在过敏性疾病患者的尿液中呈高表达，与临床诊断有较好的一致性。从而提出检测尿液半胱氨酸双加氧酶-1及其多肽片段可用于过敏性疾病的辅助诊断或病情监测。

本发明发挥尿液标本获取无创、可大规模重复取样、保存方便的优势，利用尿液标本检测尿液半胱氨酸双加氧酶-1及其多肽片段。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。

附图说明

图1是尿液半胱氨酸双加氧酶-1及其多肽片段在过敏性疾病组及健康对照组中含量图。

具体实施方式

实施例1 尿液标本的收集与处理

选取过敏性疾病患者作为过敏性疾病组，选取同期健康体检者作为正常对照组。收集各组研究对象入院后的新鲜晨尿样本30ml，不能正常排尿者收集其早晨导尿管中尿液，置于干燥、洁净的容器内。将收集的尿液标本4000r/min离心5min后，吸取上清，每管2ml分装，-80℃冰箱保存。

实施例2 质谱分析和尿液多肽的筛选

对尿液样品蛋白提取，并对提取的蛋白浓度进行测定。尿液样本的质谱分析由OrbitrapFusion型质谱完成。将实验组和正常对照组在质谱中得到的数据进行定量计算。组间比较采用t-test进行差异分析，以蛋白表达量差异在1.5倍以上且经统计检验P<0.05作为参考标准筛选差异表达蛋白。

实施例3 差异多肽的鉴定及分析

使用的数据库为Uniprot_Homo数据库，产生的质谱原始文件采用MaxQuant软件处理，检索参数设置见表1。

表1 Max Quant软件检索参数表

与健康人相比，半胱氨酸双加氧酶-1在过敏性疾病患者的尿液中高表达，其在健康对照组和过敏性疾病组尿液中的含量如图1所示，半胱氨酸双加氧酶-1在正常对照组和过敏性疾病组尿液中的表达具有显著性差异。

虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。

序列表

<110> 首都医科大学附属北京世纪坛医院

<120> 尿液半胱氨酸双加氧酶-1及其多态片段在过敏性疾病中的应用

<130> 1

<140> 20PCDO-1-CN

<141> 2020-09-24

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 200

<212> PRT

<213> Human Uine

<400> 1

Met Glu Gln Thr Glu Val Leu Lys Pro Arg Thr Leu Ala Asp Leu Ile

1 5 10 15

Arg Ile Leu His Gln Leu Phe Ala Gly Asp Glu Val Asn Val Glu Glu

20 25 30

Val Gln Ala Ile Met Glu Ala Tyr Glu Ser Asp Pro Thr Glu Trp Ala

35 40 45

Met Tyr Ala Lys Phe Asp Gln Tyr Arg Tyr Thr Arg Asn Leu Val Asp

50 55 60

Gln Gly Asn Gly Lys Phe Asn Leu Met Ile Leu Cys Trp Gly Glu Gly

65 70 75 80

His Gly Ser Ser Ile His Asp His Thr Asn Ser His Cys Phe Leu Lys

85 90 95

Met Leu Gln Gly Asn Leu Lys Glu Thr Leu Phe Ala Trp Pro Asp Lys

100 105 110

Lys Ser Asn Glu Met Val Lys Lys Ser Glu Arg Val Leu Arg Glu Asn

115 120 125

Gln Cys Ala Tyr Ile Asn Asp Ser Ile Gly Leu His Arg Val Glu Asn

130 135 140

Ile Ser His Thr Glu Pro Ala Val Ser Leu His Leu Tyr Ser Pro Pro

145 150 155 160

Phe Asp Thr Cys His Ala Phe Asp Gln Arg Thr Gly His Lys Asn Lys

165 170 175

Val Thr Met Thr Phe His Ser Lys Phe Gly Ile Arg Thr Pro Asn Ala

180 185 190

Thr Ser Gly Ser Leu Glu Asn Asn

195 200

Claims (9)

1.尿液半胱氨酸双加氧酶-1及其多肽片段在制备用于过敏性疾病诊断、鉴别诊断、病情程度判断、治疗效果评价、监测、预后评估及机理研究等制剂的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述尿液半胱氨酸双加氧酶-1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；或由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列衍生的，且与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述制剂为过敏性疾病患者尿液半胱氨酸双加氧酶-1及其多肽片段检测试剂盒。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括抗原抗体反应的免疫方法及其试剂盒如能够特异性结合半胱氨酸双加氧酶-1及其多肽片段的适配体抗体或抗体片段中的一种或多种。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述检测方法包括直接检测半胱氨酸双加氧酶-1及其多肽片段的质谱等方法及其相关试剂盒。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述检测方法包括直接检测半胱氨酸双加氧酶-1及其多肽片段或其相关核酸检测等方法及其相关试剂盒。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括选自下组的成分：固相载体，稀释液，对照品，标准品，质控品，检测抗体，第二抗体、第二抗体稀释液，发光试剂，洗涤液、显色液、终止液中的任意一种或几种的组合。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述标准品包括半胱氨酸双加氧酶-1标准品、人源化标签抗体标准品；较佳地，所述质控品包括：半胱氨酸双加氧酶-1控品、人源化标签抗体质控品；较佳地，所述固相载体包括：微粒、微球、玻片、试纸条、塑料珠、液相芯片、微孔板或亲和膜等以及同等功能的其他载体。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述固相载体的材质为聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺、纤维素中的任意一种及具有类似功能的载体。

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