CN114252605A - 尿液髓过氧化物酶及其多肽片段在过敏性疾病中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种尿液髓过氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）及其多肽片段的应用，具体为尿液髓过氧化物酶及其多肽片段在制备用于过敏性疾病诊断、鉴别诊断、病情程度判断、治疗效果评价、监测、预后评估及机理研究等制剂的应用。本发明通过研究证实，与健康人（正常对照组）相比，尿液髓过氧化物酶及其多肽片段在过敏性疾病患者中表达升高。可用于过敏性疾病患者的各种目的应用检测。本发明发挥尿液标本获取无创、可大规模重复取样、保存方便的优势，利用尿液标本检测尿液髓过氧化物酶及其多肽片段。

Description

尿液髓过氧化物酶及其多肽片段在过敏性疾病中的应用
技术领域
本发明涉及尿液髓过氧化物酶及其多肽片段的新用途，具体涉及尿液髓过氧化物酶及其多肽片段在过敏性疾病诊断、鉴别诊断、病情程度判断、治疗效果评价、监测、预后评估及机理研究等制剂的应用。
背景技术
过敏性疾病又称变态反应性疾病，典型的过敏性疾病包括过敏性鼻炎、支气管哮喘、变应性皮炎、湿疹、变应性结膜炎及过敏性休克等。据世界卫生组织统计，全球过敏人群数量庞大，约有三分之一的人曾遭受过过敏性疾病的侵害。近年来由于人们生活方式急剧变化、工业化程度显著提高以及大气污染的明显加重，过敏性疾病的发病率逐年上升，严重的过敏性疾病甚至危及生命，目前已成为全球公共卫生焦点问题。
目前临床上对于过敏性疾病的辅助检查主要包括皮肤点刺试验（skin pricktest, SPT）及血清sIgE检测等，但SPT试验患者较痛苦依从性差，易受药物影响，并且还可增加全身过敏症状发生的风险，不适于严重过敏体质及儿童与老年群体。sIgE检测也并非无创检测，常需患者反复抽血。为提高过敏性疾病患者的生活质量和依从性，减轻多次采血及点刺试验的痛苦，期望通过尿液蛋白或多肽研究，实现用无痛、方便、快捷、易重复的尿液检测辅助过敏性疾病的诊断，也为进一步尿液多肽检测试剂盒的研究奠定基础。
髓过氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）是血红素过氧化物酶超家族成员,由两条重链和两条轻链组成,分子量为140000。MPO基因由12 外显子和11个内含子组成,位于染色体17q22,主要由中性粒细胞和单核细胞表达。已有许多研究表明MPO与动脉粥样硬化、心血管疾病及代谢综合征等多种炎症性疾病有紧密联系，其发病机制多与氧化应激、炎症反应和血管内皮损害相关。本研究过敏性疾病患者尿液MPO含量较健康人组出现表达上调，在尿液中含量升高。
与常用的临床血液样本相比，尿液可以完全无创、连续、大量收集；没有稳态调节，可累积更多种类、更大幅度的变化，机体的很多病理生理变化可能体现在尿液中。一些激素和细胞因子等分子量相对较小的蛋白多肽入血后，会很快被排泄进入尿液，这些蛋白和多肽在尿液中被检测到的概率比在血中大很多；尿液收集之前，尿中可能的蛋白降解过程已经完成，所以尿蛋白可在较长时间内保持稳定。为减轻过敏性疾病患者多次采血的痛苦，本实验在前期方法学摸索的基础上，期望通过尿液蛋白或多肽研究，实现用无痛、方便、快捷、易重复的尿液检测辅助过敏性疾病患者的诊断及病情监测，也为进一步尿液多肽检测试剂盒的研究奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种尿液髓过氧化物酶及其多肽片段在制备用于过敏性疾病诊断、鉴别诊断、病情程度判断、治疗效果评价、监测、预后评估及机理研究等制剂的应用。
优选地，所述尿液髓过氧化物酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示
(MGVPFFSSLR CMVDLGPCWA GGLTAEMKLL LALAGLLAIL ATPQPSEGAA
PAVLGEVDTS LVLSSMEEAK QLVDKAYKER RESIKQRLRS GSASPMELLS
YFKQPVAATR TAVRAADYLH VALDLLERKL RSLWRRPFNV TDVLTPAQLN
VLSKSSGCAY QDVGVTCPEQ DKYRTITGMC NNRRSPTLGA SNRAFVRWLP
AEYEDGFSLP YGWTPGVKRN GFPVALARAV SNEIVRFPTD QLTPDQERSL
MFMQWGQLLD HDLDFTPEPA ARASFVTGVN CETSCVQQPP CFPLKIPPND
PRIKNQADCI PFFRSCPACP GSNITIRNQI NALTSFVDAS MVYGSEEPLA
RNLRNMSNQL GLLAVNQRFQ DNGRALLPFD NLHDDPCLLT NRSARIPCFL
AGDTRSSEMP ELTSMHTLLL REHNRLATEL KSLNPRWDGE RLYQEARKIV
GAMVQIITYR DYLPLVLGPT AMRKYLPTYR SYNDSVDPRI ANVFTNAFRY
GHTLIQPFMF RLDNRYQPME PNPRVPLSRV FFASWRVVLE GGIDPILRGL
MATPAKLNRQ NQIAVDEIRE RLFEQVMRIG LDLPALNMQR SRDHGLPGYN
AWRRFCGLPQ PETVGQLGTV LRNLKLARKL MEQYGTPNNI DIWMGGVSEP
LKRKGRVGPL LACIIGTQFR KLRDGDRFWW ENEGVFSMQQ RQALAQISLP
RIICDNTGIT TVSKNNIFMS NSYPRDFVNC STLPALNLAS WREAS）；或由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列衍生的，且与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。
优选地，所述制剂为过敏性疾病患者尿液髓过氧化物酶及其多肽片段检测试剂盒。
优选地，所述试剂盒包括抗原抗体反应的免疫方法及其试剂盒如能够特异性结合髓过氧化物酶及其多肽片段的适配体抗体或抗体片段中的一种或多种。
优选地，所述检测方法包括直接检测髓过氧化物酶及其多肽片段的质谱等方法及其相关试剂盒。
优选地，所述检测方法包括直接检测髓过氧化物酶及其多肽片段的相关核酸检测等方法及其相关试剂盒。
优选地，所述试剂盒还包括选自下组的成分：固相载体，稀释液，对照品，标准品，质控品，检测抗体，第二抗体、第二抗体稀释液，发光试剂，洗涤液、显色液、终止液中的任意一种或几种的组合。
优选地，所述标准品包括髓过氧化物酶标准品、人源化标签抗体标准品；较佳地，所述质控品包括：髓过氧化物酶质控品、人源化标签抗体质控品；较佳地，所述固相载体包括：微粒、微球、玻片、试纸条、塑料珠、液相芯片、微孔板或亲和膜等以及同等功能的其他载体。
优选地，所述固相载体的材质为聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺、纤维素中的任意一种及具有类似功能的载体。
发明人首先收集了健康人、过敏性疾病患者的尿液标本，4000r/min离心5min后，吸取上清，采用Bradford法测定提取的蛋白浓度，进行SDS-PAGE酶解。尿液样本的Label-free质谱分析由OrbitrapFusion型质谱完成。将过敏性疾病组和正常对照组在质谱中得到的数据进行定量计算。以蛋白表达量差异在1.5倍以上且经统计检验P<0.05作为参考标准筛选差异性多肽。然后发明人对具有统计学意义的差异性多肽进行鉴定，利用数据库检索得到差异蛋白髓过氧化物酶。
本发明通过研究证实与健康人相比，髓过氧化物酶及其多肽片段在过敏性疾病患者的尿液中呈高表达，与临床诊断有较好的一致性。从而提出检测尿液髓过氧化物酶及其多肽片段可用于过敏性疾病的辅助诊断或病情监测。
本发明发挥尿液标本获取无创、可大规模重复取样、保存方便的优势，利用尿液标本检测尿液髓过氧化物酶及其多肽片段。
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。
附图说明
图1是尿液髓过氧化物酶及其多肽片段在过敏性疾病组及健康对照组中含量图。
具体实施方式
实施例1 尿液标本的收集与处理
选取过敏性疾病患者作为过敏性疾病组，选取同期健康体检者作为正常对照组。收集各组研究对象入院后的新鲜晨尿样本30ml，不能正常排尿者收集其早晨导尿管中尿液，置于干燥、洁净的容器内。将收集的尿液标本4000r/min离心5min后，吸取上清，每管2ml分装，-80℃冰箱保存。
实施例2 质谱分析和尿液多肽的筛选
对尿液样品蛋白提取，并对提取的蛋白浓度进行测定。尿液样本的质谱分析由OrbitrapFusion型质谱完成。将实验组和正常对照组在质谱中得到的数据进行定量计算。组间比较采用t-test进行差异分析，以蛋白表达量差异在1.5倍以上且经统计检验P<0.05作为参考标准筛选差异表达蛋白。
实施例3 差异多肽的鉴定及分析
使用的数据库为Uniprot_Homo数据库，产生的质谱原始文件采用MaxQuant软件处理，检索参数设置见表1。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
与健康人相比，髓过氧化物酶在过敏性疾病患者的尿液中高表达，其在健康对照组和过敏性疾病组尿液中的含量如图1所示，髓过氧化物酶在正常对照组和过敏性疾病组尿液中的表达具有显著性差异。
虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。
序列表
<110> 张曼
<120> 尿液髓过氧化物酶及其多态片段在过敏性疾病中的应用
<130> 1
<140> 20PMPO-CN
<141> 2020-08-21
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 745
<212> PRT
<213> Human Urine
<400> 1
Met Gly Val Pro Phe Phe Ser Ser Leu Arg Cys Met Val Asp Leu Gly
1 5 10 15
Pro Cys Trp Ala Gly Gly Leu Thr Ala Glu Met Lys Leu Leu Leu Ala
20 25 30
Leu Ala Gly Leu Leu Ala Ile Leu Ala Thr Pro Gln Pro Ser Glu Gly
35 40 45
Ala Ala Pro Ala Val Leu Gly Glu Val Asp Thr Ser Leu Val Leu Ser
50 55 60
Ser Met Glu Glu Ala Lys Gln Leu Val Asp Lys Ala Tyr Lys Glu Arg
65 70 75 80
Arg Glu Ser Ile Lys Gln Arg Leu Arg Ser Gly Ser Ala Ser Pro Met
85 90 95
Glu Leu Leu Ser Tyr Phe Lys Gln Pro Val Ala Ala Thr Arg Thr Ala
100 105 110
Val Arg Ala Ala Asp Tyr Leu His Val Ala Leu Asp Leu Leu Glu Arg
115 120 125
Lys Leu Arg Ser Leu Trp Arg Arg Pro Phe Asn Val Thr Asp Val Leu
130 135 140
Thr Pro Ala Gln Leu Asn Val Leu Ser Lys Ser Ser Gly Cys Ala Tyr
145 150 155 160
Gln Asp Val Gly Val Thr Cys Pro Glu Gln Asp Lys Tyr Arg Thr Ile
165 170 175
Thr Gly Met Cys Asn Asn Arg Arg Ser Pro Thr Leu Gly Ala Ser Asn
180 185 190
Arg Ala Phe Val Arg Trp Leu Pro Ala Glu Tyr Glu Asp Gly Phe Ser
195 200 205
Leu Pro Tyr Gly Trp Thr Pro Gly Val Lys Arg Asn Gly Phe Pro Val
210 215 220
Ala Leu Ala Arg Ala Val Ser Asn Glu Ile Val Arg Phe Pro Thr Asp
225 230 235 240
Gln Leu Thr Pro Asp Gln Glu Arg Ser Leu Met Phe Met Gln Trp Gly
245 250 255
Gln Leu Leu Asp His Asp Leu Asp Phe Thr Pro Glu Pro Ala Ala Arg
260 265 270
Ala Ser Phe Val Thr Gly Val Asn Cys Glu Thr Ser Cys Val Gln Gln
275 280 285
Pro Pro Cys Phe Pro Leu Lys Ile Pro Pro Asn Asp Pro Arg Ile Lys
290 295 300
Asn Gln Ala Asp Cys Ile Pro Phe Phe Arg Ser Cys Pro Ala Cys Pro
305 310 315 320
Gly Ser Asn Ile Thr Ile Arg Asn Gln Ile Asn Ala Leu Thr Ser Phe
325 330 335
Val Asp Ala Ser Met Val Tyr Gly Ser Glu Glu Pro Leu Ala Arg Asn
340 345 350
Leu Arg Asn Met Ser Asn Gln Leu Gly Leu Leu Ala Val Asn Gln Arg
355 360 365
Phe Gln Asp Asn Gly Arg Ala Leu Leu Pro Phe Asp Asn Leu His Asp
370 375 380
Asp Pro Cys Leu Leu Thr Asn Arg Ser Ala Arg Ile Pro Cys Phe Leu
385 390 395 400
Ala Gly Asp Thr Arg Ser Ser Glu Met Pro Glu Leu Thr Ser Met His
405 410 415
Thr Leu Leu Leu Arg Glu His Asn Arg Leu Ala Thr Glu Leu Lys Ser
420 425 430
Leu Asn Pro Arg Trp Asp Gly Glu Arg Leu Tyr Gln Glu Ala Arg Lys
435 440 445
Ile Val Gly Ala Met Val Gln Ile Ile Thr Tyr Arg Asp Tyr Leu Pro
450 455 460
Leu Val Leu Gly Pro Thr Ala Met Arg Lys Tyr Leu Pro Thr Tyr Arg
465 470 475 480
Ser Tyr Asn Asp Ser Val Asp Pro Arg Ile Ala Asn Val Phe Thr Asn
485 490 495
Ala Phe Arg Tyr Gly His Thr Leu Ile Gln Pro Phe Met Phe Arg Leu
500 505 510
Asp Asn Arg Tyr Gln Pro Met Glu Pro Asn Pro Arg Val Pro Leu Ser
515 520 525
Arg Val Phe Phe Ala Ser Trp Arg Val Val Leu Glu Gly Gly Ile Asp
530 535 540
Pro Ile Leu Arg Gly Leu Met Ala Thr Pro Ala Lys Leu Asn Arg Gln
545 550 555 560
Asn Gln Ile Ala Val Asp Glu Ile Arg Glu Arg Leu Phe Glu Gln Val
565 570 575
Met Arg Ile Gly Leu Asp Leu Pro Ala Leu Asn Met Gln Arg Ser Arg
580 585 590
Asp His Gly Leu Pro Gly Tyr Asn Ala Trp Arg Arg Phe Cys Gly Leu
595 600 605
Pro Gln Pro Glu Thr Val Gly Gln Leu Gly Thr Val Leu Arg Asn Leu
610 615 620
Lys Leu Ala Arg Lys Leu Met Glu Gln Tyr Gly Thr Pro Asn Asn Ile
625 630 635 640
Asp Ile Trp Met Gly Gly Val Ser Glu Pro Leu Lys Arg Lys Gly Arg
645 650 655
Val Gly Pro Leu Leu Ala Cys Ile Ile Gly Thr Gln Phe Arg Lys Leu
660 665 670
Arg Asp Gly Asp Arg Phe Trp Trp Glu Asn Glu Gly Val Phe Ser Met
675 680 685
Gln Gln Arg Gln Ala Leu Ala Gln Ile Ser Leu Pro Arg Ile Ile Cys
690 695 700
Asp Asn Thr Gly Ile Thr Thr Val Ser Lys Asn Asn Ile Phe Met Ser
705 710 715 720
Asn Ser Tyr Pro Arg Asp Phe Val Asn Cys Ser Thr Leu Pro Ala Leu
725 730 735
Asn Leu Ala Ser Trp Arg Glu Ala Ser
740 745

Claims (9)

1.尿液髓过氧化物酶及其多肽片段在制备用于过敏性疾病诊断、鉴别诊断、病情程度判断、治疗效果评价、监测、预后评估及机理研究等制剂的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述尿液髓过氧化物酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；或由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列衍生的，且与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述制剂为过敏性疾病患者尿液髓过氧化物酶及其多肽片段检测试剂盒。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括抗原抗体反应的免疫方法及其试剂盒如能够特异性结合髓过氧化物酶及其多肽片段的适配体抗体或抗体片段中的一种或多种。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述检测方法包括直接检测髓过氧化物酶及其多肽片段的质谱等方法及其相关试剂盒。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述检测方法包括直接检测髓过氧化物酶及其多肽片段或其相关核酸检测等方法及其相关试剂盒。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括选自下组的成分：固相载体，稀释液，对照品，标准品，质控品，检测抗体，第二抗体、第二抗体稀释液，发光试剂，洗涤液、显色液、终止液中的任意一种或几种的组合。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述标准品包括髓过氧化物酶标准品、人源化标签抗体标准品；较佳地，所述质控品包括：髓过氧化物酶控品、人源化标签抗体质控品；较佳地，所述固相载体包括：微粒、微球、玻片、试纸条、塑料珠、液相芯片、微孔板或亲和膜等以及同等功能的其他载体。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述固相载体的材质为聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺、纤维素中的任意一种及具有类似功能的载体。
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