CN113777304A

CN113777304A - 尿液纤维蛋白溶解酶原及其多肽片段在烧伤中的应用

Info

Publication number: CN113777304A
Application number: CN202010517789.3A
Authority: CN
Inventors: 张曼; 王佶图
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2020-06-09
Filing date: 2020-06-09
Publication date: 2021-12-10

Abstract

本发明提供一种尿液纤维蛋白溶解酶原（Plasminogen）及其多肽片段的应用，具体为尿液纤维蛋白溶解酶原及其多肽片段在制备用于烧伤诊断、鉴别诊断、烧伤面积及程度评价、治疗效果评价、监测、预后评估及机理研究等制剂的应用。烧伤是日常生活中常见的重要创伤，每年每100万人中约有5000～100000人烧伤，据世界卫生组织统计，每年全球死于烧伤患者超过30万人，严重烧伤救治存活率仍处于较低水平。本发明通过研究证实，与健康人（正常对照组）相比，尿液纤维蛋白溶解酶原及其多肽片段在烧伤患者中高表达并随烧伤程度的不同而变化。可用于烧伤患者的各种目的应用检测。本发明发挥尿液标本获取无创、可大规模重复取样、保存方便的优势，利用尿液标本检测尿液纤维蛋白溶解酶原及其多肽片段。

Description

尿液纤维蛋白溶解酶原及其多肽片段在烧伤中的应用

技术领域

本发明涉及尿液纤维蛋白溶解酶原及其多肽片段的新用途，具体涉及尿液纤维蛋白溶解酶原及其多肽片段在于烧伤诊断、鉴别诊断、烧伤面积及程度评价、治疗效果评价、监测、预后评估及机理研究等的应用。

背景技术

烧伤是指由于火焰、高温气体、灼热的固体或液体、放射线、电能、强酸强碱等化学物质所引起的人体皮肤、组织甚至深层脏器的损伤，是一种全身性综合性疾病。烧伤后创面组织大量坏死、感染、休克及凝血功能障碍等反应可引起机体发生一系列的病理生理学变化。不同程度的烧伤对人体有着不同的影响，严重的烧伤可对人体内环境造成破坏，使烧伤患者出现各系统复杂性的病理生理变化，相关的检测指标也会随着烧伤严重程度的不同随之出现相应的改变。及时检测这些指标的变化可为临床医生对于疾病的诊断，病情的判断，治疗方法的选择以及患者预后的评估等多方面提供有价值的参考依据。

但是，严重烧伤的病人皮肤完整性较差，血液学检测作为皮肤有创性检查在此类患者的临床应用中存在着诸多困难，反复的抽血检测还会加剧患者痛苦。尿液作为血液的超滤液蕴含着丰富的生物学信息，其采集过程具有无创便捷等优势，这在烧伤患者的检测中尤为明显。在尿液中寻找有助于烧伤诊断及反映病情变化的生物标志物，可提高烧伤患者的生活质量和依从性，减轻多次采血的痛苦，更好的为临床医生提供有利于疾病诊断和治疗的参考依据。

纤维蛋白溶解酶原(Plasminogen, Pg)可溶解血栓中的纤维蛋白，并在胚胎发育、组织重塑、肿瘤侵袭和炎症等多种过程中发挥蛋白水解酶的作用。其可激活尿激酶型纤溶酶原激活剂、胶原酶和几种补体酶原，如C1和C5。本研究烧伤患者尿液中纤维蛋白溶解酶原较健康人组出现表达上调，且与烧伤程度呈一定相关性，随烧伤程度的不同而变化。

与常用的临床血液样本相比，尿液可以完全无创、连续、大量收集；没有稳态调节，可累积更多种类、更大幅度的变化，机体的很多病理生理变化可能体现在尿液中。一些激素和细胞因子等分子量相对较小的蛋白多肽入血后，会很快被排泄进入尿液，这些蛋白和多肽在尿液中被检测到的概率比在血中大很多；尿液收集之前，尿中可能的蛋白降解过程已经完成，所以尿蛋白可在较长时间内保持稳定。为减轻烧伤患者多次采血的痛苦，本实验在前期方法学摸索的基础上，期望通过尿液蛋白或多肽研究，实现用无痛、方便、快捷、易重复的尿液检测辅助烧伤患者的诊断及病情监测，也为进一步尿液多肽检测试剂盒的研究奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种尿液纤维蛋白溶解酶原及其多肽片段在制备用于烧伤诊断、鉴别诊断、烧伤面积及程度评价、治疗效果评价、监测、预后评估及机理研究等制剂的应用。

优选地，所述尿液纤维蛋白溶解酶原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示(MEHKEVVLLL LLFLKSGQGE PLDDYVNTQG ASLFSVTKKQ LGAGSIEECA AKCEEDEEFT CRAFQYHSKEQQCVIMAENR KSSIIIRMRD VVLFEKKVYL SECKTGNGKN YRGTMSKTKN GITCQKWSST SPHRPRFSPATHPSEGLEEN YCRNPDNDPQ GPWCYTTDPE KRYDYCDILE CEEECMHCSG ENYDGKISKT MSGLECQAWDSQSPHAHGYI PSKFPNKNLK KNYCRNPDRE LRPWCFTTDP NKRWELCDIP RCTTPPPSSG PTYQCLKGTGENYRGNVAVT VSGHTCQHWS AQTPHTHNRT PENFPCKNLD ENYCRNPDGK RAPWCHTTNS QVRWEYCKIPSCDSSPVSTE QLAPTAPPEL TPVVQDCYHG DGQSYRGTSS TTTTGKKCQS WSSMTPHRHQ KTPENYPNAGLTMNYCRNPD ADKGPWCFTT DPSVRWEYCN LKKCSGTEAS VVAPPPVVLL PDVETPSEED CMFGNGKGYRGKRATTVTGT PCQDWAAQEP HRHSIFTPET NPRAGLEKNY CRNPDGDVGG PWCYTTNPRK LYDYCDVPQCAAPSFDCGKP QVEPKKCPGR VVGGCVAHPH SWPWQVSLRT RFGMHFCGGT LISPEWVLTA AHCLEKSPRPSSYKVILGAH QEVNLEPHVQ EIEVSRLFLE PTRKDIALLK LSSPAVITDK VIPACLPSPN YVVADRTECFITGWGETQGT FGAGLLKEAQ LPVIENKVCN RYEFLNGRVQ STELCAGHLA GGTDSCQGDS GGPLVCFEKDKYILQGVTSW GLGCARPNKP GVYVRVSRFV TWIEGVMRNN）；或由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列衍生的，且与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。

优选地，所述制剂为烧伤患者尿液纤维蛋白溶解酶原及其多肽片段检测试剂盒。

优选地，所述试剂盒包括抗原抗体反应的免疫方法及其试剂盒如能够特异性结合纤维蛋白溶解酶原及其多肽片段的适配体抗体或抗体片段中的一种或多种。

优选地，所述检测方法包括直接检测纤维蛋白溶解酶原及其多肽片段的质谱等方法及其相关试剂盒。

优选地，所述检测方法包括直接检测纤维蛋白溶解酶原及其多肽片段的相关核酸检测等方法及其相关试剂盒。

优选地，所述试剂盒还包括选自下组的成分：固相载体，稀释液，对照品，标准品，质控品，检测抗体，第二抗体、第二抗体稀释液，发光试剂，洗涤液、显色液、终止液中的任意一种或几种的组合。

优选地，所述标准品包括纤维蛋白溶解酶原标准品、人源化标签抗体标准品；较佳地，所述质控品包括：纤维蛋白溶解酶原质控品、人源化标签抗体质控品；较佳地，所述固相载体包括：微粒、微球、玻片、试纸条、塑料珠、液相芯片、微孔板或亲和膜等以及同等功能的其他载体。

优选地，所述固相载体的材质为聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺、纤维素中的任意一种及具有类似功能的载体。

发明人首先收集了健康人、不同烧伤程度患者的尿液标本，4000r/min离心5min后，吸取上清，采用Bradford法测定提取的蛋白浓度，进行SDS-PAGE酶解。尿液样本的Label-free质谱分析由OrbitrapFusion型质谱完成。将烧伤组和正常对照组在质谱中得到的数据进行定量计算。以蛋白表达量差异在1.5倍以上且经统计检验P<0.05作为参考标准筛选差异性多肽。然后发明人对具有统计学意义的差异性多肽进行鉴定，利用数据库检索得到差异蛋白纤维蛋白溶解酶原。

本发明通过研究证实与健康人相比，纤维蛋白溶解酶原及其多肽片段在烧伤患者的尿液中呈高表达，并随烧伤程度的加重而升高，与临床诊断有较好的一致性。从而提出检测尿液纤维蛋白溶解酶原及其多肽片段可用于烧伤的辅助诊断或病情监测。

本发明发挥尿液标本获取无创、可大规模重复取样、保存方便的优势，利用尿液标本检测尿液纤维蛋白溶解酶原及其多肽片段。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。

附图说明

图1是尿液纤维蛋白溶解酶原及其多肽片段在不同程度烧伤组及健康对照组中含量图。

图2是尿液纤维蛋白溶解酶原及其多肽片段在不同程度烧伤组及健康对照组中变化趋势图。

具体实施方式

实施例1 尿液标本的收集与处理

选取烧伤患者作为烧伤组，选取同期健康体检者作为正常对照组。收集各组研究对象入院后的新鲜晨尿样本30ml，不能正常排尿者收集其早晨导尿管中尿液，置于干燥、洁净的容器内。将收集的尿液标本4000r/min离心5min后，吸取上清，每管2ml分装，-80℃冰箱保存。

实施例2 质谱分析和尿液多肽的筛选

对尿液样品蛋白提取，并对提取的蛋白浓度进行测定。尿液样本的质谱分析由OrbitrapFusion型质谱完成。将实验组和正常对照组在质谱中得到的数据进行定量计算。组间比较采用t-test进行差异分析，以蛋白表达量差异在1.5倍以上且经统计检验P<0.05作为参考标准筛选差异表达蛋白。

实施例3 差异多肽的鉴定及分析

使用的数据库为Uniprot_Homo数据库，产生的质谱原始文件采用MaxQuant软件处理，检索参数设置见表1。

与健康人相比，纤维蛋白溶解酶原在烧伤患者的尿液中高表达，如图1所示，其在健康对照组和不同程度烧伤组中的变化趋势如图2所示，纤维蛋白溶解酶原在正常对照组和烧伤组尿液中的表达具有显著性差异，并随烧伤程度的不同而变化。

虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。

序列表

<110> 张, 曼

<120> 尿液纤维蛋白溶解酶原及其多肽片段在烧伤中的应用

<130> 1

<140> 20PPg-CN

<141> 2020-05-30

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 810

<212> PRT

<213> Human Urine

<400> 1

Met Glu His Lys Glu Val Val Leu Leu Leu Leu Leu Phe Leu Lys Ser

1 5 10 15

Gly Gln Gly Glu Pro Leu Asp Asp Tyr Val Asn Thr Gln Gly Ala Ser

20 25 30

Leu Phe Ser Val Thr Lys Lys Gln Leu Gly Ala Gly Ser Ile Glu Glu

35 40 45

Cys Ala Ala Lys Cys Glu Glu Asp Glu Glu Phe Thr Cys Arg Ala Phe

50 55 60

Gln Tyr His Ser Lys Glu Gln Gln Cys Val Ile Met Ala Glu Asn Arg

65 70 75 80

Lys Ser Ser Ile Ile Ile Arg Met Arg Asp Val Val Leu Phe Glu Lys

85 90 95

Lys Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg

100 105 110

Gly Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser

115 120 125

Ser Thr Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser

130 135 140

Glu Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln

145 150 155 160

Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys

165 170 175

Asp Ile Leu Glu Cys Glu Glu Glu Cys Met His Cys Ser Gly Glu Asn

180 185 190

Tyr Asp Gly Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu Glu Cys Gln Ala

195 200 205

Trp Asp Ser Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Phe

210 215 220

Pro Asn Lys Asn Leu Lys Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Glu

225 230 235 240

Leu Arg Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Lys Arg Trp Glu Leu

245 250 255

Cys Asp Ile Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Ser Ser Gly Pro Thr

260 265 270

Tyr Gln Cys Leu Lys Gly Thr Gly Glu Asn Tyr Arg Gly Asn Val Ala

275 280 285

Val Thr Val Ser Gly His Thr Cys Gln His Trp Ser Ala Gln Thr Pro

290 295 300

His Thr His Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Asp

305 310 315 320

Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Arg Ala Pro Trp Cys His

325 330 335

Thr Thr Asn Ser Gln Val Arg Trp Glu Tyr Cys Lys Ile Pro Ser Cys

340 345 350

Asp Ser Ser Pro Val Ser Thr Glu Gln Leu Ala Pro Thr Ala Pro Pro

355 360 365

Glu Leu Thr Pro Val Val Gln Asp Cys Tyr His Gly Asp Gly Gln Ser

370 375 380

Tyr Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr Thr Thr Gly Lys Lys Cys Gln Ser

385 390 395 400

Trp Ser Ser Met Thr Pro His Arg His Gln Lys Thr Pro Glu Asn Tyr

405 410 415

Pro Asn Ala Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Asp

420 425 430

Lys Gly Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Ser Val Arg Trp Glu Tyr

435 440 445

Cys Asn Leu Lys Lys Cys Ser Gly Thr Glu Ala Ser Val Val Ala Pro

450 455 460

Pro Pro Val Val Leu Leu Pro Asp Val Glu Thr Pro Ser Glu Glu Asp

465 470 475 480

Cys Met Phe Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly Lys Arg Ala Thr Thr

485 490 495

Val Thr Gly Thr Pro Cys Gln Asp Trp Ala Ala Gln Glu Pro His Arg

500 505 510

His Ser Ile Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg Ala Gly Leu Glu Lys

515 520 525

Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Gly Gly Pro Trp Cys Tyr

530 535 540

Thr Thr Asn Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp Val Pro Gln Cys

545 550 555 560

Ala Ala Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val Glu Pro Lys Lys

565 570 575

Cys Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp

580 585 590

Pro Trp Gln Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly

595 600 605

Gly Thr Leu Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu

610 615 620

Glu Lys Ser Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala His

625 630 635 640

Gln Glu Val Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg

645 650 655

Leu Phe Leu Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser

660 665 670

Ser Pro Ala Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser

675 680 685

Pro Asn Tyr Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Ile Thr Gly Trp

690 695 700

Gly Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln

705 710 715 720

Leu Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn

725 730 735

Gly Arg Val Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly

740 745 750

Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu

755 760 765

Lys Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys

770 775 780

Ala Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val

785 790 795 800

Thr Trp Ile Glu Gly Val Met Arg Asn Asn

805 810

Claims

1.尿液纤维蛋白溶解酶原及其多肽片段在制备用于烧伤诊断、鉴别诊断、烧伤面积及程度评价、治疗效果评价、监测、预后评估及机理研究等制剂的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述尿液纤维蛋白溶解酶原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；或由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列衍生的，且与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述制剂为烧伤患者尿液纤维蛋白溶解酶原及其多肽片段检测试剂盒。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括抗原抗体反应的免疫方法及其试剂盒如能够特异性结合纤维蛋白溶解酶原及其多肽片段的适配体抗体或抗体片段中的一种或多种。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述检测方法包括直接检测纤维蛋白溶解酶原及其多肽片段的质谱等方法及其相关试剂盒。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述检测方法包括直接检测纤维蛋白溶解酶原及其多肽片段或其相关核酸检测等方法及其相关试剂盒。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括选自下组的成分：固相载体，稀释液，对照品，标准品，质控品，检测抗体，第二抗体、第二抗体稀释液，发光试剂，洗涤液、显色液、终止液中的任意一种或几种的组合。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述标准品包括纤维蛋白溶解酶原标准品、人源化标签抗体标准品；较佳地，所述质控品包括：纤维蛋白溶解酶原控品、人源化标签抗体质控品；较佳地，所述固相载体包括：微粒、微球、玻片、试纸条、塑料珠、液相芯片、微孔板或亲和膜等以及同等功能的其他载体。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述固相载体的材质为聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺、纤维素中的任意一种及具有类似功能的载体。