CN114252626A - 尿液粘连蛋白-1及其多肽片段在过敏性疾病中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种尿液粘连蛋白‑1（Nectin‑1）及其多肽片段的应用，具体为尿液粘连蛋白‑1及其多肽片段在制备用于过敏性疾病诊断、鉴别诊断、病情程度判断、治疗效果评价、监测、预后评估及机理研究等制剂的应用。本发明通过研究证实，与健康人（正常对照组）相比，尿液粘连蛋白‑1及其多肽片段在过敏性疾病患者中表达降低。可用于过敏性疾病患者的各种目的应用检测。本发明发挥尿液标本获取无创、可大规模重复取样、保存方便的优势，利用尿液标本检测尿液粘连蛋白‑1及其多肽片段。

Description

尿液粘连蛋白-1及其多肽片段在过敏性疾病中的应用
技术领域
本发明涉及尿液粘连蛋白-1及其多肽片段的新用途，具体涉及尿液粘连蛋白-1及其多肽片段在过敏性疾病诊断、鉴别诊断、病情程度判断、治疗效果评价、监测、预后评估及机理研究等制剂的应用。
背景技术
过敏性疾病又称变态反应性疾病，典型的过敏性疾病包括过敏性鼻炎、支气管哮喘、变应性皮炎、湿疹、变应性结膜炎及过敏性休克等。据世界卫生组织统计，全球过敏人群数量庞大，约有三分之一的人曾遭受过过敏性疾病的侵害。近年来由于人们生活方式急剧变化、工业化程度显著提高以及大气污染的明显加重，过敏性疾病的发病率逐年上升，严重的过敏性疾病甚至危及生命，目前已成为全球公共卫生焦点问题。
目前临床上对于过敏性疾病的辅助检查主要包括皮肤点刺试验（skin pricktest, SPT）及血清sIgE检测等，但SPT试验患者较痛苦依从性差，易受药物影响，并且还可增加全身过敏症状发生的风险，不适于严重过敏体质及儿童与老年群体。sIgE检测也并非无创检测，常需患者反复抽血。为提高过敏性疾病患者的生活质量和依从性，减轻多次采血及点刺试验的痛苦，期望通过尿液蛋白或多肽研究，实现用无痛、方便、快捷、易重复的尿液检测辅助过敏性疾病的诊断，也为进一步尿液多肽检测试剂盒的研究奠定基础。
粘连蛋白-1（Nectin-1）存在于很多组织，例如内皮组织的粘附连接与神经系统化学性突触的粘附连接。粘连蛋白-1具有结合细胞粘附分子、相同蛋白质及碳水化合物等功能，参与铁离子的代谢、细胞粘附及免疫应答等多个生物过程。本研究过敏性疾病患者尿液粘连蛋白-1含量较健康人组出现表达下调，在尿液中含量降低。
与常用的临床血液样本相比，尿液可以完全无创、连续、大量收集；没有稳态调节，可累积更多种类、更大幅度的变化，机体的很多病理生理变化可能体现在尿液中。一些激素和细胞因子等分子量相对较小的蛋白多肽入血后，会很快被排泄进入尿液，这些蛋白和多肽在尿液中被检测到的概率比在血中大很多；尿液收集之前，尿中可能的蛋白降解过程已经完成，所以尿蛋白可在较长时间内保持稳定。为减轻过敏性疾病患者多次采血的痛苦，本实验在前期方法学摸索的基础上，期望通过尿液蛋白或多肽研究，实现用无痛、方便、快捷、易重复的尿液检测辅助过敏性疾病患者的诊断及病情监测，也为进一步尿液多肽检测试剂盒的研究奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种尿液粘连蛋白-1及其多肽片段在制备用于过敏性疾病诊断、鉴别诊断、病情程度判断、治疗效果评价、监测、预后评估及机理研究等制剂的应用。
优选地，所述尿液粘连蛋白-1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示(MARMGLAGAAGRWWGLALGL TAFFLPGVHS QVVQVNDSMY GFIGTDVVLH CSFANPLPSV KITQVTWQKS TNGSKQNVAIYNPSMGVSVL APYRERVEFL RPSFTDGTIR LSRLELEDEG VYICEFATFP TGNRESQLNL TVMAKPTNWIEGTQAVLRAK KGQDDKVLVA TCTSANGKPP SVVSWETRLK GEAEYQEIRN PNGTVTVISR YRLVPSREAHQQSLACIVNY HMDRFKESLT LNVQYEPEVT IEGFDGNWYL QRMDVKLTCK ADANPPATEY HWTTLNGSLPKGVEAQNRTL FFKGPINYSL AGTYICEATN PIGTRSGQVE VNITEFPYTP SPPEHGRRAG PVPTAIIGGVAGSILLVLIV VGGIVVALRR RRHTFKGDYS TKKHVYGNGY SKAGIPQHHP PMAQNLQYPD DSDDEKKAGPLGGSSYEEEE EEEEGGGGGE RKVGGPHPKY DEDAKRPYFT VDEAEARQDG YGDRTLGYQY DPEQLDLAENMVSQNDGSFI SKKEWYV）；或由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列衍生的，且与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。
优选地，所述制剂为过敏性疾病患者尿液粘连蛋白-1及其多肽片段检测试剂盒。
优选地，所述试剂盒包括抗原抗体反应的免疫方法及其试剂盒如能够特异性结合粘连蛋白-1及其多肽片段的适配体抗体或抗体片段中的一种或多种。
优选地，所述检测方法包括直接检测粘连蛋白-1及其多肽片段的质谱等方法及其相关试剂盒。
优选地，所述检测方法包括直接检测粘连蛋白-1及其多肽片段的相关核酸检测等方法及其相关试剂盒。
优选地，所述试剂盒还包括选自下组的成分：固相载体，稀释液，对照品，标准品，质控品，检测抗体，第二抗体、第二抗体稀释液，发光试剂，洗涤液、显色液、终止液中的任意一种或几种的组合。
优选地，所述标准品包括粘连蛋白-1标准品、人源化标签抗体标准品；较佳地，所述质控品包括：粘连蛋白-1质控品、人源化标签抗体质控品；较佳地，所述固相载体包括：微粒、微球、玻片、试纸条、塑料珠、液相芯片、微孔板或亲和膜等以及同等功能的其他载体。
优选地，所述固相载体的材质为聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺、纤维素中的任意一种及具有类似功能的载体。
发明人首先收集了健康人、过敏性疾病患者的尿液标本，4000r/min离心5min后，吸取上清，采用Bradford法测定提取的蛋白浓度，进行SDS-PAGE酶解。尿液样本的Label-free质谱分析由OrbitrapFusion型质谱完成。将过敏性疾病组和正常对照组在质谱中得到的数据进行定量计算。以蛋白表达量差异在1.5倍以上且经统计检验P<0.05作为参考标准筛选差异性多肽。然后发明人对具有统计学意义的差异性多肽进行鉴定，利用数据库检索得到差异蛋白粘连蛋白-1。
本发明通过研究证实与健康人相比，粘连蛋白-1及其多肽片段在过敏性疾病患者的尿液中呈低表达，与临床诊断有较好的一致性。从而提出检测尿液粘连蛋白-1及其多肽片段可用于过敏性疾病的辅助诊断或病情监测。
本发明发挥尿液标本获取无创、可大规模重复取样、保存方便的优势，利用尿液标本检测尿液粘连蛋白-1及其多肽片段。
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。
附图说明
图1是尿液粘连蛋白-1及其多肽片段在过敏性疾病组及健康对照组中含量图。
具体实施方式
实施例1 尿液标本的收集与处理
选取过敏性疾病患者作为过敏性疾病组，选取同期健康体检者作为正常对照组。收集各组研究对象入院后的新鲜晨尿样本30ml，不能正常排尿者收集其早晨导尿管中尿液，置于干燥、洁净的容器内。将收集的尿液标本4000r/min离心5min后，吸取上清，每管2ml分装，-80℃冰箱保存。
实施例2 质谱分析和尿液多肽的筛选
对尿液样品蛋白提取，并对提取的蛋白浓度进行测定。尿液样本的质谱分析由OrbitrapFusion型质谱完成。将实验组和正常对照组在质谱中得到的数据进行定量计算。组间比较采用t-test进行差异分析，以蛋白表达量差异在1.5倍以上且经统计检验P<0.05作为参考标准筛选差异表达蛋白。
实施例3 差异多肽的鉴定及分析
使用的数据库为Uniprot_Homo数据库，产生的质谱原始文件采用MaxQuant软件处理，检索参数设置见表1。
表1 Max Quant软件检索参数表
Figure DEST_PATH_IMAGE002
与健康人相比，粘连蛋白-1在过敏性疾病患者的尿液中低表达，其在健康对照组和过敏性疾病组尿液中的含量如图1所示，粘连蛋白-1在正常对照组和过敏性疾病组尿液中的表达具有显著性差异。
虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。
序列表
<110> 首都医科大学附属北京世纪坛医院
<120> 尿液粘连蛋白-1及其多态片段在过敏性疾病中的应用
<130> 1
<140> 20PNECTIN-1-CN
<141> 2020-09-24
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 517
<212> PRT
<213> Human Urine
<400> 1
Met Ala Arg Met Gly Leu Ala Gly Ala Ala Gly Arg Trp Trp Gly Leu
1 5 10 15
Ala Leu Gly Leu Thr Ala Phe Phe Leu Pro Gly Val His Ser Gln Val
20 25 30
Val Gln Val Asn Asp Ser Met Tyr Gly Phe Ile Gly Thr Asp Val Val
35 40 45
Leu His Cys Ser Phe Ala Asn Pro Leu Pro Ser Val Lys Ile Thr Gln
50 55 60
Val Thr Trp Gln Lys Ser Thr Asn Gly Ser Lys Gln Asn Val Ala Ile
65 70 75 80
Tyr Asn Pro Ser Met Gly Val Ser Val Leu Ala Pro Tyr Arg Glu Arg
85 90 95
Val Glu Phe Leu Arg Pro Ser Phe Thr Asp Gly Thr Ile Arg Leu Ser
100 105 110
Arg Leu Glu Leu Glu Asp Glu Gly Val Tyr Ile Cys Glu Phe Ala Thr
115 120 125
Phe Pro Thr Gly Asn Arg Glu Ser Gln Leu Asn Leu Thr Val Met Ala
130 135 140
Lys Pro Thr Asn Trp Ile Glu Gly Thr Gln Ala Val Leu Arg Ala Lys
145 150 155 160
Lys Gly Gln Asp Asp Lys Val Leu Val Ala Thr Cys Thr Ser Ala Asn
165 170 175
Gly Lys Pro Pro Ser Val Val Ser Trp Glu Thr Arg Leu Lys Gly Glu
180 185 190
Ala Glu Tyr Gln Glu Ile Arg Asn Pro Asn Gly Thr Val Thr Val Ile
195 200 205
Ser Arg Tyr Arg Leu Val Pro Ser Arg Glu Ala His Gln Gln Ser Leu
210 215 220
Ala Cys Ile Val Asn Tyr His Met Asp Arg Phe Lys Glu Ser Leu Thr
225 230 235 240
Leu Asn Val Gln Tyr Glu Pro Glu Val Thr Ile Glu Gly Phe Asp Gly
245 250 255
Asn Trp Tyr Leu Gln Arg Met Asp Val Lys Leu Thr Cys Lys Ala Asp
260 265 270
Ala Asn Pro Pro Ala Thr Glu Tyr His Trp Thr Thr Leu Asn Gly Ser
275 280 285
Leu Pro Lys Gly Val Glu Ala Gln Asn Arg Thr Leu Phe Phe Lys Gly
290 295 300
Pro Ile Asn Tyr Ser Leu Ala Gly Thr Tyr Ile Cys Glu Ala Thr Asn
305 310 315 320
Pro Ile Gly Thr Arg Ser Gly Gln Val Glu Val Asn Ile Thr Glu Phe
325 330 335
Pro Tyr Thr Pro Ser Pro Pro Glu His Gly Arg Arg Ala Gly Pro Val
340 345 350
Pro Thr Ala Ile Ile Gly Gly Val Ala Gly Ser Ile Leu Leu Val Leu
355 360 365
Ile Val Val Gly Gly Ile Val Val Ala Leu Arg Arg Arg Arg His Thr
370 375 380
Phe Lys Gly Asp Tyr Ser Thr Lys Lys His Val Tyr Gly Asn Gly Tyr
385 390 395 400
Ser Lys Ala Gly Ile Pro Gln His His Pro Pro Met Ala Gln Asn Leu
405 410 415
Gln Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Asp Glu Lys Lys Ala Gly Pro Leu Gly
420 425 430
Gly Ser Ser Tyr Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Gly Gly Gly
435 440 445
Gly Glu Arg Lys Val Gly Gly Pro His Pro Lys Tyr Asp Glu Asp Ala
450 455 460
Lys Arg Pro Tyr Phe Thr Val Asp Glu Ala Glu Ala Arg Gln Asp Gly
465 470 475 480
Tyr Gly Asp Arg Thr Leu Gly Tyr Gln Tyr Asp Pro Glu Gln Leu Asp
485 490 495
Leu Ala Glu Asn Met Val Ser Gln Asn Asp Gly Ser Phe Ile Ser Lys
500 505 510
Lys Glu Trp Tyr Val
515

Claims (9)

1.尿液粘连蛋白-1及其多肽片段在制备用于过敏性疾病诊断、鉴别诊断、病情程度判断、治疗效果评价、监测、预后评估及机理研究等制剂的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述尿液粘连蛋白-1的氨基酸序列如SEQID NO.1所示；或由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列衍生的，且与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述制剂为过敏性疾病患者尿液粘连蛋白-1及其多肽片段检测试剂盒。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括抗原抗体反应的免疫方法及其试剂盒如能够特异性结合粘连蛋白-1及其多肽片段的适配体抗体或抗体片段中的一种或多种。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述检测方法包括直接检测粘连蛋白-1及其多肽片段的质谱等方法及其相关试剂盒。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述检测方法包括直接检测粘连蛋白-1及其多肽片段或其相关核酸检测等方法及其相关试剂盒。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括选自下组的成分：固相载体，稀释液，对照品，标准品，质控品，检测抗体，第二抗体、第二抗体稀释液，发光试剂，洗涤液、显色液、终止液中的任意一种或几种的组合。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述标准品包括粘连蛋白-1标准品、人源化标签抗体标准品；较佳地，所述质控品包括：粘连蛋白-1控品、人源化标签抗体质控品；较佳地，所述固相载体包括：微粒、微球、玻片、试纸条、塑料珠、液相芯片、微孔板或亲和膜等以及同等功能的其他载体。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述固相载体的材质为聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺、纤维素中的任意一种及具有类似功能的载体。
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