CN103383374A - 用于检测肝癌血清特征蛋白的指纹图谱模型及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及蛋白质指纹图谱检测技术领域，特别是一种用于检测肝癌血清特征蛋白的指纹图谱模型，从血清中筛选出4个上调蛋白和3个下调蛋白共7个岩藻糖基化异常糖蛋白作为特征蛋白质组，以该特征蛋白质组为组成，建立用于检测肝癌血清特征蛋白的指纹图谱模型；4个上调蛋白分别为：分子量为9290.06道尔顿，分子量为2660.24道尔顿，分子量为2764.18道尔顿，分子量为1862.71道尔顿；3个下调蛋白分别为：分子量为4282.99道尔顿，分子量为3963.52道尔顿，分子量为6023.31道尔顿。该模型为肝癌的早期诊断提供了新的方法，并为进一步发现新的肿瘤标记物提供了基础，有利于提高肝癌诊断的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质指纹图谱检测技术领域，特别是一种用于检测肝癌血清特征蛋白的指纹图谱模型及其制备方法。
背景技术
我国是乙型肝炎病毒（HBV）高感染的国家之一。由HBV 导致的肝癌死亡率高，手术治疗后5年生存率较低。显著提高治疗效果的有效手段是早期诊断。目前常用的肝癌实验初检方法是血清AFP含量测定，但是其灵敏度和特异性都不高。研究发现，肝癌血清AFP蛋白发生高度岩藻糖基化，并且特异性高。检测这部分AFP（AFP-L3）可以大大提高肝癌诊断水平。但是，鉴于约有一半肝癌患者血清AFP值为阴性，使其临床应用受到限制。
研究者发现，肝癌中糖蛋白的异常岩藻糖基化可能不仅仅限于AFP，血清转铁蛋白、高尔基蛋白73等在肝癌中也发生了岩藻糖基化变化，说明肝癌血清中可能存在着许多岩藻糖基化异常的蛋白，而这些蛋白可能作为新的肝癌诊断标志物。因此，进一步筛选、鉴定这些糖蛋白，并发现新的肝癌标志物和治疗靶标是当前肝癌临床现状的迫切需要。目前肝癌早期诊断水平亟待提高的主要原因是通常只依靠一两个实验指标，而包括AFP在内的现有指标的特异性和灵敏度都不能完全满足临床需要。如果能同时分析比对一组肝癌相关蛋白或糖基化异常糖蛋白，则能大大提高诊断水平。
双向电泳技术虽能同时检测一组蛋白，但因其无法检测低丰度和小分子量的蛋白以及操作繁琐使其无法应用于临床。近十年来美国赛弗吉生物系统公司（Ciphergen Biosystem Inc.）提供的表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱技术（Surface enhanced laser desorption/ ionization time of flight mass spectrometry, SELDI-TOF-MS）可以同时对样本中的一组蛋白进行检测分析，已有用于肿瘤标记物的筛查和临床检测的报道，但是其检测同一标本重复性不稳定的问题使其遭受众多科研和医务工作者的质疑。而德国布鲁克·道尔顿公司（Bruker Daltonics Inc.）与美国哈佛大学医学院、美国休斯敦贝勒医学院利用飞行时间质谱技术（MALDI-TOF-MS）共同开发研究的液体蛋白芯片指纹图谱解决方案(CLINPORT系统)解决了SELDI-TOF-MS技术重复性不好稳定性不高的缺陷。该系统具有诸多优势：（1）多种不同表面性质的磁珠可供选择；（2）重复性好；（3）样品需求量少；（4）灵敏度高，低丰度蛋白也可以检测到；（5）大规模，高通量，可以在短时间内快速全自动完成检测；（6）不仅可发现一种蛋白质或生物标记分子，而且可发现不同的多种方式的组合蛋白质模式，并能直接用于临床检测。新近已有将CLINPROT技术应用于肿瘤研究的报道，如鼻咽癌、膀胱癌、子宫颈癌、头颈鳞癌和胰腺癌等。但是根据糖蛋白质组学原理应用CLINPROT技术建立肝癌血清岩藻糖基化异常糖蛋白质组指纹图谱模型迄今国内外均未见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种用于检测肝癌血清特征蛋白的指纹图谱模型及其制备方法，该模型为肝癌的早期诊断提供了新的方法，并为进一步发现新的肿瘤标记物提供了基础，有利于提高肝癌诊断的准确性。
本发明的目的是采用如下技术方案实现的：一种用于检测肝癌血清特征蛋白的指纹图谱模型，从血清中筛选出4个上调蛋白和3个下调蛋白共7个岩藻糖基化异常糖蛋白作为特征蛋白质组，以所述特征蛋白质组为组成，建立用于检测肝癌血清特征蛋白的指纹图谱模型；所述4个上调蛋白分别为：分子量为9290.06道尔顿，分子量为2660.24道尔顿，分子量为2764.18道尔顿，分子量为1862.71道尔顿；所述3个下调蛋白分别为：分子量为4282.99道尔顿，分子量为3963.52道尔顿，分子量为6023.31道尔顿。
本发明还提供了一种用于检测肝癌血清特征蛋白的指纹图谱模型的制备方法，包括以下步骤：
1）收集多例经病理和DNA检查明确诊断的原发性肝癌患者血清作为肝癌组的血清标本；已确诊的肝硬化患者的血清，已确诊的肝炎患者的血清以及经体检确定为健康者的血清作为非肝癌组的血清标本，进行低温冷冻备用；
2）采用可以特异吸附岩藻糖基化异常糖蛋白的MB-LAC LCA磁珠对上述肝癌组及非肝癌组的血清标本的糖蛋白进行吸附，随后将特异吸附的糖蛋白洗脱下来备用；
3）将上述步骤中洗脱下来的两组血清标本中特异吸附的糖蛋白在专用芯片上进行读取，获得两组蛋白指纹图谱；
4）对所述两组蛋白指纹图谱进行标准化处理，并收集数据；
5）对所得数据进行统计学处理，对每个蛋白质荷比峰做T检验和Wilconxon秩和检验，找出肝癌组的血清标本和非肝癌组的血清标本之间的差异蛋白峰，通过遗传运算选出4个上调蛋白分别为：分子量为9290.06道尔顿，分子量为2660.24道尔顿，分子量为2764.18道尔顿，分子量1862.71道尔顿，以及3个下调蛋白分别为：分子量为4282.99道尔顿，分子量为3963.52道尔顿，分子量为6023.31道尔顿，利用这7个岩藻糖基化异常糖蛋白建立用于检测肝癌血清岩藻糖基化异常糖蛋白质组指纹图谱模型；
6）采用所述用于检测肝癌血清岩藻糖基化异常糖蛋白质组指纹图谱模型进行肝癌的检测和筛查。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
1、本发明为肝癌早期检测和筛查提供了新方法和新途径，并为进一步发现新的肝癌标记物提供了基础；
2、本发明应用基于凝集素磁珠的CLINPROT系统建立肝癌特征性血清岩藻糖基化异常糖蛋白质组指纹图谱模型，在国内外均未见报道，具有技术的前瞻性。该模型可同时对一组肝癌相关糖基化异常糖蛋白进行分析比对，诊断的灵敏度和特异性必然高于目前以单一标志物为标准或者少数几个标志物联合检测的诊断方法，对肝癌的早期诊断提供了新标准；
3、本发明所选用的研究人群为肝癌患者和非肝癌人群，较目前已见的其他诊断肝癌的蛋白质指纹图谱模型只选用肝癌患者和健康人作为研究对象，所包含的人群范围更全面，使得所建立的诊断模型能适用所有人群；
4、本发明应用CLINPROT系统建立肝癌特征性血清岩藻糖基化异常糖蛋白质组指纹图谱模型较之目前已有的应用SELDI-TOF-MS技术建立的肝癌诊断模型，克服了其重复性差稳定性低等缺点；
5、本发明模型的构建方法设计合理可行，为降低我国肝癌的病死率、提高肝癌的临床治愈率提供了一种新的筛查方法。
6、利用本发明用双盲法分析了96份血清标本(其中有乙型肝炎病毒相关的原发性肝癌患者，乙型肝炎病毒导致的肝硬化患者，慢性乙型肝炎患者和健康志愿者)，结果显示，阳性检出率(敏感性)达74.07%，特异性为76.81%。因此，本发明可实现肝癌的早期预警、早期发现。
附图说明
图1是本发明用于检测肝癌血清特征蛋白的指纹图谱模型的制备方法的流程图。
具体实施方式
本发明用于检测肝癌血清特征蛋白的指纹图谱模型，从血清中筛选出4个上调蛋白（指在肝癌组血清中含量高于非肝癌组血清中含量）和3个下调蛋白（指在肝癌组血清中含量低于非肝癌组血清中含量）共7个岩藻糖基化异常糖蛋白作为特征蛋白质组，以所述特征蛋白质组为组成，建立用于检测肝癌血清特征蛋白的指纹图谱模型；所述4个上调蛋白分别为：分子量为9290.06道尔顿，分子量为2660.24道尔顿，分子量为2764.18道尔顿，分子量为1862.71道尔顿；所述3个下调蛋白分别为：分子量为4282.99道尔顿，分子量为3963.52道尔顿，分子量为6023.31道尔顿。
本发明用于检测肝癌血清特征蛋白的指纹图谱模型的制备方法，包括以下步骤：
1）收集多例经病理和DNA检查明确诊断的与乙型肝炎病毒相关的原发性肝癌患者血清作为肝癌组的血清标本；已确诊的乙型肝炎病毒导致的肝硬化患者的血清，已确诊的不伴肝硬化的慢性乙型肝炎患者的血清以及经体检确定为健康者的血清作为非肝癌组的血清标本，进行低温冷冻备用。
2）采用可以特异吸附岩藻糖基化异常糖蛋白的MB-LAC LCA磁珠对上述肝癌组及非肝癌组的血清标本的糖蛋白进行吸附，随后将特异吸附的糖蛋白洗脱下来备用。吸附方法和洗脱方法为常规通用方法，具体步骤如下：
从4℃冰箱中取出 MB-LAC LCA磁珠悬浮液一管小心吸打，使磁珠完全、均匀的悬浮于液相中；将200 μl样品管置于孔板上，加入2 μl磁珠(MB)和100 μl磁珠清洗缓冲液（WB1），将样品管转移到磁架上，使磁珠贴壁20 s，磁珠与液体分离，待液体澄清后，吸净液体；用加样枪吸取上清液；重复1次，保证悬浮液完全被吸走；将样品管放到孔板上，加入20 μl磁珠结合液（BB）和10 μl血清样品，混匀；室温放置1 h，间歇混匀；而后将样品管放到磁架上，静置20 s，磁珠贴壁，与悬浮的液体分离，小心吸走上清液后在孔板上加100 μl磁珠清洗液（WB1）,而后将样品管在磁架上，静置20 s磁珠完全贴壁，小心吸走上清液；再把样品管放到孔板上，加入100 μl磁珠清洗缓冲液（WB2），放到磁架上，静置20 s，磁珠完全贴壁，小心吸走上清液；重复1次，保证悬浮液完全被吸走；将样品管放到孔板上，加10 μl磁珠洗脱缓冲液（EB），室温静置25 min，间歇混匀；最后将样品管放到磁架上，静置30 s使磁珠完全贴壁，将上清液移到干净的管中；取上清液质谱检测或者进行另外的处理。
3）将上述洗脱下来的样品洗脱液取1μl与5 μl的0.4 mg/ml HCCA基质混合均匀后，取1 μl上述混合液体点在专用芯片上，晾干后采用蛋白飞行时间质谱仪（Bruker Daltonic公司生产，型号autoflexTMⅡ）进行读取，设定采集范围为1kD-10kD ，激光波长337 nm，强度50 Hz，检测敏感度为8-10，采集200 shots的数据获得两组蛋白指纹图谱。
4）采用分析软件flexAnalysisTM(Bruker Daltonics, Germany)对所有两组血清标本的蛋白指纹图谱进行标准化处理，并收集数据。
5）采用分析软件CLINPROTTM software (Bruker Daltonics, Germany)对所得数据进行统计学处理，对每个蛋白质荷比峰做T检验和Wilconxon秩和检验，寻找出肝癌组和非肝癌组血清之间的差异蛋白峰（认定P <0.001 时具有统计学意义，共得到60 个蛋白峰），通过遗传运算选出7个岩藻糖基化异常糖蛋白，建立用于检测肝癌血清岩藻糖基化异常糖蛋白质组指纹图谱模型，其中包括4个差异蛋白稳定上调，即在肝癌组血清中高表达：分子量为9290.06道尔顿，分子量为2660.24道尔顿，分子量为2764.18道尔顿，分子量1862.71道尔顿；以及3个差异蛋白稳定下调，即在肝癌组血清中低表达：分子量为4282.99道尔顿，分子量为3963.52道尔顿，分子量为6023.31道尔顿。如下表1所示：
6) 采用上述通过遗传运算建立的由7个特征蛋白组成的用于检测肝癌血清岩藻糖基化异常糖蛋白质组指纹图谱模型进行肝癌的检测和筛查。对96份血清标本（其中有乙型肝炎病毒相关的原发性肝癌患者，乙型肝炎病毒导致的肝硬化患者，慢性乙型肝炎患者和健康志愿者）进行双盲法分析，最终的分析结果如下表2所示：
利用本发明的用于检测肝癌血清岩藻糖基化异常糖蛋白质组指纹图谱模型检测肝癌血清的实施例说明如下：
实施例1：
抽取待测患者静脉血2ml，不抗凝。室温放置30 min 至1h. 于室温2500 转/min 离心5 min，取血清等量分装后 -80℃ 冰箱中冻存。实验时，从 -80℃ 冰箱中取出标本，冰中融化后备用。从 4℃ 冰箱中取出 MB-LAC LCA磁珠悬浮液一管小心吸打，使磁珠完全、均匀的悬浮于液相中；将200 μl样品管置于孔板上，加入2 μl磁珠(MB)和100 μl磁珠清洗缓冲液（WB1），将样品管转移到磁架上，使磁珠贴壁20 s，磁珠与液体分离，待液体澄清后，吸净液体；用加样枪吸取上清液；重复1次，保证悬浮液完全被吸走；将样品管放到孔板上，加入20 μl磁珠结合液（BB）和10 μl待测患者血清样品，混匀；室温放置1 h，间歇混匀；而后将样品管放到磁架上，静置20 s，磁珠贴壁，与悬浮的液体分离，小心吸走上清液后在孔板上加100 μl磁珠清洗液（WB1）,而后将样品管在磁架上，静置20 s磁珠完全贴壁，小心吸走上清液；再把样品管放到孔板上，加入100 μl磁珠清洗缓冲液（WB2），放到磁架上，静置20 s，磁珠完全贴壁，小心吸走上清液；重复1次，保证悬浮液完全被吸走；将样品管放到孔板上，加10 μl磁珠洗脱缓冲液（EB），室温静置25 min，间歇混匀；最后将样品管放到磁架上，静置30 s使磁珠完全贴壁，将上清液移到干净的管中；然后将上述洗脱下来的样品洗脱液取1μl与5 μl的0.4 mg/ml HCCA基质混合均匀后取1 μl上述混合液体点在专用芯片上，晾干后采用蛋白飞行时间质谱仪（Bruker Daltonic公司生产，型号autoflexTMⅡ）进行读取，设定采集范围为1kD-10kD ，激光波长337 nm，强度50 Hz，检测敏感度为8-10，采集200 shots的数据获得蛋白质图谱。采用分析软件flexAnalysisTM (Bruker Daltonics, Germany)对获得的蛋白质指纹图谱进行分析，首先对图谱进行预处理，应用Top Hat Baseline 基线处理和Savitsky Golay Smoothing平滑处理，过滤信噪比小于5的蛋白峰，并进行校正和TIC(总离子流)归一化，蛋白峰量化指标选用峰面积。然后将其蛋白峰面积与已建立的由7个特征蛋白组成的检测肝癌血清岩藻糖基化异常糖蛋白质组指纹图谱模型的蛋白峰面积标准差进行比较，判断其为肝癌患者。
实施例2：
抽取待测患者静脉血2ml，不抗凝。室温放置30 min 至1h. 于室温2500 转/min 离心5 min，取血清等量分装后 -80℃ 冰箱中冻存。实验时，从 -80℃ 冰箱中取出标本，冰中融化后备用。从 4℃ 冰箱中取出 MB-LAC LCA磁珠悬浮液一管小心吸打，使磁珠完全、均匀的悬浮于液相中；将200 μl样品管置于孔板上，加入2 μl磁珠(MB)和100 μl磁珠清洗缓冲液（WB1），将样品管转移到磁架上，使磁珠贴壁20 s，磁珠与液体分离，待液体澄清后，吸净液体；用加样枪吸取上清液；重复1次，保证悬浮液完全被吸走；将样品管放到孔板上，加入20 μl磁珠结合液（BB）和10 μl待测患者血清样品，混匀；室温放置1 h，间歇混匀；而后将样品管放到磁架上，静置20 s，磁珠贴壁，与悬浮的液体分离，小心吸走上清液后在孔板上加100 μl磁珠清洗液（WB1）,而后将样品管在磁架上，静置20 s磁珠完全贴壁，小心吸走上清液；再把样品管放到孔板上，加入100 μl磁珠清洗缓冲液（WB2），放到磁架上，静置20 s，磁珠完全贴壁，小心吸走上清液；重复1次，保证悬浮液完全被吸走；将样品管放到孔板上，加10 μl磁珠洗脱缓冲液（EB），室温静置25 min，间歇混匀；最后将样品管放到磁架上，静置30 s使磁珠完全贴壁，将上清液移到干净的管中；然后将上述洗脱下来的样品洗脱液取1μl与5 μl的0.4 mg/ml HCCA基质混合均匀后取1 μl上述混合液体点在专用芯片上，晾干后采用蛋白飞行时间质谱仪（Bruker Daltonic公司生产，型号autoflexTMⅡ）进行读取，设定采集范围为1kD-10kD ，激光波长337 nm，强度50 Hz，检测敏感度为8-10，采集200 shots的数据获得蛋白质图谱。采用分析软件flexAnalysisTM (Bruker Daltonics, Germany)对获得的蛋白质指纹图谱进行分析，首先对图谱进行预处理，应用Top Hat Baseline 基线处理和Savitsky Golay Smoothing平滑处理，过滤信噪比小于5的蛋白峰，并进行校正和TIC(总离子流)归一化，蛋白峰量化指标选用峰面积。然后将其蛋白峰面积与已建立的由7个特征蛋白组成的检测肝癌血清岩藻糖基化异常糖蛋白质组指纹图谱模型的蛋白峰面积标准差进行比较，判断其为非肝癌患者。
实施例3：
抽取待测患者静脉血2ml，不抗凝。室温放置30min 至1h. 于室温2500 转/min 离心5 min，取血清等量分装后 -80℃ 冰箱中冻存。实验时，从 -80℃ 冰箱中取出标本，冰中融化后备用。从 4℃ 冰箱中取出 MB-LAC LCA磁珠悬浮液一管小心吸打，使磁珠完全、均匀的悬浮于液相中；将200 μl样品管置于孔板上，加入2 μl磁珠(MB)和100 μl磁珠清洗缓冲液（WB1），将样品管转移到磁架上，使磁珠贴壁20 s，磁珠与液体分离，待液体澄清后，吸净液体；用加样枪吸取上清液；重复1次，保证悬浮液完全被吸走；将样品管放到孔板上，加入20 μl磁珠结合液（BB）和10 μl待测患者血清样品，混匀；室温放置1 h，间歇混匀；而后将样品管放到磁架上，静置20 s，磁珠贴壁，与悬浮的液体分离，小心吸走上清液后在孔板上加100 μl磁珠清洗液（WB1）,而后将样品管在磁架上，静置20 s磁珠完全贴壁，小心吸走上清液；再把样品管放到孔板上，加入100 μl磁珠清洗缓冲液（WB2），放到磁架上，静置20 s，磁珠完全贴壁，小心吸走上清液；重复1次，保证悬浮液完全被吸走；将样品管放到孔板上，加10 μl磁珠洗脱缓冲液（EB），室温静置25 min，间歇混匀；最后将样品管放到磁架上，静置30 s使磁珠完全贴壁，将上清液移到干净的管中；然后将上述洗脱下来的样品洗脱液取1μl与5 μl的0.4 mg/ml HCCA基质混合均匀后取1 μl上述混合液体点在专用芯片上，晾干后采用蛋白飞行时间质谱仪（Bruker Daltonic公司生产，型号autoflexTMⅡ）进行读取，设定采集范围为1kD-10kD ，激光波长337 nm，强度50 Hz，检测敏感度为8-10，采集200 shots的数据获得蛋白质图谱。采用分析软件flexAnalysisTM (Bruker Daltonics, Germany)对获得的蛋白质指纹图谱进行分析，首先对图谱进行预处理，应用Top Hat Baseline 基线处理和Savitsky Golay Smoothing平滑处理，过滤信噪比小于5的蛋白峰，并进行校正和TIC(总离子流)归一化，蛋白峰量化指标选用峰面积。然后将其蛋白峰面积与已建立的由7个特征蛋白组成的检测肝癌血清岩藻糖基化异常糖蛋白质组指纹图谱模型的蛋白峰面积标准差进行比较，判断其为肝癌患者。
以上是本发明的较佳实施例，凡依本发明技术方案所作的改变，所产生的功能作用未超出本发明技术方案的范围时，均属于本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种用于检测肝癌血清特征蛋白的指纹图谱模型，其特征在于：从血清中筛选出4个上调蛋白和3个下调蛋白共7个岩藻糖基化异常糖蛋白作为特征蛋白质组，以所述特征蛋白质组为组成，建立用于检测肝癌血清特征蛋白的指纹图谱模型；所述4个上调蛋白分别为：分子量为9290.06道尔顿，分子量为2660.24道尔顿，分子量为2764.18道尔顿，分子量为1862.71道尔顿；所述3个下调蛋白分别为：分子量为4282.99道尔顿，分子量为3963.52道尔顿，分子量为6023.31道尔顿。
2.一种用于检测肝癌血清特征蛋白的指纹图谱模型的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）收集多例经病理和DNA检查明确诊断的原发性肝癌患者血清作为肝癌组的血清标本；已确诊的肝硬化患者的血清，已确诊的肝炎患者的血清以及经体检确定为健康者的血清作为非肝癌组的血清标本，进行低温冷冻备用；
2）采用可以特异吸附岩藻糖基化异常糖蛋白的MB-LAC LCA磁珠对上述肝癌组及非肝癌组的血清标本的糖蛋白进行吸附，随后将特异吸附的糖蛋白洗脱下来备用；
3）将上述步骤中洗脱下来的两组糖蛋白在专用芯片上进行读取，获得两组蛋白指纹图谱；
4）对所述两组蛋白指纹图谱进行标准化处理，并收集数据；
5）对所得数据进行统计学处理，对每个蛋白质荷比峰做T检验和Wilconxon秩和检验，找出肝癌组的血清标本和非肝癌组的血清标本之间的差异蛋白峰，通过遗传运算选出4个上调蛋白分别为：分子量为9290.06道尔顿，分子量为2660.24道尔顿，分子量为2764.18道尔顿，分子量1862.71道尔顿，以及3个下调蛋白分别为：分子量为4282.99道尔顿，分子量为3963.52道尔顿，分子量为6023.31道尔顿，利用这7个岩藻糖基化异常糖蛋白建立用于检测肝癌血清岩藻糖基化异常糖蛋白质组指纹图谱模型。
3.根据权利要求2所述的用于检测肝癌血清特征蛋白的指纹图谱模型的制备方法，其特征在于：采用所述用于检测肝癌血清岩藻糖基化异常糖蛋白质组指纹图谱模型进行肝癌的检测和筛查。
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