CN102633882B - 蛋白质复合物及其在肿瘤诊断和/或预后评估中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及蛋白质复合物及其在肿瘤诊断和/或预后评估中的应用。具体而言,本发明涉及一种蛋白质复合物、用于制备诊断和/或预后评估哺乳动物包括人癌症的试剂的蛋白质复合物、诊断哺乳动物包括人癌症的方法。本发明利用积累的资料总结出了人类血清或血浆在非变性PAGE电泳上蛋白质复合物的主要类型及主要蛋白质复合物的组成并建立了蛋白质复合物含量与肿瘤间的关系,为肿瘤及其它慢性疾病的诊断和/或预后评估提供一种新的方法。

Description

蛋白质复合物及其在肿瘤诊断和/或预后评估中的应用
技术领域
本发明提供了蛋白质复合物,还提供了所述蛋白质复合物在制备用于诊断和/或预后评估癌症的试剂中的用途,及利用所述蛋白质复合物的相关信息诊断和/或预后评估哺乳动物包括人的癌症的方法。本发明通过分析血清中蛋白质复合物的存在形式和定量分析,可以对肺癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌和甲状腺癌等及其它慢性疾病进行辅助诊断和/或预后评估。
背景技术
目前使用的癌症标志物主要指癌细胞分泌或脱落到体液或组织中的物质,或是宿主对体内新生物反应而产生并进入到体液或组织中的物质。临床上常用的癌症标志物有:前列腺特异性抗原(PSA,可辅助诊断前列腺癌);甲胎蛋白(AFP,可辅助诊断急慢性肝炎、原发性肝癌等);癌胚抗原(CEA,在结肠癌、胰腺癌、胃癌、肺癌和乳腺癌中有较高的表达);糖蛋白抗原CA125(可辅助诊断卵巢癌);CA19-9(在胰腺癌、结肠癌、肝癌、胃癌、胆囊癌、肺癌和乳腺癌等中均有高表达);鳞状细胞相关抗原(SCC,可辅助诊断鳞状上皮癌);细胞角蛋白19(与CEA联合应用可辅助诊断肺癌)。这些标志物都是单一肽链蛋白,其检测方法是利用免疫发光法检测,其操作复杂,费用较高,敏感性或特异性不高(Sturgeon,C.M.et al.Serumtumour markers:how to order and interpret them.BMJ.2009,339:852-858.Hartwell,L.et al.Cancer biomarkers:a systems approach.Nat Biotechnol.2006,24(8):905-908.)。这些标志物有的不存在于正常人体内,有的在癌症病人体内含量超过健康人体内含量。通过测定其存在或含量可辅助诊断肿瘤、分析病程、指导治疗、监测复发或转移、判断预后。一般认为好的癌症标志物应具有下列特点:(1)敏感性高,能早期测出癌症患者;(2)特异性好;(3)有器官特异性,能对癌症定位;(4)血清中浓度与瘤体大小、临床分期相关,可用以判断预后;(5)半衰期短,能反映癌症的动态变化,监测治疗效果、复发和转移;(6)测定方法准确性高,操作简便,价廉。但至今为止,还没有发现这类癌症标志物。
蛋白质复合物(protein complex)是指具有两个或两个以上多肽链非共价键相互作用所形成的复合物。一般蛋白质复合物可分为结构型蛋白质复合物和功能型蛋白质复合物。蛋白质复合物在多种生物学过程中发挥着重要作用。这种相互作用存在于机体细胞的生命活动过程中,参与代谢、物质转移、信息传递等,不同的蛋白质复合物具有不同的生物学功能(Babusiak,M.,et al.Native proteomic analysis of protein complexes in murine intestinalbrush border membranes.Proteomics.2007,7(1):121-129.)。血液中蛋白质复合物在调节凝血过程、疾病发生过程中发挥着重要的生物学功能,例如甲胎蛋白-IgM的复合物在原发性肝细胞癌患者血清中含量升高,利用免疫学方法检测此复合物可诊断原发性肝细胞癌,其灵敏性和特异性优于单独使用甲胎蛋白(Jingting,J.,et al.Clinical evaluation of serumalpha-fetoprotein-IgM immune complexes on the diagnosis of primary hepatocellular carcinoma.JClin Lab Anal.2009,23(4):213-218.)。
因此,如果能发现新的可用于诊断恶性疾病,特别是肿瘤的蛋白质复合物及利用所述蛋白质复合物简便地诊断和/或辅助诊断或预后评估恶性疾病,特别是肿瘤的方法将具有重要的经济、健康和社会效益。
发明内容
因此,本发明的技术目的在于发现新的蛋白质复合物及其在慢性疾病,特别是肿瘤诊断和/或预后评估中的用途。
因此,本发明的第一方面涉及一种蛋白质复合物,其具有通式I:
[(HPT)n1(CFH)n2(C3)n3(C4A)n4(C5)n5(C7)n6(IgG1)n7(ApoA-I)n8(IgA1)n9],
其中,HPT代表触珠蛋白,Apo A-I代表载脂蛋白A-I,CFH代表补体H,C3代表补体3,C4A代表补体4A,C5代表补体5,C7代表补体7,IgG1代表免疫球蛋白G1,IgA1代表免疫球蛋白A1;
其中,n1=1、2、3、4或5,n2=0或1,n3=0或1,n4=0或1,n5=0或1,n6=0或1,n7=0、1、2、3、4或5,n8=0或1,n9=0或1;
且其中该蛋白质复合物的分子量范围为140~1400kDa。
优选地,所述蛋白质复合物具有选自通式II至VII的通式,其中:
通式II:
[(HPT)n1(CFH)n2(C3)n3(C4A)n4(IgG1)n7(IgA1)n9],其中n1=1、2或3,n2=1,n3=1,n4=1,n7=1,n9=1;
通式III:
[(HPT)n1(C3)n3(C4A)n4(IgG1)n7(Apo A-I)n8(IgA1)n9],其中n1=1、2或3,n3=1,n4=1,n7=1,n8=1,n9=1;
通式IV:
[(HPT)n1(C3)n3(C4A)n4(IgG1)n7(IgA1)n9],其中n1=1、2或3,n3=1,n4=1,n7=1,n9=1;
通式V:
[(HPT)n1(C3)n3(C4A)n4(C5)n5(C7)n6(IgG1)n7(IgA1)n9],其中n1=1、2或3,n3=1,n4=1,n5=1,n6=1,n7=1,n9=1;
通式VI:
[(HPT)n1(C3)n3(Apo A-I)n8(IgA1)n9],其中n1=1、2或3,n3=1,n8=1,n9=1或
通式VII:
[(HPT)n1(CFH)n2(C3)n3(IgG1)n7(IgA1)n9],其中n1=1、2、3、4或5,n2=1,n3=1,n7=1、2、3、4或5,n9=1。
本发明的第二方面涉及上述的蛋白质复合物,其用于制备诊断和/或预后评估哺乳动物包括人癌症的试剂,优选地,所述癌症选自肺癌、结直肠癌、胰腺癌、胃癌或甲状腺癌。
本发明的第三方面涉及上述的蛋白质复合物在制备诊断和/或预后评估哺乳动物包括人癌症的试剂中的用途,优选地,所述癌症选自肺癌、结直肠癌、胰腺癌、胃癌或甲状腺癌。
本发明的第四方面涉及一种诊断和/或预后评估哺乳动物包括人癌症的方法,其包括以下步骤:
A)获取患者或健康状况未知的哺乳动物包括人血液,经离心后得到血清或血浆,作为样本;
B)分别取0.5~100μL样本和等体积的0.5~100μL外参照血清,进行native-PAGE电泳,所述外参照血清为混合的健康人血清,其中native-PAGE电泳的条件按本领域的常规条件进行,分离胶的浓度为4%-10%质量体积比;
C)电泳完毕后,用本领域已知的凝胶染色方法将凝胶染色,然后扫描凝胶,获得凝胶电泳图,优选地,所述凝胶染色方法为银染或考马斯亮蓝染色;
D)根据上述步骤C)电泳图中的凝胶条带,对照说明书附图1中的条带类型,将样本血清归类,其中标记凝胶条带时按条带分子量从大到小的顺序从1开始进行;
E)利用Quantity One软件分析上述步骤C)凝胶电泳图中样本和对照的目标条带,以代表转铁蛋白相关复合物的第19个凝胶条带为内参照,将其含量归一化,利用软件,输出归一化后每个凝胶条带的光密度值,记为NQn,其中n为凝胶条带的标记;
F)利用下面的公式依次计算样本中每个凝胶条带的相对表达量,记为ratio,
ration=[NQn]样本/[NQn]外参照,其中n为凝胶条带的标记;
G)根据上述步骤D)中样本血清的类型,选择相应的相对表达量值带入到回归方程,计算分值,记为score,然后对比下表中癌症的阈值,判断样本是否为癌症或其它慢性疾病,
(表6ROC曲线分析结果)。
优选地,上述方法中的癌症选自肺癌、结直肠癌、胰腺癌、胃癌或甲状腺癌。
换言之,本发明通过对健康人群(control)和肺癌(lung cancer,LC)、结直肠癌(colorectalcancer,CC)、胰腺癌(pancreatic cancer,PC)、胃癌(stomach cancer,SC)和甲状腺癌(thyroid cancer,TC)患者血清中蛋白质复合物的研究,发现了与上述癌症相关的蛋白质复合物,利用质谱技术鉴定了该蛋白质复合物的组成成分。这些蛋白质成分包括补体系统成分、免疫球蛋白、急性期反应蛋白和载脂蛋白。它们形成的复合物存在形式及其含量变化可以描述肺癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌和甲状腺癌的发生。下面对该蛋白质复合物中所涉及的蛋白质及它们与疾病的关系进行简单的概述。
蛋白复合物包括:
补体系统相关蛋白质、免疫球蛋白、急性期反应蛋白和载脂蛋白
(1)该蛋白质复合物中包含的补体系统相关蛋白质:
1)补体C3(complement component 3,C3)是补体系统中含量最多、最重要的一个蛋白质。C3分子量约为195kDa,其基本结构是由115kDa的α链和70kDa的β链通过二硫键连接组成。在C3转化酶作用下,从C3α链裂解产生C3a(9kDa)和剩余的部分C3b。血清中C3的水平与多种疾病密切相关,如免疫复合物引起的肾炎、系统性红斑狼疮、肝炎、肝硬化、急性炎症、冠心病、肺癌(Heo SH,et al.Identification of putative serum glycoprotein biomarkers for human lungadenocarcinoma by multilectin affinity chromatography and LC-MS/MS.Proteomics.2007,7(23):4292-4302.)和结直肠癌(Qiu Y,et al.Plasma glycoprotein profiling for colorectal cancerbiomarker identification by lectin glycoarray and lectin blot.J Proteome Res.2008,7(4):1693-1703.)等。补体C3a在丙肝病毒引起的肝细胞癌病人血清中的含量显著高于对照组,但经过治疗后其水平会显著下调(Kanmura S,et al.The complement component C3a fragment isa potential biomarker for hepatitis C virus-related hepatocellular carcinoma.J Gastroenterol,2010,45(4):459-467.)。
2)补体H(complement factor H,CFH)是血液中仅次于C3的补体成分。CFH是一个单肽链糖蛋白,分子量约为155kDa,是H因子家族中最具特征性的蛋白质。CFH的C末端可与C3b结合,N末端含有补体调节区域,使C3转化酶降解,从而抑制旁路途径的补体活化(Miha′lyJo′zsi,et al.Factor H family proteins and human diseases.Cell.2008,380-387.)。CFH也是重要的先天免疫效应分子,具有区分激活和非激活细胞表面的能力。一些肿瘤细胞可分秘CFH,保护细胞免于补体介导的溶解,CFH可作为肿瘤分级、分期的指标和膀胱癌的诊断指标(AlvarezA,et al.Bladder cancer biomarkers:current developments and future implementation.Curr OpinUrol.2007,17(5):341-346.)。
3)补体C4(complement component 4,C4)是补体激活途径中的一个重要蛋白质。通过二硫键连接三条肽链(α链98kDa,β链73kDa,γ链33kDa)形成C4。C4由两个基因C4A和C4B所编码。因此血清中的C4分子有2种类型即C4A和C4B,二者具有高度同源性。血清中C4含量升高常见于多种传染病,如急性炎症、心肌梗塞和多发性骨髓瘤等;降低则常见于系统性红斑性狼疮、多发性硬化症、类风湿性关节炎和免疫复合物引起的肾病(Soto K,et al.FamilialC4B deficiency and immune complex glomerulonephritis.Clin Immunol.2010,137(1):166-175.)等。补体C3和C4可用于乳腺癌的预后评价(Michlmayr A,et al.Modulation of plasmacomplement by the initial dose of epirubicin/docetaxel therapy in breast cancer and its predictivevalue.British journal of Cancer.2010,103:1201-1208.)。
4)补体C5(complement component 5,C5)是形成膜攻击复合物的补体分子。由二硫键连接α和β链后形成C5,分子量约为190kDa,其中α链分子量约为115kDa,β链分子量约为75kDa。在C5转化酶的作用下,C5α链被剪切成C5a(11kDa)和C5b(105kDa),前者和C3a均为重要的炎症介质,C5b参与形成补体膜攻击复合物。血清中C5含量降低常见于系统性红斑狼疮、反复感染等。
5)补体C7(complement component 7,C7)是一单肽链糖蛋白,其分子量约为121kDa,C7有触发淋巴细胞母细胞化的作用,血清中C7含量降低常见于肾脏疾病、强直性脊柱炎和扩散性淋球菌感染等。
(2)该蛋白质复合物中包含的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig):Ig是一类具有抗体活性或化学结构上与抗体相似的球蛋白,是重要的免疫效应分子。因结构不同可分为IgG(immunoglobulin gamma)、IgA(immunoglobulin alpha)、IgM、IgD和IgE 5种。Ig分子的基本结构是由二硫键连接四条肽链后形成,即两条分子量较小的轻链(L链)和两条分子量较大的重链(H链)组成。L链分为2种类型κ和λ。
1)血清免疫球蛋白的主要成分是IgG,它占总免疫球蛋白的70-75%,分子量约为150kDa,含糖2~3%。IgG分子由4条肽链组成,包括两条分子量约为23kDa的L链,两条分子量约为50kDa(50~60kDa)的H链。人体IgG分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4等4种亚型。IgG是初级免疫应答中最持久、最重要的抗体,在抗感染过程中起到重要作用,它能够促进单核巨噬细胞的吞噬作用,中和细菌毒素的毒性及与病毒抗原结合使病毒失去感染宿主细胞的能力。IgG还具有调理吞噬和结合葡萄球菌A蛋白等作用。
2)IgA在正常人血清中的含量仅次于IgG,占血清免疫球蛋白总量的10%~20%。IgA分为IgA1和IgA2两种类型,每种类型均可形成二聚体或多聚体,在血清中IgA1是主要类型,约90%的以单体形式存在,单体的分子量约为160kDa。研究发现在IgA1型肾病、慢性肝脏疾病和骨髓瘤患者(Almogren,A.,et al.Irreversible aggregation of the Fc fragment derived frompolymeric but not monomeric serum IgA1--implications in IgA-mediated disease.Mol Immunol.2008,45(1):87-94.)中IgA1二聚体或多聚体的含量显著升高。
(3)该蛋白质复合物中包含的触珠蛋白(haptoglobin,HPT):HPT是一种在肝脏合成的酸性糖蛋白,属于急性反应期蛋白质。HPT由两条β链(重链)和两条α链(轻链)组成。β链的糖含量约20%,分子量约为45kDa;α链分为2种类型:α1(9kDa)和α2(16kDa)。根据α链类型的不同,HPT可分为3种类型:HP1-1(两条α1和两条β链)、HP2-2(两条α2和两条β链)、HP2-1(一条α1、一条α2和两条β链)。HPT主要功能是与游离血红蛋白质结合成稳定的复合物,阻止血红蛋白从肾小球滤过,避免游离血红蛋白对肾小管的损害。HPT还具有抗氧化、抗炎及免疫调节等功能。HPT血清含量在创伤、肿瘤、冠心病、感染、炎症、系统性红斑狼疮等情况下显著升高;在各种溶血、肝细胞病变组织出现出血时含量降低。HPT是多种炎症、糖尿病(Maffei,M.,et al.The obesity and inflammatory marker haptoglobin attracts monocytesvia interaction with chemokine(C-C motif)receptor 2(CCR2).BMC Biol.2009,7:87.)和肿瘤(Lai,C.H.et al.Proteomics-based identification of haptoglobin as a novel plasma biomarker inoral squamous cell carcinoma.Clin Chim Acta.2010,13-14:984-991.)的候选标志物。HPT变化对头颈鳞状细胞癌患者的预后有指导意义(Lee CC,et al.The prognostic utility of haptoglobingenotypes in squamous cell carcinoma of the head and neck.Clin Chem Lab Med.2009,47(10):1277-1283.)。
(4)该蛋白质复合物中包含的载脂蛋白A-I(apolipoprotein A-I,ApoA-I):人Apo A-I是单一多肽链蛋白质,分子量约为28kDa。Apo A-I是高密度脂蛋白(high density lipoproteins,HDL)的主要成分,其含量约为70%。Apo A-I具有抗动脉粥样硬化、调节胆固醇代谢和抗炎等作用。Apo A-I在胆管癌中含量显著低于对照组和良性疾病组(Wang X.,et al.Characterization of apolopoprotein A-I as a potential biomarker for cholangiocarcinoma.EuropeanJournal of Cancer Care.2009,18:625-635.);Apo A-I对结直肠癌的预后判断具有重要意义(Helgi H.,et al.Identification of serum proteins as prognostic and predictive markers of colorectalcancer using surface enhanced laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry.Oncology Reports.2010,24:57-64.)。Apo A-I含量降低还见于冠心病、动脉硬化性疾病、炎症、未控制糖尿病、缺血性脑血管疾病、肾病综合征和活动性肝炎等。在急性期炎症时,Apo A-I可与触珠蛋白结合,防止Apo A-I的羟基自由基被氧化(Salvatore,A.,et al.Haptoglobin bindingto apolipoprotein A-I prevents damage from hydroxyl radicals on its stimulatory activity of theenzyme lecithin-cholesterol acyl-transferase.Biochemistry.2007,46(39):11158-11168.)。
在补体活化过程中,C3b分别与CFH(Candida J.Soames,et al.Interactions between humancomplement components factor H,factor I and C3b.Biochem.J.1997,326:553-561.)、IgG(HULutz,et al.High doses of immunoglobulin G attenuate immune aggregate-mediated complementactivation by enhancing physiologic cleavage of C3b in C3bn-IgG complexes.Blood.1996,88:184-193.)和C4b(Meri S,et al.A mechanism of activation of the alternative complement pathwayby the classical pathway:protection of C3b from inactivation by covalent attachment to C4b.Eur JImmunol.1990,20(12):2551-2661.)结合形成复合物。细胞内的C5、C6和C7可结合,并参与形成膜攻击复合物。有关补体系统和本发明发现的其它蛋白质在血清中的相互作用,以及这些蛋白复合物与疾病的发展、预后等联系还未见报道。
具体而言,本发明提供了一种蛋白质复合物标志物,还提供了该蛋白质复合物分离和定量分析方法和在癌症诊断中的应用。
该蛋白质复合物组成成分是触珠蛋白(HPT)、载脂蛋白A-I(Apo A-I)、补体H(CFH)、补体3(C3)、补体4(C4A)、补体5(C5)、补体7(C7)、免疫球蛋白G1(IgG1)和免疫球蛋白A1(IgA1),其表达式为[(HPT)n1(CFH)n2(C3)n3(C4A)n4(C5)n5(C7)n6(IgG1)n7(ApoA-I)n8(IgA1)n9],n1=1、2、3、4或5,n2=0或1,n3=0或1,n4=0或1,n5=0或1,n6=0或1,n7=0、1、2、3、4或5,n8=0或1,n9=0或1。分子质量范围为140~1400kDa。
该蛋白质复合物在血清中含量的升高可以用于对肺癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌和甲状腺癌进行辅助诊断,并可以对上述五种癌症进行区分。利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(nativepolyacrylamide gel electrophoresis,Native-PAGE)分离血清中的蛋白质复合物,并以蛋白质复合物的含量变化来判断和/或预后评估癌症及其它慢性疾病。
本发明发现血清转铁蛋白质复合物(serotransferrin associated protein complex,TAP,它由转铁蛋白质与载脂蛋白质组成)的含量、存在形式与个体的性别、年龄、健康状况无关,转铁蛋白质复合物可以作为该发明中的蛋白质复合物定量分析的内参照。同时,本发明每次所用样本血清体积少(2μL),操作方法简单、易行,价廉。本发明筛选了与肿瘤等慢性疾病相关的蛋白质复合物标志物,并针对不同肿瘤患者血清中蛋白质复合物的不同分布类型建立了诊断模型。结果表明,根据不同的蛋白复合物分布类型,选择不同的蛋白质复合物相对表达量值进行联合检测,可以有效提高肿瘤诊断的敏感性、特异性和准确性,且可以用于肿瘤病情进展监测、药物疗效评价和预后评估等。
附图说明
图1:非变性聚丙烯酰胺凝胶(Native-PAGE)分离血清中蛋白质复合物的结果,并给出了蛋白质复合物存在类型。
图2:非变性聚丙烯酰胺凝胶(Native-PAGE)上待分离和鉴定的蛋白质复合物条带。
图3:血清中a类型分布的蛋白质复合物的变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)分离结果。
图4:血清中b、f类型分布的蛋白质复合物的变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)分离结果。
图5:血清中e类型分布的蛋白质复合物和TAP的变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)分离结果。
图6:蛋白质复合物组成成分的鉴定条带。
图7:统计分析非变性聚丙烯酰胺凝胶(Native-PAGE)中的19个目标蛋白质复合物条带。
具体实施方式
本发明是利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(native polyacrylamide gel electrophoresis,Native-PAGE)分离血清中的蛋白质复合物,结合变性的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分离Native-PAGE中的蛋白质复合物,用质谱技术鉴定复合物中的蛋白质成分。以转铁蛋白质复合物为内参照,依据Native-PAGE中蛋白质复合物条带光密度值,确定蛋白质复合物的相对含量。
所述方法简述如下:
(1)将血清进行Native-PAGE分离,然后染色,根据条带分布特征可将人群分为8种类型;
(2)根据条带分布类型,切下步骤(1)中含有目标蛋白质复合物的凝胶条带,并将其用二硫苏糖醇(DL-dithiothreitol,DTT)还原和碘乙酰胺(iodoacetamide,IAA)烷基化处理;
(3)将步骤(2)中的凝胶条带进行SDS-PAGE电泳分离,然后将其染色;
(4)步骤(2)中得到的每个目标蛋白质复合物条带在步骤(3)中均有对应的蛋白质条带,切下步骤(3)中得到的蛋白质条带,进行脱色和脱水;
(5)将步骤(4)处理的蛋白质条带用测序级胰酶酶解后,进行质谱鉴定;
(6)将步骤(5)中得到的质谱图搜库,鉴定步骤(3)中的蛋白质条带的蛋白质,从而确定步骤(1)中蛋白质复合物的组成成分;
(7)根据步骤(1)中Native-PAGE凝胶分离的结果,发现患者血清中目标蛋白复合物的凝胶条带深度显著比对照组深。对于同一患者,条带深度会随着疗效的不同而变化,或者发生条带类型的变化,这提示Native-PAGE中蛋白质复合物条带的变化与疾病、疗效和预后有关;
(8)本发明发现附图2中的转铁蛋白复合物(TAP)的表达相对稳定,与年龄、性别、健康状况和条带类型等无关,可作为Native-PAGE中其它蛋白质复合物定量分析的内参照;
(9)将每块Native-PAGE凝胶中第19个条带(即TAP对应的条带,见图7)光密度值归一化,然后将归一化后的样本(sample)中蛋白质复合物凝胶条带的光密度值(normalizedquantity,NQ)除以外参照(N)中相对应蛋白质复合物凝胶条带的NQ值,此比值(ratio)即为样本中相应蛋白质复合物的相对表达量。例如,图7所示样本1(sample 1)中条带1的相对表达量为ratio1,则可通过下面公式计算:
ratio1=[NQ1]样本/[NQ1]外参照
同样的方法计算其它样本中相应条带的比值,每个样本都得到18个比值(ratio1~ratio18);
(10)通过数据处理和统计分析,本发明根据不同的蛋白质复合物凝胶条带类型,筛选相应的差异凝胶条带进行分析,提供了辅助诊断肺癌、结直肠癌、胰腺癌、胃癌和甲状腺癌等肿瘤的模型;
(11)根据上述(10)中的模型,绘制不同肿瘤患者血清中蛋白质复合物的不同分布类型的受试者操作曲线(ROC),计算相应的诊断阈值(cut-off)、敏感性和特异性。
本发明每次所用样本血清体积少(2μL),操作方法简单、易行,价廉。本发明筛选了与肿瘤等慢性疾病相关的蛋白质复合物标志物,并针对肿瘤患者血清中不同的蛋白质复合物分布类型,建立诊断不同肿瘤的模型。结果表明,根据不同的蛋白复合物分布类型,将相关的蛋白质复合物相对表达量值进行联合检测,可以有效提高肿瘤诊断的敏感性、特异性和准确性,且可以用于肿瘤病情进展监测、药物疗效评价和预后评估等。
为了理解本发明,下面以实施例进一步说明本发明。以下实施例仅用于说明本发明,而不用于限定本发明的范围,本领域技术人员公知,在不背离本发明精神的情况下,可以对本发明做出许多修改,这样的修改也落入本发明的范围。
下述实验方法如无特别说明,均为常规方法,所使用的实验材料如无特别说明,均可容易地从商业公司获取。
实施例
实施例1(制备实施例)
血清中蛋白质复合物的分离,蛋白质复合物成份分离和鉴定
研究对象为1591例血清样本,其中包括501例健康对照、282例肺癌、209例结直肠癌、201例胰腺癌、205例胃癌和193例甲状腺癌患者。
1、血清中蛋白质复合物的Native-PAGE分离方法
Native-PAGE凝胶组成成分及电泳条件如下:
梯度分离胶(4%-10%(质量体积比),丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺=37.5∶1(质量比))成分由重液和轻液经梯度混匀器制备而成。重液(10%(质量体积比),丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺=37.5∶1(质量比))成分为:TBM(90mM三羟甲基氨基甲烷(Tris base)/90mM硼酸(Boricacid)/1.5mM氯化镁(MgCl2)),0.05%(体积比)四甲基乙二胺(TEMED)和0.001g/mL过硫酸铵(AP);轻液(4%(质量体积比),丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺=37.5∶1(质量比))成分为:TBM,0.05%(体积比)四甲基乙二胺(TEMED)和0.001g/mL过硫酸铵(AP)。
浓缩胶(4%(质量体积比),丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺=37.5∶1(质量比))成分为:20mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)(pH 7.5),5mM氯化镁,0.1%(体积比)四甲基乙二胺(TEMED)和0.001g/mL过硫酸铵(AP)。
电泳缓冲液成分为:含25mM三羟甲基氨基甲烷(Tris base)和192mM甘氨酸溶液。
电泳设备:北京市六一仪器厂DYCZ-24DN型垂直电泳仪器,此例中配制Native-PAGE凝胶的玻璃板参数为130mm×100mm×1.5mm。
样本处理方法:全血在4度3000×g,离心10分钟,用移液器吸取上清到新的离心管中;12000×g,离心10分钟,将上清小体积分装于新的离心管中,保存于-80度冰箱中。Native-PAGE电泳前每个样本取2μL与8μL 1.25×上样缓冲液(25mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸(pH 6.8),12.5%甘油(体积比),二甲苯青痕量)混合后加入到每个加样孔中。每块凝胶中均加入同一个混合的健康人血清作为外参照(N)。
电泳条件:设置恒流方式,按每块胶通过电流10mA,持续分离2小时,之后按每块胶通过电流25mA,持续分离3.5小时,整个分离过程在4度下进行。
电泳结束后,进行考马斯亮蓝G-250染色,之后用水脱色。根据不同人血清中的蛋白质复合物在Native-PAGE中的位置分布不同,可将其分为8类(见附图1)。其主要蛋白质复合物分布类型为a、b、c,约占研究人群的83%,其中蛋白质复合物分布类型c(约占研究人群的11%),e、f、g和h(约占研究人群的16%),其它少数类型占总人群的数量较少(约占研究人群的1%),因此一并将它们归为其它类(others)。
2、SDS-PAGE方法分离蛋白质复合物条带
(1)取a、b、e、f类型血清各5μL按上述1中方法进行操作;
(2)将含目标蛋白质复合物(如附图2所示)的凝胶条带切下,分别放入不同的0.6mL离心管中,水洗胶块5分钟,重复洗涤3次;
(3)在每管中加入0.3mL含0.03g/mL二硫苏糖醇(DTT)的平衡溶液(配方:1.5M三羟甲基氨基甲烷-盐酸(pH6.8)25mL,甘油40mL,SDS 8g,18.2M′Ω水定容至400mL),室温反应40分钟,弃上清,水洗胶块5分钟,重复洗涤3次;
(4)在每管中加入0.3mL含0.12g/mL碘乙酰胺(IAA)的平衡溶液,室温避光反应35分钟,弃上清,水洗胶块5分钟,重复洗涤3次;
(5)配制SDS-PAGE分离胶(11%(质量体积比),丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺=37.5∶1(质量比)),自然凝固后,将上述步骤(4)中所得的胶块分别放在分离胶上的不同泳道中,覆盖浓缩胶(4%(质量体积比),丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺=37.5∶1(质量比)),进行电泳分离。电泳条件为恒压方式,50伏,分离1.5小时,之后改为恒压100伏,再分离2小时;
(6)电泳分离结果见附图3~5。
3、蛋白质复合物组成成分的鉴定
(1)分别切下上述步骤2(5)中分离得到的蛋白质凝胶条带(如附图6所示),并切成约为2mm3大小的碎胶块,分别在0.6mL离心管中水洗胶块5分钟,重复洗涤3次;
(2)每个离心管中加入0.3mL含25mM碳酸氢铵/50%乙腈(体积比)的溶液,在旋转混合仪中脱色10~12小时后,离心,弃上清,再加入0.3mL上述脱色液,直至完全脱去胶块中的蓝色;
(3)将每个离心管中加入0.3mL乙腈,可看到胶块体积缩小,由无色透明变为半透明最后变为白色。震荡1分钟左右,室温静置10分钟,弃上清,将胶块放于洁净处,自然干燥;
(4)根据胶块体积将适量(3~4μL)测序级胰酶(Roche公司)加入到每个离心管中,4度放置1小时后,加入适量(4~6μL)25mM碳酸氢铵,放于37度水浴中酶解12~16小时;
(5)分别从不同离心管中取1μL酶解液分别点在不同靶点上,自然干燥后,再添加1μLα-氰基-4-羟基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid,CHCA)基质(1mg/mL),自然干燥;
(6)使用布鲁克(Bruker)公司的质谱仪(Apex ultra MALDI FTICR MS)进行质谱鉴定,激光波长355nm。质谱参数设置:正离子模式,采集范围800~4000m/z(质量电荷比);
(7)将所得肽质量指纹图谱(peptide mass fingerprinting,PMF)在SwissProt数据库搜索匹配蛋白质,结合SDS-PAGE凝胶上提示的蛋白质分子量信息,共鉴定了16个蛋白质成分,分别属于10种不同的蛋白质,即补体C3、补体H、补体C4A、补体C5、补体C7、免疫球蛋白质A1、免疫球蛋白质G1、触珠蛋白质、载脂蛋白质A-I和血清转铁蛋白质。条带2、3和6分别为补体C3的α和β链;条带4、5和10分别为C4A的α、β和γ链;条带8和11分别为免疫球蛋白(Ig)G1的重链和轻链;条带9和12分别是触珠蛋白的β和α2链;条带13为补体C5的α链。具体鉴定结果见表1。
表1鉴定蛋白的信息
备注:对应为图6中标注“*”条带的蛋白质鉴定信息。表中列出的均为鉴定蛋白质条带与对应的多肽链的比较。
(8)确定附图2中各蛋白质复合物的组成成分。根据表1鉴定结果和各蛋白质复合物的SDS-PAGE电泳分离结果(图3~图5),可得蛋白质复合物组成的表达式为:
[(HPT)n1(CFH)n2(C3)n3(C4A)n4(C5)n5(C7)n6(IgG1)n7(Apo A-I)n8(IgA1)n9]
各组成成分如下:触珠蛋白(HPT),补体H(CFH),补体C3(C3),补体C4A(C4A),补体C5(C5),补体C7(C7),免疫球蛋白G1(IgG1),免疫球蛋白A1(IgA1)和载脂蛋白A-I(Apo A-I)
当n1=1~3、n2=1、n3=1、n4=1、n7=1、n9=1,即蛋白质复合物的组成为通式II,[(HPT)1~3(CFH)1(C3)1(C4A)1(IgG1)1(IgA1)1]时,对应的蛋白质复合物为a1、a2、a3、b1、b2、b3、e1、e2、f1或f2;
当n1=1~3、n3=1、n4=1、n7=1、n8=1、n9=1,即蛋白质复合物的组成为通式III,[(HPT)1~3(C3)1(C4A)1(IgG1)1(Apo A-I)1(IgA1)1]时,对应的蛋白质复合物为a4、b5或f3;
当n1=1~3、n3=1、n4=1、n7=1、n9=1,即蛋白质复合物的组成为通式IV,[(HPT)1~ 3(C3)1(C4A)1(IgG1)1(IgA1)1]时,对应的蛋白质复合物为e3;
当n1=1~3、n3=1、n4=1、n5=1、n6=1、n7=1、n9=1,即蛋白质复合物的组成为通式V,[(HPT)1~3(C3)1(C4A)1(C5)1(C7)1(IgG1)1(IgA1)1]时,对应的蛋白质复合物为b4;
当n1=1~3、n3=1、n8=1、n9=1,时,即复合物的组成为通式VI,[(HPT)1~3(C3)1(ApoA-I)1(IgA1)1]时,对应的蛋白质复合物为a5或b6;
当n1=1~5、n2=1、n3=1、n7=1~5、n9=1,即蛋白质复合物的组成为通式VII,[(HPT)1~ 5(CFH)1(C3)1(IgG1)1-5(IgA1)1]时,对应的蛋白质复合物为a1~a4或e4~e7。
TAP由转铁蛋白二聚体和载脂蛋白A-I组成。
其它蛋白质复合物分布类型中蛋白质复合物的组成与a、b、e、f位置相对应条带蛋白质复合物的组成成分相同,同时,由于蛋白质复合物的聚合状态不同、构象不同等因素的影响,同一组成的蛋白质复合物可以在Native-PAGE上显示多于一个的条带。
实施例2(应用实施例1)
Native-PAGE分离血清中蛋白质复合物的应用,所用血清样本的具体信息如下(表2)。
1、内参照的选择与评价
(1)将1591例血清样本,分别为282例肺癌(lung cancer,LC)、209例结直肠癌(colorectalcancer,CC)、201例胰腺癌(pancreatic cancer,PC)、205例胃癌(stomach cancer,SC)、193例甲状腺癌(thyroid cancer,TC)和501例健康对照(control),按实施例1中的方法进行Native-PAGE电泳,将一份混合的健康人血清作为外参照(N),目的是降低电泳、染色和凝胶扫描等过程中对凝胶条带光密度值的影响,为后续数据分析提供准确数据。每次分别取2μL血清样本和2μL外参照血清进行电泳分离;
(2)用Quantity One软件volume功能分析得出TAP的平均光密度值,然后用样本中TAP的平均光密度值除以外参照中TAP的平均光密度值,此比值即为样本中TAP的相对表达量;
(3)将样本编号、性别、年龄、条带类型、健康状况(具体指的是LC、CC、PC、SC、TC和对照组)以及TAP的相对表达量输入excel表,建立数据库;
(4)用SPSS 17.0软件进行数据的统计分析,正态分布的数据两组间比较采用t检验,正态分布且方差齐性的数据多组间比较采用方差分析。非正态分布数据组间比较采用Mann-Whitney U或Kruskal-Wallis H等非参数检验。析因设计方差分析判断所选择的因素间对TAP的相对含量有无交互作用,以P<0.05为显著性检验的标准,将年龄按≤49岁、50-59岁、60-69岁和≥70岁分为4组。分别统计分析不同癌症和对照组中TAP相对含量,分析性别(gender)、年龄组(age group)、健康状况(status,具体指的是LC、CC、PC、TC、SC和对照组)和条带类型(type)等对TAP的影响,并分析这些因素的交互作用(以“*”表示)。结果发现LC、CC、PC、TC、SC和对照组的TAP值均无显著性差异(P>0.05)。将LC、CC、PC、SC、TC作为疾病组和对照组相比,TAP值均无显著性差异(P>0.05),结果见表3所示,该结果表明性别、年龄、健康状况、条带类型等对所用血清中TAP的相对含量无显著差异,且这些因素的交互作用对血清中的TAP也没有显著差异(P>0.05)。因此可以选择TAP复合物作为其它目标蛋白质复合物定量分析的内参照。
表3癌症组与对照组TAP相对含量比较结果
2分析目标蛋白质复合物条带的相对含量,统计分析和建立模型
(1)用Quantity One软件分析每种蛋白质复合物分布类型中(见附图1所示)目标蛋白质复合物的光密度值,共19个凝胶条带(见附图7所示),1~4:a9~a6或e7~e4,5:a1、b1或e1,6:f1,7:b2,8:a2,9:b3或e2,10:f2,11:a3,12:b4,13:e3,14:a4,15:f3,16:b5,17:a5,18:b6,19:TAP;
(2)本步骤中所用的样本均来自于上述步骤1中所用的样本,经过筛选,去除经过治疗的肿瘤样本后,具体所用的样本例数为1158例,包括366例健康对照、200例肺癌、171例结直肠癌、139例胰腺癌、157例胃癌和125例甲状腺癌患者。由于e、f、g、h和其它类型样本数较少,c类型几乎无目标蛋白质复合物条带,具体信息见表4,所以本发明中主要统计分析的是a和b两种蛋白质复合物分布的类型;
(3)将第19个条带TAP的光密度值归一化后,其余的18个凝胶条带的光密度值与外参照对应凝胶条带的比值即作为目标蛋白质复合物在凝胶中的相对含量(ratio1~ratio18),将病例编号、性别、年龄、条带类型、健康状况(对照组和疾病类型)以及ratio1~ratio18输入excel表,建立数据库;
(4)SPSS 17.0软件统计分析筛选与不同疾病类型相关的危险因素,建立风险评估模型。分析比较不同癌症与对照组之间的异同,先对不同样本的18个比值(ratio)进行正态性检验,根据数据的分布特征采用合适的统计方法。本发明所用统计学方法主要有Mann-Whitney U或Kruskal-Wallis H检验,Chi-Square检验,Spearman rank-order相关分析和Binary logisticregression等;
(5)将年龄按≤60岁和>60岁分为两组。Mann-Whitney U检验表明,蛋白质复合物分布类型a中,LC、CC、PC、SC和TC患者血清中蛋白质复合物1-5、8、10、11、14、17的相对表达量显著高于对照组(P<0.001)。蛋白质复合物分布类型b中,LC、CC、PC、SC和TC患者血清中蛋白质复合物5、7、9、12、14、16、18的相对表达量显著高于对照组(P<0.01)。不同肿瘤与对照组相比进行单因素逻辑回归分析,再进行多因素逻辑回归分析筛选与不同肿瘤患者对应的风险因素;
(6)多因素逻辑回归分析:根据不同肿瘤的蛋白质复合物分布类型(type),将经过上述步骤(4)和(5)初步筛选后的差异凝胶条带相对含量进行回归分析,进一步筛选风险因素,建立不同肿瘤与对照组相比的回归模型。下面各方程均已考虑性别和年龄的影响。
肺癌(LC)中各指标综合检测得分的方程为:
Score(LC,type=a)=1/{1+exp[-(-8.112+1.442×ratio2+1.092×ratio8)]}
Score(LC,type=b)=1/{1+exp[-(-4.603+0.044×ratio9+0.044×ratio12+0.024×ratio18)]},
结直肠癌(CC)中各指标综合检测得分的方程为:
Score(CC,type=a)=1/{1+exp[-(-6.994+1.656×ratio2+0.495×ratio3)]}
Score(CC,type=b)=1/{1+exp[-(-4.792+0.069×ratio9+0.027×ratio18)]},
胰腺癌(PC)中各指标综合检测得分的方程为:
Score(PC,type=a)=1/{1+exp[-(-9.291+2.347×ratio2+0.760×ratio8)]}
Score(PC,type=b)=1/{1+exp[-(-4.313+0.065×ratio9+0.036×ratio18)]},
胃癌(SC)中各指标综合检测得分的方程为:
Score(SC,type=a)=1/{1+exp[-(-12.700+3.432×ratio2+0.526×ratio17)]}
Score(SC,type=b)=1/{1+exp[-(-2.632+0.044×ratio9+0.034×ratio18-1.934×gender2)]},
甲状腺癌(TC)中各指标综合检测得分的方程为:
Score(TC,type=a)=1/{1+exp[-(-7.040+1.559×ratio2+0.846×ratio8)]}
Score(TC,type=b)=1/{1+exp[-(-3.847+0.056×ratio9+0.032×ratio18)]};
具体每个模型均有意义(P>0.05,Hosmer and Lemeshow检验),各参数均有意义(P<0.01),优势比(Odds Ratio,OR)及95%可信区间(95%CI)见表5。
表4研究样本在不同类型中性别和年龄统计特征
实施例3(应用实施例2)
利用SPSS软件绘制单个蛋白质复合物及综合使用各蛋白质复合物相对含量的受试者操作曲线(ROC)
根据实施例2步骤2(6)中的方程,绘制ROC曲线,计算ROC曲线下面积(AUC)及95%可信区间(95%CI)、检查的阈值(cut-off值)、敏感性(sensitivity)和特异性(specificity)等。分析结果表明肺癌、结直肠癌、胰腺癌、胃癌、甲状腺癌分别与健康对照组相比,敏感性及特异性均大于80.00%。将各相关的目标蛋白质复合物的相对含量联合检测时诊断的敏感性和特异性高于任何一种单一的目标蛋白质复合物。本发明只列出将各相关指标联合检测后的结果(见表6)。
表6ROC曲线分析结果
综上所述,本发明所提供的以血清中蛋白质复合物在Native-PAGE凝胶中的相对表达量为指标,作为辅助诊断五种肿瘤等应用的模型具有较高的敏感性、特异性和准确性。
尽管本发明的内容是结合本实施例进行说明,但是不能认为是对本发明范围的限制,本发明的范围由所附权利要求书限定。毫无疑问,本发明的方法可以推广至其它慢性疾病的诊断、病情的发展判断、药物疗效的评估及预后评价。因此,本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内对本发明进行各种改动或修饰,这些改动或修饰形式同样在本发明的保护范围。例如,本领域技术人员明白,可以将本发明中所使用的常规凝胶电泳更换为毛细管凝胶电泳,并按毛细管电泳的条件制备反应人类血清或血浆中蛋白质复合物概况的图片及相关的经验方程和疾病诊断的参考阈值,将患者样品的蛋白质复合物的毛细管凝胶电泳图谱与该图片比较后获得患者的疾病状况。

Claims (6)

1.一种蛋白质复合物,其具有通式I:
[(HPT)n1(CFH)n2(C3)n3(C4A)n4(C5)n5(C7)n6(IgG1)n7(ApoA-I)n8(IgA1)n9],
其中,HPT代表触珠蛋白,Apo A-I代表载脂蛋白A-I,CFH代表补体H,C3代表补体3,C4A代表补体4A,C5代表补体5,C7代表补体7,IgG1代表免疫球蛋白G1,IgA1代表免疫球蛋白A1;
其中,n1=1、2、3、4或5,n2=0或1,n3=0或1,n4=0或1,n5=0或1,n6=0或1,n7=0、1、2、3、4或5,n8=0或1,n9=0或1;
且其中该蛋白质复合物的分子量范围为140~1400kDa。
2.根据权利要求1所述的蛋白质复合物,其特征在于所述蛋白质复合物具有选自下述通式II至通式VII的通式,其中:
通式II:
[(HPT)n1(CFH)n2(C3)n3(C4A)n4(IgG1)n7(IgA1)n9],其中n1=1、2或3,n2=1,n3=1,n4=1,n7=1,n9=1;
通式III:
[(HPT)n1(C3)n3(C4A)n4(IgG1)n7(Apo A-I)n8(IgA1)n9],其中n1=1、2或3,n3=1,n4=1,n7=1,n8=1,n9=1;
通式IV:
[(HPT)n1(C3)n3(C4A)n4(IgG1)n7(IgA1)n9],其中n1=1、2或3,n3=1,n4=1,n7=1,n9=1;
通式V:
[(HPT)n1(C3)n3(C4A)n4(C5)n5(C7)n6(IgG1)n7(IgA1)n9],其中n1=1、2或3,n3=1,n4=1,n5=1,n6=1,n7=1,n9=1;
通式VI:
[(HPT)n1(C3)n3(Apo A-I)n8(IgA1)n9],其中n1=1、2或3,n3=1,n8=1,n9=1或
通式VII:
[(HPT)n1(CFH)n2(C3)n3(IgG1)n7(IgA1)n9],其中n1=1、2、3、4或5,n2=1,n3=1,n7=1、2、3、4或5,n9=1。
3.根据权利要求1或2所述的蛋白质复合物,其用于制备诊断和/或预后评估哺乳动物癌症的试剂,所述哺乳动物为人。
4.根据权利要求3所述的蛋白质复合物,其特征在于所述癌症选自肺癌、结直肠癌、胰腺癌、胃癌或甲状腺癌。
5.根据权利要求1或2所述的蛋白质复合物在制备诊断和/或预后评估哺乳动物癌症的试剂中的用途,所述哺乳动物为人。
6.根据权利要求5所述的用途,其特征在于所述癌症选自肺癌、结直肠癌、胰腺癌、胃癌或甲状腺癌。
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