KR20170106371A - 마이코플라즈마 뉴모니아의 면역학적 검출법 및 키트 - Google Patents

마이코플라즈마 뉴모니아의 면역학적 검출법 및 키트 Download PDF

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Abstract

(과제) 본 발명은 마이코플라즈마 폐렴의 원인균인 마이코플라즈마 뉴모니아를 간편 또한 신속하게 고감도 검출을 가능하게 하는 특이적 항체, 또한 상기 항체를 포함하는 면역학적 검출법 및 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
(해결수단) 마이코플라즈마 뉴모니아의 P30 단백질의 특정 에피토프를 인식하는 항체를 제작하고 상기 항체를 이용하여 면역학적 검출함으로써, 마이코플라즈마 뉴모니아의 감염을 종래법보다 신속 또한 특이적으로 진단할 수 있다. 본 발명에 의하면 특수한 기기 및 숙련한 기술을 필요로 하지 않아, 병원 등에 있어서 간편 또한 신속하게 마이코플라즈마 뉴모니아의 검출 및 감염을 진단하는 것이 가능하게 된다.

Description

마이코플라즈마 뉴모니아의 면역학적 검출법 및 키트
본 발명은 마이코플라즈마 뉴모니아(Mycoplasma pneumoniae)의 P30 단백질에 대한 항체와 그것을 사용한 마이코플라즈마 뉴모니아의 면역학적 검출법 및 키트에 관한 것이다.
마이코플라즈마 폐렴은 마이코플라즈마 뉴모니아에 의해 야기되는 비정형 폐렴이다. 마이코플라즈마 폐렴은 클라미디아 폐렴과 함께 비정형 폐렴의 30~40%를 차지하고, 시중 폐렴 중에서도 높은 비율을 차지하고 있다.
마이코플라즈마 폐렴은 유아, 소아, 청년기에 많이 나타난다. 잠복 기간은 2~3주간이고, 기도 점막에의 병원체의 배출은 초발 증상 발현전 2~8일에 나타나고, 임상 증상 발현시에 피크가 되어 높은 레벨이 약 1주간 계속된 후, 4~6주간 이상 배출이 계속된다. 주요 임상 증상으로서는 발열, 전신 권태, 두통, 기타 감기와 같은 증상이다. 38℃를 넘는 고열, 강한 건성 기침 등이 특징이고, 기침은 해열 후에도 3~4주간으로 장기에 걸친다. 그러나, 마이코플라즈마 폐렴에 특징적인 검사 소견은 없고, 흉부 X선 검사에서는 불투명 유리와 같은 엷은 음영이 전형적이라고 알려졌다.
마이코플라즈마의 감염 양식은 감염 환자로부터의 비말 감염과 접촉 감염이고, 마이코플라즈마 뉴모니아가 경기도적으로 침입하여 기관지, 세기관지 상피에 흡착함으로써 감염이 성립한다.
마이코플라즈마 감염증은 감염증법에 기초하는 신고 감염증(5류 감염증)으로 지정되어 있고, 지정 의료 기관은 신속하게 환자수를 신고할 의무가 있다.
마이코플라즈마 뉴모니아는 자기 증식 가능한 최소의 미생물이고, 다른 세균과는 다르게 세포벽을 가지지 않는다. 따라서, 세포벽 합성 저해 작용을 갖는 항균약인 β락탐계 항균약 및 세팜계 항균약은 무효하고, 치료에 있어서는 매크로라이드계 항균약, 테트라사이클린계 항균약 및 뉴퀴놀론계 항균약이 투여된다. 따라서, 기인균의 특정은 치료 방침을 결정하는데 있어서도 신속하게 행해지는 것이 요망되고 있다.
현재, 마이코플라즈마 뉴모니아 감염의 확정 진단에는 분리 배양법과 혈청 학문적 검사가 사용되고 있다.
분리 배양에는 마이코플라즈마를 검출하기 위한 전용 배지(PPLO 배지)를 필요로 한다. 또한, 다른 세균과 비교해도 증식이 늦어 판정까지 빨라도 1주일 정도 걸리기 때문에, 분리 배양법에서는 임상 현장에 있어서 신속하게 기인균을 특정하는 것이 어려운 상황이다.
또한, 마이코플라즈마는 온도에 민감하여, 마이코플라즈마를 함유하는 검체는 일반적인 세균을 함유하는 검체와 다르게 냉장 상태에서 보관할 수 없다. 그 때문에, 검체 보관 또는 수송 중에 검체에 포함되는 마이코플라즈마가 사멸 또는 감소하여, 분리 배양법에 의해서도 검출 불가능한 경우도 있다.
혈청 학문적 검사로서는 IgG 항체나 IgM 항체를 특이적으로 검출하는 한랭 응집 반응, 보체 결합 반응(Complement Fixation test: CF법), 간접 적혈구 응집 반응(Indirect Hemaggulutination test: IHA법), 입자 응집법(Particle Aggulutination: PA법), 효소 면역 측정법(Enzyme Immunoassay: EIA법) 등을 들 수 있다.
또한, 간이 검사로서 혈청 또는 혈장 중의 마이코플라즈마 뉴모니아 특이적 IgM 항체를 EIA법으로 검출하는 면역크로마토그래피 키트(이뮤노 카드 마이코플라즈마 항체(TFB Inc. 제작))가 시판되고 있고, 임상 현장에서 사용되고 있다.
혈청학적 검사로는 검출하는 검체 중의 IgM 항체는 감염 초기에 상승하지만, 항체 생산 응답이 낮은 경우나 측정 시기에 의해 위음성으로 판정되는 경우가 있다. 또한, 혈중에서 IgM 항체가 소실될 때까지 시간이 걸리기 때문에, 혈청학적 검사의 결과가 현재의 감염 상황을 적확하게 나타내고 있다고 말하기 어려운 측면이 있다.
따라서, 혈청학적 검사에 의한 확정 진단은 급성기와 회복기의 페어 혈청을 사용한 정량적 검사를 할 수 밖에 없어, 사후 진단이 되는 경우가 많다.
또한, 마이코플라즈마 뉴모니아의 DNA를 검출하는 핵산 검출법도 사용되고 있다. 그러나, 핵산 검출법은 핵산 증폭의 조작이 복잡하고, 또한 특별한 기기를 필요로 하는 것, 측정에 몇시간을 필요로 하는 것 등에서 일반적으로 사용되고 있는 검사는 아니다.
보다 신속 또한 간편하게 마이코플라즈마 뉴모니아 감염을 검출하기 위해서, 마이코플라즈마 뉴모니아 항원에 대한 특이적 항체가 개발되어 마이코플라즈마 감염의 유무를 감별하는 검출법이 보고되고 있다.
마이코플라즈마 뉴모니아는 플라스크형의 돌기부인 접착 기관에 의해 호흡기 표피세포의 섬모에 부착된 후, 활주 운동에 의해 세포 표면으로 이동하여 접착하는 것으로 감염이 성립한다. 이 접착이나 활주 운동에 중심적인 역할을 다하는 접착 단백질로서 알려져 있는 P1 단백질(169KDa)에 특이적인 항체를 제작하고, 상기 P1 단백질을 검출 마커로서 사용한 검출법(특허문헌 1 및 2)이 보고되고 있다.
상기 보고에 있는 검출 항원인 P1 단백질은 2개의 유전자형이 존재하고, 유전자형간에 P1 단백질의 아미노산 서열이 다른 것도 알려져 있다. 따라서, 광범위하게 마이코플라즈마 뉴모니아를 검출하기 위해서는 각각의 P1 유전자형의 P1 단백질에 대응한 항체, 또는 각 유전자형간의 P1 단백질의 공통 부위를 인식하는 항체를 제작할 필요가 있다. 또한, 계절마다 유행에 따라서는 지난 유행기와는 다른 유전자형이 검출되는 것, 즉 유행기에 의해 유전자형이 변화되는 것이 보고되고 있기 때문에, 유행 초기에 유전자형을 파악하여 대응한 항체를 사용할 필요가 있다.
또한, P1 단백질보다 마이코플라즈마 뉴모니아의 분리주간에 보존되어 있는 것이 알려져 있는 DnaK 단백질을 검출용 마커로서 사용한 검출법(특허문헌 3)도 보고되고 있다. DnaK 단백질은 인간에 있어서의 비뇨기 감염증의 원인이 되는 마이코플라즈마 제니탈리움도 갖고 있기 때문에 교차 반응성을 나타낸다. 따라서, 상기 단백질을 검출용 마커로서 마이코플라즈마 뉴모니아를 특이적으로 검출할 수 없다.
또한, 마이코플라즈마 뉴모니아의 접착 단백질인 P30 단백질(30 kDa)의 변이주에 관해 보고가 있다(비특허문헌 1). 본 보고에 있어서, P30 단백질에 대한 토끼 항혈청을 사용한 SDS-PAGE 검출법에 대해서 보고되고 있다. P30 단백질의 N말단 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(102-181번째) 및 C말단 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드(139-275번째)를 Modified murine dihydrofolate reductase(DHFR)과의 융합 단백질로서 발현시켜 상기 융합 단백질에 대한 토끼 항혈청을 작출하고 있다. 본 보고에 있어서, P30 단백질에 대하여 반응성을 갖는 토끼 항혈청이 개시될 뿐이고, P30 단백질에 있어서의 특정한 에피토프를 인식하는 항체에 대해서는 어떠한 개시도 되어 있지 않다. 또한, 본 항혈청이 본 발명에 있어서의 면역 검출법에 사용할 수 있는 것인지는 확실하지 않고, 높은 특이성 및 반응성을 갖는 것인지도 불분명하다.
마이코플라즈마 폐렴은 적절한 치료가 행해지지 않는 경우, 증상의 장기화나 중증화, 또한 2차 감염으로 의한 감염 확대를 초래할 우려가 있었다. 그래서, 적절한 치료나 항균약을 선택하기 위해서, 마이코플라즈마 뉴모니아의 신속 또한 확실한 검출이 요구되어 있었다.
또한, 마이코플라즈마 뉴모니아를 신속하게 검출하는 시도는 이루어지고 있지만, 또한 마이코플라즈마 뉴모니아를 특이적으로 검출할 수 있는 특이적 항체, 또한 상기 항체를 포함하는 면역 측정법 및 키트가 요구되어 있었다.
일본 특허 공개 평 5-304990호 공보 일본 특허 공개 2013-72663호 공보 국제 공개 WO2011/068189호 공보
G. Layh-Schmitt 외, 「The adhesin related 30-kDa protein of Mycoplasma peumoniae exhibits size and antigen variability.」, FEMS Microbiology Letters, 152, 1997, 101-108쪽.
본 발명은 생체 시료 중의 마이코플라즈마 뉴모니아의 P30 단백질을 특이적으로 검출함으로써, 마이코플라즈마 뉴모니아에 의한 감염의 진단을 종래보다 높은 정밀도로 행할 수 있도록 하는 것이다.
본 발명자들은 마이코플라즈마 뉴모니아의 P30 단백질을 면역원으로서 마우스를 면역하여 P30 단백질의 특정 에피토프에 대한 항체를 취득하는데 성공하고, 상기 항체를 면역 측정법, 특히 샌드위치식 면역 측정법, 특히 면역크로마토그래피 측정법에 사용함으로써 마이코플라즈마 뉴모니아를 종래보다 특이적 또한 고감도로 검출할 수 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명의 일 국면에 의하면, 마이코플라즈마 뉴모니아의 P30 단백질에 한 항체를 사용하는 면역 측정법으로 이루어지고, 상기 항체가 서열번호 3~5 중 어느 하나의 아미노산 서열에 위치하는 에피토프에 대한 항체인 마이코플라즈마 뉴모니아의 검출법이 제공된다.
마찬가지로, 마이코플라즈마 뉴모니아의 P30 단백질에 대한 항체를 적어도 구비하고 있고, 상기 항체가 서열번호 3~5 중 어느 하나의 아미노산 서열에 위치하는 P30 단백질의 에피토프에 대한 항체인 마이코플라즈마 뉴모니아의 면역학적 측정 키트가 제공된다.
이 검출법 및 면역학적 측정 키트에 있어서의 면역 측정법으로서는 특히 ELISA(Enzyme-linked Immunosorbent assay)법, 면역크로마토그래피 측정법 등의 샌드위치식 면역 측정법이 바람직하다.
따라서, 본 발명의 다른 국면에 의하면, 마이코플라즈마 뉴모니아의 P30 단백질에 대한 제 1 항체와 제 2 항체를 사용한 샌드위치식 면역 측정법으로 이루어지고, 상기 제 1 항체 및 상기 제 2 항체 중 적어도 어느 일방이 서열번호 3~5 중 어느 하나의 아미노산 서열에 위치하는 에피토프에 대한 항체인 마이코플라즈마 뉴모니아의 검출법이 제공된다.
마찬가지로, 마이코플라즈마 뉴모니아의 P30 단백질에 대한 제 1 항체와 제 2 항체를 적어도 구비하고 있고, 상기 제 1 항체 및 상기 제 2 항체 중 적어도 어느 일방이 서열번호 3~5 중 어느 하나의 아미노산 서열에 위치하는 P30 단백질의 에피토프에 대한 항체인 마이코플라즈마 뉴모니아의 샌드위치식 면역 측정 키트가 제공된다.
또한, 본 발명의 바람직한 실시형태에 의하면, 마이코플라즈마 뉴모니아의 P30 단백질에 대한 제 1 항체를 미리 소정 위치에 고정시켜 형성된 포착 부위를 구비하는 막 담체를 준비하고, 상기 P30 단백질에 대한 제 2 항체와 소정량의 피검시료의 혼합액을 상기 포착 부위를 향하여 상기 막 담체로 크로마토 전개시키고, 상기 피검시료 중에 포함되는 항원과 상기 제 2 항체의 복합체를 상기 포착 부위에 포착시키는 면역크로마토그래피 측정법으로서, 상기 제 1 항체 및 상기 제 2 항체 중 적어도 어느 일방이 서열번호 3~5 중 어느 하나의 아미노산 서열에 위치하는 에피토프에 대한 항체인 마이코플라즈마 뉴모니아 검출용 면역크로마토그래피 측정법이 제공된다.
또한, 본 발명의 바람직한 실시형태에 의하면, 마이코플라즈마 뉴모니아의 P30 단백질에 대한 제 1 항체와 제 2 항체와 막 담체를 적어도 구비하고, 상기 제 1 항체는 상기 막 담체의 소정 위치에 미리 고정되어 포착 부위를 형성하고, 상기 제 2 항체는 적당한 표지 물질로 표지되고, 또한 상기 포착 부위로부터 이격된 위치에 상기 막 담체로 크로마토 전개 가능하도록 준비되어 이루어지는 면역크로마토그래피 테스트 스트립으로서, 상기 제 1 항체 및 상기 제 2 항체 중 적어도 어느 일방이 서열번호 3~5 중 어느 하나의 아미노산 서열에 위치하는 에피토프에 대한 항체인 마이코플라즈마 뉴모니아 검출용 면역크로마토그래피법 테스트 스트립이 제공된다.
본 발명에서 필수적으로 사용하는 P30 단백질에 대한 항체는 서열번호 3~5 중 어느 하나의 아미노산 서열에 위치하는 에피토프에 대한 항체이고, 폴리클로날 항체이어도, 모노클로날 항체이어도 좋지만, 반응 특이성의 관점에서 모노클로날 항체로 하는 것이 바람직하다.
또한, 서열번호 3~5의 아미노산 서열은 서열번호 1로 나타내어지는 P30 단백질의 전체 아미노산 서열의 일부를 구성하는 것이고, P30 단백질의 에피토프를 포함하는 영역이다.
면역크로마토그래피 측정법 등의 샌드위치식 면역 측정법의 경우, 거기서 사용하는 제 1 항체 및 제 2 항체는 각각 폴리클로날 항체이어도, 모노클로날 항체이어도 좋지만, 반응 특이성의 관점에서 일반적으로 적어도 일방의 항체를 모노클로날 항체로 하는 것이 바람직하고, 양방의 항체를 모노클로날 항체로 하는 것이 특히 바람직하다. 또한, P30 단백질은 균체 표면에 국재하여 다수 존재하고 있지만, 사용된 항체에 의한 경합 반응을 회피하고, 보다 높은 반응성을 갖기 위해서도 제 1 항체와 제 2 항체는 P30 단백질의 다른 에피토프에 대한 항체인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 마이코플라즈마 뉴모니아 검출용 항체가 반응하는 마이코플라즈마 뉴모니아의 P30 단백질은 마이코플라즈마가 생체 세포에 접착할 때에 필요한 단백질이고, 접착 인자인 P1 단백질과 함께 작용하여 액세서리 단백질 중 하나로서 알려져 있다.
P30 단백질은 분자량 30KDa의 단백질이고, P1 단백질과 마찬가지로 접착과 병원성에 관계되는 접착 단백질 중 하나이다. 마이코플라즈마 뉴모니아의 균체에 있어서는 접착 기관의 선단부의 세포 표면에 국재하고 있고, 세포막 내에 매몰되어 있는 N말단 영역과 세포막 외에 존재하는 C말단 영역을 가지는 막 관통형 단백질이다. 또한, C말단 영역에는 프롤린을 많이 포함하는 아미노산 서열이 존재하고, 상기 서열의 반복 구조가 존재한다. 일반적으로 프롤린을 많이 포함하는 아미노산 서열로 이루어지는 영역은 입체적인 고차 구조를 취하는 것으로 알려져 있고, 항체 반응하는 에피토프가 될 가능성이 높은 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 사용하는 항체는 서열번호 1로 나타내어지는 P30 단백질의 전체 아미노산 중, 서열번호 3~5 중 어느 하나의 아미노산 서열에 위치하는 에피토프에 대한 항체이다. 또한, 이들 항체는 다른 마이코플라즈마속과 반응하지 않고 마이코플라즈마 뉴모니아에만 반응하여 특이성이 우수하다. 서열번호 3~5의 아미노산 서열은 P30 단백질의 에피토프를 포함하는 영역이다. 따라서, 본 발명에서 사용하는 항체는 서열번호 3~5의 아미노산 서열 중 어느 하나에 포함되는 12~15 아미노산 잔기로 이루어지는 P30 단백질의 단편과 항원항체 반응하는 항체라고 바꿔 말할 수 있다.
이리하여, 본 발명의 다른 국면에 의하면, 서열번호 3~5 중 어느 하나의 아미노산 서열에 위치하는 P30 단백질의 에피토프를 인식하는 항체가 제공된다.
(발명의 효과)
본 발명에 의하면, 마이코플라즈마 뉴모니아 P30 단백질에 대하여 특이적으로 반응하는 항체를 제작하고, 상기 P30 단백질을 검출 마커로서 사용하여 면역학적 측정을 행함으로써 마이코플라즈마 뉴모니아의 감염을 신속 또한 특이적으로 진단할 수 있다. 또한, 본 발명의 면역학적 측정법 및 측정 기구에 의하면 특수한 기기 및 숙련한 기술을 필요로 하지 않아, 병원 등에 있어서 간편 또한 신속하게 마이코플라즈마 뉴모니아에 의한 감염의 진단을 종래보다 신속 또한 안전하게 행할 수 있다.
본 발명에 의하면, 면역 측정법에 의한 검출법에 있어서 서열번호 1로 나타내어지는 P30 단백질의 전체 아미노산 서열 중, 서열번호 3~5 중 어느 하나의 아미노산 서열에 위치하는 에피토프에 대한 항체를 사용하기로 했으므로, 마이코플라즈마 뉴모니아에 의한 감염의 진단을 종래보다 높은 정밀도로 행할 수 있고, 또한 고감도로 검출이 가능해져 초기에 검출할 수 있다.
도 1의 a는 면역크로마토법 테스트 스트립의 평면도, b는 a에서 나타낸 면역크로마토법 테스트 스트립의 종 단면도이다.
본 발명에 있어서, 항체의 제조 및 상기 항체를 사용하는 검출법 및 측정법에 있어서의 각 스텝은 각각, 그 자체, 공지의 면역학적 방법에 준거하여 행해진다.
본 발명에 있어서, 폴리클로날 항체는, 예를 들면 서열번호 1에 기재되는 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열 중, 서열번호 3~5의 아미노산 서열에 대응하는 DNA 단편을 클로닝하고, 상기 클론화 유전자를 대장균 등의 숙주에서 유전자 공학적으로 발현시켜 발현 단백질을 추출 및 정제하고, 이 정제 단백질을 항원으로서 상법에 따라서 동물을 면역하여 그 항혈청으로부터 얻을 수 있다.
본 발명에 있어서, 모노클로날 항체는, 예를 들면 상기와 마찬가지로 얻어진 정제 단백질을 항원으로서, 마우스와 같은 동물에 면역한 후 이 면역된 동물의 비장 세포와 미엘로마 세포를 세포 융합하여 얻어진 융합 세포를 HAT 함유 배지에서 선택한 후에 증식시킨다. 증식시킨 주를 상술한 바와 같이 하여 얻어진 서열번호 3~5의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 사용하고, 예를 들면 효소 표지 면역법 등에 의해 선별함으써 취득할 수 있다.
다른 방법으로서, 상기 모노클로날 항체는, 예를 들면 마이코플라즈마 뉴모니아 균체로부터 정제한 P30 단백질을 항원으로서, 마우스와 같은 동물에 면역한 후 이 면역된 동물의 비장 세포와 미엘로마 세포를 세포 융합하여 얻어진 융합 세포를 HAT 함유 배지에서 선택한 후에 증식시키고, 증식시킨 주로부터 서열번호 3~5의 폴리펩티드와 반응하는 주를 선별함으로써 취득할 수 있다.
본 발명의 항체는 항체 및 상기 항체와 실질적으로 동등한 마이코플라즈마 뉴모니아의 P30 단백질에 있어서의 서열번호 3~5의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드에 대하여 반응성을 갖는 항체 프래그먼트 및 개변 항체도 포함한다. 항체 프래그먼트로서는 Fab 프래그먼트, F(ab')2 프래그먼트, Fab' 프래그먼트, scFv 프래그먼트 등을 들 수 있다.
피검시료 중의 마이코플라즈마 뉴모니아를 검출하기 위한 본 발명의 면역크로마토그래피 측정법은 공지의 면역크로마토그래피법 테스트 스트립의 구성에 준거하여 용이하게 실시할 수 있다.
일반적으로, 이러한 면역크로마토그래피법 테스트 스트립은 항원의 제 1 항원 결정기에서 항체항원 반응 가능한 제 1 항체와, 상기 항원의 제 2 항원 결정기에서 항체항원 반응 가능하고 또한 표지된 제 2 항체와, 막 담체를 적어도 구비하고, 상기 제 1 항체는 상기 막 담체의 소정 위치에 미리 고정되어 포착 부위를 형성하고, 상기 제 2 항체는 상기 포착 부위로부터 이격된 위치에 상기 막 담체로 크로마토 전개 가능하게 배치되어 구성된다. 제 1 항체 및 제 2 항체는 상술한 바와 같이, 각각 폴리클로날 항체이어도 모노클로날 항체이어도 좋지만, 적어도 어느 일방이 모노클로날 항체인 것이 바람직하다. 통상은 제 1 항체 및 제 2 항체는 「헤테로」의 조합으로 사용되고, 즉 항원 상의 위치 및 구조 중 어느쪽이 다른 각 항원 결정기를 각각 인식하는 제 1 항체 및 제 2 항체가 조합되어 사용된다. 그러나, 제 1 항원 결정기와 제 2 항원 결정기는 항원 상의 위치가 다르면 구조적으로 동일이어도 좋고, 그 경우, 제 1 항체 및 제 2 항체는 「호모」의 조합의 모노클로날 항체이어도 좋고, 즉 제 1 항체 및 제 2 항체의 양방에 동일한 모노클로날 항체를 사용할 수 있다.
예를 들면, 도 1에 나타내어지는 테스트 스트립을 들 수 있다. 도 1에 있어서, 숫자 1은 점착 시트, 2는 함침 부재, 3은 막 담체, 31은 포착 부위, 32는 대조 포착 부위, 4는 흡수용 부재, 5는 시료 첨가용 부재를 나타내고 있다.
도시의 예에서는 막 담체(3)은 폭 5mm, 길이 36mm의 가늘고 긴 띠 형상의 니트로셀룰로오스제 멤브레인 필터로 작성되어 있다.
상기 막 담체(3)에는 그 크로마토 전개 시점측의 말단으로부터 7.5mm의 위치에 제 1 항체가 고정되어 검체의 포착 부위(31)가 형성된다. 또한, 막 담체(3)의 크로마토 전개 시점측의 말단으로부터 15mm의 위치에 대조 포착 부위(32)가 설치되어 있다. 이 대조 포착 부위(32)는 분석 대상 물질의 존부에 관계없이 반응이 행해지는 것을 확인하기 위한 것이고, 통상 상기 제 2 항체와 면역학적으로 특이적으로 결합하는 물질(분석 대상 물질을 제외함)을 막 담체(3)에 고정화함으로써 형성할 수 있다. 예를 들면, 제 2 항체로서 마우스 원래의 항체를 사용한 경우에는 상기 마우스 항체에 대한 항체를 사용할 수 있다.
도시의 예에서는 막 담체(3)는 니트로셀룰로오스제 멤브레인 필터를 사용하고 있지만, 피검시료에 포함되는 검체를 크로마토 전개 가능하고, 또한 상기 포착 부위(31)를 형성하는 항체를 고정 가능한 것이면 어떠한 것이어도 좋고, 다른 셀룰로오스류 막, 나일론 막, 유리섬유 막 등도 사용할 수 있다.
함침 부재(2)는 상기 제 1 항체가 결합하는 제 1 항원 결정기와 다른 부위에 위치하는 제 2 항원 결정기에서 상기 항원과 항체항원 반응하는 제 2 항체를 함침시킨 부재로 이루어진다. 상기 제 2 항체는 적당한 표지 물질로 미리 표지된다.
도시의 예에서는 함침 부재(2)로서 5mm×15mm의 띠 형상의 유리섬유 부직포를 사용하고 있지만 이에 한정되는 것은 아니고, 예를 들면 셀룰로오스류 천(여과지, 니트로셀룰로오스 막 등), 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 등의 다공질 플라스틱 천류 등도 사용할 수 있다.
제 2 항체의 표지 물질로서는 사용 가능한 것이면 어떠한 물질이어도 좋고, 정색 표지 물질, 효소 표지 물질, 형광 표지 물질, 방사선 표지 물질 등을 들 수 있다. 이 중, 포착 부위(31)에서의 색의 변화를 육안으로 관찰함으로써 신속 또한 간편하게 판정할 수 있는 점에서, 정색 표지 물질을 사용하는 것이 바람직하다.
정색 표지 물질로서는 금 콜로이드, 백금 콜로이드 등의 금속 콜로이드 이외에, 적색 및 청색 등의 각각의 안료로 착색된 폴리스티렌 라텍스 등의 합성 라텍스나, 천연고무 라텍스 등의 라텍스를 들 수 있고, 이 중, 금 콜로이드 등의 금속 콜로이드가 특히 바람직하다.
상기 함침 부재(2)는 표지된 제 2 항체의 현탁액을 상기 유리섬유 부직포 등의 부재에 함침시키고, 이것을 건조시키는 것 등에 의해 제작할 수 있다.
도 1에 나타내는 바와 같이, 막 담체(3)를 점착 시트(1)의 중간 정도에 점착하고, 상기 막 담체(3)의 크로마토 전개의 개시점측(즉, 도 1의 좌측, 이하 「상류측」이라고 기재하고, 또한 그 역의 측, 즉 도 1의 우측을 이하 「하류측」이라고 기재함)의 말단 상에, 함침 부재(2)의 하류측 말단을 겹쳐서 접속함과 아울러, 이 함침 부재(2)의 상류측 부분을 점착 시트(1)에 점착하여 본 발명의 면역크로마토그래피법 테스트 스트립을 제작할 수 있다.
또한, 필요에 따라서 함침 부재(2)의 상면에 시료 첨가용 부재(5)의 하류측 부분을 적재함과 아울러, 상기 시료 첨가용 부재(5)의 상류측 부분을 점착 시트(1)에 접착해도 좋고, 또한 막 담체(3)의 하류측 부분의 상면에 흡수용 부재(4)의 상류측 부분을 적재함과 아울러, 상기 흡수용 부재(4)의 하류측 부분을 점착 시트(1)에 접착시킬 수도 있다.
흡수용 부재(4)는 액체를 신속하게 흡수, 유지할 수 있는 재질이면 좋고, 면포, 여과지, 및 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 등으로 이루어지는 다공질 플라스틱 부직포 등을 들 수 있지만, 특히 여과지가 최적이다. 또한, 흡수성 폴리머를 포함한 복합 재료로 이루어지는 여과지도 사용할 수 있다.
시료 첨가용 부재(5)로서는, 예를 들면 다공질 폴리에틸렌 및 다공질 폴리프로필렌 등과 같은 다공질 합성 수지의 시트 또는 필름, 및 여과지 및 면포 등과 같은 셀룰로오스제 종이 또는 직포 또는 부직포를 사용할 수 있다.
또한, 도 1의 면역크로마토그래피법 테스트 스트립은 시료 첨가용 부재(5)와 포착 부위(31)의 상방에 각각 피검시료 주입부와 판정부가 개구된 적당한 플라스틱제 케이스 내에 수용되어 제공될 수 있다. 사용자의 2차 감염을 방지하는 목적으로 면역크로마토그래피법 테스트 스트립은 플라스틱제 케이스 내에 수용되어 제공되는 것이 바람직하다.
이리하여, 생체 시료 등으로 이루어지는 피검시료를 필요에 따라서 적당한 전개 용매와 혼합하여 크로마토 전개 가능한 혼합액을 얻은 후, 상기 혼합액을 도 1에 나타내어지는 면역크로마토그래피법 테스트 스트립의 시료 첨가용 부재(5) 상에 주입하면, 상기 혼합액은 상기 시료 첨가용 부재(5)를 통과하여 함침 부재(2)에 있어서 표지된 제 2 항체와 혼합한다.
그 때, 상기 혼합액 중에 피검출물이 존재하면, 항원항체 반응에 의해 피검출물과 제 2 항체의 복합체가 형성된다. 이 복합체는 막 담체(3) 중을 크로마토 전개되어 포착 부위(31)에 도달하고, 거기에 고정된 제 1 항체와 항원항체 반응하여 포착된다.
이 때, 표지 물질로서 금 콜로이드 등의 정색 표지 물질이 사용되고 있으면, 상기 정색 표지 물질의 집적에 의해 포착 부위(31)가 발색하므로 즉시 검체를 정성적 또는 정량적으로 측정할 수 있다. 또한, 면역크로마토그래피법 테스트 스트립의 포착 부위(31)에 집적한 상기 정색 표지 물질의 정색 강도를 면역크로마토 리더에 의한 광학적 판독을 행함으로써, 정색 강도를 수치화하여 정량적으로 측정할 수 있다.
또한, 정상으로 크로마토 전개가 된 경우에는 피검출물과 항원항체 반응하지 않은 제 2 항체가 대조 포착 부위(32)에 도달하고, 거기에 고정된 제 2 항체에 대하여 반응하는 항체에 포착된다. 이 때, 표지 물질로서 정색 표지 물질이 사용되고 있으면, 상기 정색 표지 물질의 집적에 의해 대조 포착 부위(32)가 발색하여 정상으로 크로마토 전개가 이루어진 것이 확인된다. 한편, 대조 포착 영역(32)이 발색하지 않은 경우에는 제 2 항체의 전개가 이루어지지 않는 등의 문제가 발생한 것으로 확인된다.
피검시료로서는 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 비강 흡인액, 비인두 흡인액, 비강 와이핑액, 인두 와이핑액, 비인두 와이핑액 객담, 타액, 기관지 세정액 등 마이코플라즈마 뉴모니아가 존재할 수 있는 생체 시료를 들 수 있다. 피검시료는 생리식염수나 전개 용매 등의 적당한 희석액으로 희석하여 막 담체에 주입해도 좋다.
또한, 혈액이 혼입한 피검시료를 사용할 때에, 특히 표지 항체의 표지 물질로서 금 콜로이드 등의 정색 표지 물질이 사용되는 경우, 상기 시료 첨가용 부재에 혈구 포착 막 부재를 배치해 두는 것이 바람직하다. 혈구 포착 막 부재는 상기 함침 부재와 상기 시료 첨가용 부재 사이에 적층하는 것이 바람직하다. 이에 따라, 적혈구가 막 담체에 전개되는 것이 저지되므로, 막 담체의 포착 부위에 있어서의 정색 표지 물질의 집적의 확인이 용이하게 된다. 혈구 포착 막 부재로서는 카르복시메틸셀룰로오스 막을 사용할 수 있고, 구체적으로는 Advantec Toyo Kaisha, Ltd.로부터 판매되고 있는 이온교환 여과지 CM(상품명)이나, Watt Mann Co., Ltd.로부터 판매되고 있는 이온교환 셀룰로오스 페이퍼 등을 사용할 수 있다.
실시예
하기 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이 실시예에 한정되는 것은 아니다.
(실시예 1: 재조합 P30 단백질의 발현과 정제)
마이코플라즈마 뉴모니아 M129주의 P30 단백질의 아미노산 서열을 DDBJ(일본 유전학 연구소 데이터베이스)로부터 입수했다. 상기 P30 단백질의 아미노산 서열로부터, 막 관통 도메인을 제외한 세포외 영역인 서열번호 2에 나타내는 아미노산 서열(AA74-274)을 특정하여 대응하는 유전자 서열을 합성했다. His-tag 발현용 벡터인 pET302/NT-His를 제한 효소 EcoRI로 절단한 후 탈인산화 처리로서 알칼리 포스파타아제에 의해 처리하고, 상기 유전자 서열과 혼합하여 DAN Ligation Kit Ver.2(Takara Bio Inc.)를 이용하여 리게이션 반응을 행했다. 목적의 유전자를 조합한 재조합 P30 플러스미드를 재조합 단백 발현용 숙주 E.coli BL(DE3) pLysS(Novagen 제작)에 도입했다. 도입 균을 LB 한천 평판 배지에서 배양하고, 얻어진 콜로니를 LB 액체 배지에서 배양했다. 또한, 1mM IPTG(Takara Bio Inc. 제작)를 첨가하여 재조합 P30 단백질의 발현을 유도한 후 E.coli를 회수했다. 회수한 균을 가용화 버퍼[0.5% Triton X-100(SIGMA Corporation 제작), 10mM Imidazole, 20mM Phosphate 및 0.5M NaCl(pH7.4)(Amersham 제작)]에 재부유하고, 초음파 처리에 의해 가용화한 후 재조합 P30 단백질을 His trap 키트(Amersham 제작)를 이용하여 정제했다. 이 정제 단백질을 인산 완충 생리식염수(이하, PBS라고 칭함)에 대하여 투석하여 목적의 재조합 P30 단백질이라고 했다.
(실시예 2: 재조합 P30 단백질에 대한 모노클로날 항체의 작출)
실시예 1에서 얻어지는 재조합 P30 단백질을 면역용 항원으로서, 재조합 P30 단백질에 대한 모노클로날 항체(이하, 항 P30항체라고 칭함)를 작출했다. 모노클로날 항체의 작출은 상법을 따라서 행했다. 100㎍의 재조합 P30 단백질과 등량의 Aduvant Complete Freund(Difco 제작)를 혼합하고, 마우스(BALB/c, 5주령, Japan SLC, Inc.)에 3회 면역하여 그 비장 세포를 세포 융합에 사용했다. 세포 융합에는 마우스의 골수종 세포인 Sp2/0-Ag14 세포(Shulman 외, 1978)를 사용했다. 세포의 배양에는 Dulbecco's Modified Eagle Medium(Gibco 제작)에 L-글루타민 0.3mg/ml, 페니실린 G 칼륨 100단위/ml, 황산 스트렙토마이신 100㎍/ml, Gentacin 40㎍/ml을 첨가하고(이하, DMEM이라고 칭함), 이것에 소태아 혈청(JRH 제작)을 10%가 되도록 첨가한 배양액을 사용했다. 세포 융합은 면역 마우스의 비장 세포와 Sp2/0-Ag14 세포를 혼합하고, 거기에 Polyethylene glycol solution(SIGMA Corporation 제작)을 첨가함으로써 행했다. 융합 세포는 HAT-DMEM[0.1mM Sodium Hypoxanthine, 0.4μM Aminopterin 및 0.016mM Thymidine(Gibco 제작)을 포함하는 혈청가 DMEM]에서 배양하고, 효소 결합 항체법(ELISA)에 의해 배양 상청 중의 항체 생산을 확인했다. 항체 생산 양성의 세포를 HT-DMEM[0.1mM Sodium Hypoxantine 및 0.16mM Thmidine을 포함하는 혈청가 DMEM]에서 배양하고, 혈청가 DMEM에서 배양을 더 계속했다.
(실시예 3: 모노클로날 항체의 조제)
클로닝한 세포는 2,6,10,14-Tetramethylpentadecane(SIGMA Corporation 제작)을 접종해 둔 마우스(BALB/c, 리타이어, Japan SLC, Inc.)에 복강내 접종하여 복수를 채취했다. 이 복수를 단백질 G 컬럼에 제공하여 모노클로날 항체를 정제했다. 작출한 모노클로날 항체의 동종을 Mouse Monoloconal Antibody Isotyping Reagents(SIGMA Corporation 제작)를 이용하여 분류했다.
최종적으로 P30 단백질에 대한 모노클로날 항체 생산 세포가 6클론 얻어진다.
(참고예 1: 시험용 표준 균액의 제작)
마이코플라즈마 뉴모니아의 M129주 및 FH주의 표준주를 PPLO 액체 배지에 접종하여, 소정의 농도가 될 때까지 5% CO2 분위기 하, 37℃에서 배양했다. 얻어진 배양액을 PPLO 액체 배지에서 10만배 희석액까지 10배 단계 희석액을 조제하고, 그 각 희석액을 PPLO 한천 배지 상의 발육 콜로니수를 실체 현미경 하에서 계측하여 균 농도를 산출했다. 얻어진 배양액을 시험용 균액이라고 했다.
(비교예 1: 마이코플라즈마 뉴모니아 P1 단백질의 정제)
마이코플라즈마 뉴모니아 M129주를 PPLO 액체 배지에 접종하고, 37℃에서 배양했다. 얻어진 배양액을 원심분리하여 균체를 회수했다. 균체로부터의 P1 단백질의 정제 방법은 Nakane 외의 방법(Journal of Bacteriology, 2011)에 근거하여 실시했다.
얻어진 균체는 PBS, pH7.4에서 2회 세정했다. 상기 균체를 1％ CHAPS를 포함하는 PBS에 현탁시킨 후 상기 현탁액을 원심분리하고, 또한 얻어진 침사에 대하여 2% 옥틸글루코시드를 포함하는 PBS를 첨가하여 용해시켰다. 상기 용액을 원심분리하여 상청을 회수했다. 얻어진 상청을 유안 분획에 제공하고, 원심분리에 의해 잔류물을 얻었다. 얻어진 잔류물을 0.3％ Triton X-100을 포함하는 PBS에 용해시키고 Superdex 200을 사용한 겔 여과 컬럼크로마토그래피에 의해 정제했다. 이 정제 단백질을 포함하는 화분을 SDS-page에 의해 분석하여 약 170kDa에 단일인 밴드를 확인하고, 목적의 P1 단백질을 얻었다.
(실시예 4: 항 P30 항체의 에피토프 해석)
서열번호 1의 마이코플라즈마 뉴모니아 유래의 P30 단백질의 아미노산 서열로부터, N말단측에 존재하는 프롤린을 많이 포함하는 영역으로부터 에피토프가 될 수 있는 가능성이 있는 아미노산 서열을 선택하고, 서열번호 3~5의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 합성했다. 합성한 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열의 N말단으로부터 178-189번째의 GMAPRPGMPPHP(서열번호 3), 190~201번째의 GMAPRPGFPPQP(서열번호 4), 및 250-262번째의 GMAPRPGMQPPRP(서열번호 5)이었다. 또한, 서열번호 3에 나타내는 서열은 N말단으로부터 202~213번째 및 226~237번째에 있어서 동일한 서열이 존재하고, 또한 서열번호 4에 나타내는 서열은 214-225번째 및 238~249번째에 있어서 동일한 서열이 존재한다. 즉, 서열번호 3 및 4의 아미노산 서열은 P30 단백질 내에 복수 존재하고, 반복 구조를 갖고 있다.
상기 서열번호 3~5에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 96웰 마이크로 플레이트에 첨가하여 고상화했다. 대조적으로, 마이코플라즈마 뉴모니아(M.pneumoniae) 정제 균체, 실시예 1에서 조제한 정제 P30 단백질, P30 단백질의 N말단측으로부터 101~125번째의 KRKEKRLLEEKERQEQLORIS(서열번호 6), 126~145번째의 AQQEEQQALEQQAAAEAHAE(서열번호 7)로 이루어지는 폴리펩티드, 및 참고예 1에서 조제한 마이코플라즈마 뉴모니아의 P1 단백질을 고상화하고, 상기와 마찬가지로 실시예 3에서 작출한 모노클로날 항체의 반응성을 확인했다.
펩티드를 소정의 농도에서 고상화한 마이크로 플레이트에, 실시예 3에서 제작한 모노클로날 항체를 첨가하고 실온에서 1시간 반응시켰다. 다음에, 웰 내의 용액을 흡인 제거하고, 세정 후 비오틴 표지 항 마우스 항체를 반응시켰다. 1시간의 반응 후, 웰 내의 용액을 흡인 제거하고 세정한 후, 아비딘 표지 겨자무과산화효소를 첨가하여 반응시켰다. 그 후에, 발색 기질로서 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMBZ) 용액을 첨가하고 반응시켜, 2규정의 황산에 의해 반응을 정지시켰다. 마이크로 플레이트 리더(Biorad 제작)로 주파장 450nm에서 흡광도를 측정했다. 결과를 표 1에 나타낸다.
Figure pct00001
상기 결과로부터, 모노클로날 항체 BLMP001은 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드에 가장 강한 반응을 나타냈다. 또한, 유사 서열인 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드에 대해서도 반응을 나타냈다.
모노클로날 항체 BLMP002는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드에 대하여 강한 반응을 나타내고, 모노클로날 항체 BLMP003은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드에 강한 반응을 나타냈다. 모노클로날 항체 BLMP001과 마찬가지로, 유사한 아미노산 서열로 이루어지는 다른 폴리펩티드에 대해서도 반응성을 나타냈다.
모노클로날 항체 BLMP004는 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 모두에 대해서 반응을 나타냈다. 각각의 아미노산 서열에 있어서의 공통되는 서열을 인식하는 모노클로날 항체인 것으로 추측된다.
모노클로날 항체 BLMP001, BLMP002 및 BLMP003은 M.pneumoniae 정제 균체 및 정제 P30 단백질에 대해서 높은 반응을 나타내고, 대조로 한 정제 P1 단백질에 대해서 반응성을 나타내지 않았다.
따라서, 모노클로날 항체 BLMP001은 P30 단백질이 있어서의 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 인식하고, 모노클로날 항체 BLMP002는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 인식하고, 모노클로날 항체 BLMP003은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 인식하는 항체인 것이 확인되었다.
(실시예 5: 항 P30 항체를 사용한 면역크로마토그래피법 테스트 스트립의 제작)
(1) 항 P30 항체의 조제
실시예 3에서 얻어진 모노클로날 항체 BLMP001 생산 세포 및 모노클로날 항체BLMP004 생산 세포를 마우스 복강에 접종하여 얻어진 복수 각각을, 상법에 의해 단백질 G를 사용한 IgG 정제를 더 행하여 항 P30 항체라고 했다.
(2) 백금-금 콜로이드 입자 용액의 조제
사용하는 유리 기구의 모두를 왕수로 세정했다. 390ml의 초순수를 플라스크에 넣고 비등시키고, 이 비등수에 염화금산 수용액(수용액 1L당 금으로서 1g, Katayama Chemical Iudustries Co., Ltd. 제작) 30ml을 첨가하고, 그 후에 1중량% 시트르산 나트륨 수용액 60ml을 첨가하고, 6분 45초 후에 염화백금산 수용액(수용액 1L당 백금으로서 1g, Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 제작) 30ml을 첨가했다. 염화백금산 수용액 첨가로부터 5분 후에 1중량% 시트르산 나트륨 수용액 60ml을 첨가하고, 4 시간 환류를 행하여 백금-금 콜로이드 현탁액을 얻었다.
(3) 백금-금 콜로이드 표지 항 P30 항체 용액의 조제
백금-금 콜로이드 표지하는 항 P30 항체로서, 상기 (1)에서 얻어진 모노클로날 항체 BLMP001을 사용하고, 하기의 순서로 백금-금 콜로이드 표지를 행했다.
항 P30 항체의 단백 환산 중량 1㎍(이하, 항체의 단백 환산 중량을 나타낼 때, 간단히 그 정제 단백질의 중량 분석에 의한 중량 수치로 나타냄)과, 상기 (2)의 백금-금 콜로이드 용액 1ml를 혼합하고, 실온에서 2분간 정치하여 이 항체의 전부를 백금-금 콜로이드 입자 표면에 결합시킨 후 백금-금 콜로이드 용액에 있어서의 최종 농도가 1%가 되도록 10% 소혈청 알부민(이하, 「BSA」라고 기재함) 수용액을 첨가하고, 이 백금-금 콜로이드 입자의 나머지의 표면을 전부 이 BSA로 블록 하여 백금-금 콜로이드 표지 항 P30 항체(이하, 「백금-금 콜로이드 표지 항체」라고 기재함) 용액을 조제했다. 이 용액을 원심분리(5600×G, 30분간)하여 백금-금 콜로이드 표지 항체를 침전시키고, 상청액을 제외하여 백금-금 콜로이드 표지 항체를 얻었다. 이 백금-금 콜로이드 표지 항체를 10% 사카로오스 1% BSA 0.5% Triton-X100을 함유하는 50mM 트리스 염산 완충액(pH7.4)으로 현탁하여 백금-금 콜로이드 표지 항체 용액을 얻었다.
(4) 마이코플라즈마 뉴모니아의 P30 단백질 검출용 면역크로마토그래피법 테스트 스트립의 제작
(4-1) 마이코플라즈마 뉴모니아의 P30 단백질과 금 콜로이드 표지 항체의 복합체의 포착 부위
폭 5mm, 길이 36mm의 가늘고 긴 띠 형상의 니트로셀룰로오스 막을 크로마토그래피 매체의 크로마토 전개용 막 담체(3)로서 준비했다. 항 P30 항체 1.0 mg/ml이 함유되어 이루어지는 용액 0.5㎕를 이 크로마토 전개용 막 담체(3)에 있어서의 크로마토 전개 개시점측의 말단으로부터 7.5mm의 위치에 라인 형상으로 도포하고, 이것을 실온에서 건조하여 마이코플라즈마 뉴모니아의 P30 단백질과 백금-금 콜로이드 표지 항체의 복합체의 포착 부위(31)라고 했다. 이 도포용 항 P30 항체로서, 상기 (1)에서 얻어진 모노클로날 항체 BLMP004를 사용했다.
(4-2) 백금-금 콜로이드 표지 항체 함침 부재
5mm×15mm의 띠 형상의 유리섬유 부직포에, 백금-금 콜로이드 표지 항체 용액 37.5㎕를 함침시키고, 이것을 실온에서 건조시켜 백금-금 콜로이드 표지 항체 함침 부재(2)라고 했다.
(4-3) 면역크로마토그래피법 테스트 스트립의 제작
상기 크로마토 전개용 막 담체(3), 상기 표지 항체 함침 부재(2) 이외에, 시료 첨가용 부재(5)로서 면포와 흡수용 부재(4)로서 여과지를 준비했다. 그리고, 이들의 부재를 이용하여, 도 1과 동일한 면역크로마토그래피법 테스트 스트립을 제작했다.
(5) 시험
마이코플라즈마 뉴모니아의 M129주 및 FH주의 배양균액을 검체 추출액으로 희석하고, 소정의 농도로 조제하여 피검시료라고 했다. 그리고, 피검시료 100㎕를 이용하여 상기 (4)에서 얻어진 테스트 스트립의 시료 첨가용 부재(5)에 마이크로 피펫으로 적하하여 크로마토 전개하고, 실온에서 15분 방치 후 상기 포착 부위(31)에서 포착된 P30 단백질과 백금-금 콜로이드 표지 항체의 복합체의 포착량을 육안으로 관찰했다. 포착량은 그 양에 비례하여 증감하는 흑색의 정색 정도를 육안으로 -(착색 없음), ±(미약한 착색), +(명확한 착색), ++(현저한 착색), +++(매우 현저한 착색)의 5단계로 구분하여 판정했다. 음성 대조로서, 마이코플라즈마 제니탈리움(M.genitalium)의 배양균액을 소정의 농도에서 사용했다.
그 결과를 표 2에 나타낸다. 표 2로부터 명백한 바와 같이, 마이코플라즈마 뉴모니아의 2주에 대해서 높은 반응성을 나타내고, 음성 대조인 마이코플라즈마 제니탈리움에 대해서는 적용한 농도 모두에 있어서 음성을 나타냈다. 2종의 항 P30 항체를 사용한 면역크로마토그래피 측정법에 의해, 고감도 또한 고정밀도로 마이코플라즈마 뉴모니아를 검출할 수 있는 것을 알았다.
Figure pct00002
(실시예 6: P30 단백질 검출 면역크로마토그래피법 테스트 스트립과 P1 단백질 검출 면역크로마토그래피법 테스트 스트립의 반응성 비교 시험)
참고예 1에서 조제한 마이코플라즈마 뉴모니아의 M129주 및 FH주의 배양균액을 검체 추출액에서 소정의 농도로 조제하여 피검시료라고 했다. 각 면역크로마토그래피법 테스트 스트립에, 피검시료 100㎕를 시료 첨가용 부재(5)에 마이크로 피펫으로 각각 적하하여 크로마토 전개하고, 실온에서 15분간 방치 후 포착 부위(31)에서 포착된 항원과 백금-금 콜로이드 표지 항체의 복합체를 육안으로 관찰하여 판정을 행했다. 포착량은 그 양에 비례하여 증감하는 흑색의 정색 정도를 육안으로 -(착색 없음), ±(미약한 착색), +(명확한 착색), ++(현저한 착색), +++(매우 현저한 착색)의 5단계로 구분하여 판정했다. 종래법으로서, 시판되고 있는 마이코플라즈마 뉴모니아의 P1 단백질을 검출하는 시약을 사용했다. 결과를 표 3에 나타낸다.
Figure pct00003
표 3으로부터 명백한 바와 같이, 본 발명의 실시예 5에서 제작한 P30 단백질 검출용 면역크로마토그래피법 테스트 스트립을 사용한 경우, M129주에서는 1×107CFU/ml, FH주에서는 1×106CFU/ml에서 현저한 정색을 나타내고, M129주에서는 1×106CFU/ml, FH주에서는 1×105CFU/ml에서 명확한 정색을 나타냈다.
한편, 종래법은 M129주에서는 1×107CFU/ml 이상에서, FH주에서는 1×107CFU/ml에서 명확한 정색을 나타냈다.
표 3의 결과로부터 명백한 바와 같이, 동일한 정색 강도를 나타낸 피검시료의 균 농도를 비교한 결과, 본 발명의 실시예 5에서 제작한 P30 단백질 검출용 면역크로마토그래피법 테스트 스트립이 P1 단백질 검출용 면역크로마토그래피법 테스트 스트립에 대하여 M129주에 있어서 약 100배, FH주에 있어서 100배 검출 감도가 높은 것으로 나타났다. 또한, 종래법은 마이코플라즈마 제니탈리움에 대하여, 약간이나마 교차 반응을 나타내고, 비특이적 정색이 확인되었다. 본 발명의 P30 단백질 검출용 면역크로마토그래피법 테스트 스트립에 있어서 교차 반응은 확인되지 않았다.
이상의 결과로부터, 본 발명의 항 P30 항체를 사용한 P30 단백질 검출용 면역크로마토그래피법 테스트 스트립에 의해, 마이코플라즈마 뉴모니아를 고감도 또한 특이적으로 검출하는 것이 가능한 것으로 나타났다.
(실시예 7: 인두 와이핑액으로부터 마이코플라즈마 뉴모니아의 검출)
임상적으로 마이코플라즈마 뉴모니아의 감염이 의심되는 환자 20명을 대상으로 하여 상기 환자로부터 멸균한 면봉을 이용하여 인두 와이핑액을 채취했다. 상기 인두 와이핑액은 일본 감염증 연구소 보고의 핵산 증폭법에 의해, 인두 와이핑액 중에 마이코플라즈마 뉴모니아가 존재하는지를 확인했다. 그 결과로부터, 채취한 인두 와이핑액 중에서 마이코플라즈마 뉴모니아의 존재가 확인된 검체 16예(양성예)와 유전자가 검출되지 않은 검체 4예(음성예)를 선택하고, 선택된 인두 와이핑액을 피검시료로서 조제했다. 피검시료는 본 발명의 P30 단백질 검출 면역크로마토그래피법 테스트 스트립을 이용하여 마이코플라즈마 뉴모니아의 검출을 실시했다. 종래법으로서 시판되고 있는 마이코플라즈마 뉴모니아의 P1 단백질을 검출하는 시약을 사용했다.
피검시료 100㎕를 실시예 5에서 제작한 면역크로마토그래피법 테스트 스트립의 시료 첨가용 부재(5)에 마이크로 피펫으로 각각 적하하여 크로마토 전개하고, 실온에서 15분간 방치 후 포착 부위(31)에서 포착된 항원과 백금-금 콜로이드 표지 항체의 복합체를 육안으로 관찰하여 판정을 행했다. 포착량은 그 양에 비례하여 증감하는 흑색의 정색 정도를 육안으로 -(착색 없음), ±(미약한 착색), +(명확한 착색), ++(현저한 착색), +++(매우 현저한 착색)의 5단계로 구분하여 판정했다. 시험의 결과를 표 4에 나타낸다.
Figure pct00004
표 4로부터 명백한 바와 같이, 본 발명의 검출법과 핵산 증폭법의 비교 결과로부터, 본 발명의 검출법은 양성 일치율 93.8%, 음성 일치율 100.0%, 및 전체 일치율 95.0%로 매우 높은 일치율을 나타내고, 핵산 증폭법과 동등한 정밀도로 검출할 수 있는 것을 확인했다. 종래법과 비교하여, 본 발명의 검출법은 높은 검출 감도와 특이성을 갖는 검출법인 것으로 나타났다.
이상의 결과로부터, 본 발명의 면역크로마토그래피법 테스트 스트립은 인두 와이핑액으로부터 마이코플라즈마 뉴모니아를 고감도 또한 고정밀도로 검출할 수 있는 것을 확인했다.
(산업상의 이용 가능성)
본 발명에 의하면, 마이코플라즈마 뉴모니아의 P30 단백질에 있어서의 특정한 에피토프를 인식하는 항체를 사용하는 면역 측정법으로 이루어지는 마이코플라즈마 뉴모니아의 검출법 및 키트가 제공되고, 특수한 기기 및 숙련한 기술을 필요로 하지 않아, 종래법과 비교하여 마이코플라즈마 뉴모니아의 감염을 신속 또한 특이적으로 진단하는 것이 가능해진다.
1 점착 시트 2 함침 부재
3 막 담체 31 포착 부위
32 대조 포착 부위 4 흡수용 부재
5 시료 첨가용 부재
SEQUENCE LISTING <110> BL Co., Ltd. <120> Immunodetection of Mycoplasma pneumoniae and kit <130> IFP-1347 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 274 <212> PRT <213> Mycoplasma pneumoniae <400> 1 Met Lys Leu Pro Pro Arg Arg Lys Leu Lys Leu Phe Leu Leu Ala Trp 1 5 10 15 Met Leu Val Leu Phe Ser Ala Leu Ile Val Leu Ala Thr Leu Ile Leu 20 25 30 Val Gln His Asn Asn Thr Glu Leu Thr Glu Val Lys Ser Glu Leu Ser 35 40 45 Pro Leu Asn Val Val Leu His Ala Glu Glu Asp Thr Val Gln Ile Gln 50 55 60 Gly Lys Pro Ile Thr Glu Gln Ala Trp Phe Ile Pro Thr Val Ala Gly 65 70 75 80 Cys Phe Gly Phe Ser Ala Leu Ala Ile Ile Leu Gly Leu Ala Ile Gly 85 90 95 Leu Pro Ile Val Lys Arg Lys Glu Lys Arg Leu Ser Glu Glu Lys Glu 100 105 110 Arg Gln Glu Gln Leu Ala Glu Gln Leu Gln Arg Ile Ser Ala Gln Gln 115 120 125 Glu Glu Gln Gln Ala Leu Glu Gln Gln Ala Ala Ala Glu Ala His Ala 130 135 140 Glu Ala Glu Val Glu Pro Ala Pro Gln Pro Val Pro Val Pro Pro Gln 145 150 155 160 Pro Gln Val Gln Ile Asn Phe Gly Pro Arg Thr Gly Phe Pro Pro Gln 165 170 175 Pro Gly Met Ala Pro Arg Pro Gly Met Pro Pro His Pro Gly Met Ala 180 185 190 Pro Arg Ser Gly Phe Pro Pro Gln Pro Gly Met Ala Pro Arg Pro Gly 195 200 205 Met Pro Pro His Pro Gly Met Ala Pro Arg Pro Gly Phe Pro Pro Gln 210 215 220 Pro Gly Met Ala Pro Arg Pro Gly Met Pro Pro His Pro Gly Met Ala 225 230 235 240 Pro Arg Pro Gly Phe Pro Pro Gln Pro Gly Met Ala Pro Arg Pro Gly 245 250 255 Met Gln Pro Pro Arg Pro Gly Met Pro Pro Gln Pro Gly Phe Pro Pro 260 265 270 Lys Arg <210> 2 <211> 201 <212> PRT <213> Mycoplasma pneumoniae <400> 2 Phe Ile Pro Thr Val Ala Val Cys Phe Gly Phe Ser Ala Leu Ala Ile 1 5 10 15 Ile Leu Gly Leu Ala Ile Gly Leu Pro Ile Val Lys Arg Lys Glu Lys 20 25 30 Arg Leu Leu Glu Glu Lys Glu Arg Gln Glu Gln Leu Ala Glu Gln Leu 35 40 45 Gln Arg Ile Ser Ala Gln Gln Glu Glu Gln Gln Ala Leu Glu Gln Gln 50 55 60 Ala Ala Ala Glu Ala His Ala Glu Ala Glu Val Glu Pro Ala Pro Gln 65 70 75 80 Pro Val Pro Val Pro Pro Gln Pro Gln Val Gln Ile Asn Phe Gly Pro 85 90 95 Arg Thr Gly Phe Pro Pro Gln Pro Gly Met Ala Pro Arg Pro Gly Met 100 105 110 Pro Pro His Pro Gly Met Ala Pro Arg Pro Gly Phe Pro Pro Gln Pro 115 120 125 Gly Met Ala Pro Arg Pro Gly Met Pro Pro His Pro Gly Met Ala Pro 130 135 140 Arg Pro Gly Phe Pro Pro Gln Pro Gly Met Ala Pro Arg Pro Gly Met 145 150 155 160 Pro Pro His Pro Gly Met Ala Pro Arg Pro Gly Phe Pro Pro Gln Pro 165 170 175 Gly Met Ala Pro Arg Pro Gly Met Gln Pro Pro Arg Pro Gly Met Pro 180 185 190 Pro Gln Pro Gly Phe Pro Pro Lys Arg 195 200 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Mycoplasma pneumoniae <400> 3 Gly Met Ala Pro Arg Pro Gly Met Pro Pro His Pro 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Mycoplasma pneumoniae <400> 4 Gly Met Ala Pro Arg Pro Gly Phe Pro Pro Gln Pro 1 5 10 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Mycoplasma pneumoniae <400> 5 Gly Met Ala Pro Arg Pro Gly Met Gln Pro Pro Arg Pro 1 5 10 <210> 6 <211> 25 <212> PRT <213> Mycoplasma pneumoniae <400> 6 Lys Arg Lys Glu Lys Arg Leu Leu Glu Glu Lys Glu Arg Gln Glu Gln 1 5 10 15 Leu Ala Glu Gln Leu Gln Arg Ile Ser 20 25 <210> 7 <211> 20 <212> PRT <213> Mycoplasma pneumoniae <400> 7 Ala Gln Gln Glu Glu Gln Gln Ala Leu Glu Gln Gln Ala Ala Ala Glu 1 5 10 15 Ala His Ala Glu 20

Claims (19)

  1. 마이코플라즈마 뉴모니아의 P30 단백질에 대한 항체를 사용하는 면역 측정법으로 이루어지고, 상기 항체가 서열번호 3~5 중 어느 하나의 아미노산 서열에 위치하는 P30 단백질의 에피토프에 대한 항체인 마이코플라즈마 뉴모니아의 검출법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 항체가 모노클로날 항체인 검출법.
  3. 마이코플라즈마 뉴모니아의 P30 단백질에 대한 제 1 항체와 제 2 항체를 사용한 샌드위치식 면역 측정법으로 이루어지고, 상기 제 1 항체 및 상기 제 2 항체 중 적어도 어느 일방이 서열번호 3~5 중 어느 하나의 아미노산 서열에 위치하는 P30 단백질의 에피토프에 대한 항체인 마이코플라즈마 뉴모니아의 검출법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 샌드위치식 면역 측정법이 ELISA법 또는 면역크로마토그래피 측정법인 검출법.
  5. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
    상기 제 1 항체 및 상기 제 2 항체 중 적어도 어느 일방이 모노클로날 항체인 검출법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 제 1 항체 및 상기 제 2 항체 중 어느 일방을 담체에 고정해 두는 검출법.
  7. 마이코플라즈마 뉴모니아의 P30 단백질에 대한 제 1 항체를 미리 소정 위치에 고정시켜 형성된 포착 부위를 구비하는 막 담체를 준비하고, 상기 P30 단백질에 대한 제 2 항체와 소정량의 피검시료의 혼합액을 상기 포착 부위를 향하여 상기 막 담체로 크로마토 전개시켜, 상기 피검시료 중에 포함되는 항원과 상기 제 2 항체의 복합체를 상기 포착 부위에 포착시키는 면역크로마토그래피 측정법에 있어서,
    상기 제 1 항체 및 상기 제 2 항체 중 적어도 어느 일방이 서열번호 3~5 중 어느 하나의 아미노산 서열에 위치하는 P30 단백질의 에피토프에 대한 항체인 마이코플라즈마 뉴모니아 검출용의 면역크로마토그래피 측정법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 제 1 항체 및 상기 제 2 항체 중 적어도 어느 일방이 모노클로날 항체인 면역크로마토그래피 측정법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 제 2 항체는 금속 콜로이드, 라텍스 또는 형광 물질 중 어느 하나로 표지되어 있는 면역크로마토그래피 측정법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 막 담체가 니트로셀룰로오스 막인 면역크로마토그래피 측정법.
  11. 마이코플라즈마 뉴모니아의 P30 단백질에 대한 항체를 적어도 구비하고 있고, 상기 항체가 서열번호 3~5 중 어느 하나의 아미노산 서열에 위치하는 P30 단백질의 에피토프에 대한 항체인 마이코플라즈마 뉴모니아의 면역학적 측정 키트.
  12. 마이코플라즈마 뉴모니아의 P30 단백질에 대한 제 1 항체와 제 2 항체를 적어도 구비하고 있고, 상기 제 1 항체 및 상기 제 2 항체 중 적어도 어느 일방이 서열번호 3~5 중 어느 하나의 아미노산 서열에 위치하는 P30 단백질의 에피토프에 대한 항체인 마이코플라즈마 뉴모니아의 샌드위치식 면역 측정 키트.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 샌드위치식 면역 측정이 ELISA법 또는 면역크로마토그래피 측정법인 샌드위치식 면역 측정 키트.
  14. 마이코플라즈마 뉴모니아의 P30 단백질에 대한 제 1 항체와 제 2 항체와 막 담체를 적어도 구비하고, 상기 제 1 항체는 상기 막 담체의 소정 위치에 미리 고정되어 포착 부위를 형성하고, 상기 제 2 항체는 적당한 표지 물질로 표지되고, 또한 상기 포착 부위로부터 이격한 위치에 상기 막 담체로 크로마토 전개 가능하도록 준비되어 이루어지는 면역크로마토그래피법 테스트 스트립으로서,
    상기 제 1 항체 및 상기 제 2 항체 중 적어도 어느 일방이 서열번호 3~5 중 어느 하나의 아미노산 서열에 위치하는 P30 단백질의 에피토프에 대한 항체인 마이코플라즈마 뉴모니아 검출용 면역크로마토그래피법 테스트 스트립.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 제 1 항체 및 상기 제 2 항체 중 적어도 어느 일방이 모노클로날 항체인 면역크로마토그래피법 테스트 스트립.
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 제 2 항체는 금속 콜로이드, 라텍스 또는 형광 물질 중 어느 하나로 표지되어 있는 면역크로마토그래피법 테스트 스트립.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 막 담체가 니트로셀룰로오스 막인 면역크로마토그래피법 테스트 스트립.
  18. 서열번호 3~5 중 어느 하나의 아미노산 서열에 위치하는 P30 단백질의 에피토프를 인식하는 항체.
  19. 제 18 항에 있어서,
    상기 항체가 모노클로날 항체인 항체.
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