CN102296127A

CN102296127A - 荧光定量pcr检测新型甲型h1n1病毒试剂盒及非诊断检测方法

Info

Publication number: CN102296127A
Application number: CN2011102492863A
Authority: CN
Inventors: 姚李四; 胡孔新; 燕清丽; 孙肖红; 杨鹏飞; 王静
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2011-08-26
Filing date: 2011-08-26
Publication date: 2011-12-28

Abstract

本发明公开了一种检测新型甲型流感病毒荧光定量PCR试剂盒及非诊断检测方法，该试剂盒包括特定序列的引物和探针，该引物和探针检测特异性好，灵敏度高，尤其适用于此次暴发的甲型H1N1流感，与禽流感、猪流感以及普通季节性流感无交叉反应，而且成本也大大降低。

Description

荧光定量PCR检测新型甲型H1N1病毒试剂盒及非诊断检测方法

技术领域

本发明涉及一种新型的甲型H1N1流感病毒的荧光定量PCR检测方法及检测引物和特异性探针。

背景技术

自09年4月以来，包括墨西哥、美国和加拿大在内的许多国家发生了人感染甲型H1N1流感病毒疫情，这是一种新的甲型流感病毒。随着感染甲型H1N1流感的人群不断的增加，疫情愈来愈严重，世界卫生组织已于09年6月将流感大流行警戒级别提升到6级，世界处在09年流感大流行的开端。甲型H1N1流感病毒属正黏液病毒科甲型流感病毒属的单股RNA病毒。根据其外部糖蛋白血凝素(hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(nneuraminidase，NA)的不同抗原特性可将甲型流感病毒分为多个亚型。HA和NA具有高度变异性，但对于该流感病毒其它片段相比又极其保守。因此，HA、NA基因片段成为检测流感病毒的重要考察对象。

面对这突如其来的流感病毒，如何快速准确的检测已成为世界各国疾病预防控制中心最关心的问题。实时荧光定量法显然已经成为各国公认的检测标准。实时荧光定量RT-PCR(rRT-PCR)法检测新型甲型H1N1的方案是用一组寡核苷酸引物和双重标记的

探针，对呼吸道样本或体外培养的甲流感病毒进行定量检测鉴定。

世界卫生组织较早公布了用实时定量RT-PCR来检测甲流感的操作步骤。其中，InfA引物和探针组合是通用于检测A型流感病毒，swInfA引物和探针组合是特异性检测所有甲型流感A型病毒，swH1引物和探针组合是特异检测猪H1型流感病毒。但是，由于当时NCBI公布的相关序列有限，世界卫生组织所公布的引物和探针对此次暴发的新型甲型H1N1流感病毒的检测特异性、灵敏度有限。

本发明就是针对于目前设计并公布的引物及探针存在的灵敏度检测相对较低，检测费用较高进行改进。

发明内容

本发明提供一种对新型甲型H1N1流感病毒的荧光定量PCR检测方法，本发明的方法包括利用一对新的引物和探针组合对病毒样本进行实时荧光定量监测。

本发明的检测方法检测特异性好，灵敏度高，尤其适用于此次暴发的新型甲型H1N1流感，与禽流感、猪流感以及普通季节性流感无交叉反应。本发明还在于设计且仅有一对引物和探针组合，由此降低检测成本，实现了快速准确检测H1N1流感病毒。

本发明提供一种检测新型甲型H1N1流感病毒的引物和探针的方法，该方法包括：(1)筛选新型甲型H1N1流感HA全长序列，进行同源性比对，在其保守区设计引物并提交GENEBANK验证引物的特异性；(2)根据PCR扩增区域内的核苷酸序列设计特异性探针，并提交GENEBANK验证探针的特异性；(3)待检测样本进行荧光定量PCR实时定量分析。

本发明还提供一种检测新型甲型H1N1病毒试剂盒，其中，包括引物和探针，引物和探针序列见表1。

在本发明上述方法中，所筛选的新型甲型H1N1流感可以是NCBI公布的所有新型的甲型H1N1流感HA全长序列。另外，本发明的方法中，可以利用DNASTAR软件进行序列的同源性比对。比对结果见图1。图中阴影部分为HA基因序列保守区。

在本发明引物和探针设计中，首先在比对后序列保守区设计引物和探针，根据引物设计原理，在保守区617bp-760bp之间设计上游引物YHAF和下游引物YHAR。探针YHAProbe在上游引物YHAF和下游引物YHAR之间设计。引物YHAF中第24位含有兼并碱基R，探针YHAProbe中第1位含有兼并碱基W，第30位含有兼并碱基K。探针在合成时5′端连接FAM荧光基团3′端连接BHQ1非荧光基团。引物和探针组合的特异性增强。序列见表1。

表1引物和探针序列

表2为利用Beacon Designer 7.5软件分析设计的引物和探针的参数。

表2引物和探针信息

本发明提供一种检测新型甲流感的实时荧光定量PCR方法，该方法包括以下步骤：

(1)核酸提取

病毒RNA提取选用QIAamp Mini kit 52906病毒RNA提取试剂盒。

(2)荧光定量PCR(RT-PCR)扩增

选用本发明的检测新型甲型H1N1病毒试剂盒，该试剂盒中反应体系组分及其体积见表3。

表3

扩增条件：采用本领域的标准扩增条件。

例如

48℃ 30分钟

95℃ 10分钟

本发明所述的方法中，探针与荧光基团相连，所述荧光基团为FAM-BHQ1，其它荧光基团也同样适用。比如，FAM-TAMARA等。所述荧光定量PCR(RT-PCR)反应体系可使用的仪器包括ABI实时PCR系统(例如7000，7300，7500，7900等)；BioRad实时PCR检测系统、Stratagene定量多聚酶链反应仪(例如MX4000，MX3000，MX3005)，扩增条件因每台仪器的型号而决定。

附图说明

图1为利用DNASTAR软件分析HA全长基因同源性保守区域。

图2和图3为本发明设计的引物和世界卫生组织公布的引物灵敏度比较的检测结果。体外合成新型甲型H1N1流感HA全长基因片段作为标准品。标准品依次稀释成各个浓度梯度，扩增后荧光强度随反应循环数变化的曲线。其中，图2为世界卫生组织公布的引物和探针组合(WHO-SWH1)的扩增曲线，图3为本发明设计的引物和探针组合(YHA)的扩增曲线，图中横坐标为循环次数，纵坐标代表相应的校正后报告荧光强度(Rn)。

图4表示用本发明建立的方法对普通季节性流感H1N1、猪流感H1N1、禽流感H5N1、H9N2进行非特异性检测的结果。其中，X轴表示循环次数，Y轴表示相应的校正后报告荧光强度。

图5表示用本发明建立的方法对病毒培养物进行检测。其中，X轴表示循环次数，Y轴表示相应的校正后报告荧光强度。

具体实施方式

实施例1：引物灵敏度检测

1)选择体外合成新型甲型H1N1流感HA全长基因片段做为标准品，将其病毒RNA浓度从10^-1依次稀释到10^-10；

2)阴性对照：正常咽拭子RNA；

3)反应体系按照表3进行配制；

4)引物探针组合：本发明设计的引物和探针组合(YHA)及世界卫生组织公布的引物探针组合(WHO-SWH1)。

检测结果如图2、3所示。

图2中1-6曲线分别为标准品浓度稀释度为10^-4-10^-10用世界卫生组织公布的引物探针组合(WHO-SWH1)扩增出的曲线。图3中1-6曲线依次为标准品浓度稀释度为10^-4-10^-10用本发明设计的引物和探针组合(YHA)扩增的曲线。我们从图2和图3中可以看出，本发明中引物和探针组合扩增出结果的曲线出线早于世界卫生组织公布的引物和探针组合(WHO-SWH1)扩增出结果的曲线。

表4两组引物探针组合灵敏度检测结果比较

表4数据表示，本发明中YHA引物和探针组合与WHO公布的SWH1引物和探针组合分别扩增HA基因片段病毒RNA的不同浓度梯度下的扩增CT值。CT值反应了每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。我们从数据中可以看到，引物探针组合WHO-SWH1扩增10^-9CT值为37.84，而有效CT值为Ct(阈值)≤37，在此我们可以判断其CT值为“-”。从而，我们得出结论：本发明设计的引物探针组合相较于世界卫生组织公布的引物探针组合灵敏度要稍高些。

实施例2：引物特性检测

1)对普通季节性流感H1N1，猪流感H1N1，禽流感H5N1、H9N2，进行非特异性检测；

2)阳性对照：新型甲型H1N1流感病毒HA片段RNA；

3)阴性对照：正常咽拭子RNA；

4)反应体系按照表2进行配制。

检测结果见图4及表5。

图4结果显示，只有编号为1的阳性对照HA RNA(10^-6)出现了扩增曲线。其余样品曲线均在基线以下，无扩增反应。

表5人、禽、猪流感病毒检测结果

表5数据显示了本发明设计的引物探针组合对普通季节性流感H1N1，猪流感H1N1，禽流感H5N1、H9N2基因扩增CT值为“-”。表明本发明设计的引物探针组合对其它流感病毒RNA无交叉反应。

实施例3：对病毒培养物检测

1)对病毒培养物进行检测，筛选新型甲型H1N1流感病毒；

2)阳性对照：新型甲型H1N1流感病毒HA片段RNA；

3)阴性对照：正常咽拭子RNA；

4)反应体系按照表3进行配制。

检测结果见图5及表6。

图5中只出现了阳性对照一条扩增曲线，其余样本均无扩增。反应结果为阴性。

表6病毒培养物检测结果

表6中的数据结果显示，检测病毒培养物结果均为阴性。

结果分析：

扩增反应完成40个循环之后，本发明设计的引物探针组合灵敏度检测到病毒RNA浓度稀释度为10^-9与世界卫生组织公布的引物探针组合相比，灵敏度高一个数量级；与普通季节性流感H1N1，猪流感H1N1，禽流感H5N1、H9N2无交叉反应；从病毒培养物中检测到6株均为阴性。

上述病毒培养物是从食品或者用品中提取的，因此该检测方法并非以人体和动物体为对象，其只是为了检测是否具有病毒，不是以诊断为目的，不属于疾病的诊断方法。

结果判断：

当待检测样本的Ct(阈值)≤37时即判为阳性。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国检验检疫科学研究院

<120> 荧光定量PCR检测新型甲型H1N1病毒试剂盒及检测方法

<130> 中国检验检疫科学研究院

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 新甲型H1N1-YHAF

<220>

<221> 兼并碱基代码

<222> (1)..(25)

<223> R:A/G；

<400> 1

aaagtctcta tcagaatgca gatrc 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 新甲型H1N1-YHAR

<400> 2

cggctctact agtgtccagt aatag 25

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 新甲型H1N1-YHAProbe

<220>

<221> YHAProbe荧光基团、淬灭基团

<222> (1)..(30)

<223> 探针5'端接FAM；探针3'端接BHQ1

<220>

<221> 兼并碱基代码

<222> (1)..(30)

<223> W:A/T；K:G/T

<400> 3

wcatcaagat acagcaagaa gttcaagcck 30

Claims

1.一种新型甲型H1N1流感病毒的荧光定量PCR非诊断检测方法，该方法包括设计了一对引物和探针对待检样本进行实时定量监测，引物和探针序列如下：

2.如权利要求1所述的检测方法，其中，所述探针连接的荧光基团可为FAM-BHQ1，FAM-TAMARA等。

3.如权利要求1所述的检测方法，其中，该方法包括步骤：

1)待检测样本核酸的提取；

2)RT-PCR反应，配制一定组分浓度的25μL PCR反应体系。

4.如权利要求3中所述的检测方法，其中，所述RT-PCR反应可使用的仪器包括ABI实时PCR系统、BioRad实时PCR检测系统、Stratagene定量多聚酶链反应仪。

5.一种检测新型甲型H1N1病毒试剂盒，其中，包括引物和探针，引物和探针序列如下：

6.如权利要求5中所述的试剂盒，其中，能与新型甲型H1N1流感HA全长序列特异性结合并扩增的等同引物，其位点区域的覆盖率不能超过50％，其同源性不能超过70％。

7.如权利要求5中所述的试剂盒，其中，能与新型甲型H1N1流感HA全长序列特异性结合并扩增的等同探针，其位点区域的覆盖率不能超过50％，其同源性不能超过70％。