CN111663006A - 一种猪细小病毒7型环介导等温扩增检测引物组及其试剂盒 - Google Patents

一种猪细小病毒7型环介导等温扩增检测引物组及其试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测猪细小病毒7型的环介导等温扩增方法的引物组，包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其中所述一对外引物包括F3和B3；所述一对内引物包括FIP和BIP；所述一对环引物LF和LB；本发明进一步公开了一种包含上述引物组的试剂盒，该试剂盒包括所述引物组、等温扩增反应缓冲液、Bst 2.0WarmStart DNA聚合酶、dNTP Mix、MgSO4、超纯水和荧光显色检测试剂。本发明提供一种猪细小病毒7型环介导等温扩增检测引物组及其试剂盒，本发明污染小，操作简便、快速、可用肉眼直接观察结果。具有特异性强、灵敏度高等优点，无需昂贵仪器设备，尤其便于基层使用。

Description

一种猪细小病毒7型环介导等温扩增检测引物组及其试剂盒
技术领域
本发明属于动物传染病学检测领域，具体为一种猪细小病毒7型环介导等温扩增检测引物组及其试剂盒。
背景技术
猪细小病毒(PPV)是一种小型、无包膜的单链DNA病毒，属细小病毒科。目前除了经典的PPV(称为PPV1)外又陆续发现了一些新的细小病毒，迄今已鉴定出7种PPV基因型(PPV1-PPV7)。PPV7是最近发现的PPV基因型，2016年在美国首次报道。PPV7基因组4103bp，包括538bp的5'非编码区，2019bp的NS1基因、1410bp的衣壳蛋白基因和119bp的3'非编码区。
LAMP法是针对目标DNA链上的六个区段设计四个不同的引物然后再利用链置换反应在一定温度下进行反应。反应只需要把基因模板、引物、链置换型DNA合成酶、基质等共同置于一定温度下(60～65℃)、经一个步骤即可完成。扩增效率极高，可在15分～1小时内实现109～1010倍的扩增。而且由于有着高度的特异性，只需根据扩增反应产物的有无即可对靶基因序列的存在与否作出判断。本标准加入SYBR Green I染料，即可通过观察颜色变化得知扩增产物的有无，判定结果。目前国内外均未见有用于检测猪细小病毒7型的LAMP引物组及试剂盒在猪细小病毒检测中的应用。为此，我们推出了一种猪细小病毒7型环介导等温扩增检测引物组及其试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于：为了解决背景技术中涉及的技术问题，提供一种猪细小病毒7型环介导等温扩增检测引物组及其试剂盒。
本发明采用的技术方案如下：
一种检测猪细小病毒7型的环介导等温扩增方法的引物组，包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其中所述一对外引物包括F3和B3；所述一对内引物包括FIP和BIP；所述一对环引物LF和LB；所述引物组的序列见表1：
表1：该引物组序列
Figure BDA0002141579960000021
。
一种包含上述引物组的试剂盒包括:所述引物组、等温扩增反应缓冲液、Bst2.0WarmStart DNA聚合酶、dNTP Mix、MgSO4、超纯水和荧光显色检测试剂。
进一步，所述等温扩增反应缓冲液为10×等温扩增反应缓冲液，所述10×等温扩增反应缓冲液包括：200mM Tris-HCl，100mM(NH4)2SO4，500mM KCl，20mM MgSO4，1％Tween-20。
进一步，所述Bst 2.0WarmStart DNA聚合酶浓度为8000U/ml。
进一步，所述dNTP Mix浓度为10mM；进一步，所述MgSO4浓度为100mM。
进一步，所述的荧光显色检测试剂采用1000×SYBR Green Ⅰ染料，荧光试剂在反应后加入。
进一步，所述LAMP反应体系见表2：
表2：LAMP反应体系
Figure BDA0002141579960000031
。
需要说明的是环引物LF/LB也可以不加入反应体系(不加入时，使用超纯水补足反应体系)，但加入环引物LF/LB可节约LAMP的反应时间。若不加入环引物LF/LB，最适反应时间需重新优化。此外，环引物有时可只设计出1条引物为LB。此时加入环引物LB可节约LAMP的反应时间。若不加入环引物组LB，最适反应时间需重新优化。
本发明还提供了所述的环介导等温扩增反应的引物组在制备猪细小病毒7型快速诊断试剂中的用途。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
本发明提供一种猪细小病毒7型环介导等温扩增检测引物组及其试剂盒，使用时与猪常见传染病病原不发生交叉反应；具体有如下有益效果：
1、污染小:本试剂盒的荧光试剂SYBR Green Ⅰ是高灵敏的DNA荧光染料，结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出扩增产物中双链DNA数量。
2、操作简便、快速:本发明建立的LAMP方法操作简便，无需复杂昂贵仪器，只需要水浴锅即可完成。此外，建立的LAMP方法快速高效，从提取样品到结果判定可在30-60min内完成(时效性和TaqMan实时荧光定量PCR方法相当)。反应结果判定方法简单，加入荧光染料后，在可见光下将阳性、阴性结果进行对比。肉眼可见阳性样品管反应液呈绿色，阴性管样品管反应液颜色呈橙色。经紫外线照射装置(波长240-260nm或350-370nm)照射可见，阳性样品发出翠绿色的荧光，阴性样品则没有。必要时，可进行常规琼脂糖凝胶电泳鉴定，阳性样品可见有不连续稊状电泳条带。
3、特异性强、灵敏度高:本发明建立的LAMP方法检测猪细小病毒7型，所检测的阴性对照样品(如猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪库布病毒和猪蓝耳病毒)和水对照样品均无扩增产物，和PCR检测结果一致。但是LAMP方法较常规PCR灵敏度高10倍左右，最低检测限为100copy/μL。
综上所述，本发明的检测方法，可用肉眼直接观察结果，特异性强、灵敏度高，无需昂贵仪器设备，方便快速，污染小，尤其便于基层使用。
附图说明
图1为猪细小病毒7型LAMP检测试验(琼脂糖电泳观察)，其中M：DNA分子量标准2000；1:猪细小病毒7型；2：ddH2O；
图2为猪细小病毒7型LAMP检测试验(直接显色观察)，其中1:猪细小病毒7型；2：ddH2O；
图3为猪细小病毒7型LAMP特异性实验(琼脂糖电泳观察)，其中M：DNA分子量标准2000；1:猪细小病毒7型；针对性的病原对照6种，分別为:2：伪狂犬病毒；3：猪圆环病毒2型；4：猪圆环病毒3型；5：猪库布病毒；6：猪蓝耳病毒；7：ddH2O；
图4为猪细小病毒7型LAMP特异性实验(直接显色观察)，其中1:猪细小病毒7型；针对性的病原对照6种，分別为:2：伪狂犬病毒；3：猪圆环病毒2型；4：猪圆环病毒3型；5：猪库布病毒；6：猪蓝耳病毒；7：ddH2O；
图5为猪细小病毒7型LAMP方法敏感性试验(琼脂糖电泳观察)；其中M:DNA分子量标准2000；1：ddH2O；2：10×1010copy/μL；3：10×109copy/μL；4：10×108copy/μL；5：10×107copy/μL；6：10×106copy/μL；7：10×105copy/μL；8：10×104copy/μL；9：10×103copy/μL；10：10×102copy/μL；11：10×101copy/μL；
图6为猪细小病毒7型PCR方法敏感性试验(琼脂糖电泳观察)；其中M:DNA分子量标准2000；1：ddH2O；2：10×1010copy/μL；3：10×109copy/μL；4：10×108copy/μL；5：10×107copy/μL；6：10×106copy/μL；7：10×105copy/μL；8：10×104copy/μL；9：10×103copy/μL；10：10×102copy/μL；11：10×101copy/μL；
图7为猪细小病毒7型LAMP方法敏感性试验(直接显色观察)；其中1：ddH2O；2：10×1010copy/μL；3：10×109copy/μL；4：10×108copy/μL；5：10×107copy/μL；6：10×106copy/μL；7：10×105copy/μL；8：10×104copy/μL；9：10×103copy/μL；10：10×102copy/μL；11：10×101copy/μL；
图8为本发明中临床样品琼脂糖凝胶电泳鉴定图；
图9为本发明中临床样品荧光染料显色鉴定图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
1材料方法
1.1试验毒株和菌株
试验用病原猪细小病毒7型、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪库布病毒和猪蓝耳病毒由本实验室鉴定和保存。
1.2待检样品DNA模板的制备
1.2.1核酸提取
用北京天根生化科技有限公司(也可用其他商品化公司等效试剂盒)的病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(DP315)按照说明书方法进行操作提取猪细小病毒7型(猪细小病毒7型MK484100株)核酸DNA，并按照试剂盒的方法同时提取试验对照毒株核酸(猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型提取核酸DNA；猪库布病毒和猪蓝耳病毒RNA；提取的DNA可直接用于LAMP检测，提取的RNA需反转录为cDNA才可用于LAMP检测)。
1.2.2 cDNA模板的制备
用北京天根生化科技有限公司(也可用其他商品化公司等效试剂盒)的FastQuantRT Kit(with gDNase)，按照说明书方法，将提取的核酸RNA反转录为cDNA，cDNA反转录配置反应液体系为(见表3，表4)，步骤如下：
(1)按照表1-5体系配置成混合液放置42℃水浴中孵育3min。
(2)按照表1-6体系配置成混合液待用。
(3)将上述两个体系溶液混匀放置42℃水浴锅中，孵育15min。
(4)放置95℃，3min后，置于冰盒上。合成的cDNA放置-20℃备用。
表3 gDNA去除反应体系
Figure BDA0002141579960000071
表4反转录反应体系
Figure BDA0002141579960000072
1.3 LAMP检测方法的建立
1.3.1 LAMP的引物设计
根据Gen bank中登录的猪细小病毒7型MK484100株ORF2阅读框碱基序列，利用LAMP引物设计的在线网站(http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)设计引物，包括外引物1对(F3和B3)、内引物1对(FIP和BP)和环引物1对(LF和LB)，具体序列见上述引物表。将设计好的相关引物，经NCBI数据库进行BLAST分析，符合试验预期。
利用设计的外引物(F3和B3)对猪细小病毒7型、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪库布病毒和猪蓝耳病毒进行常规PCR扩增(猪库布病毒和猪蓝耳病毒使用反转录后的cDNA；猪细小病毒7型、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型试验DNA模板)，按照2×Taq PCR预混试剂Ⅱ(KT211)说明书进行PCR反应，反应体系参考试剂盒说明书配制，反应体系为20μL，其中量2×Taq PCR MasterMix Ⅱ反应液10μL、上下游引物(F3和B3，10μM)各1μL、提取的核酸模板2μL，补充灭菌去离子水6μL至终体积20μL。反应条件为：95℃预变性5min；94℃30s，56℃30s，72℃45s，35个循环；循环结束后72℃延伸10min反应结東后，进行常规琼脂糖凝胶电泳。结果F3和B3仅对猪细小病毒7型扩増岀现特异性目的条带对其他病原(如猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪库布病毒和猪蓝耳病毒)均未见特异性条带扩增。上述结果表明设计的相关引物无交叉干扰，特异性强。
1.3.2 LAMP方法的建立和优化
配置LAMP试验反应液，反应体系为25ul。每25μL反应体系中含有10×等温扩增缓冲液2.5μL，MgSO4(100mM)1.5μL，dNTP(2.5mM)7μL，40μM FIP/BIP各1μL，5μM F3/B3各1μL，10μM LF/LB各1μL，Bst2.0 DNA聚合酶(80000U/ml)1uL，待检样品DNA模板1μL，其余用超纯水(5μ)补足至25μL。实验不同温度(61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、)、不同时间(10min、20min、30min、40min、50min、60min、70min)检测引物组反应性能。优化后的反应条件为65℃反应60min。
1.3.3 LAMP检测方法的特异性试验
用优化后的LAMP条件，检测相关实验样品模板核酸(猪库布病毒和猪蓝耳病毒使用反转录后的cDNA；猪细小病毒7型、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型试验DNA模板)，评价建立的LAMP方法的特异性。
1.3.4阳性标准品的构建
根据本团队前期鉴定的猪细小病毒7型(猪细小病毒7型MK484100株)ORF2阅读框基因序列，利用引物设计软件Primer Premier 5设计特异性引物，引物序列为:F1:5′-ATGGCAGAACACATCACCCTGAGTAAC-3′和R1:5′-TTATTTTCGGCTGGTTGTTGTTGTG-3′，用于扩增约1410bp的完整ORF2阅读框碱基片段，引物由南京擎科生物科技有限公司合成。
用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(DP315)提取猪细小病毒7型(猪细小病毒7型MK484100株)DNA，按照本实验室建立的20μL体系进行PCR反应，其中2×Taq PCR MasterMixⅡ反应液10μL、上下游引物(F1和R1，10μM)各1μL、提取的核酸模板2μL，补充灭菌去离子水6μL至终体积20μL。PCR扩增程序：98℃预变性3min；98℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min30s，35个循环；循环结束后72℃延伸10min。
用1.0％的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照pMDTM19-T Vector Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书将PCR扩增的PPV7ORF2阅读框碱基片段克隆到pMDTM19-T克隆载体上，随机挑取5个单菌落于氨苄青霉素(含量为100μg/mL)抗性的LB液体培养基培养过夜后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用PCR扩增时的引物(F1和R1)对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送南京擎科生物科技有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST分析验证，符合试验预期的阳性重组质粒作为LAMP与PCR的阳性标准品(pMDTM19-PPV7)，分装后置于-20℃保存备用。
1.3.5 LAMP检测方法的敏感性试验
根据猪细小病毒7型(猪细小病毒7型MK484100株)ORF2阅读框基因序列，利用引物设计软件Primer Premier 5设计进行普通PCR鉴定特异性引物，引物序列为:F2:5′-ATCCTCTGGCGACACTT-3′和R2:5′-GGCTGTATCCGCTTTCT-3′，用于扩增约643bp的碱基片段，引物由南京擎科生物科技有限公司合成。
对猪细小病毒7型构建的阳性标准品(pMDTM19-PPV7)进行连续稀释(质粒浓度分别为10×1010copy/μL；10×109copy/μL；10×108copy/μL；10×107copy/μL；10×106copy/μL；10×105copy/μL；10×104copy/μL；10×103copy/μL；10×102copy/μL；10×101copy/μL)，按照优化后的LAMP条件和普通PCR鉴定条件进行检测，获得其敏感性试验数据。
1.3.6 LAMP检测方法的临床应用
对本硏究室收集的6份鹅组织病料经硏磨处理后，按照商品化试剂盒提取相应DNA后，按照优化后的LAMP条件和普通PCR鉴定条件进行检测。
2实验结果
2.1鉴定结果判定
琼脂糖凝胶电泳鉴定：反应结束后，取LAMP扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，琼脂糖凝胶经紫外线照射装置(350-370nm)照射可见阳性样品(猪细小病毒7型MK484100株)扩增产物电泳结果为不连续梯形条带，阴性对照无不连续梯形条带(见图1)。
荧光染料显色鉴定：反应结束后，在LAMP扩增产物中加入1μL 1000×SYBR GreenⅠ荧光染料，产物所在ep管经紫外线照射裝置(350-370nm)照射可见，阳性样品(猪细小病毒7型MK484100株)发出翠绿色的荧光，阴性对照未见可见荧光(见图2)。
2.2特异性试验判定
琼脂糖凝胶电泳鉴定：反应结束后，取LAMP扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，琼脂糖凝胶经紫外线照射装置(350-370nm)照射可见阳性样品(猪细小病毒7型MK484100株)扩增产物电泳结果为不连续梯形条带，阴性样品(伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪库布病毒、猪蓝耳病毒)和阴性对照均无不连续梯形条带(见图3)。
荧光染料显色鉴定：反应结束后，在LAMP扩增产物中加入1μL 1000×SYBR GreenⅠ荧光染料，产物所在ep管经紫外线照射裝置(350-370nm)照射可见，阳性样品(猪细小病毒7型MK484100株)发出翠绿色的荧光，阴性样品(伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪库布病毒、猪蓝耳病毒)和阴性对照均未见可见荧光(见图4)。
2.3敏感性试验判定
琼脂糖凝胶电泳鉴定：反应结束后，取LAMP及普通PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，琼脂糖凝胶经紫外线照射装置(350-370nm)照射可见LAMP阳性扩增产物电泳结果为不连续梯形条带，猪细小病毒7型构建的阳性标准品(pMDTM19-PPV7)浓度在10×102copy/μL时为最低检测限，即猪细小病毒7型构建的阳性标准品(pMDTM19-PPV7)浓度在10×102copy/μL时扩增产物可观察到连续梯形条带，浓度在10×101copy/μL时无连续梯形条带，阴性对照无条带(见图5)。普通PCR阳性扩增产物电泳结果为643bp大小的目的条带，猪细小病毒7型构建的阳性标准品(pMDTM19-PPV7)浓度在10×103copy/μL时为最低检测限，即猪细小病毒7型构建的阳性标准品(pMDTM19-PPV7)浓度在10×103copy/μL时扩增产物可观察到643bp大小的目的条带，浓度在10×102copy/μL时目的条带，阴性对照无条带(见图6)。
荧光染料显色鉴定：反应结束后，在LAMP扩增产物中加入1μL 1000×SYBR GreenⅠ荧光染料，产物所在ep管经紫外线照射裝置(350-370nm)照射可见，猪细小病毒7型构建的阳性标准品(pMDTM19-PPV7)浓度在10×102copy/μL时为最低检测限，即猪细小病毒7型构建的阳性标准品(pMDTM19-PPV7)浓度在10×102copy/μL时扩增产物可观察到翠绿色的荧光，浓度在10×101copy/μL时未见可见荧光，阴性对照未见可见荧光(见图7)。
2.4临床样品的检测
琼脂糖凝胶电泳鉴定：反应结束后，取LAMP扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，琼脂糖凝胶经紫外线照射装置(350-370nm)照射可见阳性样品扩增产物电泳结果为不连续梯形条带，阴性对照无不连续梯形条带(见图8)。
荧光染料显色鉴定：反应结束后，在LAMP扩增产物中加入1μL 1000×SYBR GreenⅠ荧光染料，产物所在ep管经紫外线照射裝置(350-370nm)照射可见，阳性样品发出翠绿色的荧光，阴性对照未见可见荧光(见图9)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种检测猪细小病毒7型的环介导等温扩增方法的引物组，其特征在于：包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其中所述一对外引物包括F3和B3；所述一对内引物包括FIP和BIP；所述一对环引物LF和LB；所述引物组的序列见表1：
表1：该引物组序列
Figure FDA0002141579950000011
。
2.一种含权利要求1所述的一种猪细小病毒7型环介导等温扩增检测引物组的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括所述引物组、等温扩增反应缓冲液、Bst2.0 WarmStart DNA聚合酶、dNTP Mix、MgSO4、超纯水和荧光显色检测试剂。
3.如权利要求2所述的一种猪细小病毒7型环介导等温扩增检测引物组及其试剂盒，其特征在于：所述等温扩增反应缓冲液为10×等温扩增反应缓冲液，所述10×等温扩增反应缓冲液包括：200mM Tris-HCl，100mM(NH4)2SO4，500mM KCl，20mM MgSO4，1％Tween-20。
4.如权利要求2所述的一种猪细小病毒7型环介导等温扩增检测引物组及其试剂盒，其特征在于：所述Bst2.0 WarmStart DNA聚合酶浓度为8000U/ml。
5.如权利要求2所述的一种猪细小病毒7型环介导等温扩增检测引物组及其试剂盒，其特征在于：所述dNTP Mix浓度为10mM。
6.如权利要求2所述的一种猪细小病毒7型环介导等温扩增检测引物组及其试剂盒，其特征在于：所述MgSO4浓度为100mM。
7.如权利要求2所述的一种猪细小病毒7型环介导等温扩增检测引物组及其试剂盒，其特征在于：所述的荧光显色检测试剂采用1000×SYBR Green Ⅰ染料，荧光试剂在反应后加入。
8.如权利要求2-7任一所述的一种猪细小病毒7型环介导等温扩增检测引物组及其试剂盒，其特征在于：所述LAMP反应体系见表2：
表2：LAMP反应体系
Figure FDA0002141579950000021
Figure FDA0002141579950000031
。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105349702A (zh) * 2015-11-27 2016-02-24 广西壮族自治区兽医研究所 一种猪细小病毒环介导等温扩增试剂盒及其应用
CN106435015A (zh) * 2016-08-30 2017-02-22 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种快速显色一步法检测猪细小病毒的lamp试剂盒

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105349702A (zh) * 2015-11-27 2016-02-24 广西壮族自治区兽医研究所 一种猪细小病毒环介导等温扩增试剂盒及其应用
CN106435015A (zh) * 2016-08-30 2017-02-22 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种快速显色一步法检测猪细小病毒的lamp试剂盒

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PALINSKI,R.M. 等: "KU563733.1 Porcine parvovirus 7 isolate 42 NS1 (REP) and capsid (CP) genes,complete cds", 《GENBANK》 *
XIULIN XING 等: "First identification of porcine parvovirus 7 in China", 《ARCH VIROL》 *
孙文超 等: "猪细小病毒 7 型 SYBR Green I 荧光定量 PCR检测方法的建立", 《中国预防兽医学报》 *
林丽萍 等: "《食品卫生微生物检验学》", 30 June 2019, 中国农业大学出版社 *
汪东风 等: "《食品质量与安全监测技术》", 31 July 2018, 中国轻工业出版社 *

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