CN104152580A - 用于检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的引物组及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种用于检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的引物组及其应用。本发明提供的用于检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的引物组包括：具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游外部引物，具有如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游外部引物，具有如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的上游内部引物和具有如SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的下游内部引物。本发明提供的引物组特异性强、灵敏度高，适用于LAMP法扩增锦鲤疱疹病毒Sph基因，能够用于制备检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的试剂。

Description

用于检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的引物组及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及用于检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的引物组及其应用。
背景技术
锦鲤疱疹病毒病(Koi herpesvirus Disease，KHVD)是一种锦鲤和鲤鱼的高致病性疾病，是近几年危害淡水鱼养殖，特别是鲤鱼养殖的主要水生传染病，同时也是近几年所发现的新的水生病毒性传染病，其传染性和传播性所造成的危害已被全世界重视。锦鲤疱疹病毒病可导致鲤鱼和锦鲤大规模死亡，造成巨大的经济损失，给淡水鱼养殖造成严重影响。同时，国际贸易促进了该疾病的传播与扩散，使该疾病在全世界范围内流行，由于目前没有合适的防治方法，导致其一旦爆发难以控制。近几年，国际动物卫生组织对锦鲤疱疹病毒病的重视程度逐渐提高，并将其纳入水生动物疫病手册，许多研究人员也参与到该病的研究工作中，以图尽快控制该病的流行与传播。
锦鲤疱疹病毒病是由锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus，KHV)引起的鲤鱼和锦鲤的传染性病毒病。1997年首次在德国发现，1998年以色列和美国相继发生了该病并鉴定其病原为锦鲤疱疹病毒。锦鲤疱疹病毒(KHV)可感染各年龄段的锦鲤和鲤鱼，死亡率很高，已经给世界上众多国家造成了巨大的经济损失，目前无有效的预防和控制措施。研究发现，KHV病毒感染后的临床症状与感染细菌和寄生虫后的临床症状相似，这些症状可能掩盖KHV病毒所致的危害，所以不能单一通过观察发病鱼的临床症状给予决定性的判断，需要结合其他检测方法共同检测来确定。目前，检测锦鲤疱疹病毒病的方法有电镜检测、ELISA、PCR、荧光PCR等。PCR方法在我国已作为疫情检测及诊断手段，也是OIE诊断手册推荐的检测方法。为了保证检测结果的特异性和可靠性，OIE手册建议采用两种不同的基因进行PCR检测。针对锦鲤疱疹病毒，OIE手册提供的PCR方法涉及DNA聚合酶基因(Sph)和胸苷激酶基因(TK)两个基因，操作复杂，特异性和灵敏度较低。所以，急需一种操作简单、准确检测KHV的方法以便于检测锦鲤疱疹病毒，实现锦鲤疱疹病毒病的及时确诊、控制和治疗。
LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification)法，即环介导等温扩增反应，是2000年由Notomi等发明的一种新颖的恒温核酸扩增方法。该方法采用特异地识别靶序列上六个区域的四条引物(两条外引物，两条内引物)及具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在65℃左右进行核酸的指数级扩增，其扩增效率可达到109-1010个拷贝数量级；并且LAMP法扩增产物的检测方法种类多：焦磷酸镁沉淀检测(浊度检测)、荧光显色检测、凝胶电泳检测或实时检测；使得该方法具有简便、快速、准确、廉价、易检测等特点。为了实现KHV的简便、准确检测，很有必要提供一种利用LAMP技术检测锦鲤疱疹病毒的方法。
发明内容
本发明的发明目的在于提供一种用于检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的引物组及其应用。本发明提供的用于检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的引物组特异性强、灵敏度高，可以用于LAMP法扩增锦鲤疱疹病毒Sph基因，能够用于制备检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的试剂。
为了实现本发明的发明目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种用于检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的引物组，该引物组包括以下引物：
具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游外部引物；
具有如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游外部引物；
具有如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的上游内部引物；
具有如SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的下游内部引物。
锦鲤疱疹病毒Sph基因，GenBank登录号AB375381.1。本发明设计获得了10组引物组，从10组引物组中筛选出一组特异性强、灵敏度高、扩增效率高的引物组。实验结果证明，本发明提供的引物组能够特异性检测锦鲤疱疹病毒Sph基因，相比普通PCR，检测灵敏度高出两个数量级，可以用于LAMP法扩增锦鲤疱疹病毒Sph基因，能够用于制备检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的试剂。本发明将具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游外部引物命名为FOP；具有如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游外部引物命名为BOP；具有如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的上游内部引物命名为FIP；具有如SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的下游内部引物命名为BIP。
本发明提供的引物组是根据锦鲤疱疹病毒Sph基因的保守序列设计获得的，所以本领域技术人员可以推理得出利用本发明提供的引物组除了能够扩增检测本发明设计引物所对应的锦鲤疱疹病毒Sph基因外。还能够扩增检测以下两个DNA分子中的任意一个：(1)与本发明设计引物所用的锦鲤疱疹病毒Sph基因序列杂交且编码相同功能蛋白的DNA分子；(2)与本发明设计引物所用的锦鲤疱疹病毒Sph基因至少具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA分子。
环介导等温扩增反应分为两个阶段：第一阶段为起始阶段，经过这一阶段，形成了茎环状结构；第二阶段为扩增循环阶段，以茎环状结构为模板进行周而复始地扩增；第一阶段是第二阶段的基础。根据靶序列设计的上游外部引物、下游外部引物、上游内部引物和下游内部引物直接决定了环介导等温扩增的特异性和灵敏度。环介导等温扩增反应中还可以加入环引物，环引物能够在第二阶段时与茎环状结构结合启动链置换合成，进一步完善扩增反应，例如，进一步提高扩增的速度和效率，本领域技术人员很容易想到在本发明提供的引物组的基础上再加入环引物，这也属于本发明的保护范围。
本发明还提供了一种引物组在制备检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的试剂中的应用，该引物组包括以下引物：
具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游外部引物；
具有如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游外部引物；
具有如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的上游内部引物；
具有如SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的下游内部引物。
本发明还提供了一种检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的试剂盒，该试剂盒包括一种引物组，该引物组包括以下引物：
具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游外部引物；
具有如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游外部引物；
具有如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的上游内部引物；
具有如SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的下游内部引物。
优选地，本发明提供的试剂盒中的上游外部引物的浓度为0.05μmol/L～0.5μmol/L。在本发明的一些实施例中，本发明提供的试剂盒中的上游外部引物的浓度为0.2μmol/L。
优选地，本发明提供的试剂盒中的下游外部引物的浓度为0.05μmol/L～0.5μmol/L。在本发明的一些实施例中，本发明提供的试剂盒中的下游外部引物的浓度为0.2μmol/L。
优选地，本发明提供的试剂盒中的上游内部引物的浓度为0.8μmol/L～2.0μmol/L。在本发明的一些实施例中，本发明提供的试剂盒中的上游内部引物的浓度为1.6μmol/L。
优选地，本发明提供的试剂盒中的下游内部引物的浓度为0.8μmol/L～2.0μmol/L。在本发明的一些实施例中，本发明提供的试剂盒中的下游内部引物的浓度为1.6μmol/L。
本发明还提供了一种利用本发明提供的引物组扩增锦鲤疱疹病毒Sph基因的方法，包括：
获得待测生物样品，以具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游外部引物、具有如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游外部引物、具有如SEQ IDNO:3所示核苷酸序列的上游内部引物和具有如SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的下游内部引物扩增待测生物样品；
该引物组包括以下引物：
具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游外部引物；
具有如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游外部引物；
具有如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的上游内部引物；
具有如SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的下游内部引物。
本发明提供的扩增锦鲤疱疹病毒Sph基因的方法以本发明提供的引物组为引物，采用LAMP法进行扩增，操作简单，提高了扩增反应的特异性和灵敏度，所得扩增产物鉴定方便，更有利于灵敏、快速、准确地检测生物样品中是否含有锦鲤疱疹病毒Sph基因。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的扩增锦鲤疱疹病毒Sph基因的方法中用于检测扩增产物的方法为荧光显色法、浊度检测法或凝胶电泳检测法。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的扩增锦鲤疱疹病毒Sph基因的方法中用于检测扩增产物的方法具体为荧光显色法。
当环介导等温扩增的反应体系中含有钙黄绿素时，可通过荧光显色进行结果判断：如果环介导等温扩增所得扩增产物显示为绿色，代表待测生物样品中含有锦鲤疱疹病毒Sph基因；如果环介导等温扩增所得扩增产物显示为橙色，待测生物样品中不含有锦鲤疱疹病毒Sph基因。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的扩增锦鲤疱疹病毒Sph基因的方法中用于检测扩增产物的方法具体为浊度检测法。
在环介导等温扩增反应过程中会产生一种焦磷酸镁的衍生物副产物，随着环介导等温扩增反应扩增产物的增加，焦磷酸镁衍生物的生成量也会逐渐增加，焦磷酸镁衍生物为白色沉淀，使得扩增产物呈现出白色浑浊。因此，如果环介导等温扩增产物中生成白色沉淀代表待测生物样品中含有锦鲤疱疹病毒Sph基因；如果环介导等温扩增产物中没有生成白色沉淀，则说明待测生物样本中不含有锦鲤疱疹病毒Sph基因。因此，通过观察反应产物白色浑浊的有无即可验证是否待测生物样品中是否含有锦鲤疱疹病毒Sph基因。因为环介导等温扩增反应中焦磷酸镁衍生物沉淀的形成量与反应所产生的DNA量之间呈线性关系，因此可以通过浊度仪实时检测扩增产物，如果浊度仪生成浊度变化曲线代表待测生物样品中含有锦鲤疱疹病毒Sph基因基因；如果浊度仪没有响应，则代表待测生物样品中不含锦鲤疱疹病毒Sph基因。同时，也可根据浊度变化曲线对生物样品中所含有的锦鲤疱疹病毒Sph基因进行定量分析。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的扩增锦鲤疱疹病毒Sph基因的方法中用于检测扩增产物的方法具体为凝胶电泳检测法。
环介导等温扩增产物是一系列具有不同茎长度的茎环结构DNA和带有许多环的类似花椰菜结构的DNA混合物，因为扩增产物中含有一个或多个重复单元，所以各个扩增产物之间的长度差可以看作一个常数，当用凝胶电泳分析时，一个待测生物样品所得的扩增产物所对应的电泳泳道呈现梯状条带。如果扩增产物的琼脂糖凝胶电泳显示梯状条带，代表待测生物样品中含有锦鲤疱疹病毒Sph基因；如果扩增产物的琼脂糖凝胶电泳不显示梯状条带，则说明待测生物样品中不含锦鲤疱疹病毒Sph基因。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的扩增锦鲤疱疹病毒Sph基因的方法中，扩增的体系包括以下组分：
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的扩增锦鲤疱疹病毒Sph基因的方法中，扩增的体系包括以下组分：
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的扩增锦鲤疱疹病毒Sph基因的方法中，当采用荧光显色法检测扩增产物时，扩增的体系中还包括2％～4％的钙黄绿素。
优选地，本发明提供的扩增锦鲤疱疹病毒Sph基因的方法中，环介导等温扩增的反应程序为：61℃～65℃，30min～60min；4℃，保存。
本发明还提供了一种利用本发明提供的引物组检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的方法，包括：
获得待测生物样品，以具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游外部引物、具有如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游外部引物、具有如SEQ IDNO:3所示核苷酸序列的上游内部引物和具有如SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的下游内部引物扩增待测生物样品，得扩增产物；检测所得扩增产物，根据检测结果判断待测生物样品中是否含有锦鲤疱疹病毒Sph基因；
该引物组包括以下引物：
具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游外部引物；
具有如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游外部引物；
具有如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的上游内部引物；
具有如SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的下游内部引物。
本发明提供了一种用于检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的引物组及其应用。本发明提供的用于检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的引物组包括：具有如SEQ IDNO:1所示核苷酸序列的上游外部引物，具有如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游外部引物，具有如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的上游内部引物和具有如SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的下游内部引物。本发明提供的引物组为根据锦鲤疱疹病毒Sph基因设计获得的，特异性强、灵敏度高，适用于LAMP法扩增锦鲤疱疹病毒Sph基因，能够用于制备检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的试剂。实验结果证实，本发明提供的引物组能够特异性扩增锦鲤疱疹病毒Sph基因，相比普通PCR，检测灵敏度高出两个数量级，可以用于LAMP法扩增锦鲤疱疹病毒Sph基因，能够用于制备检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的试剂。
附图说明
图1示实施例1引物筛选结果所得扩增曲线，曲线1代表第1组引物组所对应的扩增曲线；曲线2代表第2组引物组所对应的扩增曲线；曲线3代表第3组引物组所对应的扩增曲线；曲线4代表第4组引物组所对应的扩增曲线；曲线5代表第5组引物组所对应的扩增曲线；曲线6代表第6组引物组所对应的扩增曲线；曲线7代表第7组引物组所对应的扩增曲线；
图2示实施例2的扩增产物检测结果，1号反应管代表实验组1，扩增产物为绿色；2号反应管代表实验组2，扩增产物为绿色；3号反应管代表空白对照组，扩增产物为浅橙色；
图3示实施例3的扩增产物检测结果，1号反应管代表空白对照组，扩增产物为浅橙色；2号反应管代表实验组1，扩增产物为绿色；3号反应管代表实验组2，扩增产物为绿色；
图4示实施例4的扩增产物的检测结果，1号反应管代表实验组1，扩增产物为绿色；2号反应管代表实验组2，扩增产物为绿色；3号反应管代表空白对照组，扩增产物为浅橙色；
图5示实施例5中LAMP法第一次扩增实验结果，其中样品1示2.66×1010copies/μL的模板；样品2示2.66×109copies/μL的模板；样品3示2.66×108copies/μL的模板；样品4示2.66×107copies/μL的模板；样品5示2.66×106copies/μL的模板；样品6示2.66×105copies/μL的模板；样品7示2.66×104copies/μL的模板；样品8示2.66×103copies/μL的模板；A为蓝色；B为红色；C为绿色；
图6示实施例5中LAMP法第二次扩增实验结果，其中样品1示2.66×1010copies/μL的模板；样品2示2.66×109copies/μL的模板；样品3示2.66×108copies/μL的模板；样品4示2.66×107copies/μL的模板；样品5示2.66×106copies/μL的模板；样品6示2.66×105copies/μL的模板；样品7示2.66×104copies/μL的模板；样品8示2.66×103copies/μL的模板；A为蓝色；B为红色；C为绿色；
图7示实施例5中LAMP法第三次扩增实验结果，其中样品1示2.66×1010copies/μL的模板；样品2示2.66×109copies/μL的模板；样品3示2.66×108copies/μL的模板；样品4示2.66×107copies/μL的模板；样品5示2.66×106copies/μL的模板；样品6示2.66×105copies/μL的模板；样品7示2.66×104copies/μL的模板；样品8示2.66×103copies/μL的模板；A为蓝色；B为红色；C为绿色；
图8示实施例5中普通PCR法扩增的实验结果，其中其中泳道1示2.66×1010copies/μL的模板；泳道2示2.66×109copies/μL的模板；泳道3示2.66×108copies/μL的模板；泳道4示2.66×107copies/μL的模板；泳道5示2.66×106copies/μL的模板；泳道6示2.66×105copies/μL的模板；泳道7示2.66×104copies/μL的模板；泳道8示2.66×103copies/μL的模板；
图9示实施例6中第一次扩增实验中不同的模板LAMP扩增所得扩增曲线的柱状图；样品1示模板1所得扩增曲线；样品2示模板2所得扩增曲线；样品3代表模板3所得扩增曲线；样品4代表模板4所得扩增曲线；样品5代表空白对照组；A为蓝色；B为红色；C为绿色；
图10示实施例6第二次扩增实验中不同的模板LAMP扩增所得扩增曲线的柱状图；样品1示模板2所得扩增曲线；样品2示模板3所得扩增曲线；样品3代表模板1所得扩增曲线；样品4代表模板4所得扩增曲线；样品5代表空白对照组；A为蓝色；B为红色；C为绿色；
图11示实施例6第三次扩增实验中不同的模板LAMP扩增所得扩增曲线的柱状图；样品1示模板2所得扩增曲线；样品2示模板1所得扩增曲线；样品3代表模板3所得扩增曲线；样品4代表模板4所得扩增曲线；样品5代表空白对照组；A为蓝色；B为红色；C为绿色；
图12示实施例7中PCR法扩增实验的检测结果；M为DNA分子量Marker；1代表阳性对照；2代表阴性对照；3代表皮肤黏液生物样品；4代表脑生物样品；5代表心脏生物样品；6代表血液生物样品；7代表肾脏生物样品；8代表肌肉生物样品；
图13示实施例7中LAMP法扩增实验的检测结果；样品1代表阳性对照；样品2代表阴性对照；样品3代表肌肉生物样品；样品4代表血液生物样品；样品5代表肾脏生物样品；样品6代表脑生物样品；样品7代表皮肤黏液生物样品；样品8代表心脏生物样品；A为蓝色；B为红色；C为绿色；
图14示实施例8中利用试剂盒扩增模板时，所得扩增曲线的柱状图；样品1示阴性对照所得扩增曲线；样品2示模板所得扩增曲线；A为蓝色；B为红色；C为绿色；
图15示本发明实施例9的检测结果，1号反应管代表空白对照组，扩增产物为浅橙色；2号反应管代表待测样品，扩增产物为绿色；3号反应管代表阳性对照组，扩增产物为绿色；
图16示实施例10的检测结果，1号反应管代表阳性对照组，1号反应管中含有白色浑浊沉淀物；2号反应管代表待测样品，2号反应管中含有白色浑浊沉淀物；3号反应管代表空白对照组，3号反应管澄清。
具体实施方式
本发明公开了一种用于检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的引物组及其应用。本领域技术人员可以参考本文内容，获得该引物组，实现其应用，特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的制备方法已经通过较佳的实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文制备方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的用于检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的引物组及其应用中所用到的试剂和原料均可由市场购得。
为了使本技术领域的技术人员能够更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1 特异性引物组的筛选
引物设计：
根据锦鲤疱疹病毒Sph基因(GenBank登录号AB375381.1)，利用PrimerExplorer V4在线软件http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html，设计合成用于检测锦鲤疱疹病毒的LAMP引物：通过综合考虑碱基组成、GC含量、二级结构的形成、Tm值、引物之间的距离、引物末端的稳定性等因素，设置和调整引物设计软件参数，共设计合成获得10组引物，以用于LAMP引物的筛选。LAMP法所需引物中上游外部引物、下游外部引物、上游内部引物和下游内部引物是必须的，也直接决定了扩增的灵敏度和特异性。本实施例合成的10组引物及各个引物对应的核苷酸序列见表1。
表1 10组引物及各个引物对应的核苷酸序列
KHV核酸的提取：
锦鲤疱疹病毒KHV购买于北京中原经贸公司(ATCC、VR-1592)，按照宝生物工程(大连)有限公司的DNA提取试剂盒说明书进行操作提取锦鲤疱疹病毒核酸，即KHV核酸；将提取的KHV核酸用于LAMP试验。
引物筛选：
对设计获得的10组引物进行筛选，因为LAMP引物组中两条外部引物、两条内部引物决定了扩增的特异性和灵敏度，所以，对两条外部引物、两条内部引物进行筛选，以获得最佳引物。在此阶段，不需要加入环引物，待引物筛选完毕，如果想使反应时间更短，可以考虑加入环引物。
以各组引物设置扩增体系，每个扩增体系的体积为25μL，包括本实施例获得的KHV核酸(模板)2μL(170ng)、上游外部引物0.2μmol/L、下游外部引物0.2μmmol/L、上游内部引物1.6μmol/L、下游内部引物1.6μmol/L、dNTPS1.4mmol/L、甜菜碱(Betaine)0.8mmol/L、Tris-HCl(pH8.8)20mmol/L、KCl10mmol/L、(NH4)2SO410mmol/L、MgSO48mmol/L、Tween20 0.1％(体积百分含量)、Bst DNA Polymerase 8U和余量的水。配置扩增体系时，先将其中模板之外的试剂混匀，再加入模板，即为完整的LAMP反应体系。LAMP反应程序：63℃60分钟，4℃保存。通过Loopamp浊度仪(厂家：日本荣研化学株式会；型号：LA-320C；参数：光源为ED(波长650mm)，检出器为光电二极管，温度调节范围为区域(55-70℃)、光罩(65-90℃)，测定间隔为6秒)实时检测反应液，根据有无扩增曲线生成、扩增反应发生时间、以及扩增特异性来判断每组的扩增效率，以筛选出最优的一组引物。
引物筛选结果所得扩增曲线见图1，其中曲线1代表第1组引物组所对应的扩增曲线；曲线2代表第2组引物组所对应的扩增曲线；曲线3代表第3组引物组所对应的扩增曲线；曲线4代表第4组引物组所对应的扩增曲线；曲线5代表第5组引物组所对应的扩增曲线；曲线6代表第6组引物组所对应的扩增曲线；曲线7代表第7组引物组所对应的扩增曲线。第八组引物、第九组引物、第十组引物没有扩增。由扩增结果可知：第三组引物组的特异性最好、扩增效率最高，为最佳引物。将本实施例筛选获得的第三组引物组进行命名，见表2。
表2 第三组引物组所对应的引物及引物的命名
引物 核苷酸序列 引物命名
上游外部引物 具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列 FOP
下游外部引物 具有如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列 BOP
上游内部引物 具有如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列 FIP
下游内部引物 具有如SEQ ID NO:4所示核苷酸序列 BIP
实施例2 引物组检测SPH基因
(1)模板：
合成具有如SEQ ID NO:41所示核苷酸序列的DNA分子，该DNA分子为锦鲤疱疹病毒DNA聚合酶基因(Sph基因)经个别核苷酸替换所对应的基因序列，将该DNA分子标记为SPH，稀释所得SPH DNA分子的浓度至85ng/μL。此处将锦鲤疱疹病毒Sph基因进行个别核苷酸替换的原因是使其不能翻译成为具有活性的功能蛋白，以防止污染环境。
(2)扩增：
以步骤(1)所得DNA分子为模板，以具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA分子为上游外部引物(即FOP)、具有如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的DNA分子为下游外部引物(即BOP)、具有如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的DNA分子为上游内部引物(即FIP)、具有如SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的DNA分子为下游内部引物(即BIP)，设置扩增体系，见表3。
表3 LAMP反应体系(25μL)
组分 在反应体系中的终浓度
FIP 1.6μmol/L
BIP 1.6μmol/L
FOP 0.2μmol/L
BOP 0.2μmol/L
dNTPS 1.4mmol/L
甜菜碱(Betaine) 0.8mmol/L
Tris-HCl(pH8.8) 20mmol/L
KCl 10mmol/L
(NH4)2SO4 10mmol/L
MgSO4 8mmol/L
Tween20 0.1％(体积百分含量)
Bst DNA Polymerase 0.32U/μL
模板 6.8ng/μL
钙黄绿素 1μL
双蒸水 定容
实验分为三组，实验组1、实验组2和空白对照组，实验组1和实验组2的扩增体系如表3所示；空白对照组的扩增体系中以2μL双蒸水作为模板，其他条件两组相同。
按照表3，配置扩增体系，先将其中模板之外的试剂混匀，再加入模板，即为完整的LAMP反应体系。
LAMP反应程序：63℃ 60分钟，4℃ 保存。
(3)扩增产物检测：
本实施例采用荧光显色法对扩增产物进行检测，当反应完成后，直接观察扩增反应溶液的颜色变化(反应前溶液均显示浅橙色荧光，如果反应结果为阳性，反应后溶液应显示绿色荧光)，检测结果见图2。图中1号LAMP反应管对应实验组1，扩增产物为绿色；图中2号LAMP反应管对应实验组2扩增产物为绿色；图中3号LAMP反应管对应空白对照组，扩增产物为浅橙色。从图中可知，实验组1和实验组2所得的扩增反应液均显示绿色荧光，为阳性；空白对照组所得扩增反应液仍然显示浅橙色荧光，为阴性。以上实验结果与理论结果相一致，说明本实施例提供的引物组能够应用于检测SPH基因，可用于检测锦鲤疱疹病毒Sph基因，可以用于制备检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的试剂，也可以用于制备检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的试剂盒。
实施例3 引物组检测SPH基因
(1)模板：
与实施例2中模板相同，即为具有如SEQ ID NO:46所示核苷酸序列的DNA分子。
(2)扩增：
以步骤(1)所得DNA分子为模板，以具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA分子为上游外部引物(即FOP)、具有如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的DNA分子为下游外部引物(即BOP)、具有如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的DNA分子为上游内部引物(即FIP)、具有如SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的DNA分子为下游内部引物(即BIP)，设置扩增体系，见表4。
表4 LAMP反应体系(25μL)
组分 在反应体系中的终浓度
FIP 2.0μmol/L
BIP 2.0μmol/L
FOP 0.5μmol/L
BOP 0.5μmol/L
dNTPS 2.0mmol/L
甜菜碱(Betaine) 1.0mmol/L
Tris-HCl(pH8.8) 50mmol/L
KCl 50mmol/L
(NH4)2SO4 50mmol/L
MgSO4 50mmol/L
Tween20 1.0％(体积百分含量)
Bst DNA Polymerase 2U/μL
模板 68ng/μL
钙黄绿素 1μL
双蒸水 定容
实验分为三组，实验组1、实验组2和空白对照组，实验组1和实验组2的扩增体系如表4所示；空白对照组的扩增体系中以2μL双蒸水作为模板，其他条件三组相同。
按照表4，配置扩增体系，先将其中模板之外的试剂混匀，再加入模板，即为完整的LAMP反应体系。
LAMP反应程序：63℃ 60分钟，4℃ 保存。
(3)扩增产物检测：
本实施例采用荧光显色法对扩增产物进行检测，当反应完成后，直接观察扩增反应溶液的颜色变化(反应前溶液均显示浅橙色荧光，如果反应结果为阳性，反应后溶液应显示绿色荧光)，检测结果见图3，其中1号反应管代表空白对照组，扩增产物为浅橙色；2号反应管代表实验组1，扩增产物为绿色；3号反应管代表实验组2，扩增产物为绿色；从图中可知，实验组1和实验组2所得的扩增反应液均显示绿色荧光，为阳性；空白对照组所得扩增反应液仍然显示浅橙色荧光，为阴性。以上实验结果与理论结果相一致，说明本实施例提供的引物组能够应用于检测SPH基因，可用于检测锦鲤疱疹病毒Sph基因，可以用于制备检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的试剂，也可以用于制备检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的试剂盒。
实施例4 引物组检测SPH基因
(1)模板：
与实施例2中模板相同，即为具有如SEQ ID NO:41所示核苷酸序列的DNA分子。
(2)扩增：
以步骤(1)所得DNA分子为模板，以具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA分子为上游外部引物(即FOP)、具有如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的DNA分子为下游外部引物(即BOP)、具有如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的DNA分子为上游内部引物(即FIP)、具有如SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的DNA分子为下游内部引物(即BIP)，设置扩增体系，见表5。
表5 LAMP反应体系(25μL)
组分 在反应体系中的终浓度
FIP 0.8μmol/L
BIP 0.8μmol/L
FOP 0.05μmol/L
BOP 0.05μmol/L
dNTPS 0.8mmol/L
甜菜碱(Betaine) 0.1mmol/L
Tris-HCl(pH8.8) 5mmol/L
KCl 5mmol/L
(NH4)2SO4 5mmol/L
MgSO4 5mmol/L
Tween20 0.01％(体积百分含量)
Bst DNA Polymerase 0.02U/μL
模板 1.7ng/μL
钙黄绿素 1μL
双蒸水 定容
实验分为三组，实验组1、实验组2和空白对照组，实验组1和实验组2的扩增体系如表5所示；空白对照组的扩增体系中以2μL双蒸水作为模板，其他条件三组相同。
按照表5，配置扩增体系，先将其中模板之外的试剂混匀，再加入模板，即为完整的LAMP反应体系。
LAMP反应程序：63℃ 60分钟，4℃ 保存。
(3)扩增产物检测：
本实施例采用荧光显色法对扩增产物进行检测，当反应完成后直接观察扩增反应溶液的颜色变化(反应前溶液均显示浅橙色荧光，如果反应结果为阳性，反应后溶液应显示绿色荧光)，检测结果见图4。图中1号LAMP反应管对应实验组1，扩增产物为绿色；图中2号LAMP反应管对应实验组2，扩增产物为绿色；图中3号LAMP反应管对应空白对照组，扩增产物为浅橙色。从图中可知，实验组1和实验组2所得的扩增反应液均显示绿色荧光，为阳性；空白对照组所得扩增反应液仍然显示浅橙色荧光，为阴性。以上实验结果与理论结果相一致，说明本实施例提供的引物组能够应用于检测SPH基因，可用于检测锦鲤疱疹病毒Sph基因，可以用于制备检测锦鲤疱疹病毒的试剂，也可以用于制备检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的试剂盒。
实施例5 引物组灵敏性检测
(1)模板：
与实施例2中模板相同，即为具有如SEQ ID NO:41所示核苷酸序列的DNA，将模板SPH DNA进行稀释，浓度如下：2.66×1010copies/μL、2.66×109copies/μL、2.66×108copies/μL、2.66×107copies/μL、2.66×106copies/μL、2.66×105copies/μL、2.66×104copies/μL、2.66×103copies/μL、2.66×102copies/μL、2.66×101copies/μL。
(2)LAMP法扩增：
分别以步骤(1)所得各个浓度的DNA分子为模板，以具有如SEQ IDNO:1所示核苷酸序列的DNA分子为上游外部引物(即FOP)、具有如SEQ IDNO:2所示核苷酸序列的DNA分子为下游外部引物(即BOP)、具有如SEQ IDNO:3所示核苷酸序列的DNA分子为上游内部引物(即FIP)、具有如SEQ IDNO:4所示核苷酸序列的DNA分子为下游内部引物(即BIP)，设置扩增体系，见表6。
表6 LAMP反应体系(25μL)
组分 在反应体系中的终浓度
FIP 1.6μmol/L
BIP 1.6μmol/L
FOP 0.2μmol/L
BOP 0.2μmol/L
dNTPS 1.4mmol/L
甜菜碱(Betaine) 0.8mmol/L
Tris-HCl(pH8.8) 20mmol/L
KCl 10mmol/L
(NH4)2SO4 10mmol/L
MgSO4 8mmol/L
Tween20 0.1％(体积百分含量)
Bst DNA Polymerase 0.32U/μL
模板 2μL
双蒸水 定容
按照表6配置扩增体系，先将其中模板之外的试剂混匀，再加入模板，即为完整的LAMP反应体系。
LAMP反应程序：63℃ 60分钟，4℃ 保存。
采用浊度仪实时检测反应液，从反应开始时刻即通过Loopamp浊度仪(厂家：日本荣研化学株式会；型号：LA-320C；参数：光源为ED(波长650mm)，检出器为光电二极管，温度调节范围为区域(55-70℃)、光罩(65-90℃)，测定间隔为6秒)检测反应液，实时检测60分钟。通过LAMP浊度仪生成的扩增曲线即可判断扩增反应情况。当扩增反应的扩增曲线用柱状图表示时，如果反应为阳性扩增时，出现扩增条带，且反应速度曲线峰值都超过0；如果未发生扩增，则没有出现扩增条带。检测结果见图5，其中样品1示2.66×1010copies/μL的模板；样品2示2.66×109copies/μL的模板；样品3示2.66×108copies/μL的模板；样品4示2.66×107copies/μL的模板；样品5示2.66×106copies/μL的模板；样品6示2.66×105copies/μL的模板；样品7示2.66×104copies/μL的模板；样品8示2.66×103copies/μL的模板；A为蓝色(蓝色代表浊度值)；B为红色(红色代表阳性)；C为绿色(绿色代表阴性)。由图5可知，采用本发明提供的引物组利用LAMP法检测锦鲤疱疹病毒的最低检测灵敏度为2.66×104copies/μL。
进行三次重复实验，第二次实验结果见图6，第三次实验结果见图7，由图可知，三次实验所得实验结果基本一致，说明本发明提供的引物组利用LAMP法检测锦鲤疱疹病毒的最低检测灵敏度为2.66×104copies/μL。
(3)普通PCR扩增(对比例)：
分别以步骤(1)所得各个浓度的DNA分子为模板，以具有如SEQ IDNO:42所示核苷酸序列的DNA分子为上游引物、具有如SEQ ID NO:43所示核苷酸序列的DNA分子为下游引物、设置扩增体系，扩增体系为：模板3μL，10×Ex Taq buffer 2μL，dNTP(2.5mmol/L)3μL，上游引物0.1μL(50pmol/L)，下游引物0.1μL(50pmol/L)，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.3μL，加DEPC至20μL。以3μL双蒸水作为模板的空白对照。
PCR反应条件：预变性94℃ 30min；95℃ 1min、52℃ 1min、72℃ 1min、30个循环后、72℃延伸 10min、4 ℃保存。
采用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，扩增结果见图8，其中泳道1示2.66×1010copies/μL的模板；泳道2示2.66×109copies/μL的模板；泳道3示2.66×108copies/μL的模板；泳道4示2.66×107copies/μL的模板；泳道5示2.66×106copies/μL的模板；泳道6示2.66×105copies/μL的模板；泳道7示2.66×104copies/μL的模板；泳道8示2.66×103copies/μL的模板。由图可知，PCR方法的检测灵敏度为2.66×106copies/μL。
结合LAMP法的实验结果，进行对比可知本发明提供的LAMP方法比PCR方法的灵敏度高出两个数量级。
实施例6 引物组特异性检测
(1)模板：
分别以如下材料作为模板进行LAMP扩增：模板1：SPH基因，为具有如SEQ ID NO:41所示核苷酸序列的DNA分子(浓度为85ng/μL)；模板2：传染性造血器官坏死病病毒核酸(浓度为65ng/μL，来源于吉林农业大学动物科技学院)；模板3：鲤鱼疱疹病毒核酸(浓度为62ng/μL，来源于购于北京中原经贸公司)；模板4：鲤春病毒核酸(浓度为42ng/μL，来源于吉林农业大学动物科技学院)。同时，实验设置空白对照组：以2μL双蒸水作为模板。
(2)扩增：
分别以步骤(1)所提供的材料为模板，以具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA分子为上游外部引物(即FOP)、具有如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的DNA分子为下游外部引物(即BOP)、具有如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的DNA分子为上游内部引物(即FIP)、具有如SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的DNA分子为下游内部引物(即BIP)，设置扩增体系，见表7。
表7 LAMP反应体系(25μL)
组分 在反应体系中的终浓度
FIP 1.6μmol/L
BIP 1.6μmol/L
FOP 0.2μmol/L
BOP 0.2μmol/L
dNTPS 1.4mmol/L
甜菜碱(Betaine) 0.8mmol/L
Tris-HCl(pH8.8) 20mmol/L
KCl 10mmol/L
(NH4)2SO4 10mmol/L
MgSO4 8mmol/L
Tween20 0.1％(体积百分含量)
Bst DNA Polymerase 0.32U/μL
模板 2μL
双蒸水 定容
按照表7，配置扩增体系，先将其中模板之外的试剂混匀，再加入模板，即为完整的LAMP反应体系。
LAMP反应程序：63℃ 60分钟，4℃ 保存。
采用浊度仪实时检测反应液：从反应开始时刻即通过Loopamp浊度仪(厂家：日本荣研化学株式会；型号：LA-320C；参数：光源为ED(波长650mm)，检出器为光电二极管，温度调节范围为区域(55-70℃)、光罩(65-90℃)，测定间隔为6秒)检测反应液，实时检测60分钟，检测结果见图9，样品1示模板1所得扩增曲线；样品2示模板2所得扩增曲线；样品3代表模板3所得扩增曲线；样品4代表模板4所得扩增曲线；样品5代表空白对照组；A为蓝色；B为红色；C为绿色。根据检测结果可知，只有SPH基因作模板时，显示为阳性结果，其它模板均显示阴性结果，与预期相一致，说明本发明提供的引物特异性好，能够应用于检测SPH基因，可用于检测锦鲤疱疹病毒Sph基因，可以用于制备检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的试剂，也可以用于制备检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的试剂。
进行三次重复实验，第二次实验的实验结果见图10，其中样品3为模板1所得扩增曲线；第三次实验的实验结果见图11，其中样品2为模板2所得扩增曲线；由图可知，三次实验结果一致，都说明了本发明提供的引物组特异性好，能够应用于检测SPH基因，可用于检测锦鲤疱疹病毒Sph基因，可以用于制备检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的试剂，也可以用于制备检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的试剂。
实施例7 引物组检测生物样品
(1)生物样品的来源：
取患有锦鲤疱疹病毒病的功毒鱼(来源于本实验室)，分别收集该功毒鱼的皮肤粘液、脑、肌肉、血液、肾脏、心脏样品，对各个生物样品进行处理，作为模板，用于扩增。生物样品的处理方法：分别将各生物样品匀浆后，取上清。同时，实验设置阳性对照和空白对照。阳性对照组：以SPH基因(具有如SEQ ID NO:41所示核苷酸序列的DNA分子，浓度为85ng/μL)作为模板；空白对照组：以2μL双蒸水作为模板。
(2)常规PCR方法扩增：
目前常用于检测锦鲤疱疹病毒的方法为PCR方法，本实施例先用常规PCR方法进行检测以上样本以确定哪些样本中含有锦鲤疱疹病毒，具体操作为：分别取步骤(1)所得的各个模板、以具有如SEQ ID NO:42所示核苷酸序列的DNA分子为上游引物、具有如SEQ ID NO:43所示核苷酸序列的DNA分子为下游引物、设置扩增体系，扩增体系为：模板3μL，10×Ex Taq buffer2μL，dNTP(2.5mmol/L)3μL，上游引物0.1μL(50pmol/L)，下游引物0.1μL(50pmol/L)，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.3μL，加DEPC至20μL。
PCR反应条件：预变性94℃ 30min；95℃ 1min、52℃ 1min、72℃ 1min、30个循环后、72℃延伸 10min、4 ℃保存。
采用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，扩增结果见图12；其中，M为DNA分子量Marker；1代表阳性对照；2代表阴性对照；3代表皮肤黏液生物样品；4代表脑生物样品；5代表心脏生物样品；6代表血液生物样品；7代表肾脏生物样品；8代表肌肉生物样品。由图可知，空白对照没有扩增产物、阳性对照出现了扩增产物，说明体系正常，实验结果有意义；PCR法检测出含有锦鲤疱疹病毒Sph基因的生物样品分别为肾脏与脑。
(3)LAMP法扩增：
分别取步骤(1)所得的各个模板、具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA分子为上游外部引物(即FOP)、具有如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的DNA分子为下游外部引物(即BOP)、具有如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的DNA分子为上游内部引物(即FIP)、具有如SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的DNA分子为下游内部引物(即BIP)，配置扩增体系，见表8。
表8 LAMP反应体系(25μL)
组分 在反应体系中的终浓度
FIP 1.6μmol/L
BIP 1.6μmol/L
FOP 0.2μmol/L
BOP 0.2μmol/L
dNTPS 1.4mmol/L
甜菜碱(Betaine) 0.8mmol/L
Tris-HCl(pH8.8) 20mmol/L
KCl 10mmol/L
(NH4)2SO4 10mmol/L
MgSO4 8mmol/L
Tween20 0.1％(体积百分含量)
Bst DNA Polymerase 0.32U/μL
模板 2μL
双蒸水 定容
按照表8配置扩增体系，先将其中模板之外的试剂混匀，再加入模板，即为完整的LAMP反应体系。
LAMP反应程序：63℃ 60分钟，4℃ 保存。
采用浊度仪实时检测反应液，从反应开始时刻即通过Loopamp浊度仪(厂家：日本荣研化学株式会；型号：LA-320C；参数：光源为ED(波长650mm)，检出器为光电二极管，温度调节范围为区域(55-70℃)、光罩(65-90℃)，测定间隔为6秒)检测反应液，实时检测60分钟。检测结果见图13，样品1代表阳性对照；样品2代表阴性对照；样品3代表肌肉生物样品；样品4代表血液生物样品；样品5代表肾脏生物样品；样品6代表脑生物样品；样品7代表皮肤黏液生物样品；样品8代表心脏生物样品；A为蓝色；B为红色；C为绿色。由图可知，空白对照没有扩增、阳性对照有扩增曲线生成，说明LAMP法检测体系正常，实验结果有意义；LAMP法检测出含有锦鲤疱疹病毒Sph基因的生物样品分别为肾脏与脑，与PCR方法检测所得结果一致。说明本发明提供的引物组可以用于检测临床生物样品。本发明提供的引物组可用于检测锦鲤疱疹病毒Sph基因，可以用于制备检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的试剂，也可以用于制备检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的试剂盒。
实施例8 试剂盒的制备及使用
本实施例的试剂盒由以下组分组成：阳性对照品、阴性对照品。反应液A和反应液B组成。阳性对照品为具有如SEQ ID NO:41所示核苷酸序列的DNA分子。阴性对照品为双蒸水。反应液A为Bst DNA聚合酶，浓度为5U/μL。反应液B由具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA分子为上游外部引物(即FOP)、具有如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的DNA分子为下游外部引物(即BOP)、具有如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的DNA分子为上游内部引物(即FIP)、具有如SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的DNA分子为下游内部引物(即BIP)、dNTPs、甜菜碱、Tris-HCl(pH8.8)、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4、Tween20和双蒸水组成。根据需求配置反应液B，其中各个试剂的终浓度为：FIP 1.6μmol/L、BIP 1.6μmol/L、FOP 0.2μmol/L、BOP0.2μmol/L、dNTPS 1.4mmol/L、甜菜碱 0.8mmol/L、Tris-HCl(pH8.8)20mmol/L、KCl 10mmol/L、(NH4)2SO4 10mmol/L、MgSO4 8mmol/L、Tween20 0.1％(体积百分含量)。
取本实施例制得的试剂盒，考察本发明提供的试剂盒在检测锦鲤疱疹病毒Sph基因中的应用。
本发明提供的试剂盒适用于LAMP法扩增锦鲤疱疹病毒Sph基因，采用浊度仪实时检测反应液；使用时，以试剂盒所带的阳性对照品和阴性对照品为质控，根据浊度仪生成的扩增曲线判断扩增反应情况。质控结果必须符合下述条件：阴性对照品没有扩增，结果为阴性；阳性对照品有扩增，结果为阳性。
以实施例2提供的具有如SEQ ID NO:41所示核苷酸序列的DNA分子为模板，按照25μL的体系配制LAMP反应混合液：其中模板2μL；反应液A1.6μL；反应液B 21.4μL。LAMP反应程序：63℃ 30分钟，4℃保存。所得扩增曲线见图14，样品1示阴性对照所得扩增曲线；样品2示模板所得扩增曲线；A为蓝色；B为红色；C为绿色。该检测结果为阳性，与理论结果一致，说明本实施例提供的试剂盒能够检测出锦鲤疱疹病毒Sph基因，可以用于锦鲤疱疹病毒的检测。
实施例9 试剂盒的制备及使用
本实施例的试剂盒由以下组分组成：阳性对照品、阴性对照品。反应液A和反应液B组成。阳性对照品为具有如SEQ ID NO:41所示核苷酸序列的DNA分子。阴性对照品为双蒸水。反应液A为Bst DNA聚合酶，浓度为5U/μL。反应液B由具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA分子为上游外部引物(即FOP)、具有如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的DNA分子为下游外部引物(即BOP)、具有如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的DNA分子为上游内部引物(即FIP)、具有如SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的DNA分子为下游内部引物(即BIP)、dNTPs、甜菜碱、Tris-HCl(pH8.8)、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4、Tween20、钙黄绿素和双蒸水组成。根据需求配置反应液B，其中各个试剂的终浓度为：FIP 2.0μmol/L、BIP 2.0μmol/L、FOP 0.5μmol/L、BOP 0.5μmol/L、dNTPS 2.0mmol/L、甜菜碱 1.0mmol/L、Tris-HCl(pH8.8)50mmol/L、KCl 50mmol/L、(NH4)2SO4 50mmol/L、MgSO4 50mmol/L、Tween201.0％(体积百分含量)、钙黄绿素4％。
取本实施例制得的试剂盒，考察本发明提供的试剂盒在检测锦鲤疱疹病毒Sph基因中的应用。
本发明提供的试剂盒适用于LAMP法扩增锦鲤疱疹病毒Sph基因，采用荧光显色法检测扩增产物；使用时，以试剂盒所带的阳性对照品和阴性对照品为质控，根据扩增产物颜色变化判断扩增反应情况。质控结果必须符合下述条件：阴性对照品为浅橙色，结果为阴性；阳性对照品为绿色荧光。样本检测结果的判定：阴性为浅橙色、阳性为绿色荧光。
取患有锦鲤疱疹病毒病的功毒鱼(来源于吉林出入境检验检疫局)，收集该功毒鱼的肾脏样品，对样品进行处理，处理方法为：将各功毒鱼肾脏匀浆后，取上清，提取核酸，以所得提取物作为模板，为待测样品。按照25μL的体系配制LAMP反应混合液：其中模板2μL；反应液A 1.6μL；反应液B21.4μL。LAMP反应程序：61℃ 60分钟，4℃ 保存。所得检测结果见图15，1号反应管代表空白对照组，扩增产物为浅橙色；2号反应管代表待测样品，扩增产物为绿色；3号反应管代表阳性对照组，扩增产物为绿色。该检测结果为阳性，与实际情况一致，说明本实施例提供的试剂盒能够检测出锦鲤疱疹病毒Sph基因，可以用于锦鲤疱疹病毒的检测。
实施例10 试剂盒的制备及使用
本实施例的试剂盒由以下组分组成：阳性对照品、阴性对照品。反应液A和反应液B组成。阳性对照品为具有如SEQ ID NO:41所示核苷酸序列的DNA分子。阴性对照品为双蒸水。反应液A为Bst DNA聚合酶，浓度为5U/μL。反应液B由具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA分子为上游外部引物(即FOP)、具有如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的DNA分子为下游外部引物(即BOP)、具有如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的DNA分子为上游内部引物(即FIP)、具有如SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的DNA分子为下游内部引物(即BIP)、dNTPs、甜菜碱、Tris-HCl(pH8.8)、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4、Tween20和双蒸水组成。根据需求配置反应液B，其中各个试剂的终浓度为：FIP 0.8μmol/L、BIP 0.8μmol/L、FOP 0.05μmol/L、BOP0.05μmol/L、dNTPS 0.8mmol/L、甜菜碱 0.1mmol/L、Tris-HCl(pH8.8)5mmol/L、KCl 5mmol/L、(NH4)2 SO4 5mmol/L、MgSO4 5mmol/L、Tween20 0.01％(体积百分含量)。
取本实施例制得的试剂盒，考察本发明提供的试剂盒在检测锦鲤疱疹病毒Sph基因中的应用。
本发明提供的试剂盒适用于LAMP法扩增锦鲤疱疹病毒Sph基因，采用直接观察反应液有没有出现白色浑浊沉淀来检测有无扩增产物；使用时，以试剂盒所带的阳性对照品和阴性对照品为质控。质控结果必须符合下述条件：阴性对照品反应液没有产生白色浑浊沉淀，结果为阴性；阳性对照品产生白色浑浊沉淀，结果为阳性。样本检测结果的判定：有白色浑浊沉淀为阳性反应，否则为阴性反应。
取患有锦鲤疱疹病毒病的功毒鱼(来源于吉林出入境检验检疫局)，收集该功毒鱼的肾脏样品，对样品进行处理，处理方法为：将功毒鱼肾脏匀浆后，取上清，提取核酸，以所得提取物作为模板，为待测样品。按照25μL的体系配制LAMP反应混合液：其中模板2μL；反应液A 1.6μL；反应液B 21.4μL。LAMP反应程序：65℃ 45分钟，4℃保存。所得检测结果见图16，其中，1号反应管代表阳性对照组，1号反应管中含有白色浑浊沉淀物；2号反应管代表待测样品，2号反应管中含有白色浑浊沉淀物；3号反应管代表空白对照组，3号反应管澄清。该检测结果为阳性，与实际情况一致，说明本实施例提供的试剂盒能够检测出锦鲤疱疹病毒Sph基因，可以用于锦鲤疱疹病毒的检测。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.用于检测锦鲤疱疹病毒的引物组，其特征在于，所述引物组包括以下引物：
具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游外部引物；
具有如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游外部引物；
具有如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的上游内部引物；
具有如SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的下游内部引物。
2.如权利要求1所述的引物组在制备检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的试剂中的应用。
3.一种检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1所述的引物组。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述上游外部引物的浓度为0.05μmol/L～0.5μmol/L。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述下游外部引物的浓度为0.05μmol/L～0.5μmol/L。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述上游内部引物的浓度为0.8μmol/L～2.0μmol/L。
7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述下游内部引物的浓度为0.8μmol/L～2.0μmol/L。
8.利用如权利要求1所述的引物组扩增锦鲤疱疹病毒Sph基因的方法，其特征在于，包括：
获得待测生物样品，以具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游外部引物、具有如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游外部引物、具有如SEQ IDNO:3所示核苷酸序列的上游内部引物和具有如SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的下游内部引物扩增所述待测生物样品。
9.利用如权利要求1所述的引物组检测锦鲤疱疹病毒Sph基因的方法，其特征在于，包括：
获得待测生物样品，以具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游外部引物、具有如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游外部引物、具有如SEQ IDNO:3所示核苷酸序列的上游内部引物和具有如SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的下游内部引物扩增所述待测生物样品，得扩增产物；检测所述扩增产物，根据检测结果判断所述待测生物样品中是否含有锦鲤疱疹病毒Sph基因。
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