CN109097498A - 锦鲤疱疹病毒可视化快速检测试剂盒 - Google Patents

锦鲤疱疹病毒可视化快速检测试剂盒 Download PDF

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董学旺
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Abstract

本发明公开了一种锦鲤疱疹病毒可视化快速检测试剂盒，包括：试剂A：组织裂解液Ⅰ；试剂B：组织裂解液Ⅱ；试剂C：异丙醇；试剂D：体积百分比浓度为65％‑80％的乙醇水溶液；试剂E：灭菌双蒸水；试剂F：90‑110mg核酸提取磁珠重悬在1ml的双蒸水中；试剂G：锦鲤疱疹病毒阳性质粒；装有试剂H的检测管：本发明的试剂盒操作过程简便，在1.5‑2个小时之内就可以完成锦鲤疱疹病毒的检测，并且不需要任何高端的仪器设备，仅需要一个水浴锅或金属浴就可以完成。

Description

锦鲤疱疹病毒可视化快速检测试剂盒
技术领域
本发明涉及海洋水产养殖中病原的检测技术，具体涉及锦鲤疱疹病毒(Koiherpersvirus,KHV)的检测试剂盒。
背景技术
锦鲤疱疹病毒(Koi herpersvirus,KHV)，又称鲤疱疹病毒Ⅲ型(CyHV-Ⅲ)，是锦鲤疱疹病毒病的主要病原，传染性强，死亡率高。该病毒于1998年在以色列首次发现，随后在美国、印尼、欧洲大陆和日本等国家大面积暴发，我国广东、辽宁、吉林、华北等地也都有发生。KHV是一种双链DNA病毒，其直径约为170-230nm，含有31个病毒多肽，具有核心、衣壳和囊膜结构，核衣壳为直径100-110nm的对称二十面体。KHV主要感染锦鲤、鲤及其普通变种，潜伏感染KHV的鱼体并不表现出临床症状，水温适宜时可暴发疾病并导致死亡。该病具有高度传染性和极强致死率，不仅可以水平传播，也可以垂直传播。世界动物卫生组织(OfficeInternational Des Epizooties，OIE)将其列为必须申报的疾病，我国将其列为二类疾病。目前还没有有效的治疗手段，及早发现并采取必要措施阻止病毒传播是公认最有效的方法。因此建立灵敏、准确、快速、便捷的检测技术是减少锦鲤疱疹病暴发的重要途径。
目前，诊断KHV的方法主要有：细胞培养法、透射电镜观察、PCR、实时荧光定量PCR、抗体血清检测以及液相芯片技术等。OIE手册推荐的PCR方法包括DNA胸苷激酶(Thymidinekinase,TK)基因和DNA聚合酶(Sph)基因的检测，这些方法多数需要昂贵精密的设备仪器，并且操作复杂，耗时长，需要专业技术人员操作，并不能满足现场快速诊断的要求。因此，目前迫切需要一种操作简单、结果准确可靠、结果判断直观、成本低廉的现场快速检测方法，为疾病的防控提供技术保障。
环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种新的核酸扩增技术，在60-65℃的恒温条件下，经过30-50分钟就可以完成核酸扩增反应。LAMP反应中可形成明显的白色焦磷酸沉淀，可通过对浊度的观察或加入荧光染料，通过颜色的变化来判断反应结果。该技术具有高特异性、高效性、快速、简便等特点，广泛应用于各种病原体的检测。目前，该项技术已经应用到KHV的检测，但由于核酸提取过程的繁琐复杂操作以及采用SYB-Green等染料可能会产生的假阳性等问题，阻碍了LAMP检测技术在养殖过程中的推广应用。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种锦鲤疱疹病毒可视化快速检测试剂盒。
本发明的技术方案概述如下：
一种锦鲤疱疹病毒可视化快速检测试剂盒，包括：
试剂A：组织裂解液Ⅰ；
试剂B：组织裂解液Ⅱ；
试剂C：异丙醇；
试剂D：体积百分比浓度为65％-80％的乙醇水溶液；
试剂E：灭菌双蒸水；
试剂F：90-110mg核酸提取磁珠重悬在1ml的双蒸水中；
试剂G：锦鲤疱疹病毒阳性质粒；
装有试剂H的检测管：在检测管中按比例装有10×Buffer 2.5μl，40mM的脱氧核糖核苷酸3.5μl，100mM的MgSO4 3μl，5M的甜菜碱1μl，100μM的用SEQ ID NO.1所示的引物KHV-FIP 0.4μl，100μM的用SEQ ID NO.2所示的引物KHV-BIP 0.4μl，100μM的用SEQ ID NO.3所示的引物KHV-LF 0.2μl，100μM的用SEQ ID NO.4所示的引物KHV-LB 0.2μl，100μM的用SEQID NO.5所示的引物KHV-F3 0.05μl，100μM的用SEQ ID NO.6所示的引物KHV-B3 0.05μl，8U/μl的Bst DNA聚合酶1μl，钙黄绿素染料1μl，灭菌双蒸水9.7μl混合的试剂H；研磨棒；
一次性吸管；
牙签；
1.5ml样品管；
磁力架。
优选地，锦鲤疱疹病毒阳性质粒是用下述方法制成：PCR扩增锦鲤疱疹病毒的一段保守区序列SEQ ID NO.7，琼脂糖凝胶电泳后割胶纯化，连接到pMD-18T载体上并转化到TOP10细胞中，测序鉴定阳性克隆子，把测序正确的阳性克隆子在LB培养基中培养，用质粒提取试剂盒提取质粒即为锦鲤疱疹病毒阳性质粒。
本发明的优点：
我们优选了锦鲤疱疹病毒的SPH基因保守序列区设计了6条特异性引物，相比较4条特异性引物不仅提高了检测的特异性和灵敏度，而且极大缩短了反应时间；采用磁珠提取核酸的方法，可以充分地将待测样品中的核酸提取出来，避免了使用大型的仪器设备，精简了繁琐复杂的操作流程，同时也极大缩短了核酸提取的时间；使用钙黄绿素染料可以严格遵守LAMP反应的不开盖原则，避免了SYB-Green等其它显色原理类似的染料必须在扩增反应结束后开盖再加入的情况，极大降低了假阳性率；该试剂盒的整个操作过程十分简便，在1.5-2个小时之内就可以完成锦鲤疱疹病毒的检测，并且不需要任何高端的仪器设备，仅需要一个水浴锅或金属浴就可以完成，适合在实际生产的过程中推广使用。
附图说明：
图1试剂盒检测结果的颜色判定，其中1号管为空白对照反应结果，2号管为阳性对照反应结果，3号管为实施例4检测结果。
具体实施方式
组织裂解液Ⅰ和组织裂解液Ⅱ购自天根生物试剂公司；
核酸提取磁珠购自厦门鑫海东方生物科技有限公司；
Bst DNA聚合酶(含10×Buffer)，40mM的脱氧核糖核苷酸，100mM的MgSO4购自NewEngland Biolabs；
5M的甜菜碱购自Sigma；
钙黄绿素染料购自荣研生物科技有限公司；
pMD-18T载体，TOP10细胞购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
锦鲤疱疹病毒阳性质粒是用下述方法制成：PCR扩增锦鲤疱疹病毒的一段保守区序列SEQ ID NO.7，琼脂糖凝胶电泳后割胶纯化，连接到市售pMD-18T载体上并转化到市售TOP10细胞中，测序鉴定阳性克隆子，把测序正确的阳性克隆子在LB培养基中培养，用质粒提取试剂盒提取质粒即为锦鲤疱疹病毒阳性质粒。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
一种锦鲤疱疹病毒可视化快速检测试剂盒，包括：
试剂A：组织裂解液Ⅰ；
试剂B：组织裂解液Ⅱ；
试剂C：异丙醇；
试剂D：体积百分比浓度为70％的乙醇水溶液；
试剂E：灭菌双蒸水；
试剂F：100mg核酸提取磁珠重悬在1ml的双蒸水中；
试剂G：锦鲤疱疹病毒阳性质粒；
装有试剂H的检测管：在检测管中装有10×Buffer 2.5μl，40mM的脱氧核糖核苷酸3.5μl，100mM的MgSO4 3μl，5M的甜菜碱1μl，100μM的用SEQ ID NO.1所示的引物KHV-FIP0.4μl，100μM的用SEQ ID NO.2所示的引物KHV-BIP 0.4μl，100μM的用SEQ ID NO.3所示的引物KHV-LF 0.2μl，100μM的用SEQ ID NO.4所示的引物KHV-LB 0.2μl，100μM的用SEQ IDNO.5所示的引物KHV-F3 0.05μl，100μM的用SEQ ID NO.6所示的引物KHV-B3 0.05μl，8U/μl的Bst DNA聚合酶1μl，钙黄绿素染料1μl，灭菌双蒸水9.7μl混合的试剂H；
研磨棒，一次性吸管，牙签，1.5ml样品管，磁力架。
实施例2
一种锦鲤疱疹病毒可视化快速检测试剂盒，包括：
用体积百分比浓度为65％的乙醇水溶液替换实施例1试剂D的体积百分比浓度为70％的乙醇水溶液；
用90mg核酸提取磁珠替换实施例1试剂F中的100mg核酸提取磁珠；其它同实施例1。
实施例3
一种锦鲤疱疹病毒可视化快速检测试剂盒，包括：
用体积百分比浓度为80％的乙醇水溶液替换实施例1试剂D的体积百分比浓度为70％的乙醇水溶液；
用110mg核酸提取磁珠替换实施例1试剂F中的100mg核酸提取磁珠；其它同实施例1。
实施例4
使用实施例1的一种锦鲤疱疹病毒可视化快速检测试剂盒对锦鲤疱疹病毒快速检测，包括如下步骤：
步骤一：核酸的提取：
(1)取一个离心管，将试剂F颠倒混匀后用一次性吸管吸取试剂F向离心管管底滴入1滴，备用；
(2)取锦鲤的肾脏组织10mg，(不超过10mg)置于一个新的离心管中；
(3)向放有组织的离心管中滴加4滴试剂A，用研磨棒快速将样品充分研磨；
(4)再向匀浆液中滴加4滴试剂B，充分颠倒混匀后，10000rpm/min，离心3min，用吸管吸取上清液(注意：不要吸取管底部的组织碎片)至步骤(1)中已经准备好的离心管，用吸管反复吹打3次；
(5)滴入4滴试剂C，轻轻颠倒混匀后，放到磁力架上。5min，用吸管将上清液吸出并弃掉；
(6)向管中滴入8滴试剂D，充分颠倒混匀后，放回磁力架上，用吸管将上清液吸出并弃掉；
(7)重复步骤(6)1次；
(8)将离心管盖打开，55℃放置4分钟后取出；
(9)滴入1滴试剂E，充分颠倒混匀后，放回磁力架上；
步骤二：核酸的扩增反应：
(10)用三个牙签分别蘸取试剂G、试剂E以及步骤一中(9)获得的上清液，分别至装有试剂H的检测管内，置于65℃保温45分钟，80℃保温4分钟后取出，立即用肉眼观察反应液的颜色。
含有试剂G的检测管为阳性对照显示为荧光绿色，含有试剂E的检测管为空白对照显示为橙黄色，样品的反应液颜色与阳性对照和空白对照比较，样品结果显示为荧光绿色，阳性，见图1。耗时约1.5个小时。
实施例5
使用实施例2的一种锦鲤疱疹病毒可视化快速检测试剂盒对锦鲤疱疹病毒可视化快速检测，其中步骤一(2)取不同于实施例4的另一条锦鲤的肾脏组织10mg，置于一个新的离心管中；
其它步骤同实施例4；
检测结果显示为橙黄色，阴性。耗时约1.5个小时。
实施例6
使用实施例3的一种锦鲤疱疹病毒可视化快速检测试剂盒对锦鲤疱疹病毒可视化快速检测，其中步骤一(2)取同实施例4锦鲤的肾脏组织9mg，置于一个新的离心管中；
其它步骤同实施例4；
检测结果显示为荧光绿色，阳性。耗时2小时。
本申请的技术方案得到天津市科技支撑计划项目(14ZCZDNC00007)，天津市水产产业技术体系创新团队(ITTFRS2017007)，国家自然科学基金面上项目(31472299)的资助。
本申请的各人工序列均为自行设计后由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
检测试剂盒所述引物的核酸序列为：
SEQ ID NO.1(人工序列)
KHV-FIP:cacaccaccccggagatgtcctcatgaacgcgacgctg；
SEQ ID NO.2(人工序列)
KHV-BIP:gccccatctgcatcgagctgagatgtggtgtccgttcct；
SEQ ID NO.3(人工序列)
KHV-LF:atgctggtgcgccactg；
SEQ ID NO.4(人工序列)
KHV-LB:cgctgctgtttgcctgc；
SEQ ID NO.5(人工序列)
KHV-F3:atcagggagacgccgatc；
SEQ ID NO.6(人工序列)
KHV-B3:tgttcgagcactccttgc
锦鲤疱疹病毒SPH基因序列(SEQ ID NO.7，锦鲤疱疹病毒的拉丁文属名和种名，拉丁学名：Kio herpesvirus)
cggaggacctgataaccatcagggagacgccgatccacgacgctctcatgaacgcgacgctgtaccagtggcgcaccagcatgcacggcgacatctccggggtggtgtgctgccccatctgcatcgagctgaagccgctgctgtttgcctgcaggaacggacaccacatctgcaaggagtgctcgaacaagctgcccgctcagagggacaatctcagcaacacctaccacagcacgtgcccgcagtgcagggacccgagcatcgtggggttccagaccatggacctcgcatacgccgtcgaggaccgctacaagagcctcttcaagctgacgccgcaacagtcgcagtcgttcaagaagcacatactgcggtgagacgacggcgaggacccgcagcgcacgggaaacctccgcaacctcccaacattgatgcgaccattgtaacatgtgtcttaataaaaacgcaaacctcttaaccccgtgcctttttgtgatgattaaatatctagcaggatgataccctactacgagctcgagacgatggtggcggcgaggtaccagcagctcttgggcgagctgggcgaggaggtcgcacgactgcagctacc
序列表
<110> 天津市水生动物疫病预防控制中心
<120> 锦鲤疱疹病毒可视化快速检测试剂盒
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cacaccaccc cggagatgtc ctcatgaacg cgacgctg 38
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gccccatctg catcgagctg agatgtggtg tccgttcct 39
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgctggtgc gccactg 17
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgctgctgtt tgcctgc 17
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atcagggaga cgccgatc 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgttcgagca ctccttgc 18
<210> 7
<211> 607
<212> DNA
<213> 锦鲤疱疹病毒(Kio herpesvirus)
<400> 7
cggaggacct gataaccatc agggagacgc cgatccacga cgctctcatg aacgcgacgc 60
tgtaccagtg gcgcaccagc atgcacggcg acatctccgg ggtggtgtgc tgccccatct 120
gcatcgagct gaagccgctg ctgtttgcct gcaggaacgg acaccacatc tgcaaggagt 180
gctcgaacaa gctgcccgct cagagggaca atctcagcaa cacctaccac agcacgtgcc 240
cgcagtgcag ggacccgagc atcgtggggt tccagaccat ggacctcgca tacgccgtcg 300
aggaccgcta caagagcctc ttcaagctga cgccgcaaca gtcgcagtcg ttcaagaagc 360
acatactgcg gtgagacgac ggcgaggacc cgcagcgcac gggaaacctc cgcaacctcc 420
caacattgat gcgaccattg taacatgtgt cttaataaaa acgcaaacct cttaaccccg 480
tgcctttttg tgatgattaa atatctagca ggatgatacc ctactacgag ctcgagacga 540
tggtggcggc gaggtaccag cagctcttgg gcgagctggg cgaggaggtc gcacgactgc 600
agctacc 607

Claims (2)

1.一种锦鲤疱疹病毒可视化快速检测试剂盒，其特征是包括：
试剂A：组织裂解液Ⅰ；
试剂B：组织裂解液Ⅱ；
试剂C：异丙醇；
试剂D：体积百分比浓度为65％-80％的乙醇水溶液；
试剂E：灭菌双蒸水；
试剂F：90-110mg核酸提取磁珠重悬在1ml的双蒸水中；
试剂G：锦鲤疱疹病毒阳性质粒；
装有试剂H的检测管：在检测管中按比例装有10×Buffer 2.5μl，40mM的脱氧核糖核苷酸3.5μl，100mM的MgSO4 3μl，5M的甜菜碱1μl，100μM的用SEQ ID NO.1所示的引物KHV-FIP0.4μl，100μM的用SEQ ID NO.2所示的引物KHV-BIP 0.4μl，100μM的用SEQ ID NO.3所示的引物KHV-LF 0.2μl，100μM的用SEQ ID NO.4所示的引物KHV-LB 0.2μl，100μM的用SEQ IDNO.5所示的引物KHV-F3 0.05μl，100μM的用SEQ ID NO.6所示的引物KHV-B3 0.05μl，8U/μl的Bst DNA聚合酶1μl，钙黄绿素染料1μl，灭菌双蒸水9.7μl混合的试剂H；研磨棒；
一次性吸管；
牙签；
1.5ml样品管；
磁力架。
2.根据权利要求1所述的一种锦鲤疱疹病毒可视快速检测试剂盒，其特征是所述锦鲤疱疹病毒阳性质粒是用下述方法制成：PCR扩增锦鲤疱疹病毒的一段保守区序列SEQ IDNO.7，琼脂糖凝胶电泳后割胶纯化，连接到pMD-18T载体上并转化到TOP10细胞中，测序鉴定阳性克隆子，把测序正确的阳性克隆子在LB培养基中培养，用质粒提取试剂盒提取质粒即为锦鲤疱疹病毒阳性质粒。
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