CN108410968A - 餐饮食品中食源性致病菌的快速鉴定方法 - Google Patents

餐饮食品中食源性致病菌的快速鉴定方法 Download PDF

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刘丽
吴静
胡孔兴
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张敏敏
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

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Abstract

本发明提了餐饮食品中食源性致病菌的快速鉴定方法，步骤为：1)DNA模板提取；2)引物筛选与反应体系优化：选取金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特菌的特异基因nuc，invA，prfA，利用分别设计引物对；3)PCR扩增：4)对菌株DNA进行PCR－DHPLC检测，只有与目标扩增吻合的菌株检测出扩增吸收峰，而其他非目标扩增菌均呈阴性。可一次性检测餐饮食品中三种食源性致病菌，节约时间，节约试剂耗材，简化操作程序避免过多的人为的误差，且灵敏度高。

Description

餐饮食品中食源性致病菌的快速鉴定方法
技术领域
本发明属于食品检测领域，具体涉及餐饮食品中食源性致病菌的快速鉴定方法。
背景技术
近年来我国食品安全频频出现问题，食品安全问题已经成为生活中不可不谈的话题。我国疾病预防控制中心相关资料表明，我国近年来由食源性致病菌引起的食品安全事件最为严重。中国最新一项食源性疾病主动监测显示，我国平均6.5人中就有1人次罹患食源性疾病。轻者多以急性胃肠炎症状出现，如呕吐、恶心、腹痛、腹泻、发烧等，经过治疗可以恢复健康；但重者可出现呼吸、循环、神经等系统症状，抢救及时可转危为安；如贻误时机还可危及生命，有的急性中毒，虽经千方百计治疗，但仍给中毒者留下后遗症。致病微生物引起的食品安全问题在我国屡见不鲜，一旦发生，对公众的健康危害是明确而广泛的。
饮食模式的改变，例如对生鲜食品和未彻底加热食品的偏爱、从食品的加工至消费间隔时间的延长、不在家中进餐时尚的流行等均是微生物性食源性疾病发病率上升的原因。在这样的社会背景下，我国食源性致病菌检测链条的发展有着巨大的空间。快速而准确检测出被称为“头号杀手”的食品致病菌，是确保食品安全的首要任务。
传统的食品微生物检测通常采用琼脂平板培养法,这种方法主要依靠培基进行培养、分离及生化鉴定,操作过程繁杂且费时费力,一般需几天才能完成。目前，国内外的微生物检测市场已经较成熟，政府部门到大中小食品企业，都有较大的需求。目前一些食品微生物快速检测方法主要是通过综合应用微生物学、化学、生物化学、生物物理学、免疫学以及血清学试验技术对微生物进行检测。食源性致病菌快速检测方法主要有显色培养基法、电阻抗法、微热量法、免疫学方法及分子生物学检测方法等。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供餐饮食品中食源性致病菌的快速鉴定方法。
本发明的技术方案如下：
餐饮食品中食源性致病菌的快速鉴定方法，包括以下步骤：
1)DNA模板提取：
取餐饮样品，加入到增菌培养基中充分混匀，培养，得到样品菌悬液；然后，取标准菌株菌悬液和样品菌悬液，加入LB肉汤中，震荡培养，然后按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明，提取模板DNA；
2)引物筛选与反应体系优化：
选取金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特菌的特异基因nuc，invA，prfA，分别设计引物对；
3)PCR扩增条件：
多重PCR反应体系模板DNA：三种致病菌各2μL；nuc上下游引物10μmol/L 1.25μL，invA上下游引物3μmol/L 1.25μL，prfA上下游引物10μmol/L 1.25μL；MultiplexPCRMix 2:25μL；MultiplexPCRMix 1:0.12μL；体系终体积50μL。
PCR反应条件：94℃预变性10min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸60s，进行30个循环；72℃延伸10min，4℃保存反应产物。
4)对菌株DNA进行PCR－DHPLC检测，只有与目标扩增吻合的菌株检测出扩增吸收峰，而其他非目标扩增菌均呈阴性。
进一步的，步骤1)具体为：
取餐饮样品25g，加入到225mL增菌培养基中充分混匀，培养18h，得到样品菌悬液；取标准菌株菌悬液和样品菌悬液各50μL，加入3mL LB肉汤中，在37℃条件下150r/min振荡培养8h，然后按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明，提取模板DNA。
步骤1)所述增菌培养基选自缓冲蛋白胨水BPW、7.5％氯化钠肉汤或单增李斯特菌李增菌肉汤LB1。
本发明使用的标准菌株是三种食源性致病菌:金黄色葡萄球菌，编号ATCC12600；沙门氏菌，编号ATCC14028；单增李斯特菌，编号CICC21633。
步骤1)所述准菌株菌悬液制备方法为：金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和单增李斯特菌3种标准菌株，分别取1-2株溶于3mL0.45％的Nacl溶液中，即得。
步骤2)中设计引物对后，筛选适合多重PCR的组合，对每对引物在同等条件下反应，调整引物量以及引物浓度比值，选出最佳的引物组合；进行扩增试剂体系和扩增条件优化，得出最佳反应条件。
进一步的，步骤2)中nuc特异性基因上游引物：nuc-F，序列为GGGCAATACGCAAAGAGGTT；
下游引物：nuc-R，序列为GCACTTGCTTCAGGGCCATA；
invA特异性基因上游引物：invA-F，序列为GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA；
下游引物：invA-R，序列为TCATCGCACCGTCAAAGGAACC；
prfA特异性基因上游引物：prfA-F，序列为：GAATGTAAACTTCGGCGCGAATCAG；
下游引物：prfA-R，序列为：GCCGTCGATGATTTGAACTTCATC。
步骤4中DHPLC分析条件为：
色谱柱:PS－DVB&C18DNASep色谱柱(4.6mm×50mm，粒度3μm)；柱温:50℃；流动相条件:0min，55％缓冲溶液A，45％缓冲溶液B；0.5min，50.2％缓冲溶液A，49.8％缓冲溶液B；3.5min，41.8％缓冲溶液A，58.2％缓冲溶液B；6.5min，38.2％缓冲溶液A，61.8％缓冲溶液B；10min，36.3％缓冲溶液A，63.7％缓冲溶液B；13min，35％缓冲溶液A，65％缓冲溶液B；流速:0.9mL/min；洗脱的DNA在260nm进行紫外吸收检测。上样量:PCR产物10μL。
HPLC缓冲液:缓冲溶液A为50mLTEAA，250μL乙腈，去离子水定容至1L；缓冲溶液B为50mLTEAA，250mL乙腈，去离子水定容至1L。
本发明提供的餐饮食品中食源性致病菌的快速鉴定方法，可一次性检测餐饮食品中三种食源性致病菌，节约时间，节约试剂耗材，简化操作程序避免过多的人为的误差，且灵敏度高。
附图说明
图1为3种致病菌单一PCR和多重PCR扩增产物DHPLC分离结果；
a:invA；b:nuc；c:prfA；f:invA、nuc、prfA；m:100bp DNA ladder marker。
具体实施方式
实施例1
餐饮食品中食源性致病菌的快速鉴定方法，包括以下步骤：
1)DNA模板提取：
取餐饮样品25g，加入到225mL增菌培养基中充分混匀，培养18h。取标准菌株菌悬液和样品菌悬液各50μL，加入3mLLB肉汤中37℃、150r/min振荡培养8h，然后按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明，提取模板DNA。
2)引物筛选与反应体系优化：
选取金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特菌的特异基因nuc，invA，prfA，利用Primerpremier5.0及Oligo6.0软件设计3对引物，如下表1。筛选适合多重PCR的组合，对每对引物在同等条件下反应，调整引物量以及引物浓度比值，选出最佳的引物组合。进行扩增试剂体系和扩增条件优化，得出最佳反应条件。
使用三种食源性致病菌:金黄色葡萄球菌，编号ATCC12600；沙门氏菌，编号ATCC14028；单增李斯特菌，编号CICC21633。
表1
3)PCR扩增条件：
多重PCR反应体系模板DNA：三种致病菌各2μL；上下游引物nuc(10μmol/L)1.25μL，invA(3μmol/L)1.25μL，prfA(10μmol/L)1.25μL；MultiplexPCRMix2:25μL；MultiplexPCRMix1:0.12μL；体系终体积50μL。
PCR反应条件94℃预变性10min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸60s，进行30个循环；72℃延伸10min，4℃保存反应产物。
4)DHPLC分析条件：
色谱柱:PS－DVB&C18DNASep色谱柱(4.6mm×50mm，粒度3μm)；柱温:50℃；流动相条件:0min，55％缓冲溶液A，45％缓冲溶液B；0.5min，50.2％缓冲溶液A，49.8％缓冲溶液B；3.5min，41.8％缓冲溶液A，58.2％缓冲溶液B；6.5min，38.2％缓冲溶液A，61.8％缓冲溶液B；10min，36.3％缓冲溶液A，63.7％缓冲溶液B；13min，35％缓冲溶液A，65％缓冲溶液B；流速:0.9mL/min；洗脱的DNA在260nm进行紫外吸收检测。上样量:PCR产物10μL。
HPLC缓冲液:缓冲溶液A为50mLTEAA，250μL乙腈，去离子水定容至1L；缓冲溶液B为50mLTEAA，250mL乙腈，去离子水定容至1L。结果如图1。
对菌株DNA进行PCR－DHPLC检测，只有与目标扩增吻合的菌株检测出扩增吸收峰，而其他非目标扩增菌均呈阴性。
SEQUENCE LISTING
<110> 芜湖市食品药品检验中心（市药品不良反应监测中心）
<120> 餐饮食品中食源性致病菌的快速鉴定方法
<130> 1
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> nuc-F
<400> 1
gggcaatacg caaagaggtt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> nuc-R
<400> 2
gcacttgctt cagggccata 20
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> inva-f
<400> 3
gtgaaattat cgccacgttc gggcaa 26
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> invA-R
<400> 4
tcatcgcacc gtcaaaggaa cc 22
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> prfA-F
<400> 5
gaatgtaaac ttcggcgcga atcag 25
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> prfA-R
<400> 6
gccgtcgatg atttgaactt catc 24

Claims (7)

1.餐饮食品中食源性致病菌的快速鉴定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)DNA模板提取：
取餐饮样品，加入到增菌培养基中充分混匀，培养，得到样品菌悬液；然后，取标准菌株菌悬液和样品菌悬液，加入LB肉汤中，震荡培养，然后按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明，提取模板DNA；
2)引物筛选与反应体系优化：
选取金黄色葡萄球菌、沙门菌、单增李斯特菌的特异基因nuc，invA，prfA，分别设计引物对；
3)PCR扩增条件：
多重PCR反应体系模板DNA：三种致病菌各2μL；nuc上下游引物10μmol/L 1.25μL，invA上下游引物3μmol/L 1.25μL，prfA上下游引物10μmol/L 1.25μL；MultiplexPCRMix 2:25μL；MultiplexPCRMix 1:0.12μL；体系终体积50μL；
PCR反应条件：94℃预变性10min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸60s，进行30个循环；72℃延伸10min，4℃保存反应产物；
4)对菌株DNA进行PCR－DHPLC检测，只有与目标扩增吻合的菌株检测出扩增吸收峰，而其他非目标扩增菌均呈阴性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)具体为：
取餐饮样品25g，加入到225mL增菌培养基中充分混匀，培养18h，得到样品菌悬液；取标准菌株菌悬液和样品菌悬液各50μL，加入3mL LB肉汤中，在37℃条件下150r/min振荡培养8h，然后按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明，提取模板DNA。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中设计引物对后，筛选适合多重PCR的组合，对每对引物在同等条件下反应，调整引物量以及引物浓度比值，选出最佳的引物组合；进行扩增试剂体系和扩增条件优化，得出最佳反应条件。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中nuc特异性基因上游引物：nuc-F，序列为GGGCAATACGCAAAGAGGTT；
下游引物：nuc-R，序列为GCACTTGCTTCAGGGCCATA。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中invA特异性基因
上游引物：invA-F，序列为GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA；
下游引物：invA-R，序列为TCATCGCACCGTCAAAGGAACC。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中prfA特异性基因
上游引物：prfA-F，序列为：GAATGTAAACTTCGGCGCGAATCAG；
下游引物：prfA-R，序列为：GCCGTCGATGATTTGAACTTCATC。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4中DHPLC分析条件为：
色谱柱:PS－DVB&C18DNASep色谱柱(4.6mm×50mm，粒度3μm)；柱温:50℃；流动相条件:0min，55％缓冲溶液A，45％缓冲溶液B；0.5min，50.2％缓冲溶液A，49.8％缓冲溶液B；3.5min，41.8％缓冲溶液A，58.2％缓冲溶液B；6.5min，38.2％缓冲溶液A，61.8％缓冲溶液B；10min，36.3％缓冲溶液A，63.7％缓冲溶液B；13min，35％缓冲溶液A，65％缓冲溶液B；流速:0.9mL/min；洗脱的DNA在260nm进行紫外吸收检测；上样量:PCR产物10μL。
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