CN111621581A - 一种检测李斯特菌用标准化质粒冻干粉 - Google Patents
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Abstract
本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一种检测李斯特菌用标准化质粒冻干粉。该冻干粉以prfA、hlyA毒力基因作为检测用目标基因，具体制备步骤包括：提取全基因组DNA、设计引物并进行PCR扩增、与pLB质粒连接、转化、筛选、鉴定并提取质粒、制备冻干粉成品等步骤。本申请中，发明人以现有若干菌株作为标准菌株，以若干毒力基因作为目标基因，利用基因工程技术手段，以pLB质粒作为载体，构建了含有目标毒力基因的标准化质粒样品。利用该标准品，可为相关食源性单增李斯特菌的快速检测和鉴定奠定良好技术基础，无论对于单增李斯特菌标准化检测体系建立、抑或对于确保食品安全，都具有十分重要的技术价值和应用意义。
Description
技术领域
本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一种检测李斯特菌用标准化质粒冻干粉。
背景技术
随着人们生活水平的不断提高，人们对于食品安全问题日益重视。在食品安全问题中，食源性微生物所导致的食品质量问题一直居于首位，而由食源性微生物所引起的食源性疾病已经成为最重要的世界性卫生疾病问题之一。受限于技术实际和其他客观条件，现阶段我国检测食源性微生物时，即时性检测时，由于定性检验DNA参考物质体系尚不不完整，因此大大限制了检验检测的技术水平。
单核细胞增生李斯特菌（简称单增李斯特菌）( Listeria monocytogenes，LM)是一种革兰氏染色阳性菌，因其繁殖和生存能力强大，在自然界中存在广泛，因此，也是人类生活中一种常见的食源性致病菌。其可通过李斯特菌溶血素、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C和卵磷脂酶的裂解作用逃离吞噬小体，并在细胞质中增殖。感染时可引发肠胃炎、脑膜炎、免疫缺陷、新生儿及孕妇败血症等疾病，严重者甚至可导致死亡。
现有技术中，对于单增李斯特氏菌主要检测方法有：传统的培养方法，这种方法需要结合相关的显色培养基和基于生化反应的VITEK系统进行检测，具有操作复杂、所需时间长的缺陷，不能有效满足预防和控制食源性致病性疾病的暴发的需要。ELISA试剂盒虽然具有快速、简单且灵敏的优点，但价格昂贵，因此应用范围较为有限。免疫学检测方法虽然具有检测速度较快（通常在数小时内完成）、检测较为方便优点，特别是免疫层析试纸条携带方便，适合现场检测，但免疫检测方法对抗体具有较高的特异性，易受到杂菌的干扰，灵敏度不如分子检测法好，因此导致该方法的检测结果准确率存在较多问题。PCR检测方法也是现有检测技术中较为常用的检测方法，但如前所述，由于缺乏一定的标准化样品，因此使得PCR检测方法在实际应用中较少。也因此，如能开发一种针对单增李斯特氏菌PCR检测用标准品，对于相关致病菌的即时、快速检测具有十分重要的技术意义。
发明内容
本申请目的在于提供一种检测李斯特菌用标准化质粒冻干粉，以此作为标准品应用时，可为李斯特菌的快速、即时检测体系的建立和食品安全奠定一定技术基础。
本申请所采取的技术方案详述如下。
一种检测李斯特菌用标准化质粒冻干粉，以单增李斯特菌1862、单增李斯特氏菌ATCC19115（保藏于美国菌种保藏中心）、单增李斯特氏菌 CICC 21633（CICC，中国工业微生物菌种保藏管理中心）、英诺克李斯特ATCC33090、英诺克李斯特 FC11260为标准菌株，以prfA（转录激活调节蛋白基因）、hlyA（溶血素）毒力基因作为检测用目标基因，以pLB质粒作为载体质粒，通过基因工程技术手段，转化制备成含有目标毒力基因的标准品，从而为致病菌标准化检测体系奠定基础，具体步骤如下：
（一）提取全基因组DNA、设计引物并进行PCR扩增
提取总DNA时，将各菌体的培养菌液离心处理后，对各菌体按照现有技术（例如采用TIANamp Bacteria DNA Kit细菌基因组DNA提取试剂盒（离心柱型，参考其说明书操作即可）常规提取即可；
针对不同毒力基因，设计PCR扩增用引物序列如下：
prfA –F1：5’- GATACAGAAACATCGGTTGGC-3’，
prfA –R1：5’- GTGTAATCTTGATGCCATCAG-3’；
扩增产物274bp；
hlyA-F：5’- CCTAAGACGCCAATCGAA-3’，
hlyA-R：5’- AAGCGCTTGCAACTGCTC-3’；
扩增产物702bp；
prfA-F2：5’- GAATGTAAACTTCGGCGCGAATCAG-3’，
prfA-R2：5’- GCCGTCGATGATTTGAACTTCATC-3’；
扩增产物388bp；
以所提取的全基因组DNA为模板，利用上述引物进行序列扩增，PCR扩增时，25µl体系设计如下：
DNA模板，1 μL；
上游引物， 0.5 μL(25 mmol/L)；
下游引物， 0.5 μ(25 mmol/L)L；
2×PCR mix，12.5 μL；
超纯水，10.5 μL；
具体扩增程序参考如下：
对PCR扩增产物进行回收、纯化备用；
（二）连接、转化
以pLB质粒作为连接载体，将步骤（一）中的扩增产物（即prfA基因）分别与pLB质粒进行连接，并进行转化；
（三）筛选、鉴定并提取质粒
对步骤（二）中的转化产物进一步提取质粒进行鉴定，对鉴定正确的菌株进行传代培养，并最终提取质粒备用；
（四）制备冻干粉成品
配合赋形剂、保护剂，将步骤（三）所制备质粒进一步制备成冻干粉，即为评价李斯特菌致病性时的标准化质粒标准品（即作为对照品应用）。
所述李斯特菌用标准化质粒冻干粉在食品检测中应用，具体用于检测银耳，作为阳性对照，用于判定银耳是否受到致病性单增李斯特菌污染。
利用所述李斯特菌用标准化质粒冻干粉的李斯特菌检测方法，包括如下步骤：
（一）处理样品
对检测样品进行处理，提取待检测样品中微生物DNA；
（二）设计引物并进行PCR扩增
具体引物序列同前述prfA1、hlyA、prfA2引物对，即具体为：
prfA –F1：5’- GATACAGAAACATCGGTTGGC-3’，
prfA –R1：5’- GTGTAATCTTGATGCCATCAG-3’；
扩增产物274bp；
hlyA-F：5’- CCTAAGACGCCAATCGAA-3’，
hlyA-R：5’- AAGCGCTTGCAACTGCTC-3’；
扩增产物702bp；
prfA-F2：5’- GAATGTAAACTTCGGCGCGAATCAG-3’，
prfA-R2：5’- GCCGTCGATGATTTGAACTTCATC-3’；
以步骤（一）中所提取微生物DNA为模板，分别利用上述引物对中一对、两对或者三对进行PCR扩增，以此作为检测样；
同时，利用李斯特菌用标准化质粒冻干粉作为模板，分别利用上述引物对中一对、两对或者三对进行PCR扩增，以此作为标准样；
（三）对比和鉴定
对步骤（二）中扩增产物进行电泳分析和对比，如果检测样具有与标准样相同带型，则表明待检样品受到了李斯特菌污染。
基因组分析表明，单增李斯特菌的毒力基因有hlyA、prfA、iap、inlA-inlH、plcB、Ami、ActA、Vir R、sigB、mpl、Prs、ldh、dal等。本申请中，发明人以现有特定的单增李斯特菌1862、单增李斯特氏菌ATCC19115等作为标准菌株，以若干毒力基因作为目标基因，利用基因工程技术手段，以pLB质粒作为载体，构建了含有目标毒力基因的标准化质粒样品。利用该标准品，可为相关食源性单增李斯特菌的快速检测和鉴定奠定良好技术基础，无论对于单增李斯特菌标准化检测体系建立、抑或对于确保食品安全，都具有十分重要的技术价值和应用意义。
附图说明
图1为单增李斯特菌全基因组DNA凝胶；
图2为全基因组PCR扩增凝胶；
图3为对质粒冻干粉的毒力基因检测；其中，M:Marker 1-3：25℃条件下；4-6:4℃条件下；7-9：-20℃条件下；10：阴性对照；
图4为样品表面微生物DNA用hlyA引物扩增结果；图中1~30为不同产地样品标号对应结果；
图5为样品表面微生物DNA用prfA1引物扩增结果；图中1~30为不同产地样品标号对应结果；
图6为样品表面微生物DNA用prfA2引物扩增结果；图中1~30为不同产地样品标号对应结果；
图7为国标法检测污染批样品的结果，左图为PALCAM培养基结果，右图为TSB培养基培养结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。
生物材料：
相关引物序列合成和测序工作，由华大基因公司完成；
单增李斯特菌1862、单增李斯特氏菌ATCC19115（保藏于美国菌种保藏中心）、单增李斯特氏菌 CICC 21633（CICC，中国工业微生物菌种保藏管理中心）、英诺克李斯特ATCC33090、英诺克李斯特 FC11260，均为本领域研究中常用微生物菌株；
实验试剂：
细菌全基因组DNA提取试剂盒(DP302) 、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（离心柱型）（DP209）、pLB零背景快速克隆试剂盒（不含MCS）VT206、质粒小提试剂盒（DP103）、土壤基因组DNA提取试剂盒（DP336）、RNaseA、Goldview核酸染料、电泳用marker等，均为天根生化科技有限公司产品；
溶菌酶、Tris-HCl缓冲液等，北京索莱宝科技有限公司产品；
实验仪器：
核酸蛋白检测仪（NANODROP 2000C）、PCR仪（5020），Thermo Fisher Scientific公司产品；
凝胶成像系统，北京东胜创新生物科技有限公司产品。
实施例1
由于相关质粒构建是本申请技术方案基础，因此本实施例就相关重组质粒的构建过程简要介绍说明如下。
（一）细菌培养、并提取全基因组DNA
首先，将各菌种复苏后，分别接种到灭菌的含有0.6%酵母浸膏的TSB-YE（胰酪胨大豆肉汤培养基）液体培养基里，37℃、摇床内200rpm培养16个小时；
分别取培养菌悬液取1.5 mL，离心1分钟，弃上清，沉淀用生理盐水洗三次，参考细菌基因组DNA提取试剂盒说明书，提取基因组DNA备用。
对所提取的全基因DNA测定样品浓度、纯度及核酸完整性检测，同时进行1.5%琼脂凝胶核酸电泳分析，结果如图1所示。
可以看出，均只有一条清晰的特异性条带，表明所提取基因组DNA完整性较好，可以满足后续实验需要。
（二）PCR扩增
针对不同毒力基因，设计PCR扩增用引物序列如下：
prfA –F1：5’- GATACAGAAACATCGGTTGGC-3’，
prfA –R1：5’- GTGTAATCTTGATGCCATCAG-3’；
扩增产物274bp；
hlyA-F：5’- CCTAAGACGCCAATCGAA-3’，
hlyA-R：5’- AAGCGCTTGCAACTGCTC-3’；
扩增产物702bp；
prfA-F2：5’- GAATGTAAACTTCGGCGCGAATCAG-3’，
prfA-R2：5’- GCCGTCGATGATTTGAACTTCATC-3’；
扩增产物388bp；
以所提取的全基因组DNA为模板，利用上述引物进行序列扩增，PCR扩增时，25µl体系设计如下：
DNA模板，1 μL；
上游引物， 0.5 μL(25 mmol/L)；
下游引物， 0.5 μ(25 mmol/L)L；
2×PCR mix，12.5 μL；
超纯水，10.5 μL；
具体扩增程序参考如下：
对PCR扩增产物进行回收、纯化，并对PCR扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，成像结果如图2所示。进一步对扩增产物进行回收和测序分析，以判定扩增产物是否正确。
具体扩增的prfA基因的目的片段长度为（274bp），如SEQ ID NO.1所示，具体如下：
GATACAGAAACATCGGTTGGCTATTATAATTTAGAAGTCATTAGCGAACAGGCTACCGCATACGTTATCAAAATAAACGAACTAAAAGAACTACTGAGCAAGAATCTTACGCACTTTTTCTATGTTTTCCAAACCCTACAAAAACAAGTTTCATACAGCCTAGCCAAATTTAATGATTTTTCGATTAACGGGAAGCTCGGCTCTATTTGCGGTCAACTTTTAATCCTGACCTATGTGTATGGTAAAGAAACTCCTGATGGCATCAAGATTACAC。
（三）连接、转化
参考pLB零背景快速克隆试剂盒说明书，将步骤（二）所回收的PCR扩增产物（即，毒力基因）分别与pLB载体进行连接，并采用热激法转化DH5α感受态细胞，随后涂板（含有氨苄青霉素终浓度100μg/ml的LB平板），37℃倒置培养16h。
（四）筛选、鉴定并提取质粒
挑取阳性克隆子进行鉴定（利用前述引物对hlyA、 prfA1和prfA2进行PCR扩增鉴定），小提质粒进行鉴定，对于鉴定正确的进一步培养扩增（含有氨苄青霉素终浓度100μg/ml的LB液体培养基，150rpm、37℃摇床培养大约12-16小时）后，采用碱裂解法大量提取质粒备用。
（五）制备冻干粉
将步骤（四）中所提取质粒进一步委托北京六合华大基因科技有限公司制备成冻干粉标准品，标准品中质粒浓度为300 ng/g。
为确保冻干粉质量，进一步对不同保藏温度下质粒进行PCR检测验证（具体PCR反应参考前述即可），具体结果如图3所示。可以看出，保藏温度差异对于检测结果不具有实际影响，这进一步为其作为标准品应用奠定了基础。
实施例2
为检验实施例1所制备质粒标准品实际应用效果，以市场随机购买的银耳样品为例，发明人对其是否遭受李斯特菌污染进行了实际检测应用，具体实验过程简介如下。
（一）材料来源
检测所用银耳样品均随机购买于当地超市或商店，具体银耳样品批次及产地情况如下表所示：
（二）提取基因组并PCR扩增
对每批次样品，分别称取20g，加入 pH 7.0 无菌氯化钠蛋白胨缓冲液 200 mL，振荡30 min，超声处理10 min；
收集液体，12000 r/min离心5 min，取沉淀，利用土壤基因组DNA提取试剂盒提取微生物基因组 DNA。
以所提取微生物基因组DNA为模板，利用前述hlyA、prfA1、prfA2引物对进行PCR扩增。
作为对照，以实施例1所制备冻干粉替代上述微生物基因组DNA模板，同步进行PCR扩增。
对扩增产物分别进行1.5%琼脂糖凝胶检测。
作为对照，按照国标方法（GB4789.30—2016）检测银耳样本中的单增李斯特菌，具体操作参考如下：
取银耳样品（注意无菌操作，即避免新的感染）25 g加入到含有225 mL的LB1增菌液的锥形瓶中，30℃培养24 h，移取0.1 mL转种于10 mL的LB2增菌液内，30℃培养24 h；
取LB2二次增菌液划线接种于PALCAM 琼脂平板，36℃培养48h，挑取3个~5个典型或可疑菌落，分别接种在 TSA-YE平板上划线， 36℃培养24 h；最后挑取可疑菌落，用16SRNA和国标中毒力基因扩增PCR进行测序鉴定。
具体PCR鉴定结果及部分国标法鉴定结果如图4~图7所示。可以看出，就国标法而已，虽然可以培养出菌落，但最终测序结果表明，其并非致病性李斯特菌；而利用本申请标准化质粒，则可准确鉴定每一批次银耳样品是否受到了李斯特菌感染（三十批银耳样品中，检出一批样品被污染），加上该检测方法检测时间较短，因此具有较好应用效果。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南大学
<120> 一种检测李斯特菌用标准化质粒冻干粉
<130> none
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 274
<212> DNA
<213> Listeria monocytogenes
<400> 1
gatacagaaa catcggttgg ctattataat ttagaagtca ttagcgaaca ggctaccgca 60
tacgttatca aaataaacga actaaaagaa ctactgagca agaatcttac gcactttttc 120
tatgttttcc aaaccctaca aaaacaagtt tcatacagcc tagccaaatt taatgatttt 180
tcgattaacg ggaagctcgg ctctatttgc ggtcaacttt taatcctgac ctatgtgtat 240
ggtaaagaaa ctcctgatgg catcaagatt acac 274
Claims (6)
1.一种检测李斯特菌用标准化质粒冻干粉，其特征在于，该冻干粉以prfA、hlyA毒力基因作为检测用目标基因，采用如下步骤制备获得：
（一）提取全基因组DNA、设计引物并进行PCR扩增
提取李斯特菌菌体的总DNA时；
针对不同毒力基因，设计PCR扩增用引物序列如下：
prfA –F1：5’- GATACAGAAACATCGGTTGGC-3’，
prfA –R1：5’- GTGTAATCTTGATGCCATCAG-3’；
扩增产物274bp；
hlyA-F：5’- CCTAAGACGCCAATCGAA-3’，
hlyA-R：5’- AAGCGCTTGCAACTGCTC-3’；
扩增产物702bp；
prfA-F2：5’- GAATGTAAACTTCGGCGCGAATCAG-3’，
prfA-R2：5’- GCCGTCGATGATTTGAACTTCATC-3’；
扩增产物388bp；
以所提取的全基因组DNA为模板，利用上述引物进行序列扩增对PCR扩增产物进行回收、纯化备用；
（二）连接、转化
以pLB质粒作为连接载体，将步骤（一）中的扩增产物分别与pLB质粒进行连接，并进行转化；
（三）筛选、鉴定并提取质粒
对步骤（二）中的转化产物进一步提取质粒进行鉴定，对鉴定正确的菌株进行传代培养，并最终提取质粒备用；
（四）制备冻干粉成品
将步骤（三）所制备质粒进一步制备成冻干粉，即为评价李斯特菌致病性时的标准化质粒标准品。
2.如权利要求1所述检测李斯特菌用标准化质粒冻干粉，其特征在于，步骤（一）中，所述李斯特菌以单增李斯特菌1862、单增李斯特氏菌ATCC19115、单增李斯特氏菌 CICC21633、英诺克李斯特ATCC33090或英诺克李斯特 FC11260为标准菌株。
3.如权利要求1所述检测李斯特菌用标准化质粒冻干粉，其特征在于，步骤（一）中，PCR扩增时，25µl体系设计如下：
DNA模板，1 μL；
上游引物， 0.5 μL、25 mmol/L；
下游引物， 0.5 μ、25 mmol/LL；
2×PCR mix，12.5 μL；
超纯水，10.5 μL；
具体扩增程序参考如下：
4.权利要求1所述检测李斯特菌用标准化质粒冻干粉在食品检测中应用，其特征在于，作为阳性对照标准品进行应用。
5.如权利要求4所述检测李斯特菌用标准化质粒冻干粉在食品检测中应用，其特征在于，用于检测银耳。
6.利用权利要求1所述李斯特菌用标准化质粒冻干粉的李斯特菌检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
（一）处理样品
对检测样品进行处理，提取待检测样品中微生物DNA；
（二）设计引物并进行PCR扩增
具体引物序列为：
prfA –F1：5’- GATACAGAAACATCGGTTGGC-3’，
prfA –R1：5’- GTGTAATCTTGATGCCATCAG-3’；
扩增产物274bp；
hlyA-F：5’- CCTAAGACGCCAATCGAA-3’，
hlyA-R：5’- AAGCGCTTGCAACTGCTC-3’；
扩增产物702bp；
prfA-F2：5’- GAATGTAAACTTCGGCGCGAATCAG-3’，
prfA-R2：5’- GCCGTCGATGATTTGAACTTCATC-3’；
以步骤（一）中所提取微生物DNA为模板，分别利用上述引物对中一对、两对或者三对进行PCR扩增，以此作为检测样；
同时，利用李斯特菌用标准化质粒冻干粉作为模板，分别利用上述引物对中一对、两对或者三对进行PCR扩增，以此作为标准样；
（三）对比和鉴定
对步骤（二）中扩增产物进行电泳分析和对比，如果检测样具有与标准样相同带型，则表明待检样品受到了李斯特菌污染。
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|---|---|---|---|
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-
2020
- 2020-06-28 CN CN202010597468.9A patent/CN111621581A/zh active Pending
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