CN110106268A - 一种维氏气单胞菌的lamp检测引物组合物及试剂盒 - Google Patents

一种维氏气单胞菌的lamp检测引物组合物及试剂盒 Download PDF

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Abstract

一种维氏气单胞菌的LAMP检测引物组合物及试剂盒。引物组合物包括两条外引物AV‑F3引物和AV‑B3引物、两条内引物AV‑FIP引物和AV‑BIP引物。检测维氏气单胞菌的试剂盒包含A溶液、B溶液和C试液：A溶液中含有上述维氏气单胞菌的LAMP检测引物组合物、dNTPs、10×lamp buffer、Mg2+和BstDNA聚合酶；B溶液为维氏气单胞菌基因组DNA阳性对照液；C试液为无菌水。采用本发明的检测维氏气单胞菌的试剂盒对维氏气单胞菌进行检测，具有较高的准确度、灵敏度和特异性。

Description

一种维氏气单胞菌的LAMP检测引物组合物及试剂盒
技术领域
本发明属于水产病原菌及食源性致病菌检测技术领域，具体地，涉及一种维氏气单胞菌的LAMP检测引物组合物及试剂盒。
背景技术
维氏气单胞菌是引起水产动物疾病的重要病原菌及食源性致病菌，是人-鱼共患致病菌，可以引发人急性腹泻、脑膜炎、肠胃炎、菌血症等疾病。维氏气单胞菌具有气单胞菌属典型的毒力因子，如气溶素、肠毒素等，对水产动物有较高的致死率，给养殖业造成了巨大损失。维氏气单胞菌具有气单胞菌属典型的毒力因子气溶素、肠毒素等，目前，维氏气单胞菌的鉴定主要是靠生理生化方法和分子生物学方法。由于生理生化鉴定费时费力，相对依赖实验室条件，并且分类依据和判定标准更新滞后，结果可靠性不强，有报道称API20E细菌鉴定系统误把维氏气单胞菌鉴定为嗜水气单胞菌。分子生物学方法基于16SrRNA的分析技术也用于鉴定维氏气单胞菌，但由于气单胞菌属的16SrRNA有较高相似性，种与种的相似性多超过98％，仅利用于16SrRNA基因相似性往往难以准确检测维氏气单胞菌。
日本科学家Notomi等人发明了一种新的核酸扩增技术环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)，其基本原理是针对靶基因的6个区域，设计4条特异性引物(FIP,BIP,F3,B3)，在链置换BstDNA聚合酶的作用下于恒温60℃-65℃扩增60min左右，即可进行循环扩增，且效率可达109-1010个数量级。LAMP反应具有较高的专一性，只有四条引物在靶基因中的6个不同区域完全匹配才能进行扩增。这种技术具有的特点是特异性强、高效、快速、简便、灵敏度高。目前，在微生物检测方面，LAMP技术对沙门氏菌、副溶血弧菌、分歧杆菌、嗜水气单胞菌以及病毒方面的流感病毒、口蹄疫病毒检测等已有研究，但对于建立维氏气单胞菌LAMP检测方法的研究还处于相对匮乏的水平。
发明内容
本发明的目的是提供一种维氏气单胞菌的LAMP检测引物组合物及试剂盒，以解决上述技术问题中的至少一个。
根据本发明的一个方面，提供一种维氏气单胞菌的LAMP检测引物组合物：包括两条外引物AV-F3引物和AV-B3引物、两条内引物AV-FIP引物和AV-BIP引物；AV-F3引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2，AV-B3引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.3，AV-FIP引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.4，AV-BIP引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.5。
根据本发明的另一个方面，提供一种维氏气单胞菌的LAMP检测引物组合物在制备检测维氏气单胞菌的试剂盒中的应用。
根据本发明的另一个方面，提供一种检测维氏气单胞菌的试剂盒：包括A溶液，A溶液中含有上述维氏气单胞菌的LAMP检测引物组合物、dNTPs、10×lamp buffer、Mg2+和BstDNA聚合酶。
优选地，A溶液中的引物组合物满足如下浓度比例：AV-FIP引物：AV-BIP引物：AV-F3引物：AV-B3引物＝6:6:1:1。
优选地，在A溶液中，AV-FIP引物的浓度为1.2μmol/L，AV-BIP引物的浓度为1.2μmol/L，AV-F3引物的浓度为0.2μmol/L，AV-B3引物的浓度为0.2μmol/L。
优选地，在A溶液中，dNTPs的浓度为1.8mmol/L，Mg2+的浓度为3mmol/L，BstDNA聚合酶的浓度320U/mL，10×lamp buffer的浓度为1×。
优选地，还包括B溶液和C试液，B溶液为维氏气单胞菌基因组DNA样品液，C试液为无菌水。
优选地，按照A溶液：待测DNA样品液＝22:3的体积比，取A溶液与待测DNA样品液，混合，配制实验组反应液；按照A溶液：B溶液＝22:3的体积比，取A溶液与B溶液，混合，配制阳性对照组反应液；按照A溶液：C试液＝22:3的体积比，取A溶液与C试液，混合，配制阴性对照组反应液；分别使实验组反应液、阳性对照组反应液和阴性对照组反应液在61-65℃下进行LAMP扩增反应，反应时间为30-90分钟；分别对完成LAMP扩增反应后的实验组反应液、阳性对照组反应液和阴性对照组反应液进行灭活处理，定性检测。
优选地，检测维氏气单胞菌的试剂盒还包括D溶液，D溶液为SYBR Green I荧光染料；定性检测的具体步骤为：按照灭活后的实验组反应液：D溶液＝22:1的体积比，向灭活后的实验组反应液中加入D溶液；按照灭活后的阳性对照组反应液：D溶液＝22:1的体积比，向灭活后的阳性对照组反应液中加入D溶液；按照灭活后的阴性对照组反应液：D溶液＝22:1的体积比，向灭活后的阴性对照组反应液中加入D溶液。
优选地，LAMP扩增反应的反应条件为：反应温度为63℃，反应时间为70分钟。
本发明根据维氏气单胞菌基因所设计的扩增引物能有效、特异地检测维氏气单胞菌，此外，本发明对LAMP扩增的反应条件以及各种所学试剂用量的一系列优化，参照优化的实验参数制备检测维氏气单胞菌的试剂盒具有较高的灵敏度、特异性和准确性，采用该试剂盒对维氏气单胞菌进行检测，所达到灵敏度远高于PCR扩增反应。另一方面，本发明的检测维氏气单胞菌的试剂盒进样方便，不需经过细菌培养，样品用量少，仅需少量水产动物血液等样品即可进行检测，实现了微创取样，降低检测成本。
附图说明
图1为实施例1中以AV-F3、AV-B3为引物PCR扩增维氏气单胞菌气溶素的电泳分析图；图中的字母及数字含义如下：M，100bp marker；1，阴性对照(无菌水为模板)；2、3、4、5、6，维氏气单胞菌基因组DNA；
图2为实施例1中在不同温度下进行LAMP扩增反应实验结果的电泳分析图；图中的字母及数字含义如下：M，100bp marker；1，阴性对照；2，61℃；3，62℃；4，63℃；5，64℃；6，65℃；
图3为实施例1中在不同时间梯度设置的LAMP扩增反应实验结果的电泳分析图；图中的字母及数字含义如下：M，100bp ladderⅡ；1，阴性对照；2，30min；3，40min；4，50min；5，60min；6，70min；
图4为实施例1中对应不同MgCl2溶液加样量的LAMP扩增反应实验结果的电泳分析图；图中的字母及数字含义如下：M，100bp marker；1，2μL；2，3μL；3，4μL；4，5μL；5，6μL；
图5为实施例1中对应不同dNTPs投料量的LAMP扩增反应实验结果的电泳分析图；图中的字母及数字含义如下：M，100bp marker；1，1.5μL；2，2.5μL；3，3.5μL；4，4.5μL；5，5.5μL；
图6为实施例1中对应不同BstDNA聚合酶投料量的LAMP扩增反应实验结果的电泳分析图；图中的字母及数字含义如下：M，100bp marker；1，0.6μL；2，0.8μL；3，1.0μL；4，1.2ul；5，1.4μL；
图7为实施例1中对应不同内外引物的用量体积比的LAMP扩增反应实验结果的电泳分析图，图中的字母及数字含义如下：M，100bp marker；1，AV-FIP：AV-BIP：AV-F3：AV-B3＝1：1：1：1；2，AV-FIP：AV-BIP：AV-F3：AV-B3＝2：2：1：1；3，AV-FIP：AV-BIP：AV-F3：AV-B3＝4：4：1：1；4，AV-FIP：AV-BIP：AV-F3：AV-B3＝6：6：1：1；5，AV-FIP：AV-BIP：AV-F3：AV-B3＝8：8：1：1；
图8为实施例2中的维氏气单胞菌LAMP扩增反应灵敏度检测结果图，基因组DNA按10倍比的浓度梯度依次稀释，图中的字母及数字含义如下：M：100bp marker、1:100、2:101、3:102、4:103、5:104、6:105、7:106、8:107
图9为实施例2中灵敏度检测时以维氏气单胞菌稀释基因组DNA浓度为模板，B3、F3为引物，进行PCR扩增结果图；图中的字母及数字含义如下：M：100bp marker、1:100、2:101、3:102、4:103、5:104、6:105、7:106、8:107
图10为实施例2中12种不同菌株的LAMP扩增结果图；图中的字母及数字含义如下：M，100bp ladderII；1，阴性对照；2、3、4、5、6、7，维氏气单胞菌；8，大肠杆菌；9，铜绿假单胞菌；10，嗜水气单胞菌；11、12，斑点气单胞菌；13，金黄色气单胞菌；
图11为为实施例2中12种不同菌株的PCR扩增结果图；图中的字母及数字含义如下：M，100bp ladderII；1，阴性对照；2、3、4、5、6、7，维氏气单胞菌；8，大肠杆菌；9，铜绿假单胞菌；10，嗜水气单胞菌；11、12，斑点气单胞菌；13，金黄色气单胞菌；
图12为实施例3中的含有焦磷酸镁白色沉淀的LAMP扩增反应产物图；
图13为实施例3中利用10×SYBR GreenⅠ染料对LAMP扩增反应产物的效果对比实物图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。
实施例1LAMP扩增反应的优化
1.引物设计与合成
以Genbank中维氏气单胞菌的气溶素基因序列(登录号为EF034117.1)为靶基因，选择其中相对保守的序列，该序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，运用LAMP在线设计软件(Primer Explorer version 4,http://primerexplorer.jp/e/)，进行引物设计。设计出的LAMP引物包括两条外引物AV-F3和AV-B3、两条内引物AV-FIP和AV-BIP，均由上海英俊公司合成。四条引物具体对应的核苷酸碱基序列及其在SEQ ID NO.1中的具体位置如表1所示。
表1气溶素基因的LAMP扩增引物序列
2.维氏气单胞菌LAMP快速检测的实验优化
菌株：维氏气单胞菌(Aeromona veronii)，由电子科技大学中山学院材料与食品学院实验室保存。
LB液体培养基：依次称取酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，搅拌均匀至完全溶解，PH调至7.0-7.2后补充水至1000ml，分装试管中，121℃高温灭菌20分钟备用。
主要试剂：
AV-F3溶液(10μmol/L)、AV-B3溶液(10μmol/L)、AV-FIP溶液(10μmol/L)、AV-BIP溶液(10μmol/L)。BstDNA polymerase large fragment(8000U/mL)、dNTPs(10mmol/L)、MgCl2(25mmol/L)、10×lamp buffer、6X Loading Buffer、Marker，均购于鼎国生物工程公司。
琼脂糖凝胶电泳缓冲液(TAE buffer)：9.68g Tris碱、2.28ml冰乙酸、0.68g EDTA定容至2000mL。
PCR的反应试剂：TaqDNA聚合酶购于鼎国生物工程公司，其中细菌DNA引物由Invitrogen公司合成，引物的序列如下：
AV-F3:5’-AAGGGGTGGTGGAGAACG-3’；
AV-B3:5’-TCGGATCAGTCATCCTCGC-3’。
其他试剂和溶液：蒸馏水、无菌水、75％乙醇、无水乙醇、溴酚蓝指示剂、CABT、3×MLB溶液、苯酚、氯仿、异戊醇、TE缓冲液等。
主要仪器和设备：
试管、酒精灯、EP管、H-1650离心机、DK-8D型电热恒温水槽(上海一恒科技有限公司)，DYY-6C型电泳仪(北京市六一仪器厂)，凝胶成像系统购于美国BIO-RAD公司，PCR仪购于DNAThermal Cycler公司，MP5002电子天平，SW-cd-IFD洁净工作台(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)，海尔冰箱，NANODROP 2000，HZ-2011K-A摇床(太仓市华利达实验设备有限公司)，移液枪，WD750ASL23微波炉，YXQ-LS-立式压力蒸汽灭菌器。
琼脂糖凝胶的制备：称取1g的琼脂糖加入到49mL的TAE缓冲液中，放置于微波炉中加热至溶解并摇匀，琼脂糖的浓度为2％。等冷却到40℃-60℃时，加入3μL的goldview摇匀后进行倒胶。将洗干净干燥的挡板和梳子放进凝胶槽中，把冷却的凝胶小心倒入槽中，直至距梳齿高3/1的距离左右。待凝胶完全凝固后取出梳子。把凝胶槽放进电泳槽中，加入TAE缓冲液使液面没过凝胶面。
2.1维氏气单胞菌因组DNA的提取
运用酚-氯仿法提取细菌基因组。从细菌LB培养基中取2mL的维氏气单胞菌菌液于EP管中，加水至12mL，3000r/min离心10min弃掉上清液；在沉淀中加入2mL CABT，重复上述步骤；在沉淀中加水至10mL，3000r/min离心10min，弃上层清液并晾干沉淀，加入0.5mL 3×MLB溶液，37℃水浴过夜消化；转移液体到EP管中，加入0.5mL酚、氯仿、异戊醇(25:24:1)混合液，13000r/min离心10min，吸取上清液到EP管，重复该步骤；在上清液中加1.0mL-20℃预冷的无水乙醇，上下混匀可见絮状物析出，4℃12000r/min离心20min，弃上清液；用1mL-20℃75％乙醇清洗沉淀两次，每次13000r/min离心10min，弃上清液；室温干燥，加入70μL TE缓冲液，充分溶解后-20℃保存备用。
取提取得到的产物，以AV-F3、AV-B3为上下游引物进行气溶素基因部分序列PCR扩增，退火温度为50℃，进行30个循环，通过电泳分析检测PCR扩增结果。电泳检测的结果如图1所示，其中维氏气单胞菌基因组DNA均出现了扩增条带，阴性对照则没有出现扩增条带，说明成功提取了维氏气单胞菌的基因组DNA。将成功提取的维氏气单胞菌因组DNA作为DNA模板。
2.1LAMP扩增反应温度的优化
2.1.1实验操作
按顺序依次加入3.5μL AV-FIP、3.5μL AV-BIP、0.2μL AV-F3、0.2μL AV-B3、3.5μLdNTPs、2.5μL 10x lamp buffer、5.0μL MgCl2、2.6μL无菌水、1.0μL Bst DNA聚合酶、3.0μLDNA模板，将LAMP扩增反应物摇匀分装于6个PCR管中分别放置于61℃、62℃、63℃、64℃、65℃的恒温水浴锅中反应50min，其中有一管是阴性对照组加与模板相同量的无菌水加进行实验。反应完后把产物放置于80℃水浴10min进行灭活。
用移液枪吸取2μL溴酚蓝指示剂在一次性手套上点样。取6μL的产物与溴酚蓝混匀，用移液枪将混匀物分别加入2％琼脂糖凝胶板的梳孔中，2％琼脂糖凝胶板的其中一个孔加入8μL的DNAMarker。记录点样的顺序。
盖上电泳槽，接通电泳仪的电源。打开电源的开关，把电压调整到80-100V，按开始键，使DNA样品从负极向正极移动。当溴酚蓝指示剂移动到距离起点2到3cm就停止电泳，切断电源。
打开电泳槽，取出凝胶，在BIO-RAD成像系统中观察并拍照保存。
2.1.2检测结果
图2为5个不同温度梯度在LAMP扩增反应的实验结果，其中63℃的阶梯状条带最亮最多最清晰，所以63℃为LAMP扩增反应的最佳反应温度。
2.2 LAMP扩增反应时间的优化
2.2.1实验方法
按顺序依次加入3.5μL AV-FIP、3.5μL AV-BIP、0.2μL AV-F3、0.2μL AV-B3、3.5μLdNTPs、2.5μL 10x lamp buffer、5.0μL MgCl2、2.6μL无菌水、1.0μL Bst DNA聚合酶、3.0μLDNA模板，将LAMP扩增反应物摇匀分装于6个PCR管中放置于63℃下的恒温水浴锅中反应30min、40min、50min、60min、70min，其中有一管是阴性对照组加与模板相同量的无菌水加进行实验。反应完后把产物放置于80℃水浴10min进行灭活。
采用2％琼脂糖凝胶电泳(70V)对制得的产物进行检测，具体操作与2.1.1保持一致。
2.2.2检测结果
图4为不同反应时间梯度设置的LAMP扩增反应的实验结果，其中70min的阶梯状条带最亮最清晰，所以70min为LAMP扩增反应的最佳反应时间。
2.3 LAMP扩增反应的Mg2+用量优化
2.3.1实验组的设置和实验操作
本实验设置5组实验组，分别标记为为实验1、2、3、4、5组，每个PCR管为一个实验组，实验组之间以MgCl2的投料量作为变量，各试剂及其对应的投料量如表2所示。向每个PCR管中按顺序依次加入AV-FIP、AV-BIP、AV-F3、AV-B3、dNTPs、10x lamp buffer、MgCl2、无菌水、BstDNA聚合酶、DNA模板，将LAMP扩增反应物摇匀，将装有反应物的PCR管放置于63℃下的恒温水浴锅中反应70min，其中有一管是阴性对照组加与模板相同量的无菌水加进行实验。反应完后把产物放置于80℃水浴10min进行灭活。
采用2％琼脂糖凝胶电泳(70V)对制得的产物进行检测，具体操作与2.1.1保持一致。
表2 LAMP扩增反应Mg2+用量优化实验中各实验组的反应物及用量
2.3.2检测结果
图3为不同MgCl2投料量对应的LAMP扩增反应的实验结果，其中，Mg2+投料量为3μL对应产物的阶梯状条带最亮最清晰，所以，在该LAMP扩增反应中，Mg2+的最佳用量为3μL。
2.4 LAMP扩增反应的dNTPs用量优化
2.4.1实验组的设置和实验操作
本实验设置5组实验组，分别标记为为实验6、7、8、9、10组，每个PCR管为一个实验组，实验组之间以dNTPs的投料量作为变量，各试剂及其对应的投料量如表3所示。向每个PCR管中按顺序依次加入AV-FIP、AV-BIP、AV-F3、AV-B3、dNTPs、10x lamp buffer、MgCl2、无菌水、BstDNA聚合酶、DNA模板，将LAMP扩增反应物摇匀，将装有反应物的PCR管放置于63℃下的恒温水浴锅中反应70min，其中有一管是阴性对照组加与模板相同量的无菌水加进行实验。反应完后把产物放置于80℃水浴10min进行灭活。
采用2％琼脂糖凝胶电泳(70V)对制得的产物进行检测，具体操作与2.1.1保持一致。
表3 LAMP扩增反应dNTPs用量优化实验中各实验组的反应物及用量
2.4.2检测结果
图5为不同dNTPs投料量对应的LAMP扩增反应的实验结果，其中，dNTPs投料量为4.5μL和5.5μL对应的阶梯状条带亮度及清晰度都显著高于其他实验组。
2.5 LAMP扩增反应的BstDNA聚合酶用量优化
2.5.1实验组的设置和实验操作
本实验设置5组实验组，分别标记为为实验11、12、13、14、15组，每个PCR管为一个实验组，实验组之间以BstDNA聚合酶的投料量作为变量，各试剂及其对应的投料量如表4所示。向每个PCR管中按顺序依次加入AV-FIP、AV-BIP、AV-F3、AV-B3、dNTPs、10x lamp buffer、MgCl2、无菌水、Bst DNA聚合酶、DNA模板，将LAMP扩增反应物摇匀，将装有反应物的PCR管放置于63℃下的恒温水浴锅中反应70min，其中有一管是阴性对照组加与模板相同量的无菌水加进行实验。反应完后把产物放置于80℃水浴10min进行灭活。
采用2％琼脂糖凝胶电泳(70V)对制得的产物进行检测，具体操作与2.1.1保持一致。
表4 LAMP扩增反应BstDNA聚合酶用量优化实验中各实验组的反应物及用量
2.5.2检测结果
图6为不同BstDNA聚合酶投料量对应的LAMP扩增反应的实验结果，其中，BstDNA聚合酶投料量为1.0μL和1.4μL对应的阶梯状条带亮度及清晰度都显著高于其他实验组。
2.6 LAMP扩增反应的内外引物用量比优化
本实验设置5组实验组，分别标记为为实验16、17、18、19、20组，每个PCR管为一个实验组，实验组之间以内外引物的用量体积比作为变量，各试剂及其对应的投料量如表5所示。向每个PCR管中按顺序依次加入AV-FIP、AV-BIP、AV-F3、AV-B3、dNTPs、10x lamp buffer、MgCl2、无菌水、Bst DNA聚合酶、DNA模板，将LAMP扩增反应物摇匀，将装有反应物的PCR管放置于63℃下的恒温水浴锅中反应70min，其中有一管是阴性对照组加与模板相同量的无菌水加进行实验。反应完后把产物放置于80℃水浴10min进行灭活。
采用2％琼脂糖凝胶电泳(70V)对制得的产物进行检测，具体操作与2.1.1保持一致。
表5 LAMP扩增反应BstDNA聚合酶用量优化实验中各实验组的反应物及用量
2.6.2检测结果
本节分以内外引物的用量体积比作为变量设置实验组，具体的测试结果如图7所示，内外引物用量体积比为AV-FIP：AV-BIP：AV-F3：AV-B3＝4：4：1：1和AV-FIP：AV-BIP：AV-F3：AV-B3＝6：6：1：1对应产物的阶梯状条带亮度及清晰度都显著高于其他实验组。其中，内外引物用量体积比为AV-FIP：AV-BIP：AV-F3：AV-B3＝4：4：1：1对应产物的阶梯状条带亮度较高，但清晰度较低；内外引物用量体积比为AV-FIP：AV-BIP：AV-F3：AV-B3＝6：6：1：1对应产物的阶梯状条带同时具有较高的亮度和清晰度，综合考虑，确定最佳的内外引物用量体积比为AV-FIP：AV-BIP：AV-F3：AV-B3＝6：6：1：1。
通过上述优化实验得出：按照体积比计取AV-F3溶液(10μmol/L)3份、AV-B3溶液(10μmol/L)3份、AV-FIP溶液(10μmol/L)0.5份、AV-BIP溶液(10μmol/L)0.5份、BstDNApolymerase large fragment(8000U/mL)1份、dNTPs(10mmol/L)4.5份、MgCl2(25mmol/L)3份、10×lamp buffer(1×)2.5份、无菌水4份混合配制得到的LAMP反应液得到的检测效果最佳；由此混合所得的LAMP反应液中各物质的浓度为：AV-FIP引物1.2μmol/L，AV-BIP引物1.2μmol/L，AV-F3引物0.2μmol/L，AV-B3引物0.2μmol/L，dNTPs 1.8mmol/L，Mg2+3mmol/L，BstDNA聚合酶320U/mL，10×lamp buffer的浓度为1×。
实施例2
菌株：维氏气单胞菌(Aeromona veronii)、斑点气单胞菌(Aeromonas punctata)、大肠杆菌(Escherichia coli)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、金黄色气单胞菌(Staphylococcus aureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，一共12株菌，均是电子科技大学中山学院材料与食品学院实验室保存菌株。
LB液体培养基：依次称取酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，搅拌均匀至完全溶解，PH调至7.0-7.2后补充水至1000ml，分装试管中，121℃高温灭菌20分钟备用。
主要试剂：
琼脂糖凝胶电泳缓冲液(TAE buffer)：9.68g Tris碱、2.28ml冰乙酸、0.68g EDTA定容至2000mL。
LAMP反应试剂：AV-F3溶液(10μmol/L)、AV-B3溶液(10μmol/L)、AV-FIP溶液(10μmol/L)、AV-BIP溶液(10μmol/L)；BstDNA polymerase large fragment(8000U/mL)、dNTPs(10mmol/L)、MgCl2(25mmol/L)、10×lamp buffer、6X Loading Buffer、Marker，均购于鼎国生物工程公司。
PCR的反应试剂：TaqDNA聚合酶购于鼎国生物工程公司，其中细菌DNA引物由Invitrogen公司合成，引物的序列如下：
AV-F3:5’-AAGGGGTGGTGGAGAACG-3’；
AV-B3:5’-TCGGATCAGTCATCCTCGC-3’。
AV-FIP:5’-GCCCCTCCAGATCCATCTCGT-GTGCGCTATGTACGCAAGG-3’
AV-BIP:5’-CCACCTCGGATAACAGTCTGGC-CGCATGCCGTCAAACTTG-3’
其他试剂和溶液：无菌水、75％乙醇、无水乙醇、溴酚蓝指示剂、CABT、3×MLB溶液、苯酚、氯仿、异戊醇、TE缓冲液等。
主要仪器和设备：
试管、酒精灯、EP管、H-1650离心机、DK-8D型电热恒温水槽(上海一恒科技有限公司)，DYY-6C型电泳仪(北京市六一仪器厂)，凝胶成像系统购于美国BIO-RAD公司，PCR仪购于DNAThermal Cycler公司，MP5002电子天平，SW-cd-IFD洁净工作台(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)，海尔冰箱，NANODROP 2000，HZ-2011K-A摇床(太仓市华利达实验设备有限公司)，移液枪，WD750ASL23微波炉，YXQ-LS-立式压力蒸汽灭菌器
1.灵敏度实验
1.1实验的设置和操作步骤
PCR扩增：PCR扩增反应的反应物及其用量具体如表6所示，将提取的1株维氏气单胞菌基因组DNA原液按10倍比的浓度梯度依次稀释，依次标为100、101、102、103、104、105、106、107，以各稀释浓度的基因组DNA为模板进行PCR扩增。把配好的PCR反应物按表7的方法进行PCR扩增，进行30个循环，72℃延伸10min，4℃保温。
表6 PCR反应体系各反应物的加入顺序及用量
试剂名称 用量(μL) 试剂名称 用量(μL)
无菌水 40 B<sub>3</sub> 1
PCR buffer 5 TaqDNA聚合酶 1
dNTPs 1 DNA模板 1
F<sub>3</sub> 1
表7 PCR扩增程序及反应条件
温育 94℃ 5min
变性 94℃ 30s
退火 50℃ 30s
延伸 32℃ 2min
LAMP扩增：LAMP扩增反应的反应物及其用量具体如表8所示，同样将提取的1株维氏气单胞菌基因组DNA原液按10倍比的浓度梯度依次稀释，依次标为100、101、102、103、104、105、106、107为模板进行LAMP扩增。将所有反应物混合并摇匀后，分装于PCR管中放置于63℃的水浴锅中反应70min。反应完后把产物放置于80℃水浴10min进行灭活。然后冰浴3min。
表8 LAMP扩增反应体系各反应物加入顺序及用量
试剂 用量(μL) 试剂 用量(μL)
AV-FIP 3.0 10×lamp buffer 2.5
AV-BIP 3.0 MgCl<sub>2</sub> 3.0
AV-F<sub>3</sub> 0.5 无菌水 3.6
AV-B<sub>3</sub> 0.5 BstDNA聚合酶 1.0
dNTPs 4.5 DNA模板 3.0
分别将PCR、LAMP产物进行跑胶，比较灵敏度。
1.2实验结果
参照图8和图9，采用LAMP扩增时，模板稀释度为100-106时都出现了明显的阶梯状条带，然而，采用PCR扩增时，只有模板稀释度为100-104时出现扩增条带，因此，以维氏气单胞菌基因组DNA原液作为检测目标时，说明LAMP扩增反应的灵敏度比PCR扩增反应的灵敏度高出2个数量级。
2.特异性实验
选取8种共12株细菌的基因组DNA为模板分别进行LAMP扩增和PCR扩增，供试菌株如表9所示，LAMP扩增和PCR扩增分别所需的试剂及其用量、添加顺序和反应条件与本实施例的灵敏度实验保持一致。
表9特异性试验所用菌株
细菌名称 株数
维氏气单胞菌(Aeromona veronii) 6株
斑点气单胞菌(Aeromonas punctata) 2株
大肠杆菌(Escherichia coli) 1株
嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila) 1株
金黄色气单胞菌(Staphylococcus aureus) 1株
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) 1株
2.2实验结果
如图10，LAMP扩增结果显示仅有6株维氏气单胞菌出现阳性结果，显示出明亮清晰的阶梯状条带，其他供试菌株对应的测试结果均未出现阶梯状条带，呈阴性。如图11，PCR扩增结果与LAMP扩增结果相吻合。
实施例3维氏气单胞菌的试剂盒的构建
本实施例的维氏气单胞菌的试剂盒，包括A溶液8-10mL、B溶液0.5-1mL、C试液0.5-1mL和D溶液1.5-2mL。A溶液中含有：AV-FIP引物(SEQ ID NO.4)1.2μmol/L、AV-BIP引物(SEQ IDNO.5)1.2μmol/L、AV-F3引物(SEQ ID NO.2)0.2μmol/L、AV-B3引物(SEQ ID NO.3)0.2μmol/L、dNTPs 1.8mmol/L、Mg2+3mmol/L、BstDNA聚合酶320U/mL、浓度为1×的10×lamp buffer。B溶液为维氏气单胞菌基因组DNA样品液。C试液为无菌水。D溶液为浓度为25×的SYBR GreenI荧光染料。
本实施例的维氏气单胞菌的试剂盒的使用方法如下：
取试剂盒A溶液22μL，加入待测DNA样品液3μL，配制实验组反应液；取试剂盒A溶液22μL，加入B溶液3μL，配制阳性对照反应液；取试剂盒A溶液22μL，加入B溶液3μL，配制阴性对照反应液。分别将实验组反应液、阳性对照反应液和阴性对照反应液放置于63℃下的恒温水浴锅中反应70min，反应完后把产物放置于80℃水浴10min进行灭活。
结果判断，结果判断可以采用以下两种方法之一：
浊度仪监测：由于LAMP的独特扩增机制，使它的扩增产物多是茎-环状和气单胞菌的DNA片段的混合产物，其在反应过程中，靶基因在DNA聚合酶的作用下能大量合成，期间dNTPs析出的焦磷酸根离子能与镁离子结合，产生扩增反应副产物-焦磷酸镁白色沉淀，从而使反应体系出现肉眼可见的浑浊现象，因此，可根据反应体系是否出现浑浊现象来判断LAMP反应进行与否，从而也可以判断靶基因是否存在。利用浊度仪监测反应容器内白色沉淀的产生情况来判断扩增结果，如有白色沉淀，则表示样品中存在维氏气单胞菌，如无沉淀产生，则表示样品中无维氏气单胞菌。如图12所示：图中装有实验组反应产物的PCR管内有明显的白色沉淀产生，而装有阴性对照组反应产物的PCR管内呈澄清状态。该判断方式适用于实验室。
显色剂检测：分别向反应完毕的实验组反应液、阳性对照反应液和阴性对照反应液中加入向LAMP产物中加入10×SYBR GreenⅠ染料1μL，混匀后，通过肉眼观察其颜色，如果显示核酸染料原来的淡粉色，则表示没有扩增，即样品中无维氏气单胞菌，判断为阴性，如果颜色转变为淡黄色，则表示有扩增，即样品中存在维氏气单胞菌，判断为阳性。如图13所示：图中装有实验组反应产物的PCR管内溶液呈淡黄色，而装有阴性对照组反应产物的PCR管内溶液呈淡粉色。该判断方式适用于对维氏气单胞菌进行实地检测。
利用本实施例构建的维氏气单胞菌的试剂盒，能够至少完成100次的维氏气单胞菌检测实验。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，技术人员阅读本申请说明书后依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，但这些修改或变更均未脱离本发明申请待批权利要求保护范围。
序列表
<110> 电子科技大学中山学院
<120> 一种维氏气单胞菌的LAMP检测引物组合物及试剂盒
<141> 2019-05-27
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1260
<212> DNA
<213> 维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)
<400> 1
ggatccctga tgaagaagtc tctctgcgcc ctcctgttgc tgatcttgtt gccacttggc 60
accgcacagg cgaccgaatt caaactgacc ggccgcacta cctggcagct tggccagttg 120
atggtcaacg gcatgccgtt cgtgatcgac gaccagaccc gcttcaagga ctggctcaac 180
gaggatgatc tcggtggtac ctgggtcgag atgaaggggt ggtggagaac ggcgtgcgct 240
atgtacgcaa ggtcgaagcc ctcgacgaag atgacaagga cgagatggat ctggaggggc 300
cggtggaagg ggggcggatc tggggctaca ccacctcgga taacagtctg gcgccgtttg 360
aagggcgctg gctcgagctg gagtgcaagt ttgacggcat gcgcctgagc cgctgccgcg 420
aggatgactg atccgatctc tgagttccga ttagaaatgc tcccgaatga agcccatgct 480
tgtcctgcat gggctttttg ttcagggacg aacgaagatg gaacaatcga gaaagtggtg 540
tgcatggatg ctgggtgtgc cgctctgggc ggcgcaggcg ggagccgacg aattgtggct 600
ggtggagctg gagcacagcg atggcatccg cctgcaattt cagggggccg aagtggagca 660
gggcagtgct gccatctggc ggcaggggga gatttggcca cagccactca aacccggcga 720
ccagctcgct ctgctggtgg ccgatggcgt tgccacccgg attgagctgc tggccgccag 780
agtcccgctg gctaatctgc cctggcagcg ggcgcaagat cgcctgcaat ccttcgatga 840
ccggcagctc acgctggcaa ccctgggcac tgtgccactc aatccgctgg tgcgctgggt 900
taacggttcg gccgccgatc tgcatgccgg gagcgagctg gcattgatcc gttcggcgga 960
tggaatattg cagggaattg aagtgatcaa tccggaagag taattcagca tcttcttatt 1020
taatatggtt tcaccatatt gtggcagcca ttaaataatg gctgccacaa tatttatgat 1080
ttattcctca ataaagtcat cactctaatt attttcttat accaccatta ttttgtttgt 1140
catggatgtt ttttggcggt ttattttatt tgtgtcaggt tttgtcggag tacatacctg 1200
tcaaatgaaa aaggatattt ctacacaata acaattatcg tatgtctgaa agagggataa 1260
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)
<400> 2
aaggggtggt ggagaacg 18
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)
<400> 3
tcggatcagt catcctcgc 19
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)
<400> 4
gcccctccag atccatctcg tgtgcgctat gtacgcaagg 40
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)
<400> 5
ccacctcgga taacagtctg gccgcatgcc gtcaaacttg 40

Claims (10)

1.一种维氏气单胞菌的LAMP检测引物组合物，其特征在于：包括两条外引物AV-F3引物和AV-B3引物、两条内引物AV-FIP引物和AV-BIP引物；所述AV-F3引物的核苷酸序列为SEQ IDNO.2，所述AV-B3引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.3，所述AV-FIP引物的核苷酸序列为SEQID NO.4，所述AV-BIP引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.5。
2.如权利要求1所述维氏气单胞菌的LAMP检测引物组合物在制备检测维氏气单胞菌的试剂盒中的应用。
3. 一种检测维氏气单胞菌的试剂盒，其特征在于：包括A溶液，所述A溶液中含有如权利要求1所述维氏气单胞菌的LAMP检测引物组合物、dNTPs、10× lamp buffer、Mg2+和BstDNA聚合酶。
4.如权利要求3所述检测维氏气单胞菌的试剂盒，其特征在于，所述A溶液中的所述引物组合物满足如下浓度比例：
所述AV-FIP引物：所述AV-BIP引物：所述AV-F3引物：所述AV-B3引物=6 : 6 : 1 : 1 。
5. 如权利要求4所述检测维氏气单胞菌的试剂盒，其特征在于：在所述A溶液中，所述AV-FIP引物的浓度为1.2 µmol/L，所述AV-BIP引物的浓度为1.2 µmol/L，所述AV-F3引物的浓度为0.2 µmol/L，所述AV-B3引物的浓度为0.2 µmol/L。
6. 如权利要求3所述检测维氏气单胞菌的试剂盒，其特征在于：在所述A溶液中，所述dNTPs的浓度为1.8 mmol/L，所述Mg2+的浓度为3 mmol/L，所述BstDNA聚合酶的浓度320 U/mL，所述10× lamp buffer的浓度为1×。
7.如权利要求3所述检测维氏气单胞菌的试剂盒，其特征在于：还包括B溶液和C试液，所述B溶液为维氏气单胞菌基因组DNA样品液，所述C试液为无菌水。
8.如权利要求7所述检测维氏气单胞菌的试剂盒的使用方法，其特征在于：
按照所述A溶液：待测DNA样品液=22:3的体积比，取所述A溶液与所述待测DNA样品液，混合，配制实验组反应液；
按照所述A溶液：所述B溶液=22:3的体积比，取所述A溶液与所述B溶液，混合，配制阳性对照组反应液；
按照所述A溶液：所述C试液=22:3的体积比，取所述A溶液与所述C试液，混合，配制阴性对照组反应液；
分别使所述实验组反应液、所述阳性对照组反应液和所述阴性对照组反应液在61-65℃下进行LAMP扩增反应，反应时间为30-90分钟；
分别对完成LAMP扩增反应后的所述实验组反应液、所述阳性对照组反应液和所述阴性对照组反应液进行灭活处理，定性检测。
9. 如权利要求8所述检测维氏气单胞菌的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述检测维氏气单胞菌的试剂盒还包括D溶液，所述D溶液为SYBR Green I 荧光染料；
所述定性检测的具体步骤为：
按照灭活后的所述实验组反应液：所述D溶液=22:1的体积比，向灭活后的所述实验组反应液中加入所述D溶液；
按照灭活后的所述阳性对照组反应液：所述D溶液=22:1的体积比，向灭活后的所述阳性对照组反应液中加入所述D溶液；
按照灭活后的所述阴性对照组反应液：所述D溶液=22:1的体积比，向灭活后的所述阴性对照组反应液中加入所述D溶液。
10.如权利要求8或9任一项所述检测维氏气单胞菌的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述LAMP扩增反应的反应条件为：反应温度为63℃，反应时间为70分钟。
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