FI121884B - Menetelmä metisilliiniresistenttien stafylokokkien havaitsemiseksi ja tunnistamiseksi sekä menetelmään tarkoitettu koetin ja testipakkaus - Google Patents
Menetelmä metisilliiniresistenttien stafylokokkien havaitsemiseksi ja tunnistamiseksi sekä menetelmään tarkoitettu koetin ja testipakkaus Download PDFInfo
- Publication number
- FI121884B FI121884B FI20085041A FI20085041A FI121884B FI 121884 B FI121884 B FI 121884B FI 20085041 A FI20085041 A FI 20085041A FI 20085041 A FI20085041 A FI 20085041A FI 121884 B FI121884 B FI 121884B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- seq
- specific
- gyrb
- pare
- complementary
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
- C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
MENETELMÄ METISILLilNIRESISTENTTIEN STAFYLOKOKKIEN HAVAITSEMISEKSI JA TUNNISTAMISEKSI SEKÄ MENETELMÄÄN TARKOITETTU KOETIN JA TESTIPAKKAUS
KEKSINNÖN ALA
5 Keksintö koskee menetelmää metisilliiniresistenttien Staphylococ- cus-lajien havaitsemiseksi ja tunnistamiseksi sekä menetelmään tarkoitettuja koettimia. Lisäksi keksintö koskee menetelmään tarkoitettuja alukkeita ja koet-timia käsittäviä testipakkauksia.
KEKSINNÖN TAUSTA
10 Verenmyrkytys on vakava, jopa hengenvaarallinen systeeminen sai raus, joka on seurausta verenkierron infektoitumisesta myrkkyjä tuottavilla bakteereilla. Verenmyrkytyksessä verenkierron toimintahäiriö saattaa johtaa useiden elinten pettämiseen ja verenpaineen putoamiseen saaden aikaan shokkitilan. Maailmanlaajuisesti verenmyrkytys on yleisin kuolinsyy tehohoitoyksiköis-15 sä kuolleisuusasteen vaihdellessa 20 %;n ja 60 %:n välillä.
Stafylokokkilajit kuuluvat verenmyrkytystä aiheuttaviin patogeenei-hin. Sellaisissa verenmyrkytystapauksissa, joissa taudinaiheuttajana on joko Staphylococcus aureus tai metisilliiniresistentti Staphylococcus aureus (MRSA) kuolleisuusaste on 15-30 %. Kliinisten tulosten perusteella näyttää siltä, että 20 28 % potilaista, joilla on S. aurauksen aiheuttama verenmyrkytys, eivät saa riittävän aikaista ja asianmukaista hoitoa, ja että 10 % potilaista saattaa aluksi saada vääränlaista antibioottihoitoa.
Verenmyrkytyksen hoidossa on taudinaiheuttajien ja antibioottiresis-tenssimarkkerien aikainen tunnistus ensiarvoisen tärkeää empiirisen mikrobi--r- 25 lääkehoidon uudelleenarvioimiseksi. Stafylokokkien lisääntyneen metisilliini- ^ resistenssiyden vuoksi empiiriseksi hoidoksi valitaan usein vankomysiini. Far- g makokineettisistä ja farmakodynaamisista syistä johtuen vankomysiinihoidon o) tehokkuus ei kuitenkaan ole paras mahdollinen metisilliinisensitiivisen S. aure- o x uksen (MSSA) ollessa kyseessä. S. aureuksen and MRSA:n aiheuttamiin ve-
CC
30 renmyrkytyksiin liittyvä korkea kuolleisuusaste korostaa metisilliiniresistenssiy- ^ den markkerigeenin mecA tunnistamisen tärkeyttä, o g Stafylokokkisuvun bakteerit ovat gram-positiivisia kokkimuotoisia o bakteereita. Suurin osa stafylokokkilajeista on koagulaasinegatiivisia bakteerei ta, poikkeuksen muodostavat S. aureus, S. intermedius, S. delphini, ja S. 35 schleiferi alalaji coagulans. Koagulaasinegatiiviset stafylokokit (CoNS) ovat 2 merkittäviä verenmyrkytyksen aiheuttajia sairaalahoidossa olevilla potilailla. Metisilliiniresistenssiys on yleistä näiden CoNS-bakteereiden joukossa (Marshall et ai. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 1998, 30:205-214).
Staphylococcus-\a]\en metisilliiniresistenssiys syntyy hankkimalla 5 stafylokokkien kasettikromosomiksi SCCmec kutsuttu suuri geneettinen elementti. SCCmec-kasetti sisältää mecA-geenin, joka koodaa metisiiliiniresis-tenssiyden määrittävää penisilliiniin sitoutuvaa proteiinia PBP 2a. Viisi erityyppistä SCCmec-kasettia ja niiden varianttia on tunnistettu. Näiden kasettien me-cA-geeni on kuitenkin erittäin konservoituna Staphylococcus-lajeilla.
10 Metisilliiniresistenssiyden havaitsemismenetelmät perustuvat joko fenotyyppiseen tai genotyyppiseen karakterisaatioon. Monet stafylokokkikan-nat ilmentävät kuitenkin mecA-geeniä heterogeenisesti. Näin ollen metisilliini-resistenssin fenotyyppinen havaitseminen, erityisesti CoNS-bakteereilla, on ongelmallista ja epäluotettavaa (Hussain et ai., J. Clin. Microbiol. 2002, 15 40:2251-2253). Stafylokokkien genomin mecA-geenin tunnistamiseen perustu va genotyyppinen karakterisaatio on siten täsmällisempää metisilliiniresistens-siyttä määritettäessä. Genotyyppinen karakterisaatio on lisäksi stafylokokkien kasvatusvaihetta vaativia fenotyyppisiä menetelmiä nopeampi. Esimerkiksi eurooppalaisessa patenttijulkaisussa EP0887424B1 kuvataan menetelmä 20 MRSA:n tai MRCoNS:n (metisilliiniresistentti koagulaasinegatiivinen stafylokokki) havaitsemiseksi. Menetelmässä toteutetaan näytteen reaktio käyttämällä alukkeina ja/tai koettimina stafylokokkigenomiin integroituneen mecA-geenin osaa ja mainittua integroitunutta DNA:ta ympäröivän kromosomaalisen DNA:n emässekvenssin osaa.
25 Kansainvälisessä patenttijulkaisussa WO 2007/023461 kuvataan alukkeita ja koettimia, jotka ovat käyttökelpoisia 23S rRNA -geeniin ja antibi-^ oottiresistenssigeeneihin, mukaan lukien mecA, perustuvassa mikro-
O
^ organismien tunnistuksessa. Menetelmä on eri bakteerilajien 23S rRNA:ta mo- o nistavien spesifisten alukeparien varassa. Joukko patogeenejä voidaan siten o 30 tunnistaan samanaikaisesti multiplex-PCR:ää käyttämällä, mikä voi olla haas- = tavaa kaikkien alukeparien optimoinnille. Ribosomaalisen RNA:n käyttöön li it-
CL
tyy lisäksi joitakin haittapuolia. Lähisukuisten bakteerilajien erottaminen toisis-§ taan rRNA-molekyylien avulla voi olla vaikeaa, koska näiden molekyylien sek-
LO
§ venssit eivät sisällä toisiinsa verrattuina riittävästi varioivia alueita.
° 35 Alalla on siten edelleen tarvetta herkille metisilliiniresistenttien
Staphylococcus-lajien havaitsemismenetelmille.
3
KEKSINNÖN LYHYT SELOSTUS
Esillä oleva keksintö antaa käyttöön menetelmän metisilliiniresis-tenttien Staphylococcus-lajien havaitsemiseksi ja tunnistamiseksi näytteestä. Mainittu menetelmä käsittää a) näytteestä peräisin olevan DNA:n monistami-5 sen käyttäen ensimmäistä alukeparia, joka hybridisoituu topoisomeraaseja gyrB ja parE koodaavien geenien konservoinneille alueille, ja toista alukeparia, joka hybridisoituu mecA -geeniin; ja b) monistetun DNA:n saattamisen kosketukseen hybridisaatio-olosuhteissa i) vähintään yhden stafylokokkisukus-pesifisen, monistetulle gyrB- tai parE-geenialueelle hybridisoituvan oligonukle-10 otidikoettimen, ii) vähintään yhden S. aureus -lajispesifisen, monistetulle gyrB-tai parE-geenialueelle hybridisoituvan oligonukleotidikoettimen, ja iii) vähintään yhden mecA-spesifisen oligonukleotidikoettimen, joka käsittää sekvenssi-numerossa 11 esitetyn sekvenssin, kanssa; ja c) mahdollisen hybridisaatio-kompleksin muodostumisen havaitsemisen.
15 Eräässä suoritusmuodossa menetelmä käsittää lisäksi monistetun DNA:n saattamisen kosketukseen vähintään yhden Staphylococcus epidermi-dis -lajispesifisen, monistetulle gyrB- tai parE-geenialueelle hybridisoituvan oligonukleotidikoettimen kanssa. Erään erityisen suoritusmuodon mukaan mainittu koetin käsittää sekvenssin, joka on valittu sekvenssinumeroiden 21 -20 25 ja niiden komplementaaristen tai käänteisten sekvenssien muodostamasta ryhmästä. Menetelmä voi myös käsittää monistetun DNA:n saattamisen kosketukseen kaikkien sekvenssinumeroissa 21 - 25 esitettyjen S. epidermidis -spesifisten koetti m ien kanssa.
Erään toisen suoritusmuodon mukaan ensimmäinen alukepari käsit-25 tää vähintään yhden sekvenssinumerossa 1 tai 2 esitetyn sekvenssin tai sen komplementaarisen tai käänteisen sekvenssin. Erään muun suoritusmuodon ^ mukaan toinen alukepari käsittää vähintään yhden sekvenssin, joka on valittu ^ sekvenssinumerosta 5 ja 6 ja niiden komplementaarisista tai käänteisistä sek-
CM
9 vensseistä.
o 30 Vielä erään suoritusmuodon mukaan mainittu vähintään yksi stafy- ϊε lokokkisukuspesifinen koetin käsittää sekvenssin, joka on valittu sekvenssinu-
CL
meroiden 26 - 33 ja niiden komplementaaristen tai käänteisten sekvenssien o muodostamasta ryhmästä. Menetelmä voi myös käsittää monistetun DNA:n o saattamisen kosketukseen kaikkien sekvenssinumeroissa 26 - 33 esitettyjen o 35 sukuspesifisten koettimien kanssa.
4
Vielä erään muun suoritusmuodon mukaan mainittu S. aureus -lajispesifinen koetin käsittää sekvenssin, joka on valittu sekvenssinumeroiden 13 - 20 ja niiden komplementaaristen tai käänteisten sekvenssien muodostamasta ryhmästä. Menetelmä voi myös käsittää monistetun DNA:n saattamisen 5 kosketukseen kaikkien sekvenssinumeroissa 13-20 esitettyjen S. aureus -lajispesifisten koettimien kanssa.
Yhden muun suoritusmuodon mukaan menetelmässä käytetään lisäksi vähintään yhtä mecA-spesifistä koetinta, joka käsittää sekvenssin, joka on valittu sekvenssinumeroiden 7 - 10 ja 12 ja niiden komplementaaristen tai 10 käänteisten sekvenssien muodostamasta ryhmästä. Menetelmä voi myös käsittää monistetun DNA:n saattamisen kosketukseen kaikkien sekvenssinumeroissa 7-12 esitettyjen mecA-spesifisten koettimien kanssa.
Esillä olevan keksinnön mukainen menetelmä voi lisäksi käsittää DNA:n monistamisen vähintään yhdellä S. aureus -lajispesifisellä alukkeella, 15 joka hybridisoituu topoisomeraaseja gyrB ja parE koodaavien geenien konservoinneille alueille, esimerkiksi S. aureuksen DNA:n monistumisen tehostamiseksi. Erään suoritusmuodon mukaan mainittu aluke käsittää sekvenssin, joka on valittu sekvenssinumerosta 3 ja 4 ja niiden komplementaarisista tai käänteisistä sekvensseistä. Erään toisen suoritusmuodon mukaisessa menetelmässä 20 käytetään molempia sekvenssinumeroissa 3 ja 4 esitettyjä alukkeita.
Eräässä erityisessä suoritusmuodossa, missä analysoitava näyte on S. aureus -puhdasviljelmä, mainittu ensimmäinen alukepari käsittää vähintään yhden sekvenssin, joka on valittu sekvenssinumerosta 3 ja 4 ja niiden komplementaarisista tai käänteisistä sekvensseistä. Erään toisen suoritusmuodon 25 mukaisessa menetelmässä käytetään molempia sekvenssinumeroissa 3 ja 4 esitettyjä alukkeita. Tällaisissa suoritusmuodoissa jätetään DNA:n monistami-^ nen topoisomeraaseja gyrB ja parE koodaavien geenien konservoituneille alu- ^ eille hybridisoituvilla laajakirjoisilla alukkeilla suorittamatta. Jos niin halutaan,
C\J
o voidaan monistetun DNA:n saattaminen kosketukseen stafylokokkisukus- o 30 pesifisten oligonukleotidikoettimien kanssa jättää myös suorittamatta, g Esillä olevan keksinnön mukainen menetelmä voidaan suorittaa liu-
CL
oksessa tai kiinteällä kantajalla. Eräässä suoritusmuodossa mainitut alukkeet § ja/tai koettimet ovat siten kiinnitettyjä kiinteään kantajaan kuten biolastuun.
LT) § Biolastu voi käsittää erillisiä lokeroita alukkeille ja koettimille.
° 35 Menetelmä voi koostua edellä kuvatuista vaiheista tai se voi lisäksi käsittää esimerkiksi DNA:n monistamisen muilla alukkeilla ja/tai monistetun 5 DNA:n saattamisen kosketukseen muiden koettimien kanssa. Joissakin suoritusmuodoissa menetelmä voi myös käsittää lisävaiheita kuten pesu- ja inku-baatiovaiheita.
Tässä tekstissä kuvataan myös mecA-spesifisiä DNA-alukkeita, jot-5 ka käsittävät nukleotidisekvenssin, joka on valittu sekvenssinumeroiden 5 ja 6 ja niiden komplementaaristen tai käänteisten sekvenssien muodostamasta ryhmästä.
Lisäksi tässä tekstissä kuvataan S. aureus -spesifisiä DNA-alukkeita, jotka käsittävät nukleotidisekvenssin, joka on valittu sekvenssinume-10 roiden 3 ja 4 ja niiden komplementaaristen tai käänteisten sekvenssien muodostamasta ryhmästä.
Lisäksi tässä tekstissä kuvataan DNA-alukeseos, joka käsittää sek-venssinumeroissa 1 - 6 esitettyjä alukkeita ja niiden komplementaarisia tai käänteisiä sekvenssejä.
15 Vielä lisäksi keksintö antaa käyttöön mecA-spesifisiä oligonukleoti- dikoettimia, jotka käsittävät nukleotidisekvenssin, joka esitetään sekvenssinu-merossa 11. Tässä tekstissä kuvataan myös mecA-spesifisiä oligonukleotidi-koettimia, jotka käsittävät nukleotidisekvenssin, joka on valittu sekvenssinumeroiden 7 - 10 ja 12 ja niiden komplementaaristen ja käänteisten sekvenssien 20 muodostamasta ryhmästä.
Esillä oleva keksintö antaa myös käyttöön testipakkauksen, joka on tarkoitettu metisilliiniresistenttien Staphylococcus-\a\ien havaitsemiseen ja tunnistamiseen näytteestä. Testipakkaus käsittää vähintään yhden gyrB- ja parE-spesifisen alukkeen, vähintään yhden mecA-spesifisen alukkeen, vähintään 25 yhden S. aureus -lajispesifisen gyrB- tai parE-koettimen, ja vähintään yhden mecA-spesifisen oligonukleotidikoettimen, joka käsittää sekvenssinumerossa ^ 11 esitetyn sekvenssin.
™ Eräs suoritusmuoto käsittää vähintään yhden gyrB- ja parE-
C\J
o spesifisen alukkeen, joka käsittää sekvenssinumerossa 1 tai 2 esitetyn sek- o 30 venssin tai niiden komplementaarisen tai käänteisen sekvenssin, ja vähintään g yhden stafylokokkisukuspesifisen gyrB- tai parE-koettimen. Mainittu stafylo-
CL
kokkisukuspesifinen koetin voi käsittää sekvenssin, joka on valittu sekvenssi-§ numeroiden 26 - 33 ja niiden komplementaaristen tai käänteisten sekvenssien
LO
§ muodostamasta ryhmästä. Testipakkaus voi mahdollisesti käsittää myös vähin- cm 35 tään yhden S. epidermidis -lajispesifisen gyrB- tai parE-koettimen. Mainittu S.
epidermidis -lajispesifinen koetin voi käsittää sekvenssin, joka on valittu sek- 6 venssinumeroiden 21 - 25 ja niiden komplementaaristen tai käänteisten sekvenssien muodostamasta ryhmästä.
Keksinnön mukainen testipakkaus voi sisältää S. aureus -lajispesifisen alukkeen ainoana gyrB- ja parE-alukkeena tai mainittu S. aureus 5 -lajispesifinen gyrB- ja parE-aluke voi lisänä testipakkauksen sisältämille laa-jakirjoisille gyrB- ja parE-alukkeille. Mainitut S. aureus -lajispesifiset alukkeet voivat käsittää sekvenssin, joka on valittu sekvenssinumerosta 3 ja 4 ja niiden komplementaarista tai käänteisistä sekvensseistä.
Erään suoritusmuodon mukaan testipakkaus käsittää vähintään yh-10 den S. aureus -lajispesifisen gyrB- tai parE-koettimen, joka käsittää sekvenssin, joka on valittu sekvenssinumeroiden 13 - 20 ja niiden komplementaaristen tai käänteisten sekvenssien muodostamasta ryhmästä. Testipakkaus voi myös sisältää kaikki sekvenssinumeroissa 13-20 esitetyt koettimet.
Erään toisen suoritusmuodon mukaan testipakkaus käsittää vähin-15 tään yhden mecA-spesifinen alukkeen, joka käsittää sekvenssin, joka on valittu sekvenssinumerosta 5 ja 6 ja niiden komplementaarisista tai käänteisistä sekvensseistä. Testipakkaus voi myös sisältää molemmat sekvenssinumeroissa 5 ja 6 esitetyt alukkeet.
Vielä erään suoritusmuodon mukaan menetelmässä voidaan lisäksi 20 käyttää vähintään yhtä meaA-spesifistä oligonukleotidikoetinta, joka käsittää sekvenssin, joka on valittu sekvenssinumeroiden 7 - 10 ja 12 ja niiden komplementaaristen tai käänteisten sekvenssien muodostamasta ryhmästä. Testi-pakkaus voi myös käsittää kaikki sekvenssinumeroissa 7-12 esitetyt koettimet.
25 Keksinnön mukainen testipakkaus voi lisäksi käsittää biolastun, jo hon mainitut alukkeet ja koettimet sisältyvät ja/tai johon ne on kiinnitetty. Bio- ^ lastu voi käsittää erillisiä lokeroita alukkeille ja koettimille.
o ^ Esillä olevan keksinnön mukainen testipakkaus voi koostua edellä C\] o kuvatuista alukkeista ja koettimista ja mahdollisesti biolastusta tai se voi lisäksi o 30 sisältää muita alukkeita ja/tai koettimia sekä sopivia reagensseja esimerkiksi g DNA:n monistamista ja hybridisaatiota varten.
□_
^ KUVIOIDEN LYHYT SELOSTUS
o S Keksintöä kuvataan seuraavaksi yksityiskohtaisemmin edullisten
O
^ suoritusmuotojen avulla viittaamalla mukaan liitettyihin kuvioihin, joissa: 35 Kuvio 1 havainnollistaa S. aureuksen (kolmiolla merkitty täplä; sek- venssinumero 18) ja mecA-geenin (ympyröidyt täplät; sekvenssinumerot 7 ja 9, 7 sekvenssinumerot 8 ja 10) samanaikaista havaitsemista mikrosirulla. Mikrosirun mecA-täplät käsittivät kahta spesifistä mecA-oligoa täplää kohti. Lisäksi havaittiin neljä kontrolliologonukleotidia (neliöidyt täplät).
Kuvio 2 havainnollistaa stafylokokkisuvun bakteerien (kolmiolla 5 merkitty täplä; sekvenssinumero 26) ja mecA-geenin (ympyröidyt täplät; sekvenssinumerot 7 ja 9, sekvenssinumerot 8 ja 10) samanaikaista havaitsemista mikrosirulla. Mikrosirun mecA-täplät käsittivät kahta spesifistä mecA-oligoa täplää kohti. Lisäksi havaittiin neljä kontrolliologonukleotidia (neliöidyt täplät).
KEKSINNÖN YKSITYISKOHTAINEN SELOSTUS 10 Esillä oleva keksintö antaa käyttöön metisilliiniresistenttien Staphy- lococcus-\ä\\en molekylaarisen tunnistusmenetelmän, jossa käytetään to-poisomeraasi- ja metisilliiniresistenssimarkkerigeenien geenisekvenssejä.
Menetelmä perustuu näytteessä olevien muiden stafylokokkien kuin S. aureuksen DNA:n tunnistamiseen bakteerisukuspesifisten koettimien avulla 15 sekä näytteessä läsnä olevan S. aureuksen DNA:n tunnistamiseen lajispesifisillä koettimilla. Lisäksi metisilliiniresistenssigeenin (mecA) läsnäolo havaitaan mecA-spesifisiä koettimia käyttämällä. Menetelmällä aikaansaadaan näytteen yksityiskohtainen analyysi yhdellä määrityksellä mahdollisesti muodostuneita hybridisaatikomplekseja analysoimalla. Menetelmää voidaan käyttää esimer-20 kiksi jonkin muun mecA-negatiivisen stafylokokin kuin S. aureuksen, jonkin muun mecA-positivisen stafylokokin kuin S. aureuksen, mecA-positiivisen S. aureuksen ja/tai mecA-negatiivisen S. aureuksen aiheuttaman infektion tai kontaminaation määrittämiseen näytteestä.
mecA-spesifisten koettimien käyttäminen yhdessä sellaisten baktee-25 risuku- tai bakteerilajispesifisten koettimien kanssa, jotka on suunniteltu hybridi disoitumaan topoisomeraasien gyrB/parE geenialueelle, joka on huomattavasti
O
<m varioivampi kuin esimerkiksi aikaisemmin bakteeridiagnostiikassa käytetty o 16S/23S rRNA -geenialue, mahdollistaa metisilliiniresistenssin ja infektioita ai- g heuttavien bakteerien samanaikaisen havaitsemisen. Näin ollen esillä olevan x 30 keksinnön mukainen menetelmä ei kärsi tunnetun tekniikan ongelmista. Mene telmään sisällytetty monistusvaihe aikaansaa korkean herkkyyden. Laajakirjoi-g set alukkeet monistavat tehokkaasti gyrB/parE-geenialuetta fylogenettisesti ehto laisista bakteerilajeista riippumatta siitä, onko kyseessä gram-negatiivinen vai ^ gram-positiivinen bakteerilaji. Yhtäaikainen mecA:n monistaminen antaa tietoa 35 tunnistettujen bakteerien metisilliiniresistenssistä.
Topoisomeraasigeenit gyraasi B (gyrB) ja parE sisältävät lajispesifi- 8 siä hypervarioivia alueita, joita voidaan käyttää eri bakteerilajien tunnistukseen. Keksinnön mukaisessa menetelmässä gyrB/parE-geeniä käytetään Staphylo-coccus-lajien tunnistamiseen. Tämä saadaan aikaan monistamalla näytteen bakteeriperäistä hypervarioivaa gyrB/parE-geenialuetta käyttäen alukkeita, jot-5 ka käsittävät mainittua hypervarioivaa aluetta ympäröivien konservoituneiden geenialueiden kanssa hybridisoituvia sekvenssejä, ja tunnistamalla monistunut geenialue suku- tai lajispesifisten koettimien avulla.
Stafylokokkien hypervarioivan gyrB/parE-geenialueen monistaminen voidaan toteuttaa käyttäen vähintään yhtä laajakirjoista alukettä tai laajakirjois-10 ten alukkeiden seosta, joka käsittää sekvenssinumeroissa 1 tai 2 esitetyn sekvenssin. Monistaminen voidaan myös toteuttaa käyttäen aluketta, joka käsittää vähintään yhden sekvenssinumerossa 1 esitetyn sekvenssin ja toista aluketta, joka käsittää vähintään yhden sekvenssinumerossa 2 esitetyn sekvenssin. Joissakin suoritusmuodoissa käytetään vähintään yhtä S. auraus -spesifistä 15 aluketta S. aurauksen hypervarioivan gyrBIparE-geenialueen monistuksen tehostamiseen. Erään erityisen suoritusmuodon mukaan mainittu S. aureus -spesifinen aluke valitaan sekvenssinumeroiden 3 ja 4 muodostamasta ryhmästä. Eräässä toisessa suoritusmuodossa monistamiseen käytetään molempia S. aureus -spesifisiä alukkeita.
20 Esillä olevan keksinnön mukainen menetelmä käsittää stafylokokki en havaitsemisen ja tunnistamisen vähintään yhdellä sukuspesifisellä koetti-mella (sekvennsinumerot 26 - 33), joka on suunniteltu hybridisoitumaan stafy-lokokkilajien hypervarioivaan gyrB/parE-geenialueeseen. Eräässä keksinnön mukaisessa suoritusmuodossa stafylokokkilajien tunnistamiseen käytetään vä-25 hintään yhtä koetinta, joka käsittää sekvenssin, joka on valittu sekvenssinumeroiden 26 - 33 muodostamasta ryhmästä. Nämä sukutason koettimet suunnitel-^ tiin tunnistamaan kaikki muut stafylokokkilajit kuin S. aureus. Eräissä muissa ™ suoritusmuodoissa tunnistamiseen käytetään useampaa kuin yhtä mainittua
OJ
o sukuspesifistä koetinta.
o 30 Tehokas mikrobilääkehoito edellyttää S. aureuksen ja muiden stafy- ^ lokokkilajien erottamista toisistaan. Menetelmä käsittää siten S. aureuksen ha-
CL
vaitsemisen ja tunnistamisen sellaisella lajispesifisellä koettimella, joka on § suunniteltu hybridisoitumaan S. aureuksen hypervarioivaan gyrB/parE-
lO
§ geenialueeseen. Eräässä suoritusmuodossa S. aureuksen havaitsemiseen ja ^ 35 tunnistamiseen käytetään vähintään yhtä koetinta, joka käsittää sekvenssin, joka on valittu sekvenssinumeroiden 13-20 muodostamasta ryhmästä.
9
Koska S. epidermidis on yleisin kliinisissä laboratorioissa eristetty CoNS, menetelmä voi mahdollisesti käsittää myös S. epidermidiksen lajispesifisen tunnistamisen. Tämä voidaan saada aikaan käyttäen spesifisiä koet-timia, jotka on suunniteltu hybridisoitumaan S. epidermidiksen hypervarioivaan 5 gyrB/parE-geenialueeseen. Eräässä suoritusmuodossa S. epidermidiksen havaitsemiseen ja tunnistamiseen käytetään vähintään yhtä koetinta, joka käsittää sekvenssin, joka on valittu sekvenssinumeroiden 21 - 25 muodostamasta ryhmästä.
Keksinnön mukainen menetelmä käsittää lisäksi näytteen metisilliini-10 resistenssiyden määrittämisen mecA-geenin avulla. Ensin mecA-geeni monistetaan käyttäen sopivia alukkeita. Eräässä suoritusmuodossa monistamiseen käytetään vähintään yhtä aluketta, joka käsittää sekvenssin, joka on valittu sekvensseistä 5 ja 6. Eräissä muissa suoritusmuodoissa monistamiseen käytetään ensimmäistä aluketta, joka käsittää sekvenssinumerossa 5 esitetyn sek-15 venssin ja toista aluketta, joka käsittää sekvenssinumerossa 6 esitetyn sekvenssin. Mahdollisesti monistunut mecA-geeni havaitaan sitten käyttäen vähintään yhtä sellaista mecA-spesifistä oligonukleotidikoetinta, joka käsittää sekvenssinumerossa 11 esitetyn sekvenssin. Eräässä suoritusmuodossa mainittu havaitseminen toteutetaan lisäksi vähintään yhdellä koettimella, joka käsittää 20 sekvenssin, joka on valittu sekvenssinumeroiden 7 - 10 ja 12 muodostamasta ryhmästä.
Tässä yhteydessä termiin "näyte” kuuluu erityyppisiä näytteitä mukaan lukien bakteeri- ja soluviljelmät, ruokanäytteet, maanäytteet, biologiset nesteet ja kliiniset näytteet kuten kudospalat, eritenäytteet (kuten yskös- tai si-25 velynäytteet), verinäytteet tai muut sopivat näytteet, jotka on saatu potilaasta, jolla epäillään olevan jokin tulehdussairaus. Analysoitava näyte on erityisesti ^ kliinisiin diagnostisiin sovelluksiin sopiva positiivinen veriviljelynäyte.
^ Sellaisessa erityisessä suoritusmuodossa, jossa analysoitava näyte
C\J
o on S. aurauksen puhdasviljelmä, hypervarioiva gyrBIparE-geenialue momste- o 30 taan käyttäen S. aureus -lajispesifisiä alukkeita, kuten sekvenssinumeroissa 3 g ja 4 kuvattuja alukkeita, jotka hybridisoituvat mainittujen gyrBIparE-geenien
CL
konservoinneille alueille. Tällaisessa suoritusmuodossa voidaan hybridisaatio § stafylokokkisukuspesifisillä koettimilla jättää toteuttamatta.
LO
§ Alan ammattilainen ymmärtää, että menetelmää voidaan helposti oj 35 laajentaa saattamalla monistettu DNA kosketuksiin muiden, monistetulle gyrBIparE-geenialueelle hybridisoituvien laji- tai sukuspesifisten koettimien 10 kanssa. Menetelmä voi myös käsittää lisävaiheita kuten pesu- ja inkubaatio-vaiheita.
Keksinnön mukaisessa menetelmässä voidaan gyrB/parE- ja mecA-geenit monistaa samanaikaisesti esimerkiksi PCR-reaktion avulla. Ennen mo-5 nistamista DNA voidaan eristää analysoitavasta näytteestä millä tahansa tunnetulla menetelmällä, kuten kaupallisesti saatavilla olevilla DNA:n eristyspak-kauksilla (esim. Roche High Pure PCR Template Preparation Kit, BD Biosciences Clontech NucleoSpin®, tai Qiagen QIAamp® DNA Mini-kit,) tai perinteisillä fenoli-kloroformilla tai vastaavilla orgaanisilla liuottimilla tehtävillä uutoilla, joko 10 manuaalisesti tai erityisillä DNA:n eristykseen soveltuvilla laitteilla. Edullisesti DNA:n eristykseen käytetään automatisoituja näytteenvalmistusalustoja (esim. bioMerieux NucIiSENS® easy-MAG™) niiden helpon saatavuuden, nopeuden ja toistettavuuden vuoksi. DNA voidaan saada myös suoraan analysoitavasta näytteestä ilman erillistä eristysvaihetta.
15 Yksinauhaisen kohdejuosteen aikaansaamiseksi voidaan käyttää mitä tahansa sopivaa menetelmää kuten epäsymmetristä PCR:ää tai eksonuk-leaasikäsittelyä. Keksintö käsittää myös sovelluksia, joissa hybridisaatioreakti-oon voidaan käyttää kaksijuosteista PCR-tuotetta.
Esillä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä voidaan leima-20 tun kohdejuosteen aikaansaamiseksi käyttää useita tunnettuja leimausmene-telmiä, kuten fluorerenssileimoja (esim. Cy5, Cy3, Cy2, TexasRed, FITC, Alexa 488, TMR, FluorX, ROX, TET tai HEX), radioaktiivisia leimoja (esim. 32P, 33P tai 33S), kemiluminesoivia leimoja (esim. HiLight Single-Color Kit) ja kolorimet-ristä havaitsemista (esim. biotiini-streptaviini-entsyymikonjugaatteja). Keksintö 25 käsittää myös sovelluksia, joissa leimaa ei tarvita lainkaan, kuten sellaisia, joissa nukleiinihappojen havaitseminen perustuu sähköiseen impulssiin (esim.
^ Motorolan eSensor™).
^ Esillä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä DNA:n monis- C\| o tukseen käytettävät reagenssit voivat olla mitä tahansa DNA:n monistukseen o 30 tavallisesti käytettyjä reagensseja, jotka alan ammattimiehet hyvin tuntevat.
g Sopivia ja edullisia kaupallisesti saatavissa olevia reagensseja ovat erityyppi-
CL
set DNA-polymeraasit ja niiden puskurit (esim. AmpliTaqGOLD™, AmpliTaq® § LD, DyNAzyme™, TaqPlus® Precision ja HotStartTaq®), nukleotidit tai valmiit
LO
§ nukleotidiseokset (esim. Sigma, Applied Biosystems tai Amersham Biosys- 35 tems), MgCh (jolloin yleensä käytetään saman valmistajan tuotetta kuin DNA-polymeraasi).
11
Monistukseen käytettävä laitteisto voi niin ikään olla mikä tahansa sopiva laitteisto (esim. Biometra® T1 Thermocycler, Applied Biosystems Ge-nAmp® PCR system 2700, tai Eppendorf Mastercycler®). Käytännössä voidaan käyttää kaikkia DNA-monistukseen sopivia laitteita ja laitteistoja ja monis-5 tus voidaan myös suorittaa manuaalisesti siirtämällä reaktioputkia lämpötilasta toiseen. Monistus voidaan myös tehdä suoraan biosirulla, joka sisältää erityisiä PCR-reaktioon tarkoitettuja kaivoja ja erityisen hybridisaatioalueen, johon koet-timet ja kontrollioligonukleotidit voidaan kiinnittää.
Tarvittaessa PCR-tuotteen puhdistus voidaan suorittaa millä tahan-10 sa kaupallisella menetelmällä (esim. Roche High Pure PCR Product Purification Kit, Amersham Biosciences MicroSpin™ S-400 tai S-300 HR -pylväät, tai Qiagen QIAquick® PCR-purification-Kit) tai se voidaan tehdä orgaanisella liuottimena tapahtuvalla uutolla. Monistustuotetta voidaan käyttää hybridisaatio-reaktioon myös sellaisenaan ilman puhdistus- tai uuttovaiheita.
15 Kun hybridisaatio tapahtuu kiinteällä kantajalla, hybridisaatiossa käytettävät koetti met voidaan kiinnittää kiinteän kantajan pintaan kovalenttisen tai ei-kovalenttisen sidoksen avulla. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää muita kemiallisia, sähkökemiallisia tai vastaavia kiinnitysmenetelmiä. Alusta tai tuki, jolle koettimet kiinnitetään voi olla valmistettu lasista, muovista, polymeereistä, 20 metallista, nationista, nitroselluloosasta, polyakryyliamidista, silikonista, piiok-sidista, silikasta tai näiden yhdistelmistä, ja sen koko voi vaihdella muutamasta millimetristä muutamiin senttimetreihin. Käytettävän alustan pinta voi olla päällystetty aminosilaani- tai muulla soveltuvalla pintakäsittelyllä, kuten esimerkiksi epoksisilaanipintakäsittelyllä, tai vaihtoehtoisesti voidaan käyttää sellaista alus-25 taa, joka ei vaadi erillistä pintakäsittelyä. Edullisia alustoja oligonukleotidikoet-timille ovat lasi ja silikoni.
^ Syntetisoidut koettimet voidaan printata mikrosirualustan pintaan ™ millä tahansa kaupallisesti saatavilla olevalla ja tähän tarkoitukseen soveltuval-
C\J
o la laitteistolla (esim. Qarray-mini arraying system, Lucidea Array Spotter, Οπιο 30 niGrid® arrayer) tai ne voidaan pipetoida pinnalle manuaalisesti. Vaihtoehtoi- ^ sesti koettimet voidaan syntetisoida suoraan pinnalle sopivaa in situ -
CL
synteesimenetelmää kuten fotolitografiaa tai ink-jet-tekniikkaa käyttämällä.
o Hybridisaatiossa käytetty hybridisaatioseos voi olla koostumuksel le» § taan erilainen kuin mitä jäljempänä suoritusesimerkeissä on esitetty, esimer- 35 kiksi suolan koostumus ja/tai suolapitoisuus voivat vaihdella (esim. 2-4xSSC tai SSPE), tai hybridisaatiossa voidaan käyttää kaupallisesti saatavilla olevia 12 hybridisaatioliuoksia (esim. Sigma ArrayHyb™). Hybridisaatioseoksessa voidaan myöskin käyttää denaturoivia tai stabiloivia lisäaineita (esim. formamidi tai dimetyylisulfoksidi (DMSO)) tai aineita, jotka vähentävät epäspesifistä sitoutumista (esim. naudan seerumin albumiini (BSA) tai lohen maidin DNA). Hybri-5 disaatio voidaan tehdä eri hybridisaatiolämpötiloissa (yleensä välillä 40 - 70 °C) ja hybridisaatioon käytettävä aika voi vaihdella sovelluksesta riippuen muutamasta minuutista muutamaan vuorokauteen. Hybridisaatio voidaan vesihauteen asemesta tehdä esim. lämpökaapissa tai erityisessä hybridisaatiolaitteessa (esim. GeneTAC HybStation tai Lucidea Slidepro Hybridizer). Hybridisaa-10 tion jälkeiset pesut voivat myöskin vaihdella kestoltaan, tilavuudeltaan, lämpötilaltaan ja käytettävän pesuliuoksen koostumukselta ja siksi olla erilaiset kuin mitä esimerkkimenetelmässä on esitetty. Mikrosirujen pesu voidaan myös suorittaa erillisellä laitteella. Joissakin tapauksissa pesu ei ole välttämätön, vaan mikrosiru voidaan analysoida heti hybridisaation jälkeen. Edullisessa menetel-15 mässä hybridisaatio toteutetaan 53 - 58 °C:ssa erityisessä hybridisaatiolait-teessa tai lämpökaapissa noin 15-30 minuutin ajan.
Monistetun DNA:n ja tässä kuvattujen koettimien välille mahdollisesti muodostuneet hybridisaatiokompleksit voidaan havaita millä tahansa sopivalla menetelmällä, jolla normaaliolosuhteissa tapahtuva hybridisaatio voidaan 20 osoittaa, kuten Southern-blottauksella, Northern-blottauksella, kolonihybridi-saatiolla, in situ -fluoresenssihybridisaatiolla (FISH), sekvensoimalla ja RT-PCR-menetelmillä. Tällaiset menetelmät ovat alan ammattilaisten hyvin tuntemia ja ne voidaan toteuttaa sekä liuoksessa että DNA:ta sitovalla kiinteällä kantajalla, kuten nitroselluloosa- tai nylonkalvolla, tai lasilla tai silikonipohjaisel-25 la pinnalla.
Mikrosiru voidaan analysoida millä tahansa tähän tarkoitukseen so-^ veltuvalla laitteistolla tai lukijalla (esim. GeneTAC UC4, GenePix® Personal
O
^ 4100A, Agilent DNA Microarray Scanner, tai valonlähteestä ja kamerasta koos- o tuva lukija). Jos kohdejuoste on leimattu fluoresoivalla leimalla, voidaan ana- o 30 lysointiin käyttää myös esim. fluoresenssimikroskooppia. Jos leimana on käy- g tetty radioaktiivista leimaa, voidaan siru tai kalvo analysoida autoradiografialla.
CL
Jos hybridisaatio on tehty elektronisen mikrosirun pinnalla ja toteaminen perus-§ tuu siten sähköiseen havaitsemiseen, voidaan mikrosiru analysoida tätä tarkoi-
LO
§ tusta varten suunnitellulla erityisellä laitteistolla.
° 35 Keksinnössä käyttökelpoiset laajakirjoiset alukkeet (taulukkol; sek- venssinumerot 1 ja 2) suunniteltiin käyttäen EMBL:n julkisesta sekvenssitieto- 13 kannasta saatuja sekvenssejä tai niissä tapauksissa, joissa tällaisia sekvenssejä ei ollut saatavilla julkisista tietokannoista, ne tuotettiin itse kloonaamalla bakteerilajien gyrB/parE-geenisekvenssifragmentteja tai PCR:n avulla käyttäen alukkeita, jotka oli suunniteltu lähisukuisten bakteerilajien sekvenssien tai tie-5 tokannoista saatavien osittaisten sekvenssien perusteella.
Taulukko 1. Monistusreaktioon käytetyt laajakirjoiset alukkeet
Aluke Geeni Sekvenssi nro Sekvenssi 5!-> 3’
gB3F gyrB/parE 1 CGICCIGGKATGTAYATHGG
gB4R gyrB/parE 2 RMICCWACICCRTGYAGICCICC
Alukesekvensseissä I tarkoittaa inosiiniemästä; K tarkoittaa emästä G tai T; Y tarkoittaa emästä C tai T; H tarkoittaa emästä A tai C tai T; R tarkoittaa emästä A tai G; M tarkoittaa emästä A tai C; ja W tarkoittaa emästä A tai T.
10 Keksinnössä käyttökelpoiset laajakirjoiset alukeseokset koostuvat useista eri alukevaihtoehdoista. Esim. alukesekvenssinumeron 1 tapauksessa seoksessa on siis alukkeita, joissa K tarkoittaa G:tä (guaniini) tai K tarkoittaa T:tä (tyrniini).
Kaikkein onnistunein puhtaan bakteeri-DNA:n monistuminen saatiin aikaan yhdellä monista erilaisin laboratoriokokein testatuista eri alukepariseok- 15 sista. Kaikkien testattujen bakteerien gyrB/parE-geenejä onnistuttiin monistamaan alukeseoksella (taulukko 4). Näin ollen alukkeet toimivat bakteerien universaaleina eli laajakirjoisina alukkeina. Spesifisyys- ja herkkyyskokeissa käytettiin kasvatuskokoelmista (ATCC ja DSM) peräisin olevia bakteerilajeja sekä kliinisiä näytteitä.
20 Tässä tekstissä kuvataan lisäksi S. aureus -spesifistä alukkeita, jot ka hybridisoituvat S. aureuksen topoisomeraaseja gyrB/parE koodaavien geenien konservoituneille alueille (taulukko 2; sekvenssinumerot 3 ja 4). Nämä ^ alukkeet suunniteltiin, kuten edellä on kuvattu laajakirjoisten alukkeiden osalta.
o
CM
cm Taulukko 2. S. aureus-spesifiset alukkeet g Aluke Geeni Sekvenssi Sekvenssi 5’~> 3’ x _________________________________________________________________ nro_______;
SaureusF gyrB/parE 3 AG ACCT G GTATGTATATT G G
§ SaureusR gyrB/parE 4 CCAACACCATGTAAACCACC
tn ................................................................................. .......... ...........................
g 25 Lisäksi tässä tekstissä kuvataan alukkeita, jotka kykenevät monis-
O
^ tamaan mecA-geeniä (taulukko 3; sekvenssinumerot 5 ja 6). Nämä alukkeet suunniteltiin, kuten edellä on kuvattu laajakirjoisten alukkeiden osalta, mutta 14 gyrB/parE-geenisekvenssien sijasta käytettiin useista stafylokokkilajeista peräisin olevia mecA-geenejä.
Taulukko 3. mecA-spesifiset alukkeet Aluke Geeni Sekvenssi Sekvenssi 5’ 3’ ; _____________I_________________________; nro___ ___________________________________
mecAF mecA 5 AATACAATCGCACATACATTAATA
mecAR mecA 6 TTACTCATGCCATACATAAATGGATAG ACG
Edellä kuvatut laajakirjoiset alukkeet, S. aureus-spesifiset alukkeet 5 sekä mecA-alukkeet voivat sisältää oligonukleotidianalogeja kuten peptidinuk-leiinihappoja (PNA), tai modifioituja emäksiä sisältäviä oligonukleotideja. Alukkeet voivat koostua vastaavissa sekvenssinumeroissa esitetyistä nukleotidise-kvensseistä tai ne voivat käsittää ylimääräisiä nukleotidejä. Alukkeilla ei myöskään tarvitse olla täsmälleen sama sekvenssi kuin templaattinukleiinihapolla, 10 mutta sen pitää olla riittävän komplementaarinen hybridisoituakseen templaat-tiin ja säilyttääkseen gyrB/parE-alueen monistuskyvyn. Aiukkeisiin voi myös olla liitettynä erilaisia kemiallisia yhdisteitä tai ryhmiä (esim. aminoryhmiä) tai muita molekyylejä, kuten leimoja, tai niistä voi kokonaan puuttua modifikaatiot. Luonnollisesti näiden oligonukleotidisekvenssien käänteiset ja komplementaa-15 riset sekvenssit ovat yhtä käyttökelpoisia, kuten alan ammattimiehelle on ilmeistä. Jokainen spesifinen sekvenssinumero tarkoittaa siis myös sen käänteistä tai komplementaarista sekvenssiä. Samoin mainittujen oligonukleotidisekvenssien toiminnalliset fragmentit ovat käyttökelpoisia alukkeina. Tässä yhteydessä termi ’’toiminnallinen fragmentti” tarkoittaa myös sellaisia modifioituja 20 tai modifioimattomia lyhennettyjä nukleotidisekvenssejä, jotka kykenevät hybri-disoitumaan kohde-DNA:han ja aloittamaan sen monistamisen.
^ Sukuspesifisten stafylokokkikoettimien sekä S. aureus o ™ lajispesifisten ja S. epidermidis -lajispesifisten oligonukleotidikoettimien suun- 0 nittelussa käytettiin linjaukseen perustuvaa suunnittelustrategiaa. Suunnittelun § 25 kohteena olleiden bakteerilajien gyrB- tai parE-geenit linjattiin suunnittelun ul- 1 kopuolella olevista bakteereista lähtöisin olevien vastaavien geenien kanssa. Sekvenssit saatiin EMBL:n julkisesta sekvenssitietokannasta tai niissä tapauk- 2 sissa, joissa tällaisia sekvenssejä ei ollut saatavilla julkisista tietokannoista, ne g tuotettiin itse kloonaamalla bakteerilajien gyrB/parE- ^ 30 geenisekvenssifragmentteja tai PCR:n avulla käyttäen alukkeita, jotka oli suunniteltu lähisukuisten bakteerilajien sekvenssien tai tietokannoista saatavi- 15 en osittaisten sekvenssien perusteella. Oligonukleotidikoettimien spesifisyys testattiin laboratorio-olosuhteissa sekä useilla eri bakteerilajeista eristetyillä puhtailla DNA-näytteillä että kliinisillä potilasnäytteillä (taulukko 4).
Taulukko 4. Suku- ja lajispesifisten koettimien ja alukkeiden suunnitte-5 lussa ja testauksessa käytetyt stafylokokkilajit | Stafylokokkilajit j Toimittajan koodi (näytteen tyyppi) | S. aureus j ATCC 29247, ATCC 51153, ATCC 49333, ATCC 43300 S. capitis | ATTC 27840, ATCC 27842................................................................................
S. cohnii_____________________________________j ATCC 29972, ATCC 29974 .................................................................= .
...... ............................. ATCC155-U__________________________________________________________^ i.MiM§£W.9!XtjGU8^.................................... DSM 20263_______________^sssss„_____________ iS: hpminis ATCC 25615, ATCC27844_________________________________________________.
i S. intermedius ___________________________ ATCC 29663 i S. lugdunensis_______________________ DSM 4805____________ j S. saccharolyticus ATCC 14953 ^ S. scM.... ............ ......ATCC 29060, ATCC 29062, ATCC 29059_____________________________________ S. warned _ __ I ATCC 17917, ATCC 27836, ATCC 27837, ATCC 25614 S. xyiosus IATCC35033 .................________
Esillä oleva keksintö koskee lisäksi mecA-geenin sisältävien stafylo-kokkikantojen linjauksen perusteella suunniteltuja mecA-spesifisiä oligonukle-otidikoettimia, jotka käsittävät sekvenssinumerossa 11 esitetyn sekvenssin (taulukko 5; sekvenssinumero 11). Lisäksi tässä tekstissä kuvataan muita melo cA-spesifisiä oligonukleotidikoettimia (taulukko 5; sekvenssinumerot 7 - 10 ja 12). Nämä koettimet suunniteltiin, kuten edellä on kuvattu gyrBIparE- ^ koettimien osalta.
o
CM
cm Taulukko 5. mecA-koettimet g | Sekvenssi nro; Sekvenssi (5-3')
£ I___________________________7____________________________________ TGATTATGGCTCAGGTACTGC
^ f 8 I TGGCTCAGGTACTGCTATCCA J
§ I_____________9____________________________________| TACTGCTATCCACCCTCAAAC_______________________________________!
o ______________________________________10___________________ | ATTAGCACTTGTAAGCACACC
I 11 __ [ TAACAACATGAAAAATGATTATGGCT___________________________ 1 _________12 1 CCTCAAACAGGTGAATTATTAGCA...................................: 16
Keksinnössä käyttökelpoisiin, monistettuun gyrB/parE-geenialueeseen hybridisoituviin koettimiin lukeutuu taulukossa 6 kuvatut koet-timet.
Taulukko 6. gyrB/parE-koettimet
Sekvenssi Geeni Spesifisyys Sekvenssi (5-3') nro:________________________________________________ : ....................... <
13 gyrBS. aureus AATAGTATCGATGAAGCATTAGCTG
14 gyrB S. aureus AACGGACC3TGGTATCCCAGT
15 gyrB \ S. aureus GGACGTGGWCCCAGTTGATAT
16 gyrB S. aureus TCCAGCTC3TCGAAC3TTATTTTAA
17 gyrB χ JS. aureus CTGTCGAAGTTATTTTAACTGTTT
18 parE;; S. aureus GTAAACCGACAGTCGAAGTTATC
19 parES; aureus CGTGGTATGCCAACAGGTAT
20 parE S. aureus GTATTTCTATAGAAGATAATGGAC
21 gyrB epiderfnidis TAGTCATATTGAAGTTRTAATTGAG
22 gyrB s. epiderrn|dis gccctgctgtcgaagttatc
23 i gyrB S, efSidefmidfe CATTAGCAGGTTATGCTAGTCATA
24 gyrB S. epidermidis ACGCCCTGCTGTCGAAGTTA
25 parE S. epidermidis TGGTTATGGTGATGCGATTACAGT
26 gyrB S. suku GGCATTCCTGTTGATATTCAAGA
^ 27 gyrB : S: suku TCAACTTCAGAAAAAGGTTTACA
δ 28 gyrB S. suku TCAACTTCAGAAAGAGGTTTGCA
c(j 29 gyrB S. suku GTTGATAATAGTATTGACGAAGC
^ 30 gyrB S. suku ; CGCCCAGCAGTTGAAGTTATCT
° 31 gyrB S. suku CCAGCAGTTGAAGTTATCTTAAC
£ 32 gyrB S. suku CCAGCAGTTGAGGTTATTTTAA
^ 33 gyrB S. suku GGGGCGCCCAGCAGTTGAA
S 5 Sekvenssinumerossa 21 R tarkoittaa emästä A tai G.
00 o Esillä olevassa keksinnössä käyttökelpoiset koettimet voivat koos tua vastaavissa sekvenssinumeroissa esitetyistä nukleotiisekvensseistä tai ne voivat käsittää ylimääräisiä nukleotideja. Ne voivat siten olla eripituisia, ja näi- 17 den oligonukelotidikoettimien haluttu spesifisyys sekä toimivuus määrittävät niiden sopivan pituuden hybridisaatioreaktioissa. Keksinnön mukaisten oligo-nukleotidikoetinsekvenssien pituus on edullisesti 15-60, edullisemmin 15-40 ja edullisimmin 20 - 30 nukleotidiä. Koettimet voivat myös olla eri tavoin modi-5 fioituja (niissä voidaan esimerkiksi käyttää oligonukleotidianalogeja, kuten pep-tidinukleiinihappoja (PNA), tai modifioituja emäksiä sisältäviä oligonukleotideja) kunhan ne säilyttävät lajispesifisyytensä. Koettimiin voi myös olla liitettynä erilaisia kemiallisia yhdisteitä tai ryhmiä (esim. aminoryhmiä) tai muita molekyylejä, kuten erilaisia detektioon tarvittavia leimoja, tai niistä voi kokonaan puuttua 10 modifikaatiot. Luonnollisesti näiden oligonukleotidisekvenssien käänteiset ja komplementaariset sekvenssit ovat yhtä käyttökelpoisia, kuten alan ammattimiehelle on ilmeistä. Jokainen spesifinen sekvenssinumero tarkoittaa siis myös sen käänteistä tai komplementaarista sekvenssiä. Samoin mainittujen oligonukleotidisekvenssien toiminnalliset fragmentit ovat käyttökelpoisia alukkeina. 15 Tässä yhteydessä termi ’’toiminnallinen fragmentti” tarkoittaa myös sellaisia modifioituja tai modifioimattomia lyhennettyjä nukleotidisekvenssejä, jotka kykenevät hybridisoitumaan kohdebakteeriin ja siten säilyttävät muuttumattoman lajispesifisyyden.
Esillä oleva keksintö antaa lisäksi käyttöön edellä kuvatussa mene-20 telmässä käyttökelpoisen testipakkauksen. Tämä testipakkaus käsittää vähintään yhden gyrB/parE-spesifisen alukkeen, vähintään yhden mecA-spesifisen alukkeen, vähintään yhden S. aureus -lajispesifisen gyrS/parE-koettimen, ja vähintään yhden mecAspesifisen oligonukleotidikoettimen, joka käsittää sek-venssinumerossa 11 esitetyn sekvenssin. Testipakkauksessa käyttökelpoiset 25 spesifiset alukkeet ja koettimen on kuvattu edellä.
T- Esimerkki 1. Stafylokokki aureuksen ja mecA-geenin havaitseminen ^ Metisilliiniresistentin Staphylococcus aureus -bakteerin (MRSA) i o puhdasviljelmästä eristetty DNA monistettiin käyttäen alla kuvattua menetel- i § mää.
x 30 DNA eristettiin analysoitavasta näytteestä käyttäen nukleiinihap- poeristysrobottia (Nuclisens® easyMAG™, bioMeriex, Ranska). DNA:n eristäni misen jälkeen haluttu kohde monistettiin PCR:n avulla. Ensin valmistettiin reak- S tioseos. Tämä PCR-reaktioseos sisälsi 1 μΜ gB3F-alukeseosta (sekvenssinu- ^ mero 1; tilattu yritykseltä Thermo Electron, USA), 1 μΜ Cy5-leimattua gB4R- 35 alukeseosta (sekvenssinumero 2; tilattu yritykseltä Thermo Electron, USA), 0,25 μΜ mecAalukettä (sekvenssinumero 3), 0,25 μΜ Cy5-laimattua mecA- 18 alukettä (sekvenssinro 4), 0,165 μΜ S. aureus -spesifistä aiuketta (sekvenssi-numero 5), 1 x Hot Start Taq® PCR -puskuria (Qiagen, Saksa), johon oli lisätty MgCI2:a siten, että lopullinen konsentraatio oli 2,0 mM, 300 μΜ kutakin dATP, dGTP, dCTP ja dTTP (Finnzymes, Suomi), 1,5 g/l BSA (EuroCIone, italia), 5 0,125 U/μΙ Hot Start Taq® DNA-polymeraasia (Qiagen, Saksa) ja 1,5 μΙ eristet tyä DNA:ta kokonaistilavuudessa 15 μΙ.
PCR suoritettiin PCR-laitteessa (Mastercycler®, Eppendorf, Saksa). Käytettiin seuraavanlaista PCR-ohjelmaa: 15 min denaturaatiovaihe lämpötilassa 95°C, 36 sykliä 20 s lämpötilassa 95°C, 35 s lämpötilassa 52°C, 20 s 10 lämpötilassa 72°C, minkä jälkeen 10 sykliä 10 s lämpötilassa 95°C ja 30 s lämpötilassa 67°C sekä lopuksi 5 sykliä 10 s lämpötilassa 95°C ja 30 s lämpötilassa 69°C. PCR:n jälkeen DNA:n monistumisen onnistuminen tarkastettiin geelielektroforeesilla 2-%:isessa agaroosigeelissä, joka sisälsi SYBR® Green ll:ta (Invitrogen, USA).
15 Monistetut kohteet hybridisoitiin silikonipohjaiselle biolastulle, johon koettimet oli kiinnitetty. Hybridisaatioreaktioseos sisälsi n. 50 - 100 ng leimattua kohdetta, 2xhybridisaatiopuskuria (koostumus: 1 PBS-tabletti, pH 7,4 (Sigma, USA), 0,7 M NaCI (Fluka, Sveitsi), 0,1 % Tween® 20 (100 %, Fluka, Sveitsi), 2xDenhardt’s (5x, Sigma, USA), 20 pg/ml lohen maidin DNA (dsDNA) 20 (Amersham, Yhdistynyt kuningaskunta)), hybridisaatiokontrollioligonukelotide-jä, ja steriiliä vettä. Reaktioseoksen tilavuus oli 25 μΙ. 2xHybridisaatiopuskuri esilämmitettiin 55 °C:seen ennen käyttöä. Hybridisaatioreaktioseos siirrettiin biolastun hybridisaatioalueelle. Hybridisaatioalue suljettiin puristimilla ja biolas-tu asetettiin erityiseen hybridisaatiolaitteeseen. Kymmenen minuutin hybridi-25 säätiön aikana lämpötilassa 55 °C Cy5-leimattu ssDNA-kohde sitoutui mikrosirulle immobilisoituihin komplementaarisiin koetinsekvensseihin muodosta- ^ en leimatun kaksinauhaisen rakenteen.
^ Hybridisaatiovaiheen jälkeen biolastu pestiin nopeasti hybridisoitu-
CM
9 mattoman DNA.n poistamiseksi. Pesuvaihe toteutettiin seuraavasti: 2,5 min 0 30 2xSSC-liuoksessa lämpötilassa 40 °C, ja 2,5 min 0,2xSSC-liuoksessa läm- 1 Potilassa 40 °C. Pesun jälkeen biolastut kuivattiin. Biolastut analysoitiin LED-valolähteestä ja CCD-kamerasta koostuvalla optisella lukijalaitteella. Havait- cj seminen perustuu Cy5-leimatun geenituotteen vapauttamaan ja kameran van- § gitsemaan fluoresoivaan signaaliin. Kuviossa 1 on esitetty esimerkki S. aure- o ^ 35 uksen ja mecA-geenin havaitsemista havainnollistavista hybridisaatiotuloksis- ta. Hybridisaatiota ei havaittu Staphylococcus-sukuspe$\fi$e\\ä koettimella 19 osoittaen, että potilaalla oli MRSA-infektio. Tunnistus oli linjassa veriviljelystä saatujen tulosten kanssa. Tulokset osoittavat siten metisilliiniresistentin Staphylococcus aurauksen nopean tunnistuksen.
Esimerkki 2. Stafylokokkien ja mecA-geenin havaitseminen 5 Staphylococcus haemolyticus -bakteerin puhdasviljelmästä eristetty DNA monistettiin ja hybridisoitiin mikrosirulle esimerkissä 1 kuvattua menetelmää käyttäen.
Tulokset paljastivat Staphylococcus-sukuspesifisen koettimen sekä mecA-geenikoettimien hybridisoitumisen. Hybridisaatiota ei havaittu S. auraus 10 -lajispesifisellä koettimella (kuvio 2). Tunnistus oli linjassa bakteeriviljelmän alkuperäisen tunnistuksen kanssa. Tulosten perusteella voitiin siis päätellä, ettei erityistä MRSA-hoitoa tarvittu.
Alan ammattilaiselle on ilmeistä, että tekniikan kehittyessä keksinnön ajatusta voidaan toteuttaa eri tavoin. Keksintö ja sen suoritusmuodot eivät 15 rajoitu edellä kuvattuihin esimerkkeihin vaan se voi vaihdella vaatimusten puitteissa.
δ
CM
CM
O
05
O
X
cc
CL
O
LO
00 o o
CM
Claims (25)
1. Menetelmä metisilliiniresistenttien Staphylococcus-\ä\\en havaitsemiseksi ja tunnistamiseksi näytteestä käsittäen vaiheet, joissa: a) monistetaan näytteestä peräisin oleva DNA käyttäen ensimmäis-5 tä alukeparia, joka hybridisoituu topoisomeraaseja gyrB ja parE koodaavien geenien konservoituneille alueille, ja toista alukeparia, joka hybridisoituu me-cA-geeniin; ja b) saatetaan monistettu DNA hybridisaatio-olosuhteissa kosketukseen 10 i) vähintään yhden stafylokokkisukuspesifisen, monistetulle gyrB- tai parE-geenialueelle hybridisoituvan oligonukleotidikoettimen kanssa, ii) vähintään yhden S. aureus-spesifisen, monistetulle gyrB- tai pa-rE-gee n (alueelle hybridisoituvan oligonukleotidikoettimen kanssa, ja iii) vähintään yhden mecA-spesifisen oligonukleotidikoettimen, joka 15 käsittää sekvenssinumerossa 11 esitetyn sekvenssin, kanssa; ja c) havaitaan mahdollisen hybridisaatiokompleksin muodostuminen.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, joka lisäksi käsittää monistetun DNA:n saattamisen kosketukseen vähintään yhden S. epidermidis -lajispesifisen, monistetulle gyrB- tai parE-geeniaiueelle hybridisoituvan oligo- 20 nukleotidikoettimen kanssa.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, jossa mainittu koetin käsittää sekvenssin, joka on valittu sekvenssinumeroiden 21 - 25 ja niiden komplementaaristen tai käänteisten sekvenssien muodostamasta ryhmästä.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa mainittu en-25 simmäinen alukepari käsittää vähintään yhden sekvenssinumerossa 1 tai 2 T: esitetyn sekvenssin tai niiden komplementaarisen tai käänteisen sekvenssin. o
™ 5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa mainittu toi- o nen alukepari käsittää vähintään yhden sekvenssin, joka on valittu sekvenssi- § numerosta 5 ja 6 ja niiden komplementaarisista tai käänteisistä sekvensseistä, x 30
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa mainittu sta- fylokokkisukuspesifinen koetin käsittää sekvenssin, joka on valittu sekvenssi-§ numeroiden 26 - 33 ja niiden komplementaaristen tai käänteisten sekvenssien g muodostamasta ryhmästä.
° 7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa mainittu S. 35 aureus -lajispesifinen koetin käsittää sekvenssin, joka on valittu sekvenssinu- meroiden 13 - 20 ja niiden komplementaarisien tai käänteisten sekvenssien muodostamasta ryhmästä.
8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, joka käsittää lisäksi monistetun DNA:n saattamisen kosketukseen hybridisaatio-olosuhteissa vähin- 5 tään yhden sellaisen mecA-spesifinen koettimen kanssa, joka käsittää sekvenssin, joka on valittu sekvenssinumeroiden 7 - 10 ja 12 ja niiden komplementaaristen tai käänteisten sekvenssien muodostamasta ryhmästä.
9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa DNA:n monistaminen vaiheessa a) suoritetaan lisäksi vähintään yhdellä S. aureus - 10 spesifisellä alukkeella, joka hybridisoituu topoisomeraaseja gyrB ja parE koo-daavien geenien konservoituneille alueille.
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, jossa mainittu S. aureus -spesifinen aluke käsittää sekvenssin, joka on valittu sekvenssinume-rosta 3 ja 4 ja niiden komplementaarisista tai käänteisistä sekvensseistä.
11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa mainittu näyte on S. aureus -puhdasviljelmä ja mainittu ensimmäinen alukepari on valittu sekvenssinumerosta 3 ja 4 ja niiden komplementaarisista tai käänteisistä sekvensseistä.
12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, jossa vaihetta i) 20 ei suoriteta.
13. Minkä tahansa edeltävän patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, jossa mainitut oligonukleotidikoettimet on kiinnitetty kiinteään kantajaan.
14. mecA-spesifinen oligonukleotidikoetin, joka käsittää sekvenssi-numerossa 11 esitetyn nukleotidisekvenssin.
15. Testipakkaus, joka on tarkoitettu käytettäväksi patenttivaatimuk sen 1 mukaisessa menetelmässä ja joka käsittää ^ a) vähintään yhden gyrB- ja parE-spesifisen alukkeen ™ b) vähintään yhden mecA-spesifisen alukkeen (M 9 c) vähintään yhden S. aureus -lajispesifisen gyrB- tai parE- o 30 koettimen £ d) vähintään yhden mecA-spesifisen oligonukleotidikoettimen, joka CL käsittää sekvenssinumerossa 11 esitetyn sekvenssin, o
16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen testipakkaus, jossa mainittu LO § gyrB- ja parE-spesifinen aluke käsittää vähintään yhden sekvenssinumerossa cm 35 1 tai 2 esitetyn sekvenssin tai niiden komplementaarisen tai käänteisen sek- venssin, ja testipakkaus käsittää lisäksi vähintään yhden stafylokokkisukus-pesifisen gyrB- tai parE-koettimen.
17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen testipakkaus, jossa mainittu stafylokokkisukuspesifinen koetin käsittää sekvenssin, joka on valittu sekvens- 5 sinumeroiden 26 - 33 ja niiden komplementaaristen tai käänteisten sekvenssien muodostamasta ryhmästä.
18. Patenttivaatimuksen 16 mukainen testipakkaus, joka käsittää lisäksi vähintään yhden S. epidermidis -lajispesifisen gyrB- tai parE-koettimen.
19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen testipakkaus, jossa mainittu 10 gyrB- tai parE-koetin käsittää sekvenssin, joka on valittu sekvenssinumeroiden 21 - 25 ja niiden komplementaaristen tai käänteisten sekvenssien muodostamasta ryhmästä.
20. Patenttivaatimuksen 15 mukainen testipakkaus, jossa mainittu gyrB- ja parE-spesifinen aluke on S. aureus -lajispesifinen aluke, joka käsittää 15 sekvenssin, joka on valittu sekvenssinumerosta 3 ja 4 ja niiden komplementaarista tai käänteisistä sekvensseistä.
21. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 16 - 19 mukainen testipakkaus, joka käsittää lisäksi vähintään yhden S. aureus -lajispesifisen, gyrB- ja parE-spesifisen alukkeen, joka käsittää sekvenssin, joka on valittu sekvenssi- 20 numerosta 3 ja 4 ja niiden komplementaarista tai käänteisistä sekvensseistä.
22. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 15-21 mukainen testipakkaus, jossa mainittu S. aureus -lajispesifinen gyrB- tai parE-koetin käsittää sekvenssin, joka on valittu sekvenssinumeroiden 13-20 ja niiden komplementaaristen tai käänteisten sekvenssien muodostamasta ryhmästä.
23. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 15-22 mukainen testipak kaus, jossa mainittu mecA-spesifinen aluke käsittää sekvenssin, joka on valittu ς sekvenssinumerosta 5 ja 6 ja niiden komplementaarisista tai käänteisistä sek- ™ vensseistä. CM
24. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 15-23 mukainen testipak- o 30 kaus, jossa mainittu mecA-spesifinen oligonukleotidikoetin käsittää sekvenssin, | joka on valittu sekvenssinumeroiden 7 - 10 ja 12 ja niiden komplementaaristen tai käänteisten sekvenssien muodostamasta ryhmästä, o
25. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 15-24 mukainen testipak- § kaus, jossa mainitut alukkeet ja koettimet on sisällytetty biosirulle. o CM
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI20085041A FI121884B (fi) | 2008-01-17 | 2008-01-17 | Menetelmä metisilliiniresistenttien stafylokokkien havaitsemiseksi ja tunnistamiseksi sekä menetelmään tarkoitettu koetin ja testipakkaus |
| PCT/FI2009/050036 WO2009090310A1 (en) | 2008-01-17 | 2009-01-16 | Method of detecting and identifying staphylococci |
| EP20090702463 EP2240607B8 (en) | 2008-01-17 | 2009-01-16 | Method of detecting and identifying staphylococci |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI20085041 | 2008-01-17 | ||
| FI20085041A FI121884B (fi) | 2008-01-17 | 2008-01-17 | Menetelmä metisilliiniresistenttien stafylokokkien havaitsemiseksi ja tunnistamiseksi sekä menetelmään tarkoitettu koetin ja testipakkaus |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI20085041A0 FI20085041A0 (fi) | 2008-01-17 |
| FI20085041A FI20085041A (fi) | 2009-07-18 |
| FI121884B true FI121884B (fi) | 2011-05-31 |
Family
ID=39004341
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI20085041A FI121884B (fi) | 2008-01-17 | 2008-01-17 | Menetelmä metisilliiniresistenttien stafylokokkien havaitsemiseksi ja tunnistamiseksi sekä menetelmään tarkoitettu koetin ja testipakkaus |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP2240607B8 (fi) |
| FI (1) | FI121884B (fi) |
| WO (1) | WO2009090310A1 (fi) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2348042A1 (en) | 2001-06-04 | 2002-12-04 | Ann Huletsky | Sequences for detection and identification of methicillin-resistant staphylococcus aureus |
| US11834720B2 (en) | 2005-10-11 | 2023-12-05 | Geneohm Sciences, Inc. | Sequences for detection and identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) of MREJ types xi to xx |
| CN101918593B (zh) | 2007-12-21 | 2019-02-15 | 生物梅里埃股份有限公司 | 抗甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测 |
| US9394573B2 (en) | 2011-12-23 | 2016-07-19 | Biomerieux S.A. | Detection of mecA variant strains of methicillin-resistant Staphylococcus aureus |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3957338B2 (ja) | 1996-02-23 | 2007-08-15 | 株式会社カイノス | 診断薬 |
| US7135283B1 (en) * | 1998-11-17 | 2006-11-14 | Nanogen, Inc. | Topoisomerase type II gene polymorphisms and their use in identifying drug resistance and pathogenic strains of microorganisms |
| US7393636B2 (en) * | 2001-11-08 | 2008-07-01 | Sanko Junyaku Co., Ltd. | Method for forming self-assembly substance using oligonucleotide synthesized by gene amplification reaction, self-assembly substance and method for detecting gene |
| DE10244456A1 (de) * | 2002-09-24 | 2004-04-15 | Hain Lifescience Gmbh | Verfahren zum Nachweis und Differenzierung von Bakterien |
| FI113549B (fi) * | 2002-11-19 | 2004-05-14 | Mobidiag Oy | Diagnostinen menetelmä hengitystieinfektioita aiheuttavien bakteerien osoittamiseksi ja tunnistamiseksi ja menetelmässä käyttökelpoinen alukeseos |
| AU2004263824A1 (en) * | 2003-06-05 | 2005-02-17 | Wyeth | Nucleic acid arrays for detecting multiple strains of a non-viral species |
| JP2006271370A (ja) * | 2005-03-02 | 2006-10-12 | Kitasato Inst:The | 黄色ブドウ球菌とメチシリン耐性菌の検出方法及びキット |
| CN101248190A (zh) | 2005-08-26 | 2008-08-20 | 皇家飞利浦电子股份有限公司 | 检测微生物和抗生素抗性标记物的方法及其中所用的核酸寡核苷酸 |
| WO2007120808A2 (en) * | 2006-04-14 | 2007-10-25 | Biohelix Corporation | A method of asymmetric helicase-dependent amplification for probe-based detection of targets |
| KR100868765B1 (ko) * | 2006-09-29 | 2008-11-17 | 삼성전자주식회사 | 항생제 내성 박테리아의 표적 서열을 증폭시킬 수 있는프라이머 세트, 박테리아의 표적 서열에 특이적으로혼성화하는 프로브 세트, 상기 프로브 세트가 고정화되어있는 마이크로어레이 및 상기 프로브 세트를 이용하여박테리아의 존재를 검출하는 방법 |
-
2008
- 2008-01-17 FI FI20085041A patent/FI121884B/fi active IP Right Grant
-
2009
- 2009-01-16 WO PCT/FI2009/050036 patent/WO2009090310A1/en active Application Filing
- 2009-01-16 EP EP20090702463 patent/EP2240607B8/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2240607B8 (en) | 2015-05-06 |
| WO2009090310A1 (en) | 2009-07-23 |
| EP2240607B1 (en) | 2015-04-01 |
| FI20085041A0 (fi) | 2008-01-17 |
| FI20085041A (fi) | 2009-07-18 |
| EP2240607A1 (en) | 2010-10-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7205104B2 (en) | Identification of biological (micro) organisms by detection of their homologous nucleotide sequences on arrays | |
| Barken et al. | Advances in nucleic acid-based diagnostics of bacterial infections | |
| Rasooly et al. | Food microbial pathogen detection and analysis using DNA microarray technologies | |
| EP1788098A1 (en) | Design of capture molecules for the detection of amplicons with high sensitivity | |
| JP5851395B2 (ja) | 食中毒菌検出用担体、及び食中毒菌の検出方法 | |
| US7202026B2 (en) | Identification of a large number of biological (micro)organisms groups at different levels by their detection on a same array | |
| FI121428B (fi) | Laajakirjoisia alukkeita, testipakkaus ja menetelmä bakteerilajien havaitsemiseksi ja tunnistamiseksi | |
| Anthony et al. | DNA array technology and diagnostic microbiology | |
| EP1859053A2 (en) | Determination of antibiotic resistance in staphylococcus aureus | |
| FI121884B (fi) | Menetelmä metisilliiniresistenttien stafylokokkien havaitsemiseksi ja tunnistamiseksi sekä menetelmään tarkoitettu koetin ja testipakkaus | |
| EP1602735A2 (en) | Method and kit for the detection and/or quantification of homologous nucleotide sequences on arrays | |
| JP2007512021A5 (fi) | ||
| JP5916740B2 (ja) | 核酸標的の定量的多重同定 | |
| EP1565573B1 (en) | Nucleic acid probes and broad-range primers from regions in topoisomerase genes, and methods in which they are used | |
| US20080026370A1 (en) | Method For Geno-And Pathotyping Pseudomonas Aeruginosa | |
| US20100167956A1 (en) | Dna chip for detection of escherichia coli | |
| US20060281112A1 (en) | Design of capture molecules for the detection of amplicons with high sensitivity | |
| EP4130275A1 (en) | Primer set and probe for detecting staphylococcus argenteus | |
| US20100099860A1 (en) | Capture molecules for the detection of amplicons with high sensitivity | |
| WO2007132001A1 (en) | Design of capture molecules for the detection of amplicons with high sensitivity | |
| EP1529848B1 (en) | Substances, sequences and methods for identifying epidemic methicillin resistant Staphylococcus aureus strains | |
| US20070059714A1 (en) | Detection of presence and antibiotic susceptibility of enterococci | |
| EP2240608B1 (en) | Method of producing single-stranded dna | |
| EP2027289A1 (en) | Design of capture molecules for the detection of amplicons with high sensitivity |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Ref document number: 121884 Country of ref document: FI |