CN102229992B - 用于多种细菌的基因检测膜条及其引物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于多种细菌的基因检测膜条及其引物。选取10种常见细菌为检测对象，以16S rRNA基因为检测靶基因，设计10种常见细菌的检测探针及其配套引物。用硝酸纤维素薄膜条作为固定探针的基质，制成10种常见细菌的基因检测膜条。PCR扩增细菌的16SrRNA基因片段，生物素标记。PCR扩增片段与膜条杂交后，采用碱性磷酸酶标记的链亲和素检测生物素标记，然后NBT/BCIP显色。结果表明该膜条能单独检测10种细菌中的任何一种或几种。本发明成功研制了10种常见细菌的基因检测膜条，建立了用膜条检测细菌的方法，该方法具备高通量、快速、准确、成本较低的特点，并具有良好的临床应用前景。

Description

用于多种细菌的基因检测膜条及其引物

技术领域

本发明属于基因检测领域，具体涉及可用于多种细菌的基因检测膜条及其引物。

背景技术

病原菌引起的感染性、传染性疾病是威胁人类健康和造成社会恐慌的重要因素，快速准确地检测病原菌是有效预防和治疗感染性疾病的关键。常规的生理生化、血清学鉴定方法操作繁琐，周期长，而且某些病原菌培养困难。PCR、ELISA等方法虽然缩短了检测周期，但假阳性率高^[1，2]，。

基因芯片技术的兴起，使快速、微量、准确、高通量地检测病原菌成为可能^[3]。基因芯片检测病原菌选取的靶基因一般为16s rRNA、16S-23S rRNA、23s rRNA的基因等^[4]，标记基因的方法有Cy3或Cy5等荧光染料、生物素、地高辛等^[4，5]。目前，市场上应用的病原菌检测芯片多采用荧光标记，如天津生物芯片技术有限责任公司出品的系列病原菌检测芯片，北京博奥生物有限公司出品的晶

食源性致病菌检测试剂盒等。但是，采用荧光标记的基因芯片需要激光共聚焦微阵列扫描仪、基因芯片点样仪等贵重仪器^[6]，成本高，价格贵。

本研究选取10种常见细菌为研究材料，采用16s rRNA基因为检测靶基因，选择多态区设计探针，硝酸纤维素薄膜条作为固定探针的基质，利用生物素标记16s rRNA基因扩增片段，PCR扩增片段与膜条杂交后，SA-AP(streptavidin labled by alkaline phosphatase，碱性磷酸酶标记的链亲和素)检测生物素标记、NBT(nitroblue tetrazolium，硝基四氮唑蓝)/BCIP(5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate，5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸)显色的方法，建立起了一种快速、准确、成本较低的细菌检测方法，具有良好的临床应用前景。本研究对感染性疾病的预防、诊断、治疗具有重大的价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于多种细菌的基因检测膜条产品及其检测时所用的引物。建立起了一种快速、准确、成本较低的细菌检测方法，具有良好的临床应用前景。

一种用于多种细菌的基因检测膜条，包括用于扩增细菌的16S rRNA基因片段的一对引物：

250F：CCTACGGGAGGCAGCAGT；

1020R：CGGGACTTAACCCAACAT；

以及固定有如下所示序列探针中的一种或几种的硝酸纤维素薄膜条，所述探针序列如下：

大肠埃希菌检测探针：

TCC ACG GAA GTT TTC AGA GAT GAG AAT GTG CCT TCG GGA ACC GTG AGA CA

肠道沙门菌检测探针：

TCC ACA GAA CTT TCC AGA GAT GGA TTG GTG CCT TCG GGA ACT GTG AGA CA

粘质沙雷菌检测探针：

TCC AGA GAA CTT TCC AGA GAT GGA TTG GTG CCT TCG GGA ACT CTG AGA CA

阴沟肠杆菌检测探针：

TCC AGA GAA CTT AGC AGA GAT GGT TTG GTG CCT TCG GGA ACT CTG AGA CA

奇异变形杆菌检测探针：

TCC AGC GAA TCC TTT AGA GAT AGA GGA GTG CCT TCG GGA ACG CTG AGA CA

铜绿假单胞菌检测探针：

TGC TGA GAA CTT TCC AGA GAT GGA TTG GTG CCT TCG GGA ACT CAG ACA CA

鲍曼不动杆菌检测探针：

TAC TAG AAA CTT TCC AGA GAT GGA TTG GTG CCT TCG GGA ATC TAG ATA CA

枯草芽孢杆菌检测探针：

TCC TCT GAA AAC CCT AGA GAT AGG GCT TCT CCT TCG GGA GCA GAG TGA CA

溶血性葡萄球菌检测探针：

TCC TTT GAC CCT TCT AGA GAT AGA AGT TTC CCC TTC GGG GGA CAA AGT GA

金黄色葡萄球菌检测探针：

TCC TTT GAC AAC TCT AGA GAT AGA GCC TTC CCC TTC GGG GGA CAA AGT GA。

所述的引物1020R的5’端被生物素标记。

所述的硝酸纤维素薄膜条还固定有：

无序的核酸探针：

ATC TGA TGC TGC ATA CGT ACT GCA TCC GTA ACT GCA ATG GTA CTG TAG CC

细菌通用探针：

TGT CGT CAG CTC GTG YYG TGA RRT GTY GGS TTA AGT SCC RYA ACG AGCGC。

所述的细菌大肠埃希菌，肠道沙门菌，粘质沙雷菌，阴沟肠杆菌，奇异变形杆菌，铜绿假单胞菌，鲍曼不动杆菌，枯草芽孢杆菌，溶血性葡萄球菌，金黄色葡萄球菌中的一种或几种。

目前，市场上有检测细菌的基因芯片，但多为荧光标记^[7]；也有用于HPV分型的非荧光标记的基因芯片^[8-9]，但还没有检测临床标本中病原细菌的非荧光标记的基因芯片。一些同行尝试过用生物素或者地高辛标记的基因芯片检测病原菌^[5][10]，但并没有用到临床实践。由于荧光标记的基因芯片价格高，而非荧光标记的基因芯片又没有产品，所以目前各医院的检验科还是传统的镜检和生化的方法鉴定样本中的病原细菌的种类。本研究选用硝酸纤维素薄膜条作为固定探针的基质，采用生物素标记细菌16S rRNA基因的扩增片段，设计出新的通用引物，以及探针，建立起了一种快速、准确、成本较低的细菌检测方法，可以同时检测一种或多种细菌，具有良好的临床应用前景。

附图说明

图1为用于鉴定细菌的16S rRNA基因片段扩增

M：Marker；1：ddH₂O；2：大肠埃希菌；3：肠道沙门菌；4：粘质沙雷菌；5：阴沟肠杆菌；6：奇异变形杆菌；7：铜绿假单胞菌；8：鲍曼不动杆菌；9：枯草芽孢杆菌；10：溶血性葡萄球菌；11：金黄色葡萄球菌；

图2为用于核酸分子杂交的16S rRNA基因片段扩增

(A)通用引物250F、bio-1020R可以扩增10种细菌的16S rRNA片段。M：Marker；1：大肠埃希菌；2：肠道沙门菌；3：粘质沙雷菌；4：阴沟肠杆菌；5：奇异变形杆菌；6：铜绿假单胞菌；7：鲍曼不动杆菌；8：枯草芽孢杆菌；9：溶血性葡萄球菌；10：金黄色葡萄球菌；

(B)Biotin成功标记反向引物Bio-1020R；

图3为10种细菌检测膜条的探针排列顺序

Scrambling：无序的核酸探针；Universal：细菌通用探针；E.coli：大肠埃希菌的探针；S.enterica：肠道沙门菌的探针；S.marcescens：粘质沙雷菌的探针；E.cloacae：阴沟肠杆菌的探针；P.mirabilis：奇异变形杆菌的探针；P.aeruginosa：铜绿假单胞菌的探针；A.baumannii：鲍曼不动杆菌的探针；B.subtilis：枯草芽孢杆菌的探针；S.hominis：溶血性葡萄球菌的探针；S.aureus：金黄色葡萄球菌的探针；

图4为本发明膜条检测10种细菌

A：大肠埃希菌；B：肠道沙门菌；C：粘质沙雷菌；D：阴沟肠杆菌；E：奇异变形杆菌；F：铜绿假单胞菌；G：鲍曼不动杆菌；H：枯草芽孢杆菌；I：溶血性葡萄球菌；J：金黄色葡萄球菌；K：同时检测5种细菌——大肠埃希菌，肠道沙门菌，粘质沙雷菌，鲍曼不动杆菌，金黄色葡萄球菌。

具体实施方式

以下结合具体实施方式进一步说明本发明，而非限制本发明。

1材料与方法

1.1细菌

10种细菌：大肠埃希菌，肠道沙门菌，粘质沙雷菌，阴沟肠杆菌，奇异变形杆菌，铜绿假单胞菌，鲍曼不动杆菌，枯草芽孢杆菌，溶血性葡萄球菌，金黄色葡萄球菌属于常用菌株，购买于武汉的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)的非专利培养物的保藏库。

1.2细菌基因组DNA提取

1.2.1CTAB法提取细菌基因组DNA

接种菌株于LB液体培养基，37℃震荡培养过夜。次日，取1.5ml新鲜培养物，12000rpm离心2min。去上清液，加入567μl的TE缓冲液，震荡重新悬浮细菌。然后，加入30μl 10％SDS和15μl 20mg/ml蛋白酶K(革兰阳性菌需先加入20μl 10mg/ml溶菌酶，37℃反应15min后再加入蛋白酶K)，混匀，于37℃温育1h，其间多次颠倒混匀。如果溶液变澄清，表示细菌裂解完全。随后，加入100μl 5mol/L NaCl和80μl CTAB(Hexadecyl trimethyl ammoniumBromide，十六烷基三甲基溴化铵)/NaCl溶液(5g CTAB溶于100ml 0.5M NaCl溶液中，需要加热到65℃使之溶解，然后室温保存)，混匀，65℃温育10min，可见白色沉淀。然后加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，混匀至乳浊状。12000rpm离心5min，转上清液至一洁净试管，加入与上清液等体积的异丙醇，轻轻混匀，直至产生絮状DNA沉淀。12000rpm离心5min，去上清液，沉淀用1ml的70％乙醇洗涤。离心，弃乙醇，在洁净工作台中干燥沉淀。最后，将沉淀溶于50μl TE缓冲液，加入1μl RNase A(10mg/ml)，4℃保存备用。

1.2.2丙酮直接煮沸法

取新鲜细菌悬液，加入等体积丙酮，置于沸水浴中煮沸10min。然后12000rmp离心2min，其上清液即为细菌DNA溶液，可以作为PCR扩增的模板。

1.3PCR扩增16S rRNA基因片段

引物合成和生物素标记交上海生工生物工程技术服务有限公司完成。建立50μl PCR反应体系：DNA模板1μl，ddH₂O 38.5μl，10×PCR缓冲液5μl，25mM MgCl₂ 2μl，10mM dNTP 1μl，20μM引物1 1μl，20μM引物2 1μl，5U/μl TaqDNA聚合酶0.5μl。采用PTC-100 Peltier ThermalCycler(BIO-RAD)进行PCR反应。如采用27F、1492R扩增16S rRNA基因片段，反应程序为94℃变性5min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸7min；4℃保存备用。如采用250F、Bio-1020R扩增16S rRNA基因片段，反应程序为94℃变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存备用。

表1扩增16s rRNA基因片段的引物

Table l Primers amplifying 16s rRNA gene fragments

a：F，正向引物；R，反向引物。

b：bio，生物素(biotin)标记

其中27F和1492R为已知的通用引物，用于鉴定菌株时的16S rRNA基因片段扩增；

250F和Bio-1020R为本发明10种细菌16S rRNA基因片段序列进行比对，寻找16S rRNA基因中的序列保守区和多态区，再利用保守区设计出的通用引物，用于检测时16S rRNA基因片段扩增。

1.4PCR产物序列分析

细菌16S rRNA基因的PCR产物具有高度特异性，测序前无需纯化即可直接测序。测序引物为27F和1492R，正反测序(北京诺赛基因组研究中心有限公司完成)。

1.5序列同源性比对

根据测序所得的10种细菌16S rRNA基因片段的序列图，去掉两端的不规则峰，取中间1380bp片段序列进行同源性分析。如果要鉴定细菌，则将序列导入美国NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的blastn在线软件，数据库选择Nucleotide collection(nr/nt)，然后运行blastn程序，取16S rRNA基因序列同源性最高的细菌作为鉴定的结果。如果要比对10种病原细菌16S rRNA基因序列的同源性，则将它们的序列导入ClustalX(1.86)软件，然后在菜单中选择Alignment----Do Complete Alignment，即得10种细菌的16S rRNA基因序列同源性比对图。

1.6基因检测膜条的制备

根据10种病原细菌16S rRNA基因序列比对的结果，在引物对250F、Bio-1020R扩增的770bp片段内，寻找序列多态性位点，并以该位点的正向序列设计探针，交上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将探针按图3的布局点在硝酸纤维素膜上，80℃烤膜1～2h，使探针与膜牢固结合，即得10种病原细菌的基因检测膜条。

1.7核酸分子杂交

以细菌DNA为模板，用引物对250F、Bio-1020R进行PCR扩增，得到生物素标记的16SrRNA基因770bp片段。将该PCR产物100℃水浴变性5min，冰浴骤冷。基因检测膜条经预杂交后，向杂交液中加入变性的生物素标记的PCR产物，杂交1h，洗膜。然后，封闭30min，SA-AP(1∶1000稀释)结合30min，洗膜，NBT/BCIP显色。显色至一定程度后即终止显色，肉眼观察，Gel Doc^TM XR+Imaging System(BIO-RAD)照相。

2结果与分析

2.1  16S rRNA基因序列分析法鉴定细菌

为确定这10种细菌，在制备基因检测膜条之前，我们采用16S rRNA基因序列分析法对这10种细菌进行了鉴定。

采用CTAB法或丙酮直接煮沸法提取细菌基因组DNA。结果表明，CTAB法和丙酮直接煮沸法提取的DNA均可作为PCR扩增的模板，但丙酮直接煮沸法快速、简单，更适于临床应用。27F和1492R引物^[11]的通用性好，可以扩增10种细菌的16S rRNA基因片段，扩增片段大小为1450bp左右(图1)。以扩增片段为模板，引物27F和1492R正反测序，然后根据序列的同源性对细菌进行鉴定，同源性最高的细菌即为鉴定的结果。以金黄色葡萄球菌鉴定为例进行说明。取测序所得的金黄色葡萄球菌16S rRNA基因1380bp片段的序列，在线软件blastn中比对后，选择Taxonomy reports，即可得到具有同源序列的细菌，以同源性从高到低的顺序从上往下排列，序列同源性最高的细菌就是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)结果如下。

10种细菌鉴定的结果参见表2。

表2  16S rRNA基因序列分析法鉴定细菌的结果

Table 2 Identification of bacteria by 16S rRNA gene sequence analysis

2.2设计10种细菌的通用引物和探针

为设计通用引物和探针，将10种细菌16S rRNA基因片段序列进行比对，寻找16S rRNA基因中的序列保守区和多态区，结果如下(部分)。

利用保守区设计通用引物250F和bio-1020R(表1)，利用多态区设计探针，探针序列如前。

2.3膜条检测10种细菌

首先，利用通用引物250F和bio-1020R，将10种细菌的16S rRNA基因片段体外进行扩增，并在扩增的同时将扩增片段进行生物素标记。以细菌的基因组DNA为模板，通用引物250F、bio-1020R可以扩增10种细菌的16S rRNA基因片段，长度在770bp左右(图2A)。随后，检测反向引物bio-1020R生物素标记是否成功，结果发现1020R(没有生物素标记、但序列与bio-1020R完全相同的引物)经检测没有信号，而bio-1020R经检测有很强的信号，说明生物素已经成功标记在bio-1020R引物的5’端(图2B)。这也说明扩增得到的16S rRNA基因片段已经被生物素标记，可以用于后续的核酸分子杂交实验。

随后，我们用扩增的10种细菌的16S rRNA基因片段分别与膜条进行杂交，考察膜条的特异性和有效性。首先，我们用膜条分别与10种细菌16S rRNA基因扩增片段杂交，结果发现出现相对应的、特异性的信号，而无序的核酸探针均没有信号，细菌通用探针均出现信号(图4A-J)。这说明膜条能特异地、有效地检测这10种细菌。然后，我们同时扩增大肠埃希菌、伤寒沙门氏菌、粘质沙雷菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌5种细菌的16S rRNA基因片段，并与膜条杂交，结果发现5种菌的探针均出现信号，说明该膜条可以同时检测出这5种细菌(图4K)。

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Claims (4)

1.一种用于多种细菌的基因检测膜条，其特征在于，包括用于扩增细菌的16S rRNA基因片段的一对引物：

250F：CCTACGGGAGGCAGCAGT；

1020R：CGGGACTTAACCCAACAT；

以及固定有如下所示序列探针的硝酸纤维素薄膜条，所述探针序列如下：大肠埃希菌检测探针：

TCC ACG GAA GTT TTC AGA GAT GAG AAT GTG CCT TCG GGA ACC GTG AGA CA

肠道沙门菌检测探针：

TCC ACA GAA CTT TCC AGA GAT GGA TTG GTG CCT TCG GGA ACT GTG AGA CA

粘质沙雷菌检测探针：

TCC AGA GAA CTT TCC AGA GAT GGA TTG GTG CCT TCG GGA ACT CTG AGA CA

阴沟肠杆菌检测探针：

TCC AGA GAA CTT AGC AGA GAT GGT TTG GTG CCT TCG GGA ACT CTG AGA CA

奇异变形杆菌检测探针：

TCC AGC GAA TCC TTT AGA GAT AGA GGA GTG CCT TCG GGA ACG CTG AGA CA

铜绿假单胞菌检测探针：

TGC TGA GAA CTT TCC AGA GAT GGA TTG GTG CCT TCG GGA ACT CAG ACA CA

鲍曼不动杆菌检测探针：

TAC TAG AAA CTT TCC AGA GAT GGA TTG GTG CCT TCG GGA ATC TAG ATA CA

枯草芽孢杆菌检测探针：

TCC TCT GAA AAC CCT AGA GAT AGG GCT TCT CCT TCG GGA GCA GAG TGA CA

溶血性葡萄球菌检测探针：

TCC TTT GAC CCT TCT AGA GAT AGA AGT TTC CCC TTC GGG GGA CAA AGT GA

金黄色葡萄球菌检测探针：

TCC TTT GAC AAC TCT AGA GAT AGA GCC TTC CCC TTC GGG GGA CAA AGT GA。

2.根据权利要求1所述的膜条，其特征在于，所述的引物1020R的5’端被生物素标记。

3.根据权利要求1所述的膜条，其特征在于，所述的硝酸纤维素薄膜条还固定有无序的核酸探针：

ATC TGA TGC TGC ATA CGT ACT GCA TCC GTA ACT GCA ATG GTA CTG TAG CC

细菌通用探针：

TGT CGT CAG CTC GTG YYG TGA RRT GTY GGS TTA AGT SCC RYA ACG AGCGC。

4.根据权利要求1所述的膜条，其特征在于，所述的细菌包括大肠埃希菌,肠道沙门菌,粘质沙雷菌,阴沟肠杆菌,奇异变形杆菌,铜绿假单胞菌,鲍曼不动杆菌,枯草芽孢杆菌,溶血性葡萄球菌,金黄色葡萄球菌。

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