CN105368961A - 一种沙雷菌定量检测荧光pcr试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医学检验技术领域，具体涉及一种沙雷菌定量检测荧光PCR试剂盒及其应用。所述的试剂盒包括阳性标准品、阴性标准品、反应液、DNA聚合酶和稀释液，所述阳性标准品、阴性标准品和反应液中均含有用于沙雷菌检测的特异性引物和特异性探针。本发明的试剂盒定量准确，兼有PCR的高灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，结果直观，检测速度快，能直接检测PCR过程中的变化，与普通PCR相比，其结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了污染。

Description

一种沙雷菌定量检测荧光PCR试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及医学检验技术领域，具体涉及一种沙雷菌定量检测荧光PCR试剂盒及其应用。
背景技术
沙雷菌是一种能引起沙雷菌肺炎和败血症的致病菌，在环境中广泛存在，主要为医院内获得性感染，发病率明显增多，且耐药菌株增多，治疗困难。与一般急性细菌性肺炎相似，主要表现为发热、寒战、咳嗽、咯血痰或假性血痰或黄痰、呼吸困难、胸痛。沙雷菌感染已成为常见的、传播广泛的条件致病菌之一，但早期诊断困难，常常导致治疗时机延误，病死率高。传统的分离、培养和病理鉴定等诊断方法敏感性低、阳性率低。早期、快速、简便、敏感、特异的诊断方法是目前条件性沙雷菌感染实验诊断研究领域的热点。
荧光PCR技术在1995年由美国PE公司率先研制成功，它兼有PCR的高灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，结果直观，能直接检测PCR过程中的变化。与普通PCR相比，其结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了污染。
发明内容
本发明需要解决的现有技术的问题是：沙雷菌感染早期诊断困难，现有技术的诊断方法敏感性低、阳性率低，导致病情延误。
为了解决上述问题，本发明提供了一种沙雷菌定量检测荧光PCR试剂盒，用来解决现有的沙雷菌感染诊断困难，敏感性低、阳性率低的问题。
具体而言，本发明提供了一种沙雷菌定量检测荧光PCR试剂盒，所述的试剂盒包括阳性标准品、阴性标准品、反应液和DNA聚合酶，所述阳性标准品、阴性标准品和反应液中均含有用于沙雷菌检测的特异性引物和特异性探针。
优选的，所述特异性引物包括引物1和引物2，其中引物1的序列SQ1为：5’-cacgccatcagatgtgcc-3’；
引物2的序列SQ2为：5’-agtgtggctggtcatcctctc-3’。
优选的，所述特异性探针为带有荧光基团和淬灭基团的特异性序列，其中，所述的荧光基团选自FAM、HEX、TET、VIC中的一种，优选为FAM、VIC；所述的淬灭基团选自MGB、TAMRA、BHQ中的一种，优选为MGB。
优选的，所述的特异性探针的序列SQ3为：5’-ctcacctaggcgacgat-3’。
优选的，所述阳性标准品中含有插入了沙雷菌特异性DNA序列SQ4的重组质粒，其中，SQ4的序列如下：
cttcgggcctcacgccatcagatgtgcccagatgggattagctagtaggtggggtaatgg60
ctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgag120
acacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcc180
优选的，所述重组质粒的浓度为1.0×103～1.0×107。
优选的，所述的阴性标准品包含有不含沙雷菌特异性DNA序列的质粒。
优选的，所述的质粒或重组质粒相同，选自pETs、pUCs、pGM-T、pBR322、pMD-T中的一种，优选为pGM-T、pBR322。
优选的，所述的反应液还包括缓冲液和dNTPs。
优选的，所述的缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钾和氯化镁。
优选的，所述的三羟甲基氨基甲烷的浓度为50～200mM，优选为100～150mM；氯化钾的浓度为300～800mM，优选为400～600mM；氯化镁的浓度为10～30mM，优选为10～20mM。
优选的，所述的DNA聚合酶为TaqDNA聚合酶。
本发明同时提供了引物1的序列SQ1、引物2的序列SQ2和特异性探针的序列SQ3用于制备沙雷菌含量测定用试剂中的应用。
优选的，所述的沙雷菌含量测定用试剂的使用方法如下：
取样本DNA加入到反应液中，作为样品检测组，然后分别在阳性标准品、阴性标准品以及样品检测组中加入DNA聚合酶，混合均匀后进行荧光定量PCR反应，其中反应液、阳性标准品、阴性标准品中均含有引物1的序列SQ1、引物2的序列SQ2和特异性探针的序列SQ3。
优选的，所述的荧光定量PCR反应条件为：94～95℃预变性2～5min，1个循环；94～95℃15～20s、55～60℃30～50s，40～50个循环。
其中，所述的质粒可以为本领域常用的任何可插入外源基因的质粒，可以为常见的pETs系列、pUCs系列、pBR322、pGM-T等，pUCs系列优选为pUC18、pUC19等。
其中，特异性引物与特异性探针根据沙雷菌高度保守序列特性设计，用于检测沙雷菌。
而且，发明人创造性的选取了沙雷菌特异性DNA序列SQ4，将其与质粒载体连接的重组质粒作为阳性标准品，其检测的特异性高，灵敏度高。
本发明的有益效果为：
1)本发明试剂盒定量准确，兼有PCR的高灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，结果直观，能直接检测PCR过程中的变化，与普通PCR相比，其结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了污染。
2)本发明试剂盒检测灵敏度和特异性高，由于采取特异性引物和探针的双保险设计，灵敏度和特异性均有很大提高，能在临床症状出现之前检测到沙雷菌的感染。
3)本发明试剂盒检测速度快，总共仅需2个小时，步骤简单，可同时进行高通量样本检测。
下面结合附图和各个具体实施方式，对本发明及其有益技术效果进行详细说明，其中：
附图说明
图1为实施例一的沙雷菌阳性标准品的荧光PCR扩增曲线和阴性标准品的荧光PCR扩增曲线。
图2为实施例一的沙雷菌临床样本的荧光PCR扩增曲线。
具体实施方式
如上所述，本发明提供了一种用于沙雷菌定量检测荧光PCR试剂盒，其目的是为了提高被测人群沙雷菌诊断的灵敏度和特异性，提供早期诊断的可靠性。
具体而言，本发明提供了一种沙雷菌定量检测荧光PCR试剂盒，所述的试剂盒包括阳性标准品、阴性标准品、反应液和DNA聚合酶，所述阳性标准品、阴性标准品和反应液中均含有用于沙雷菌检测的特异性引物和特异性探针。
其中，在本发明的一种优选实施方式中，所用到的特异性引物以及特异性探针的DNA序列分别为：
特异性引物1的序列SQ1为：5’-cacgccatcagatgtgcc-3’，作为正向引物；
特异性引物2的序列SQ2为：5’-agtgtggctggtcatcctctc-3’，作为反向引物；
特异性探针的序列SQ3为：5’-ctcacctaggcgacgat-3’。
在所述阳性标准品中含有插入沙雷菌特异DNA序列SQ4的pGM-T载体质粒，所插入序列SQ4如下：
SQ4:
cttcgggcctcacgccatcagatgtgcccagatgggattagctagtaggtggggtaatgg60
ctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgag120
acacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcc180
在本发明的具体实施中，所述阳性工作标准品含有重组质粒的浓度为1.0×103～1.0×107。
本发明中的样本DNA不仅仅来源于动物或人体的全血液或者肺泡灌洗液，还可以是任何与沙雷菌相关的样本。本发明提到的特异性引物1的序列SQ1和引物2的序列SQ2以及特异性探针的序列SQ3可以应用于制备测量沙雷菌含量的试剂。
应当说明的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规的方法，具体可参照萨姆布鲁克和拉塞尔主编的《分子克隆实验指南》第三版，或按照制造厂商所建议的步骤和条件。
下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细的说明，其中实施例中所用的试剂和仪器的厂家如下：
荧光定量PCR仪，厂家：美国ABI实时荧光定量PCR仪7500，美国；
dNTPs，厂家：TAKARA，日本；
TaqDNA聚合酶，厂家：TAKARA，日本；
DNA基因组提取试剂盒，购自天根公司；
pGM-T质粒载体，pUC18质粒载体，pMD18-T质粒载体，均购自天根生化科技(北京)有限公司；
本发明中用到的特异性引物，以及特异性探针序列均由上海英骏生物技术有限公司合成，其中，特异性探针上连接的荧光基团和淬灭基团一并由上海英俊生物技术有限公司合成。
实施例一
(一)试剂盒的准备
(1)引物和探针设计与合成
根据沙雷菌的高度保守序列，设计了特异性引物和特异性探针，
其中，正向引物SQ1为5’-cacgccatcagatgtgcc-3’；
反向引物SQ2为5’-agtgtggctggtcatcctctc-3’；
特异性探针SQ3为5’-ctcacctaggcgacgat-3’，其中MGB作为淬灭基团，FAM作为荧光基团，FAM和MGB分别连接在特异性探针序列SQ3的5’和3’端。
(2)沙雷菌阳性模板的制备
制备含有沙雷菌核酸序列的质粒作为阳性模板，用于在试剂盒检测时制备阳性标准品。
首先使用引物SQ5：5’-cttcgggcctcacgc-3’和引物SQ6：5’-ggcttgcgcccattg-3’，采用常规PCR技术扩增沙雷菌基因靶序列，然后将经过纯化的PCR产物连接到pGM-T载体上，得到连接有目的基因的质粒；接着转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，并通过筛选构建好的重组质粒作为阳性标准品，将构建的重组质粒经双向DNA测序鉴定，提取质粒，紫外分光光度计定量，并保存于-20℃。
(3)阳性标准品与阴性标准品的制备
按照表1所示的配方，制备反应液，备用。
表1反应液的配方
反应液成分 体积
10*buffer 2μl
引物SQ1(10μM) 0.4μl
引物SQ2(10μM) 0.4μl
特异性探针SQ3(10μM) 0.2μl
dNTPs(2.5mM) 0.8μl
水 12.2μl
分别取103、104、105、106、107拷贝的阳性标准品加入到反应液中配制成阳性工作标准品，其中阳性标准品与反应液的配比为2:16，将没有重组的107拷贝的pGM-T质粒，加入到反应液中配制成阴性标准工作品，其中阴性标准品与反应液的配比为2:16。其中，缓冲液(buffer)溶液的配方如下：Tris-HCl100mM、KCl500mM、MgCl215mM，其中Tris-HCl的pH值为8.5。
(二)试剂盒的组成
实施例一提供了一种用于沙雷菌定量检测荧光PCR试剂盒，所述的试剂盒包括阳性标准品、阴性标准品、反应液和DNA聚合酶，所述阳性标准品、阴性标准品和反应液中均含有用于沙雷菌检测的特异性引物和特异性探针。
其中，由装有阳性标准品的管定义为阳性标准品管，阳性标准品管有25管，每管容积为200ul，其中每管含有阳性工作标准品18ul；装有阴性标准品的管定义为阴性标准品管，阴性标准品有5管，阴性标准品管的容积为200ul，其中每管装有阴性标准品18ul；装有反应液的管有50管，反应液管的容积为200ul，其中每管有反应液16ul。
装有稀释液的管定义为稀释液管，其容积为3ml，其装有去离子水2ml作为稀释液。
装有DNA聚合酶的管定义为DNA聚合酶管，DNA聚合酶有5管，DNA聚合酶管的容积为0.65ml，其装有TaqDNA聚合酶4ul，其浓度为5U/ul。
(三)试剂盒的使用
(1)样本预处理
从天津总医院获得临床血液样本。将全血液用移液器混匀，取出1000μl于一个新的离心管中，按照DNA基因组提取试剂盒上的操作说明提取血液中沙雷菌的DNA，待用。
(2)DNA聚合酶预处理
使用前将DNA聚合酶以8000rpm离心30s，之后取36μl稀释液加入到一管DNA聚合酶中，充分混匀，备用。
(3)样本检测
取新的反应管，分别命名为样品检测组、阳性对照组和阴性对照组，分别按照表2各实验组配方配制溶液，用移液枪吹打均匀，然后置于荧光定量PCR仪中进行测定。
表2各实验组配方
检测组 样品检测组 阳性对照组 阴性对照组
反应液 16μl — —
模板DNA 2μl — —
阳性标准品 — 18μl —
阴性标准品 — — 18μl
DNA聚合酶(0.5U/μl) 2μl 2μl 2μl
(4)反应程序
将探针的报告基团设为FAM，淬灭基团设为MGB，其中FAM为荧光基团，FAM标记的荧光探针为绿色，将MGB作为淬灭基团，探针上连接有FAM和MGB时，不表现出荧光，当特异性探针被DNA聚合酶降解时，FAM和MGB基团分开，发出荧光。
打开参数窗口，设置程序为：95℃5分钟，1个循环；95℃15秒，60℃30秒，共40个循环。设置完成后，保存文件，运行程序。
(5)反应结果判断
采用软件对荧光定量PCR结果进行分析，根据分析后图像调节基线参数的起始值、停止值以及阈值(用户可根据实际情况自行调整，起始值可以在1～10、停止值可以在5～20范围选择)，使标准曲线窗口下的标准曲线图达到最佳。在定量分析菜单下分析结果，根据标本点在标准曲线的位置确定标本浓度。
其中，如果增长曲线不呈S型曲线或Ct值>＝35，则判断样品的总含量小于检测极限。
如果增长曲线呈S型曲线且Ct值<35，则按以下方法判断：
若样品的Ct值小于103阳性定量参考品，则该样品的DNA总含量＜1.0×103基因拷贝；
若样品的Ct值在103到107阳性定量参考品之间，则该样品的DNA总含量等于标准曲线中相应的基因拷贝；
若样品的C大于107阳性定量参考品，则该样品的DNA总含量为>1.0×107基因拷贝。如果需要精确定量结果，可将提取后的样品稀释至线性范围内再检测。
当荧光PCR仪程序运行完成后，在软件中选中阳性标准品和阴性标准品时其荧光曲线图应为图1所示。本次实验的临床样本荧光曲线图如图2所示。
从图1可以看出，阴性标准品为一条CT值为40的水平直线，阳性标准品为5条CT值小于35的基本等距离的S型曲线，其中荧光强度从高向低依次为107、106、105、104、103拷贝的阳性标准品。图1所示结果同时表明，本发明的试剂盒工作正常。
图2为临床样本的检测结果，从图2的检测结果可以看出，这几个样本都感染了沙雷菌，从左到右的几条曲线的DNA的含量分别为6.3*103、5.9*103、5.8*103，最后的两条曲线的DNA浓度小于103，表现为阳性，不能得出具体拷贝数，只能达到定性检测的目的。
实施例二
实施例二与实施例一的不同之处在于：缓冲液(buffer)溶液的配方如下：Tris-HCl200mM、KCl800mM、MgCl210mM，其中Tris-HCl的pH值为8.5。
实施例二中所用的荧光基团为VIC，淬灭基团为TAMRA。所用到的质粒为pUC18。其荧光定量PCR反应条件为94℃3分钟，1个循环；94℃20秒，55℃50秒，共50个循环。
实施例三
实施例三与实施例一的不同之处在于：缓冲液(buffer)溶液的配方如下：Tris-HCl50mM、KCl300mM、MgCl220mM，其中Tris-HCl的pH值为8.5。
实施例三中所用的荧光基团为FAM，淬灭基团为BHQ。所用到的质粒为pMD18-T。其荧光定量PCR反应条件为95℃5分钟，1个循环；95℃15秒，55℃40秒，共45个循环。
以上所述仅为本发明较佳实施例，并不用于局限本发明，凡在本发明的精神和原则之内所做的修改、等同替换和改进等，均需要包含在发明的保护范围之内。

Claims (15)

1.一种沙雷菌定量检测荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括阳性标准品、阴性标准品、反应液和DNA聚合酶，所述阳性标准品、阴性标准品和反应液中均含有用于沙雷菌检测的特异性引物和特异性探针。
2.根据权利要求1所述的荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述特异性引物包括引物1和引物2，其中引物1的序列SQ1为：5’-cacgccatcagatgtgcc-3’；
引物2的序列SQ2为：5’-agtgtggctggtcatcctctc-3’。
3.根据权利要求1或2所述的荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述特异性探针为带有荧光基团和淬灭基团的特异性序列，其中，所述的荧光基团选自FAM、HEX、TET、VIC中的一种，优选为FAM、VIC；所述的淬灭基团选自MGB、TAMRA、BHQ中的一种，优选为MGB。
4.根据权利要求1-3任一项所述的荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述的特异性探针的序列SQ3为：5’-ctcacctaggcgacgat-3’。
5.根据权利要求1-4任一项所述的荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述阳性标准品中含有插入了沙雷菌特异性DNA序列SQ4的重组质粒，其中，SQ4的序列如下：
cttcgggcctcacgccatcagatgtgcccagatgggattagctagtaggtggggtaatgg60
ctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgag120
acacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcc180
6.根据权利要求5所述的荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述重组质粒的浓度为1.0×103～1.0×107。
7.根据权利要求1-5任一项所述的荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述的阴性标准品包含有不含沙雷菌特异性DNA序列的质粒。
8.根据权利要求5-7任一项所述的荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述的质粒或重组质粒相同，选自pETs、pUCs、pGM-T、pBR322、pMD-T中的一种，优选为pGM-T、pBR322。
9.根据权利要求1-8任一项所述的荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述的反应液还包括缓冲液和dNTPs。
10.根据权利要求9所述的荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述的缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钾和氯化镁。
11.根据权利要求10所述的荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述的三羟甲基氨基甲烷的浓度为50～200mM，优选为100～150mM；氯化钾的浓度为300～800mM，优选为400～600mM；氯化镁的浓度为10～30mM，优选为10～20mM。
12.根据权利要求1-11任一项所述的荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述的DNA聚合酶为TaqDNA聚合酶。
13.引物1的序列SQ1、引物2的序列SQ2和特异性探针的序列SQ3用于制备沙雷菌含量测定用试剂中的应用。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述的沙雷菌含量测定用试剂的使用方法如下：
取样本DNA加入到反应液中，作为样品检测组，然后分别在阳性标准品、阴性标准品以及样品检测组中加入DNA聚合酶，混合均匀后进行荧光定量PCR反应，其中反应液、阳性标准品、阴性标准品中均含有引物1的序列SQ1、引物2的序列SQ2和特异性探针的序列SQ3。
15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述的荧光定量PCR反应条件为：94～95℃预变性2～5min，1个循环；94～95℃15～20s、55～60℃30～50s，40～50个循环。
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