KR20160034318A - 박테리아 오염을 검출하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

Abstract

박테리아 오염을 검출하기 위한 조성물, 반응 혼합물, 키트, 및 시스템 뿐만 아니라, 그를 사용하는 방법을 제공한다.

Description

박테리아 오염을 검출하기 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR DETECTING BACTERIAL CONTAMINATION}

상호 참조

본 출원은 2013년 7월 25일 출원된 미국 가출원 번호 제61/858,495호의 이익을 주장하며, 상기 출원은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.

이식 조직 및 수혈 제품의 미생물 오염은 주된 의료 문제가 된다. 혈액 은행은 환자 내로의 주입을 위해 방출하기 이전에 각 혈소판 백을 미생물 오염에 대해 테스트하는 것에 대한 큰 도전 과제에 직면해 있다. 이러한 도전 과제 중 일부는 상대적으로 짧은, 전형적으로는 5-7일 및 때때로 그보다 더 짧은 혈소판의 저장 수명에 관한 것이다. 혈소판에 대한 도전 과제는 표준 보관 조건에 의해서 더 복잡해지고 있다. 대부분의 다른 이식가능한 조직과 달리 혈소판은 냉동에 대해 내성에 대하여 띠지 않으며, 심지어 초단기간 동안 냉각된 경우에도 수혈자의 순환으로부터 빠르게 소멸된다. 혈소판 생존에 미치는 이러한 냉각 효과는 비가역적인 것으로 여겨지며, 이로 인해 혈소판은 수혈하는 데는 부적합한 것이 된다. 혈소판이 20℃ 미만의 온도에 노출되었을 때, 그의 형상은 변형되는데, 이는 손상되었음을 나타내는 것이다. 수혈 전에 혈소판을 실온(예컨대, 22-25℃)으로 유지시켜야 하는 필요성은 고가이고, 복잡한 논리적인 독특한 혈소판 보관 요건 세트를 부과하였다. 혈소판은 실온에서 대사적으로 활성을 띠는 바, 전형적으로는, 대사성 산성혈증의 독성 결과를 막기 위해 기체 교환이 이루어지도록 하기 위하여 기체 투과성 용기에서 계속해서 교반된다. 이러한 보관 조건은 박테리아 성장을 촉진시키는 바, 이로 인해 박테리아 감염의 위험은 더욱 높아진다. 배양 검출에 의존하는 스크리닝 방법은 오염을 검출하는 데 있어 사용가능한 저장 수명보다 더 긴 장시간이 소요될 수 있기 때문에, 환자 내로 오염된 혈소판이 자주 주입되고, 배양 결과가 이용가능해짐에 따라 혈소판이 오염되었다는 것을 의사는 이후에 통지받게 된다. 미국 혈액 은행 협회(A.A.B.B.: American Association of Blood Banks) 표준 5.1.5.1 하에, 혈액 은행 또는 수혈 서비스는 모든 혈소판 농축물 중의 박테리아 오염을 제한하고, 검출하는 방법을 가지도록 지시를 받게 된다. 그럼에도 불구하고, 박테리아 오염된 혈소판의 수혈 위험은 1,000 단위당 1만큼 높을 수 있으며, 상기 사례 중 10% 내지 25%는 환자에게 유해한 영향을 미치게 된다. 일부 오염은 공여자 균혈증으로부터 유래될 수도 있지만, 수집시 피부상 또는 혈액 팩 중에 존재하는 박테리아에 의한 오염이 공여자 진단 스크리닝을 통해서는 처리될 수 없는 오염의 주된 원인이 된다.

오염을 경감시키는 일반 방법은 예방적 조치(예컨대, 팔 씻기, 수집된 혈액 중 제1 분량 전달, 및 여과) 및 배양 방법을 포함한다. 현 오염률에 의히 입증된 바와 같이, 상기 방법은 여전히 부적절한 것으로 남아있다. 또한, 배양 기반 검출 방법은 상당한 인큐베이션 기간(때때로 수일) 소요되기 때문에, 샘플은 그의 유용한 수명의 상당 부분 동안에는 사용될 수 없고, 사용시에는 검출이 완벽하지 못할 수도 있다. 상대적으로 느리게 성장하는 박테리아에 의한 오염의 경우에는 특히 그러하다. 예를 들어, 표준 배양 방법을 사용하였을 때, 바실러스 종(Bacillus sp .), 스타필로코커스 종(Staphylococcal sp .), 스트렙토코커스 종(Streptococcal sp .), 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus), 코쿠리아 바리안스(Kocuria varians), 코리네박테리움 종(Corynebacterium sp .), 및 프로피오니박테리움 종(Propionibacterium sp .)에 대한 평균 검출 시간은 각각 24시간, 27시간, 34시간, 47시간, 56시간, 87시간, 및 97시간인 것으로 추정되었다.

상업적으로 이용가능한 한 테스트로는 BacT/ALERT 테스트(비오메르으 인크.(bioMerieux, Inc.: 미국 노스캐롤라이나주 더럼))가 언급된다. 박테리아 검출은 박테리아 증식에 의한 이산화탄소의 방출에 기반한다. 배양병 하단의 이산화탄소 감수성 액체 에멀션 센서는 변색되고, 센서상의 반사광 변경을 통해 검출된다. 또 다른 박테리아 검출 방법은 혈소판 시료 샘플 중의 산소 함량 측정을 포함한다. 일례로 팔(Pall) eBDS 테스트(팔 코포레이션(Pall Corporation: 미국 뉴욕주 포트 워싱턴))가 있다. 검출 접근법은 대용 마커로서 샘플 파우치 내의 대기 산소 함량을 측정한다. 산소 분석기를 사용하여 혈소판을 포함하는 파우치 또는 백의 헤드스페이스 기체 중의 산소 비율(%)을 측정한다. 수집된 혈소판 샘플 중에 박테리아가 존재하면, 인큐베이션 동안 샘플 중 박테리아의 대사 활동 및 증식을 통해 산소 소비량은 증가되고, 이로 인해 샘플 파우치 내의 혈장뿐만 아니라, 대기 중의 측정가능한 산소 함량은 감소하게 된다. 박테리아 성장에 대한 비특이적인 측정을 통해 많은 종류의 박테리아를 검출할 수는 있지만, 감도는 비교적 낮고, 장시간의 인큐베이션 시간이 소요된다.

표준 배양 기반 스크린에 대한 대안 방법으로는 박테리아 항원 검출 및 핵산 기반 스크리닝을 포함한다. 항원 기반 방법의 주된 한계는 박테리아 병원체의 스펙트럼을 알지 못하는 경우에는 샘플을 테스트하는 데 직접적으로 적용될 수 없다는 점이다. 예컨대, 16S rRNA와 같은 일반 박테리아 핵산 서열 검출은 더욱 광범위한 검출 스펙트럼을 달성하는 데 제안되어 왔지만, 현재까지 상기 방법은 현 배양 방법보다 감도 및 특이성이 더 낮고, 혈소판 샘플을 조기에 테스트하는 데에는 적절하지 못한 것으로 간주되었다.

본 발명은 검출 특이성 및 감도가 광범위하고 높은, 생물학적 샘플, 예컨대, 혈소판 샘플의 오염을 검출하기 위한 방법, 조성물, 반응 혼합물, 키트 및 시스템을 개시한다. 본 개시내용에 따른 오염 검출은 또한 배양 기반 스크리닝 방법보다 유의적으로 더 빠르다.

한 측면에서, 본 개시내용은 복수 개의 박테리아 종, 예컨대, 8개 이상의 박테리아 종 중 어느 것에 의한 샘플의 박테리아 오염을 검출하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 방법은, 단일 반응 혼합물 중에서, 약 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 150, 또는 100개 이하의 염기로 이루어진 검출 가능한 양의 앰플리콘을 수득할 수 있는 조건 하에 상기 샘플 또는 그의 일부에 대해 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계로서, 여기서, 상기 반응 혼합물은 단일 프라이머 쌍 및 단일 검출 가능 프로브를 포함하고, 여기서, 프라이머 쌍은 앰플리콘 측면에 위치하고, 앰플리콘은 검출 가능한 프로브가 하이브리드화하는 보존 서열을 포함하고, 보존 서열은 8개 이상의 박테리아 종 사이에 동일한 것인 단계; 및 상기 프로브에 의한 앰플리콘에의 하이브리드화를 검출하는 단계로서, 여기서, 프로브에 의한 하이브리드화는, 8개 이상의 박테리아 종 중 어느 것에 의한 샘플의 박테리아 오염을 나타내는 검출 가능한 신호를 생성하는 것인 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 샘플은 혈액 샘플 또는 연막 샘플이고, 오염은 피험체에서의 패혈증 예측 또는 진단에 도움이 되는 것이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 혈소판 샘플이다. 일부 실시양태에서, 혈소판 샘플은 성분채집술에 의해 단리된 혈소판 농축물이다. 일부 실시양태에서, 5 mL 미만의 혈소판 농축물로부터 단리된 핵산에 대해 핵산 증폭 반응을 수행한다. 일부 실시양태에서, 앰플리콘은 박테리아 16S rRNA 폴리뉴클레오티드 주형으로부터 생성된다. 일부 실시양태에서, 박테리아 오염 검출은 수혈자로의 수혈 전에 완료된다. 일부 실시양태에서, 증폭 반응은 300개 이하의 염기 또는 150개 이하의 염기로 이루어진 검출 가능한 양의 앰플리콘을 생성한다. 일부 실시양태에서, 증폭 반응은 100∼200개의 염기로 이루어진 검출 가능한 양의 앰플리콘을 생성한다. 일부 실시양태에서, 박테리아 종은 모두 동일한 반응에서 상이한 검출 가능한 표지를 가지는 프로브로 검출되는 그람 양성 박테리아, 그람 음성 박테리아, 또는 상기 둘 모두의 조합이다. 일부 실시양태에서, 8개 이상의 박테리아 종으로는 복수 개의 그람 양성 박테리아 종 및 복수 개의 그람 음성 박테리아 종을 포함한다. 일부 실시양태에서, 박테리아 종은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 아우레우스 Mu3; 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 스트렙토코커스 아갈락티아에(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코커스 파이오제네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia), 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 시트로박터 코세리(Citrobacter koseri), 클로스트리듐 퍼프린젠스(Clostridium perfringens), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 프로피오니박테리움 그래눌로섬(Propionibacterium granulosum), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 스타필로코커스 아우레우스 Mu50, 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 스타필로코커스 시뮬란스(Staphylococcus simulans), 마이크로코커스 루테우스, 및 엔테로박터 에어로제네스(Enterobacter aerogenes)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 샘플 중 10개 이상 또는 15개 이상의 박테리아 종 중 어느 것에 의한 박테리아 오염을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 프라이머 쌍은 하기 표 2에 기재된 서열(예컨대, 서열 번호 4, 7, 또는 9)의 10개 이상의 연속하는 뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머, 및 표 2에 기재된 서열(예컨대, 서열 번호 5, 6, 8, 또는 10)의 10개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 프라이머는 하기 표 15에 개시된 프라이머 세트, 또는 그의 임의의 조합으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 프라이머 쌍은 최적으로 정렬되었을 때 표 2 또는 표 15에 개시된 프라이머 중 어느 것 또는 그의 상보체와 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 서열 상동성을 보인다. 일부 실시양태에서, 프로브는 하기 표 3에 기재된 서열의 10개 이상의 연속하는 뉴클레오티드 또는 그의 상보체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 증폭 반응은 박테리아 오염으로부터 5 pg 미만의 출발 핵산을 함유한다. 일부 실시양태에서, 핵산 증폭 반응은 중합효소 연쇄 반응, 실시간 중합효소 연쇄 반응, 등온 증폭, 가닥 치환 증폭, 회전 환 증폭, 리가제 연쇄 반응, 전사 매개 증폭, 고체상 증폭, 핵산 서열 기반 증폭(NASBA: nucleic acid sequence-based amplification), 및 선형 증폭으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법을 이용하여 수행된다. 일부 실시양태에서, 핵산 증폭 반응은 웰에서, 플레이트에서, 튜브에서, 챔버에서, 소적에서, 유동 셀(flow cell)에서, 슬라이드에서, 칩에서, 고체 기판에 부착시켜, 비드에 부착시켜, 또는 에멀션 중에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 검출 가능한 신호는 5 로그 이상에 걸쳐 선형의 검출 범위를 보인다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 프로브 신호에 기초하여 박테리아 오염량을 측정하는 단계를 추가로 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 샘플의 박테리아 오염을 검출하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 방법은, 단일 반응 혼합물 중에서, 약 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 150, 또는 100개 이하의 염기로 이루어진 검출 가능한 양의 앰플리콘을 수득할 수 있는 조건 하에 상기 샘플 또는 그의 일부에 대해 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계로서, 여기서, 상기 반응 혼합물은 단일 프라이머 쌍 및 단일 검출 가능 프로브를 포함하고, 여기서, 프라이머 쌍은 앰플리콘 측면에 위치하고, 앰플리콘은 검출 가능한 프로브가 하이브리드화하는 보존 서열을 포함하고, 샘플 또는 그의 일부는 증폭 전에 35℃ 초과의 온도에서 배양되지 않은 것인 단계; 및 상기 프로브에 의한 앰플리콘에의 하이브리드화를 검출하는 단계로서, 여기서, 프로브에 의한 하이브리드화가 샘플의 박테리아 오염을 나타내는 검출 가능한 신호를 생성하는 것인 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 샘플은 혈액 샘플 또는 연막 샘플이고, 오염은 피험체에서의 패혈증 예측 또는 진단에 도움이 되는 것이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 혈소판 샘플이다. 일부 실시양태에서, 혈소판 샘플은 성분채집술에 의해 단리된 혈소판 농축물이다. 일부 실시양태에서, 5 mL 미만의 혈소판 농축물로부터 단리된 핵산에 대해 핵산 증폭 반응을 수행한다. 핵산 증폭 반응을 수행한다. 일부 실시양태에서, 5 mL 미만의 혈소판 농축물로부터 단리된 핵산에 대해 핵산 증폭 반응을 수행한다. 일부 실시양태에서, 앰플리콘은 박테리아 16S rRNA 폴리뉴클레오티드 주형으로부터 생성된다. 일부 실시양태에서, 박테리아 오염 검출은 수혈자로의 수혈 전에 완료된다. 일부 실시양태에서, 증폭 반응은 300개 이하의 염기 또는 150개 이하의 염기로 이루어진 검출 가능한 양의 앰플리콘을 생성한다. 일부 실시양태에서, 증폭 반응은 100∼200개의 염기로 이루어진 검출 가능한 양의 앰플리콘을 생성한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 샘플 중 10개 이상 또는 15개 이상의 박테리아 종 중 어느 것에 의한 박테리아 오염을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 프라이머 쌍은 서열 번호 4, 7, 또는 9에 기재된 서열의 10개 이상의 연속하는 뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머, 및 서열 번호 5, 6, 8, 또는 10에 기재된 서열의 10개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브는 표 3에 기재된 서열의 상보체의 10개 이상의 연속하는 뉴클레오티드 또는 그의 상보체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 증폭 반응은 박테리아 오염으로부터 5 pg 미만의 출발 핵산을 함유한다. 일부 실시양태에서, 핵산 증폭 반응은 중합효소 연쇄 반응, 실시간 중합효소 연쇄 반응, 등온 증폭, 가닥 치환 증폭, 회전 환 증폭, 리가제 연쇄 반응, 전사 매개 증폭, 고체상 증폭, 핵산 서열 기반 증폭(NASBA), 및 선형 증폭으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법을 이용하여 수행된다. 일부 실시양태에서, 핵산 증폭 반응은 웰에서, 플레이트에서, 튜브에서, 챔버에서, 소적에서, 유동 셀에서, 슬라이드에서, 칩에서, 고체 기판에 부착시켜, 비드에 부착시켜, 또는 에멀션 중에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 검출 가능한 신호는 5 로그 이상에 걸쳐 선형의 검출 범위를 보인다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 프로브 신호에 기초하여 박테리아 오염량을 측정하는 단계를 추가로 포함한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 샘플 수득 후 24시간 이내에 샘플 중의 박테리아 오염을 신속하게 검출하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 방법은, 단일 반응 혼합물 중에서, 약 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 150, 또는 100개 이하의 염기로 이루어진 검출 가능한 양의 앰플리콘을 수득할 수 있는 조건 하에 단일 프라이머 쌍 및 단일 검출 가능 프로브를 이용하여 샘플 또는 그의 일부에 대해 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계로서, 여기서, 프라이머 쌍은 앰플리콘 측면에 위치하고, 앰플리콘은 검출 가능한 프로브가 하이브리드화하는 보존 서열을 포함하고, 상기 종 중 어느 하나로부터의 약 1 pg∼5 pg의 DNA의 증폭은 30 미만의 사이클 역치 값(C_T: cycle threshold value)을 갖는 것인 단계; 및 상기 샘플 수득 후 약 24시간 이내에 상기 프로브에 의한 상기 앰플리콘에의 하이브리드화를 검출하여 상기 샘플 수득으로부터 약 24시간 이내에 오염을 검출하는 단계로서, 여기서, 상기 프로브에 의한 상기 하이브리드화가 샘플의 박테리아 오염을 나타내는 검출 가능한 신호를 생성하는 것인 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 샘플은 혈액 샘플 또는 연막 샘플이고, 오염은 피험체에서의 패혈증 예측 또는 진단에 도움이 되는 것이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 혈소판 샘플이다. 일부 실시양태에서, 혈소판 샘플은 성분채집술에 의해 단리된 혈소판 농축물이다. 일부 실시양태에서, 5 mL 미만의 혈소판 농축물로부터 단리된 핵산에 대해 핵산 증폭 반응을 수행한다. 일부 실시양태에서, 검출은 1 ml당 약 1.0 콜로니 형성 단위(CFU/mL: colony forming unit per mL)의 박테리아 로드를 갖는 혈소판 샘플의 박테리아 오염을 나타내는 검출 가능한 신호를 생성한다. 일부 실시양태에서, 5 mL 미만의 혈소판 농축물로부터 단리된 핵산에 대해 핵산 증폭 반응을 수행한다. 일부 실시양태에서, 앰플리콘은 박테리아 16S rRNA 폴리뉴클레오티드 주형으로부터 생성된다. 일부 실시양태에서, 박테리아 오염 검출은 수혈자로의 수혈 전에 완료된다. 일부 실시양태에서, 증폭 반응은 300개 이하의 염기 또는 150개 이하의 염기로 이루어진 검출 가능한 양의 앰플리콘을 생성한다. 일부 실시양태에서, 증폭 반응은 100∼200개의 염기로 이루어진 검출 가능한 양의 앰플리콘을 생성한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 샘플 중 10개 이상 또는 15개 이상의 박테리아 종 중 어느 것에 의한 박테리아 오염을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 프라이머 쌍은 서열 번호 4, 7, 또는 9에 기재된 서열의 10개 이상의 연속하는 뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머, 및 서열 번호 5, 6, 8, 또는 10에 기재된 서열의 10개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브는 표 3에 기재된 서열의 상보체의 10개 이상의 연속하는 뉴클레오티드 또는 그의 상보체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 증폭 반응은 박테리아 오염으로부터 5 pg 미만의 출발 핵산을 함유한다. 일부 실시양태에서, 핵산 증폭 반응은 중합효소 연쇄 반응, 실시간 중합효소 연쇄 반응, 등온 증폭, 가닥 치환 증폭, 회전 환 증폭, 리가제 연쇄 반응, 전사 매개 증폭, 고체상 증폭, 핵산 서열 기반 증폭(NASBA), 및 선형 증폭으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법을 이용하여 수행된다. 일부 실시양태에서, 핵산 증폭 반응은 웰에서, 플레이트에서, 튜브에서, 챔버에서, 소적에서, 유동 셀에서, 슬라이드에서, 칩에서, 고체 기판에 부착시켜, 비드에 부착시켜, 또는 에멀션 중에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 검출 가능한 신호는 5 로그 이상에 걸쳐 선형의 검출 범위를 보인다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 프로브 신호에 기초하여 박테리아 오염량을 측정하는 단계를 추가로 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 샘플(예컨대, 피험체의 생물학적 샘플) 중 상이한 속으로부터의 복수 개의 박테리아 종 중 어느 것에 의한 박테리아 오염을 검출하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 방법은 단일 프라이머 쌍을 이용하여 샘플 또는 그의 일부에 대해 핵산 증폭 반응을 수행하여 16S rRNA 폴리뉴클레오티드의 약 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 150, 또는 100개 이하의 염기로 이루어진 검출 가능한 양의 앰플리콘을 수득하는 단계로서, 여기서, 종 중 어느 하나로부터의 약 1 pg∼5 pg의 DNA의 증폭은 30 미만의 사이클 역치 값(C_T)을 갖는 것인 단계; 및 하나 이상의 검출 가능한 프로브를 이용하여 앰플리콘을 검출하는 단계로서, 여기서, 하나 이상의 검출 가능한 프로브는 각각 보존 서열에 특이적으로 하이브리드화하고, 보존 서열은 상이한 속으로부터의 복수 개의 박테리아 종 사이에 동일한 것인 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 샘플은 혈액 샘플 또는 연막 샘플이고, 오염은 피험체에서의 패혈증 예측 또는 진단에 도움이 되는 것이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 혈소판 샘플이다. 일부 실시양태에서, 음성 대조군 샘플에 대한 C_T는 5개 이상의 박테리아 종 중 어느 하나로부터의 1 pg∼5 pg의 DNA를 함유하는 샘플에 대한 C_T보다 5 사이클 이상 더 높다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 검출 가능한 프로브는 5개 이하의 상이한 프로브 또는 2개 이하의 상이한 프로브를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 검출 가능한 프로브는 하나의 프로브로 구성된다. 일부 실시양태에서, 박테리아 오염 검출은 수혈자로의 수혈 전에 완료된다. 일부 실시양태에서, 증폭 반응은 300개 이하의 염기 또는 150개 이하의 염기로 이루어진 검출 가능한 양의 앰플리콘을 생성한다. 일부 실시양태에서, 증폭 반응은 100∼200개의 염기로 이루어진 검출 가능한 양의 앰플리콘을 생성한다. 일부 실시양태에서, 박테리아 종은 모두 동일한 반응에서 상이한 검출 가능한 표지를 가지는 프로브로 검출되는 그람 양성 박테리아, 그람 음성 박테리아, 또는 상기 둘 모두의 조합이다. 일부 실시양태에서, 복수 개의 박테리아 종은 상이한 속으로부터의 복수 개의 그람 양성 박테리아 종, 및 상이한 속으로부터의 복수 개의 그람 음성 박테리아 종을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 검출 가능한 프로브는 그람 양성 박테리아 종 사이에서는 공통적이고, 그람 음성 종 중 적어도 일부에는 존재하지 않는 보존 서열에 특이적으로 하이브리드화하는 제1 프로브, 및 그람 음성 박테리아 종 사이에서는 공통적이고, 그람 양성 종 중 적어도 일부에는 존재하지 않는 보존 서열에 특이적으로 하이브리드화하는 제2 프로브를 포함한다. 일부 실시양태에서, 박테리아 종은 스타필로코커스 아우레우스, 스타필로코커스 아우레우스 Mu3; 스타필로코커스 에피더미디스, 스트렙토코커스 아갈락티아에, 스트렙토코커스 파이오제네스, 스트렙토코커스 뉴모니아, 에스케리치아 콜라이, 시트로박터 코세리, 클로스트리듐 퍼프린젠스, 엔테로코커스 패칼리스, 클렙시엘라 뉴모니아, 락토바실러스 애시도필러스, 리스테리아 모노사이토제네스, 프로피오니박테리움 그래눌로섬, 슈도모나스 아에루기노사, 세라티아 마르세센스, 바실러스 세레우스, 스타필로코커스 아우레우스 Mu50, 예르시니아 엔테로콜리티카, 스타필로코커스 시뮬란스, 마이크로코커스 루테우스, 및 엔테로박터 에어로제네스로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 샘플 중 10개 이상 또는 15개 이상의 박테리아 종 중 어느 것에 의한 박테리아 오염을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 프라이머 쌍은 서열 번호 4, 7, 또는 9에 기재된 서열의 10개 이상의 연속하는 뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머, 및 서열 번호 5, 6, 8, 또는 10에 기재된 서열의 10개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머를 포함한다. 일부 실시양태에서, 일부 실시양태에서, 프로브는 표 3에 기재된 서열의 10개 이상의 연속하는 뉴클레오티드 또는 그의 상보체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 증폭 반응은 박테리아 오염으로부터 5 pg 미만의 출발 핵산을 함유한다. 일부 실시양태에서, 핵산 증폭 반응은 중합효소 연쇄 반응, 실시간 중합효소 연쇄 반응, 등온 증폭, 가닥 치환 증폭, 회전 환 증폭, 리가제 연쇄 반응, 전사 매개 증폭, 고체상 증폭, 핵산 서열 기반 증폭(NASBA), 및 선형 증폭으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법을 이용하여 수행된다. 일부 실시양태에서, 핵산 증폭 반응은 웰에서, 플레이트에서, 튜브에서, 챔버에서, 소적에서, 유동 셀에서, 슬라이드에서, 칩에서, 고체 기판에 부착시켜, 비드에 부착시켜, 또는 에멀션 중에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 프로브는 5 로그 이상에 걸쳐 선형의 검출 범위를 갖는 신호를 생성한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 프로브 신호에 기초하여 복수 개의 박테리아 종의 존재량(abundance)을 측정하는 단계를 추가로 포함한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 16S rRNA 폴리뉴클레오티드의 일부의 증폭 및 검출을 위한 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 일부의 길이는 약 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 150, 또는 100개 미만의 뉴클레오티드 길이이다. 한 실시양태에서, 조성물은 서열 번호 9를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 표 2 또는 표 15에 기재된 서열의 10개 이상의 연속하는 뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머; 서열 번호 10을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 표 2 또는 표 15에 기재된 서열의 10개 이상의 연속하는 뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머; 및 서열 번호 16을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 표 3에 기재된 서열의 10개 이상의 연속하는 뉴클레오티드 또는 그의 상보체를 포함하는 프로브를 포함한다. 한 실시양태에서, 조성물은 표적 16S rRNA 폴리뉴클레오티드를 이용하는 증폭 반응에서, 길이가 50개 이상의 뉴클레오티드이고, 최적으로 정렬되었을 때, 서열 번호 1∼3을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 하기 표 1에 열거된 서열 중 어느 것과 90%의 서열 동일성을 가지는 앰플리콘을 증폭시키는 프라이머; 및 앰플리콘의 어느 한 가닥에 특이적으로 하이브리드화하는 하나 이상의 프로브를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 용기, 예컨대, 웰, 플레이트, 튜브, 챔버, 유동 셀 또는 칩 중에 존재한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 탈수된 형태의 것이다. 일부 실시양태에서, 표적 16S rRNA 폴리뉴클레오티드를 이용하는 증폭 반응에서, 프라이머 및 프로브에 의한 복수 개의 표적 종 중 어느 하나로부터의 약 1 pg∼5 pg의 DNA의 증폭은 30 미만의 사이클 역치 값(C_T)을 갖는다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 5개 이상의 박테리아 종 중 어느 것에 의한 혈소판 샘플의 박테리아 오염을 검출하는 방법을 제공한다. 본 방법은, 반응 혼합물 중에서, 약 800개 이하의 염기로 이루어진 검출 가능한 양의 앰플리콘을 수득할 수 있는 조건 하에 상기 샘플 또는 그의 일부에 대해 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계로서, 상기 반응 혼합물은 제1 정방향 프라이머 및 제1 역방향 프라이머를 포함하고, 여기서, 제1 정방향 프라이머 및 제1 역방향 프라이머는 각각 5개 이상의 상이한 박테리아 게놈 사이에 보존되는 별개의 영역에 하이브리드화하는 것인 단계; 상기 반응 혼합물로부터 상기 양의 앰플리콘의 존재를 나타내는 신호를 검출하여 5개 이상의 박테리아 종 중 어느 것에 의한 혈소판 샘플의 박테리아 오염을 검출하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 제1 정방향 및 제1 역방향 프라이머는 각각 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개 이상, 또는 심지어 그 초과의 상이한 박테리아 게놈 보존되는 별개의 영역에 하이브리드화한다. 보존 영역은 스타필로코커스 아우레우스의 16S rRNA(진뱅크(GenBank) 수탁 번호 NC_007622)의 9 내지 28, 32 내지 48, 522 내지 545, 888 내지 903, 916 내지 937, 939 내지 973, 975 내지 994, 957 내지 981, 1093 내지 1125, 1184 내지 1206, 1231 내지 1252, 1378 내지 1396, 1398 내지 1422, 또는 1496 내지 1516인 영역, 또는 박테리아 게놈: 스타필로코커스 아우레우스 Mu3; 스타필로코커스 에피더미디스, 스트렙토코커스 아갈락티아에, 스트렙토코커스 파이오제네스, 스트렙토코커스 뉴모니아, 에스케리치아 콜라이, 시트로박터 코세리, 클로스트리듐 퍼프린젠스, 엔테로코커스 패칼리스, 클렙시엘라 뉴모니아, 락토바실러스 애시도필러스, 리스테리아 모노사이토제네스, 세라티아 마르세센스, 바실러스 세레우스, 프로피오니박테리움 종, 스타필로코커스 아우레우스 Mu50, 예르시니아 엔테로콜리티카, 스타필로코커스 시뮬란스, 마이크로코커스 루테우스, 및 엔테로박터 에어로제네스 중 어느 하나에서의 상응하는 영역을 포함할 수 있다. 하기 표 15에 열거된 프라이머 세트를 비롯한, 본원에 개시된 프라이머 중 어느 것은 본원에 개시된 상기 방법 및 다른 방법을 실시하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 정방향 프라이머 및 제1 역방향 프라이머는 각각 최적으로 정렬되었을 때, 표적 박테리아 서열의 별개의 영역과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 이상의 서열 상동성을 보인다. 일부 실시양태에서, 반응 혼합물은 최적으로 정렬되었을 때, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개 이상 또는 그 초과의 박테리아 종 중 어느 것 또는 그 모두와 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 이상의 서열 상동성을 나타내는 제2 정방향 프라이머를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 반응 혼합물은 최적으로 정렬되었을 때, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개 이상 또는 그 초과의 박테리아 종 중 어느 것 또는 그 모두와 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 이상의 서열 상동성을 나타내는 제2 역방향 프라이머를 추가로 포함한다. 상동성인 영역은 본원에 개시된 임의의 보존 영역, 예컨대, 스타필로코커스 아우레우스의 16S rRNA(진뱅크 수탁 번호 NC_007622)의 9 내지 28, 32 내지 48, 522 내지 545, 888 내지 903, 916 내지 937, 939 내지 973, 975 내지 994, 957 내지 981, 1093 내지 1125, 1184 내지 1206, 1231 내지 1252, 1378 내지 1396, 1398 내지 1422, 또는 1496 내지 1516인 영역, 또는 본원에서 언급된 박테리아 게놈 중 어느 하나에서의 상응하는 영역을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 원하는 경우, 반응 혼합물은 DNA 결합 염료 또는 본원에 개시된 다른 표지 분자를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 검출 가능한 표지를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 증폭은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개 이상 또는 그 초과의 박테리아 종 중 어느 하나로부터의 약 1 pg∼5 pg의 DNA의 사이클 역치 값(C_T)이 30 미만이 되도록 하는 조건 하에서 수행된다.

한 측면에서, 본 개시내용은 16S rRNA 폴리뉴클레오티드의 일부의 증폭 및 검출을 위한 반응 혼합물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 일부의 길이는 약 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 150, 또는 100개 미만의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 반응 혼합물은 샘플 핵산; 표적 16S rRNA 폴리뉴클레오티드를 이용하는 증폭 반응에서, 길이가 50개 이상의 뉴클레오티드이고, 최적으로 정렬되었을 때, 서열 번호 1∼3 중 어느 것과 90%의 서열 동일성을 가지는 앰플리콘을 증폭시키는 프라이머; 앰플리콘의 어느 한 가닥에 특이적으로 하이브리드화하는 하나 이상의 프로브; 및 폴리머라제를 포함하고; 여기서, 반응 혼합물은 반응 위치에 존재한다. 일부 실시양태에서, 반응 위치는 소적, 웰, 플레이트, 튜브, 챔버, 유동 셀 또는 칩이다. 일부 실시양태에서, 표적 16S rRNA 폴리뉴클레오티드를 이용하는 증폭 반응에서, 상기 프라이머 및 프로브에 의한, 복수 개의 표적 종 중 어느 하나로부터의 약 1 pg∼5 pg의 DNA의 증폭은 30 미만의 사이클 역치 값(C_T)을 갖는다.

한 측면에서, 본 개시내용은 샘플, 예컨대, 혈소판 샘플의 박테리아 오염을 검출하기 위한 키트를 제공한다. 한 실시양태에서, 키트는 서열 번호 9를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 표 2 또는 표 15에 기재된 서열의 10개 이상의 연속하는 뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머; 서열 번호 10을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 표 2 또는 표 15에 기재된 서열의 10개 이상의 연속하는 뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머; 서열 번호 16을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 표 3에 기재된 서열의 10개 이상의 연속하는 뉴클레오티드 또는 그의 상보체를 포함하는 프로브를 포함한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 키트를 사용하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 방법은 단일 프라이머 쌍을 이용하여 샘플 또는 그의 일부에 대해 핵산 증폭 반응을 수행하여 16S rRNA 폴리뉴클레오티드의 약 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 150, 또는 100개 이하의 염기로 이루어진 검출 가능한 양의 앰플리콘을 수득하는 단계로서, 여기서, 상이한 속으로부터의 복수 개의 박테리아 종 중 어느 하나로부터의 약 1 pg∼5 pg의 DNA의 증폭은 30 미만의 사이클 역치 값(C_T)을 갖는 것인 단계; 및 하나 이상의 검출 가능한 프로브를 이용하여 앰플리콘을 검출하는 단계로서, 여기서, 하나 이상의 검출 가능한 프로브는 각각 보존 서열에 특이적으로 하이브리드화하고, 보존 서열은 상이한 속으로부터의 복수 개의 박테리아 종 사이에 동일한 것인 단계를 포함한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 상이한 속으로부터의 복수 개의 박테리아 종 중 어느 것에 의한 샘플(예컨대, 혈소판 샘플, 혈액 샘플, 또는 연막 샘플)의 박테리아 오염을 검출하기 위한 시스템을 제공한다. 한 실시양태에서, 시스템은 샘플에 대하여 검출 반응을 수행하라는 고객 요청을 수신하도록 구성된 컴퓨터; 고객 요청에 응하여 샘플 또는 그의 일부에 대하여 핵산 증폭 반응을 수행하는 증폭 시스템으로서, 여기서, 증폭 반응은, 단일 프라이머 쌍 및 단일 프로브를 이용하여, 16S rRNA 폴리뉴클레오티드의 약 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 150, 또는 100개 이하의 염기로 이루어진 검출 가능한 양의 앰플리콘을 생성하고, 추가로, 여기서, 5개 이상의 속 중 어느 하나로부터의 1 pg∼5 pg의 DNA의 증폭은 30 미만의 C_T를 갖는 것인 증폭 시스템; 및 수신자에게 보고서를 발송하는 보고서 작성기로서, 여기서, 보고서는 프로브에 의해 생성된 신호 강도의 검출에 대한 결과를 포함하는 것인 보고서 작성기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 보고서 작성기는 프로브에 의해 생성된 신호 강도에 기초하여 샘플의 오염 여부를 확인한다. 일부 실시양태에서, 수신자는 고객이다.

한 측면에서, 본 개시내용은 컴퓨터 판독 가능 매체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 컴퓨터 판독 가능 매체는 하나 이상의 프로세서에 의한 실행 시, 상이한 속으로부터의 복수 개의 박테리아 종 중 어느 것에 의한 혈소판 샘플의 박테리아 오염을 검출하는 방법을 수행하는 코드를 포함한다. 한 실시양태에서, 코드 실행시 수행되는 본 방법은 샘플에 대하여 검출 반응을 수행하라는 고객 요청을 수신하는 단계; 고객 요청에 응하여 샘플 또는 그의 일부에 대하여 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계로서, 여기서, 증폭 반응은, 단일 프라이머 쌍 및 단일 프로브를 이용하여, 16S rRNA의 약 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 150, 또는 100개 이하의 염기로 이루어진 검출 가능한 양의 앰플리콘을 생성하고, 추가로, 여기서, 5개 이상의 속 중 어느 하나로부터의 1 pg∼5 pg의 DNA의 증폭은 30 미만의 C_T를 갖는 것인 단계; 및 프로브에 의해 생성된 신호 강도의 검출에 대한 결과를 포함하는 보고서를 작성하는 단계를 포함한다.

참고 문헌 포함

본 명세서에서 언급된 모든 공개 문헌, 특허, 및 특허 출원은 본원에서 마치 각각의 개별 공개 문헌, 특허, 및 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되어 있다고 언급된 것과 같은 정도로 참조로 포함된다.

본 발명의 신규한 특징은 첨부된 청구범위에 상세히 기재되어 있다. 본 발명의 원리가 사용되는 예시적인 실시양태를 기술하는 하기의 상세한 설명, 및 첨부된 도면을 참조함으로써 본 발명의 특징 및 이점을 더욱 잘 이해할 수 있을 것이다:
도 1은 핵산 증폭 반응의 결과를 도시한 그래프이다.
도 2는 핵산 증폭 검정법의 검출 범위를 도시한 그래프이다.
도 3a 및 3b는 핵산 증폭 반응의 결과를 도시한 그래프이다.
도 4a 및 4b는 핵산 증폭 반응의 결과를 도시한 그래프이다.
도 5는 예시적인 샘플 분석 시스템을 도시한 도해이다.
도 6a 및 6b는 리우(Liu) 등에 의해 기술된, 프라이머 및 프로브 사이의 하이브리드화의 샘플 분석 결과를 도시한 것이다.
도 7a는 핵산 증폭 반응의 결과를 도시한 그래프이다.
도 7b는 핵산 증폭 검정법의 검출 범위를 도시한 그래프이다.
도 8a-g는 핵산 증폭 반응의 결과를 도시한 그래프이다.
도 9는 핵산 증폭 반응의 결과를 도시한 그래프이다.
도 10a는 3중으로 수행된 핵산 증폭 반응의 결과를 도시한 그래프이다.
도 10b는 생성된 증폭된 핵산의 용융 곡선 분석 결과를 도시한 그래프이다.

본원에 개시된 일부 실시양태의 실시는 달리 언급되지 않는 한, 당업계의 기술 범위 내에 포함되어 있는 면역학, 생화학, 화학, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학, 유전체학, 및 재조합 DNA의 종래 기법을 사용한다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook and Green, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th Edition (2012)]; 시리즈 [Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds.)]; 시리즈 [Methods In Enzymology (Academic Press, Inc.), PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995))], [Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual], 및 [Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, 6th Edition (R.I. Freshney, ed. (2010))]을 참조할 수 있다.

본 명세서 및 청구범위에서 사용되는 바, "하나"("a," "an") 및 "그"라는 단수 형태는 달리 명확하게 명시되지 않는 한, 복수 개의 지시 대상을 포함한다. 예를 들어, "한 세포"라는 용어는 그의 혼합물을 비롯한, 복수 개의 세포를 포함한다.

"폴리뉴클레오티드," "뉴클레오티드," "뉴클레오티드 서열," "핵산" 및 "올리고뉴클레오티드"라는 용어는 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어는 임의의 길이의 뉴클레오티드의 다중체 형태로, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 또는 그의 유사체를 의미한다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있고, 공지된 또는 비공지된 임의의 기능을 수행할 수 있다. 하기는 폴리뉴클레오티드의 비제한적인 일례이다: 유전자 또는 유전자 단편의 코딩 또는 비코딩 영역, 연관 분석으로부터 정의된 유전자좌들(유전자좌), 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA: messenger RNA), 트랜스퍼 RNA, 리보솜 RNA, 짧은 간섭 RNA(siRNA: short interfering RNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA: short-hairpin RNA), 마이크로RNA(miRNA), 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드, 예컨대, 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 존재할 경우, 뉴클레오티드 구조에의 변형은 중합체 조립 이전 또는 이후에 부과될 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 비뉴클레오티드 성분에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 예컨대, 표지화 성분과의 컨쥬게이션에 의해 중합화 후에 추가로 변형될 수 있다.

일반적으로, "표적 폴리뉴클레오티드"라는 용어는 존재, 양 및/또는 뉴클레오티드 서열, 또는 상기 중 하나 이상의 것의 변화를 측정하고자 하는 것인 표적 서열을 가지는 핵산 분자의 출발 집단 중의 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 일반적으로, "표적 서열"이라는 용어는 단일 가닥 핵산 상의 핵산 서열을 의미한다. 표적 서열은 유전자의 일부, 조절 서열, 게놈 DNA, cDNA, mRNA, miRNA, rRNA를 비롯한 RNA 등일 수 있다. 표적 서열은 샘플로부터의 표적 서열, 또는 제2 표적, 예컨대, 증폭 반응의 생성물일 수 있다.

일반적으로, "뉴클레오티드 프로브," "프로브," 또는 "태그 올리고뉴클레오티드"는 상응하는 표적 서열과의 하이브리드화에 의해 하이브리드화 반응에서 그의 상응하는 표적 폴리뉴클레오티드를 검출 또는 확인하는 데 사용되는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 따라서, 뉴클레오티드 프로브는 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화 가능하다. 태그 올리고뉴클레오티드는 샘플 중 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오티드에 완벽하게 상보적일 수 있거나, 또는 샘플 중 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오티드 중 상응하는 뉴클레오티드에 의해 상보화되지 않는 하나 이상의 뉴클레오티드를 함유할 수 있다.

"하이브리드화"란 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 반응하여 뉴클레오티드 잔기의 염기 사이의 수소 결합을 통해 안정화되는 복합체를 형성하는 반응을 의미한다. 수소 결합은 왓슨 크릭(Watson Crick) 염기쌍 형성, 호그스테인(Hoogstein) 결합에 의해, 또는 임의의 다른 서열 특이 방식으로 일어날 수 있다. 복합체는 이중체 구조를 형성하는 두 가닥, 다중 가닥 복합체를 형성하는 세 가닥 이상의 가닥, 단일 자가 하이브리드화 가닥, 또는 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 하이브리드화 반응은 예컨대, PCR 개시, 또는 엔도뉴클레아제에 의한 폴리뉴클레오티드의 효소적 절단과 같은, 더욱 광범위한 프로세스 단계를 구성할 수 있다. 주어진 서열과 하이브리드화할 수 있는 서열은 주어진 서열의 "상보체"로서 지칭된다.

폴리뉴클레오티드에 대해 적용되는 바와 같이 "하이브리드화 가능한"이라는 용어는 뉴클레오티드 잔기의 염기 사이에 수소 결합을 통해 안정화되는 복합체를 형성할 수 있는 폴리뉴클레오티드의 능력을 의미한다. 수소 결합은 왓슨 크릭 염기쌍 형성, 호그스테인 결합에 의해, 또는 임의의 다른 서열 특이 방식으로 일어날 수 있다. 복합체는 이중체 구조를 형성하는 두 가닥, 다중 가닥 복합체를 형성하는 세 가닥 이상의 가닥, 단일 자가 하이브리드화 가닥, 또는 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 하이브리드화 반응은 예컨대, PCR 반응 개시, 또는 리보자임에 의한 폴리뉴클레오티드의 효소적 절단과 같은, 더욱 광범위한 프로세스 단계를 구성할 수 있다. 주어진 서열과 하이브리드화되는 서열은 주어진 서열의 "상보체"로서 지칭된다.

"상보성"이란 전통적인 왓슨 크릭 또는 다른 비전통적인 유형에 의해 또 다른 핵산 서열과 수소 결합(들)을 형성할 수 있는 핵산의 능력을 의미한다. 상보성(%)은 제2 핵산 서열과 수소 결합(예컨대, 왓슨 크릭 염기쌍 형성)을 형성할 수 있는 핵산 분자 중의 잔기의 비율(%)을 나타낸다. (예컨대, 10개 중 5, 6, 7, 8, 9, 10개인 것은 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 및 100% 상보성인 것이다). "완벽하게 상보성"이라는 것은 핵산 서열의 연속하는 잔기 모두가 제2 핵산 서열 중의 동일한 개수의 연속하는 잔기와 수소 결합을 형성한다는 것을 의미한다. 본원에서 사용되는 바, "실질적으로 상보성"이라는 것은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 이상의 뉴클레오티드로 이루어진 영역에 걸친 상보성 정도가 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 이상이거나, 또는 두 핵산이 엄격한 조건 하에서 하이브리드화하는 한다는 것을 의미한다.

본원에서 사용되는 바, 하이브리드화를 위해 "엄격한 조건"이란, 표적 서열과 상보성을 가지는 핵산이 우세하게 표적 서열과 하이브리드화하고, 비표적 서열에는 실질적으로 하이브리드화하지 않는 조건을 의미한다. 엄격한 조건은 일반적으로 서열 의존적이고, 다수의 인자에 따라 달라진다. 일반적으로, 서열이 길수록, 서열이 그의 표적 서열에 특이적으로 하이브리드화하는 온도는 더 높다. 엄격한 조건의 비제한적인 예는 문헌 [Tijssen (1993), Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part I, Second Chapter "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay", Elsevier, N.Y.]에 상세하게 기술되어 있다.

"피험체," "개체," 및 "환자"라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 이는 척추동물, 바람직하게, 포유동물, 더욱 바람직하게, 인간을 의미한다. 포유동물로는 뮤린, 시미안, 인간, 농경용 동물, 스포츠용 동물, 및 애완동물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 생체내에서 수득되거나, 또는 시험관내에서 배양된 생물학적 실체의 조직, 세포 및 그의 자손 또한 포함된다.

본원에서 사용되는 바, "발현"이란, 폴리뉴클레오티드가 DNA 주형으로부터(예컨대, mRNA 또는 다른 RNA 전사체로) 전사되는 프로세스, 및/또는 이어서, 전사된 mRNA가 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질로 번역되는 프로세스를 의미한다. 전사체 및 코딩된 폴리펩티드는 통틀어 "유전자 생성물"로 지칭될 수 있다. 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA로부터 유도되는 경우, 발현은 진핵 세포에서의 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "혈소판 샘플" 및 "혈소판 농축물"은 상호교환적으로 사용되며, 이는 혈소판 정제 프로세스로부터 유래된 혈소판을 포함하는 피험체의 생물학적 샘플을 의미한다. 혈소판은 다양한 방법, 예컨대, 원심분리 또는 성분채집술에 의해 하나 이상의 다른 혈액 성분으로부터 정제될 수 있다. 이어서, 상기 정제된 혈소판을 혼합하거나, 희석하거나, 분할하거나, 또는 추가로 정제할 수 있으며, 이들 모두를 통해 혈소판 정제 프로세스로부터 유래된 혈소판을 포함하는 샘플이 제조된다.

한 측면에서, 본 개시내용은 복수 개의 박테리아 종, 예컨대, 8개 이상의 박테리아 종 중 어느 것에 의한 혈소판 샘플의 박테리아 오염을 검출하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 방법은, 단일 반응 혼합물 중에서,약 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 150, 또는 100개 이하의 염기로 이루어진 검출 가능한 양의 앰플리콘을 수득할 수 있는 조건 하에 상기 샘플 또는 그의 일부에 대해 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계로서, 여기서, 상기 반응 혼합물은 단일 프라이머 쌍 및 단일 검출 가능 프로브를 포함하고, 여기서, 프라이머 쌍은 앰플리콘 측면에 위치하고, 앰플리콘은 검출 가능한 프로브가 하이브리드화하는 보존 서열을 포함하고, 보존 서열은 8개 이상의 박테리아 종 사이에 동일한 것인 단계; 및 상기 프로브에 의한 앰플리콘에의 하이브리드화를 검출하는 단계로서, 여기서, 프로브에 의한 하이브리드화는, 8개 이상의 박테리아 종 중 어느 것에 의한 혈소판 샘플의 박테리아 오염을 나타내는 검출 가능한 신호를 생성하는 것인 단계를 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 혈소판 샘플의 박테리아 오염을 검출하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 방법은, 단일 반응 혼합물 중에서, 약 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 150, 또는 100개 이하의 염기로 이루어진 검출 가능한 양의 앰플리콘을 수득할 수 있는 조건 하에 상기 샘플 또는 그의 일부에 대해 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계로서, 여기서, 상기 반응 혼합물은 단일 프라이머 쌍 및 단일 검출 가능 프로브를 포함하고, 여기서, 프라이머 쌍은 앰플리콘 측면에 위치하고, 앰플리콘은 검출 가능한 프로브가 하이브리드화하는 보존 서열을 포함하고, 샘플 또는 그의 일부는 증폭 전에 35℃ 초과의 온도에서 배양되지 않은 것인 단계; 및 상기 프로브에 의한 앰플리콘에의 하이브리드화를 검출하는 단계로서, 여기서, 프로브에 의한 하이브리드화가 혈소판 샘플의 박테리아 오염을 나타내는 검출 가능한 신호를 생성하는 것인 단계를 포함한다.

한 측면에서, 본 개시내용은 샘플 수득 후 24시간 이내에 혈소판 샘플 중의 박테리아 오염을 신속하게 검출하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 방법은, 단일 반응 혼합물 중에서, 약 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 150, 또는 100개 이하의 염기로 이루어진 검출 가능한 양의 앰플리콘을 수득할 수 있는 조건 하에 단일 프라이머 쌍 및 단일 검출 가능 프로브를 이용하여 샘플 또는 그의 일부에 대해 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계로서, 여기서, 프라이머 쌍은 앰플리콘 측면에 위치하고, 앰플리콘은 검출 가능한 프로브가 하이브리드화하는 보존 서열을 포함하고, 상기 종 중 어느 하나로부터의 약 1 pg∼5 pg의 DNA의 증폭은 30 미만의 사이클 역치 값(C_T)을 갖는 것인 단계; 및 상기 샘플 수득 후 약 24시간 이내에 상기 프로브에 의한 상기 앰플리콘에의 하이브리드화를 검출하여 상기 샘플 수득으로부터 약 24시간 이내에 오염을 검출하는 단계로서, 여기서, 상기 프로브에 의한 상기 하이브리드화가 혈소판 샘플의 박테리아 오염을 나타내는 검출 가능한 신호를 생성하는 것인 단계를 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 개시내용은 피험체의 생물학적 샘플 중 상이한 속으로부터의 복수 개의 박테리아 종 중 어느 것에 의한 박테리아 오염을 검출하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 방법은 단일 프라이머 쌍을 이용하여 샘플 또는 그의 일부에 대해 핵산 증폭 반응을 수행하여 16S rRNA 폴리뉴클레오티드의 약 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 150, 또는 100개 이하의 염기로 이루어진 검출 가능한 양의 앰플리콘을 수득하는 단계로서, 여기서, 종 중 어느 하나로부터의 약 1 pg∼5 pg의 DNA의 증폭은 30 미만의 사이클 역치 값(C_T)을 갖는 것인 단계; 및 하나 이상의 검출 가능한 프로브를 이용하여 앰플리콘을 검출하는 단계로서, 여기서, 하나 이상의 검출 가능한 프로브는 각각 보존 서열에 특이적으로 하이브리드화하고, 보존 서열은 상이한 속으로부터의 복수 개의 박테리아 종 사이에 동일한 것인 단계를 포함한다.

다양한 측면 중 어느 것에서, 핵산은 다양한 샘플 공급원으로부터 유래된 것일 수 있다. 핵산은 반드시 그러한 것은 아니지만, 임의적으로는 예컨대, 핵산 증폭 반응에서 추가로 조작되기 이전에 단리 및/또는 정제될 수 있다. 예를 들어, 생물학적 샘플에 대해서 별도의 추출 단계 없이 중합효소 연쇄 반응(PCR: polymerase chain reaction)을 수행할 수 있고, 이로써 비정제 샘플로부터 무세포 핵산이 정제된다. 추가의 일례로서, 다른 세포 성분으로부터 핵산을 정제하지 않고, 핵산 증폭 반응 직전에 또는 그 동안 샘플에 대해 세포 용해 조건을 가할 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산(예컨대, DNA, RNA, 또는 그 둘 모두)은 핵산에 대해 증폭 반응을 수행하기 이전에 생물학적 샘플로부터 정제된다. 다양한 핵산 정제 방법이 당업계에 공지되어 있고, 생물학적 샘플 유형에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 생물학적 샘플은 피험체로부터의 조직 및/또는 유체를 포함할 수 있다. 일반적으로, 생물학적 유체로는 살아있는 유기체와 관련된 임의의 처리된 또는 비처리된 유체를 포함하며, 이는 전혈, 가온 또는 냉 혈액, 및 보관된 또는 신선한 혈액을 비롯한, 혈액; 처리된 혈액, 예컨대, 염수, 영양액, 및/또는 항응고제 용액을 포함하나, 이에 한정되지 않는 1종 이상의 생리학적 용액으로 희석된 혈액; 혈액 성분, 예컨대, 혈소판 농축물(PC: platelet concentrate), 혈소판이 풍부한 혈장(PRP: platelet-rich plasma), 혈소판 결핍 혈장(PPP: platelet-poor plasma), 혈소판 무함유 혈장, 혈장, 신선한 냉동 혈장(FFP: fresh frozen plasma), 혈장으로부터 수득된 성분, 농축 적혈구(PRC: packed red cell), 이행부 물질 또는 연막(BC: buffy coat); 혈액 또는 혈액 성분으로부터 유래되거나, 또는 골수로부터 유래된 유사 혈액 생성물; 혈장으로부터 분리되고, 생리학적 유체 또는 동결 방지액 중에 재현탁된 적혈구; 및 혈장으로부터 분리되고, 생리학적 유체 또는 동결 방지액 중에 재현탁된 혈소판을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 생물학적 샘플의 다른 비제한적인 예로는 피부, 심장, 폐, 신장, 골수, 유방, 췌장, 간, 근육, 평활근, 방광, 담낭, 결장, 장, 뇌, 전립샘, 식도, 갑상샘, 혈정, 타액, 뇨, 위액 및 소화액, 눈물, 대변, 정맥, 질액, 종양성 조직으로부터 유래된 간질액, 안구액, 땀, 점액, 귀지, 오일, 선 분비물, 척수액, 모발, 손톱, 피부 세포, 혈장, 비강 스왑 또는 비강인두 세척액, 척수액, 뇌 척수액, 조직, 인후 스왑, 생검, 태반액, 양수, 제대혈, 두드러진(emphatic) 유체, 체강액, 객담, 고름, 미생물군, 태변, 모유, 및/또는 다른 분비물 또는 체조직을 포함한다. 일부 실시양태에서, 테스트하고자 하는 샘플은 전혈이다. 일부 실시양태에서, 테스트하고자 하는 샘플은 연막이다. 일부 실시양태에서, 분석되는 조직은 이식시키고자 하거나, 또는 외과적으로 이식시키고자 하는 조직의 일부, 예컨대, 기관(예컨대, 심장, 신장, 간, 폐 등), 피부, 뼈, 신경 조직, 힘줄, 혈관, 지방, 각막, 혈액, 또는 혈액 성분의 일부이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 피험체, 예컨대, 뮤린, 시미안, 인간, 농경용 동물, 스포츠용 동물, 또는 애완동물을 포함하나, 이에 한정되지 않는 포유동물로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 샘플 중의 오염 검출은 예컨대, 피험체 진단 또는 치료와 같은 의료 행위의 근거가 된다. 예를 들어, 오염은 피험체의 패혈증을 진단 또는 예측할 수 있다. 예컨대, 치료제 투여와 같은 정확한 의료 개입이 수행될 수 있다.

일부 실시양태에서, 테스트하고자 하는 샘플은 혈소판 샘플이다. 전혈의 다른 성분으로부터 혈소판을 정제하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 이는 원심분리 및/또는 여과를 사용하는 방법(예컨대, 성분채집술)을 포함한다. 혈소판을 전혈의 성분으로서 분리되었을 때, 농축시키고/거나, 혈장 및/또는 혈소판 첨가 용액 중에 재현탁시키고/거나, 여과 장치를 통해 통과시킴으로써 백혈구를 감소시키고/거나, 약 22℃ 온도에서 평상형으로 유지된 혈소판 보관백에 보관할 수 있다. 혈소판 샘플은 별도의 정제 방법으로부터의 혈소판 샘플의 풀, 또는 그의 일부를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 혈소판 샘플은 예컨대, 원심분리에 의해 혈소판이 제거된 정제된 혈소판의 샘플의 일부이다.

핵산은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 이용하여 생물학적 샘플로부터 추출될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 페놀, 페놀/클로로포름/이소아밀 알콜, 또는 트리졸(TRIzol) 및 트리리에이젼트(TriReagent)를 비롯한 유사 제제를 이용하는 유기 추출에 의해 정제될 수 있다. 추출 기법의 다른 비제한적인 예로는 (1) 자동 핵산 추출기, 예컨대, 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems: 미국 캘리포니아주 포스터 시티)로부터 이용가능한 모델 341 DNA 익스트랙터(Model 341 DNA Extractor)를 사용하거나, 또는 사용하지 않으면서, 예컨대, 페놀/클로로포름 유기 시약을 사용하여 수행되는 유기 추출에 이은 에탄올 침전(문헌 [Ausubel et al., 1993]); (2) 고정상 흡수 방법(미국 특허 번호 제5,234,809호; 문헌 [Walsh et al., 1991]); 및 (3) 염 유도 핵산 침전 방법(문헌 [Miller et al., (1988)])(상기 침전 방법은 전형적으로는 "염석" 방법으로 지칭된다)을 포함한다. 핵산 단리 및/또는 정제의 또 다른 예는 핵산이 특이적으로 또는 비특이적으로 결합할 수 있는 자기 입자(예컨대, 비드)를 사용한 후, 자석을 이용하여 입자를 분리하고, 입자로부터 핵산을 세척 및 용리시키는 것을 포함한다(예컨대, 미국 특허 번호 제5,705,628호 참조). 일부 실시양태에서, 상기 단리 방법 이전에 예컨대, 프로테이나제 K 또는 다른 유사 프로테아제를 이용하는 분해와 같은 효소 분해 단계를 수행함으로써 샘플로부터의 원치않는 단백질의 제거에 도움을 줄 수 있다. 예컨대, 미국 특허 번호 제7,001,724호를 참조할 수 있다. 원하는 경우, RN아제 억제제가 용해 완충제에 첨가될 수 있다. 특정 세포 또는 샘플 유형의 경우, 단백질 변성/분해 단계를 공정에 부가하는 것이 바람직할 수 있다. 정제 방법은 DNA, RNA(mRNA, rRNA, tRNA를 포함하나, 이에 한정되지 않음), 또는 그 둘 모두를 단리시키도록 지시될 수 있다. 추출 방법 동안에 또는 그 이후에 DNA 및 RNA, 둘 모두를 함께 단리시킬 때, 추가 단계를 사용하여 하나 또는 그 둘 모두를 나머지 다른 하나로부터 따로따로 정제할 수 있다. 추출된 핵산의 서브 분획은 또한 예를 들어, 크기, 서열, 또는 다른 물리적 또는 화학적 특징에 의한 정제에 의해서 생성될 수 있다. 초가 핵산 단리 단계 이외에도, 핵산 정제는 예컨대, 과량 또는 원치않는 시약, 반응물, 또는 생성물을 제거하는 후속 조작 이후에 수행될 수 있다.

다양한 측면 중 어느 것에서, 핵산 증폭 반응은 다양한 핵산 증폭 방법 중 어느 것을 포함할 수 있다. 일반적으로, "증폭"이란 표적 서열의 카피수를 증가시키는 임의의 프로세스를 의미한다. 표적 핵산의 검출 및 정량화를 위한 증폭 기반 방법 다수가 당업계에 공지되어 있다. 중합효소 연쇄 반응(PCR)은 변성, 프라이머 쌍의 반대 가닥에의 어닐링, 및 프라이머 연장을 다회 사이클로 수행하여 표적 서열의 카피수를 지수적으로 증가시키는 것을 사용한다. RT-PCR로 불리는 변형법에서, RNA로부터 상보적인 DNA를 제조하는 데 역전사 효소(RT: reverse transcriptase)가 사용되고, 이어서, cDNA는 PCR에 의해 증폭되어 DNA의 다중 카피가 제조된다(예컨대, 미국 특허 번호 제5,322,770호 및 제5,310,652호 참조).

증폭 방법은 (예컨대, 열 변성 단계에서의) 온도 변화를 포함할 수 있거나, 또는 열 변성 단계를 포함하지 않는 등온 프로세스일 수 있다. 등온 증폭 방법의 일례로는 통상 SDA(strand displacement amplification)로도 지칭되는 가닥 치환 증폭이 있으며, 이는 프라이머 서열을 표적 서열의 반대쪽 가닥에 어닐링시키는 단계, dNTP의 존재하에 프라이머를 연장시켜 이중체 헤미포스포로티오에이트화된 프라이머 연장 생성물을 수득하는 단계, 반변형된 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위를 엔도뉴클레아제를 매개로 니킹시키는 단계, 및 닉의 3' 말단으로부터 현존 가닥을 치환하여 다음 회차의 프라이머 어닐링, 니킹, 및 가닥 치환을 위한 가닥을 제조하는 단계로 이루어진 사이클을 수행하여 생성물을 기하학적으로 증폭시키는 것을 사용한다(예컨대, 미국 특허 번호 제5,270,184호 및 미국 특허 번호 제5,455,166호 참조). 고온성 SDA(tSDA: Thermophilic SDA)는 본질적으로 동일한 방법에서 더 높은 온도에서 고온성 엔도뉴클레아제 및 폴리머라제를 사용한다(유럽 특허 번호 0684315).

다른 증폭 방법의 예로는 회전 환 증폭(RCA: rolling circle amplification)(예컨대, 문헌 [Lizardi, "Rolling Circle Replication Reporter Systems,"], 미국 특허 번호 제5,854,033호); 헬리카제 의존 증폭(HDA: helicase dependent amplification)(예컨대, 미국 특허 출원 US 20040058378), 및 루프 매개 등온 증폭(LAMP: loop-mediated isothermal amplification)(예컨대, 문헌 [Notomi et al., "Process for Synthesizing Nucleic Acid,"], 미국 특허 번호 제6,410,278호)을 포함한다.

핵산 증폭 반응의 추가의 예로는 NASBA로도 지칭되는 전사 기반 증폭 방법, 예컨대, 핵산 서열 기반 증폭(예컨대, 미국 특허 번호 제5,130,238호(Malek 등)); 통상 Qβ 레플리카제로도 지칭되는, RNA 레플리카제를 사용하여 프로브 분자 그 자체를 증폭시키는 것에 의존하는 방법(예컨대, 문헌 [Lizardi, P. et al. (1988) BioTechnol. 6, 1197-1202]); 및 자가 유지 서열 복제(예컨대, 문헌 [Guatelli, J. et al. (1990) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 87, 1874-1878]; [Landgren (1993) Trends in Genetics 9, 199-202]; 및 [HELEN H. LEE et al. NUCLEIC ACID AMPLIFICATION TECHNOLOGIES (1997)])를 포함한다. 또 다른 전사 기반 증폭 방법은 통상 TMA(transcription-mediated amplification)로 지칭되는 전사 매개 증폭으로서, 이는 실질적으로 일정한 온도, 이온 강도, 및 pH 조건 하에서 자가 촉매 작용에 의해 표적 핵산 서열의 다중 카피를 합성하며, 여기서, 표적 서열의 다중 RNA 카피는 자가 촉매 작용에 의해 추가의 카피를 생성한다(예컨대, 미국 특허 번호 제5,480,784호; 및 미국 특허 번호 제5,399,491호). 핵산 증폭 방법의 추가 예로는 리가제 연쇄 반응(예컨대, 미국 특허 번호 제5,494,810호 및 제5,830,711호 참조), 및 고체상 증폭 방법(예컨대, 고체 표면, 예컨대, 슬라이드 또는 비드에 부착된 프라이머를 이용한 브릿지 증폭; 예컨대, 미국 특허 번호 제5,641,658호 및 제7,985,565호 참조)을 포함한다.

일반적으로, SDA는 하기와 같이 기술될 수 있다. 단일 가닥 표적 핵산, 일반적으로 DNA 표적 서열을 SDA 프라이머와 접촉시킨다. "SDA 프라이머"의 길이는 일반적으로 25∼100개의 뉴클레오티드 길이이며, 대략 35개의 뉴클레오티드로 이루어진 SDA 프라이머가 바람직하다. SDA 프라이머는 표적 서열 3' 말단의 영역에 실질적으로 상보적이고, 프라이머는 (표적에 상보적인 영역 바깥쪽의) 그의 5' 말단에 종종 "니킹 효소" 또는 "니킹 엔도뉴클레아제"로 지칭되는 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열인 서열을 가진다. 이어서, SDA 프라이머는 표적 서열에 하이브리드화한다. SDA 반응 혼합물은 또한 폴리머라제("SDA 폴리머라제") 및 (통상 프라이머 연장 반응에서 사용되며, 데옥시뉴클레오티드 또는 dNTP, 즉, dATP, dTTP, dCTP 및 dGTP로도 불리는)(상기 중 적어도 하나가 치환되거나, 또는 변형된 dNTP이다) 4가지 데옥시뉴클레오시드-트리포스페이트 모두의 혼합물을 함유하고; 이에 따라, SDA 프라이머는 연장되고, 이로써 종종 "새로 합성된 가닥"으로 지칭되는, 변형된 프라이머가 형성된다. 치환된 dNTP는 치환된 dNTP를 함유하는 가닥에서의 절단은 억제시키지만, 다른 가닥에서의 절단은 억제시키지 못하도록 변형된다. 적합한 치환된 dNTP의 예로는 2'데옥시아데노신 5'-O-(1-티오트리포스페이트), 5-메틸데옥시시티딘 5'-트리포스페이트, 2'-데옥시우리딘 5'-트리포스페이트, 및 7-데아자-2'-데옥시구아노신 5'-트리포스페이트를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 추가로, dNTP의 치환은 새로 합성된 가닥으로의 도입 이후에 이루어질 수 있다; 예를 들어, 메틸 기를 합성된 가닥에 부가하는 데 메틸라제가 사용될 수 있다. 추가로, 뉴클레오티드모두가 치환될 경우, 폴리머라제는 5' 3' 엑소뉴클레아제 활성을 가질 수 있다. 그러나, 모든 뉴클레오티드가 치환되는 것은 아닌 경우, 폴리머라제는 바람직하게는 5' 3' 엑소뉴클레아제 활성을 가지지 않을 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 인식 부위/엔도뉴클레아제 쌍은 매우 다양한 공지의 조합 중 어느 것일 수 있다. 엔도뉴클레아제는 상기 효소가 단지 한 가닥만을 절단하기 때문에, 또는 치환된 뉴클레오티드가 도입되기 때문에, 상보적인 서열은 절단하지 않으면서, 인식 부위에서, 또는 그에 대해 3' 또는 5'에서 가닥을 절단하도록 선택된다. 적합한 인식 부위/엔도뉴클레아제 쌍이 당업계에 공지되어 있으며, 이는 HincII, HindII, AvaI, Fnu4HI, TthIIII, NcII, BstXI, BamHI 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 적합한 효소, 및 그의 상응하는 인식 부위 및 사용되는 변형된 dNTP를 도시하는 차트는 미국 특허 번호 제5,455,166호(상기 특허는 본원에서 참조로 포함된다)에서 살펴볼 수 있다. 일단 니킹되고 나면, 새로 니킹된 가닥 5' 3'을 연장시키는 데 폴리머라제("SDA 폴리머라제")가 사용되며, 이를 통해 또 다른 새로 합성된 가닥이 생성된다. 선택된 폴리머라제는 닉 부위에서 5' 3' 중합화를 개시할 수 있어야 하고, 이는 또한 닉으로부터 하류의 중합화된 가닥을 치환할 수 있어야 하며, 5' 3' 엑소뉴클레아제 활성을 가지지 않아야 한다(이는 추가로 차단제 첨가로 달성될 수 있다). SDA에서 적합한 폴리머라제로는 DNA 폴리머라제 I의 클레나우(Klenow) 단편, 시쿼나제(SEQUENASE) 1.0 및 시쿼나제 2.0(미국 바이오케미칼(U.S. Biochemical))), T5 DNA 폴리머라제 및 Phi29 DNA 폴리머라제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일반적으로, SDA는 열순환을 필요로 하지 않는다. 반응 온도는 일반적으로 비특이적인 하이브리드화가 이루어지지 못하도록 충분히 높은 온도이지만, 특이적인 하이브리드화가 이루어질 수 있도록 충분히 낮은 온도로 설정된다; 상기 온도는 전형적으로 효소에 따라 약 37℃ 내지 약 42℃이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 다른 증폭 기법의 경우, 제2 프라이머 연장 반응은 상보적인 표적 서열을 사용함으로써 수행될 수 있고, 이를 통해 설정된 기간 동안 증폭은 실질적으로 증가하게 된다. 즉, 제2 프라이머 핵산은 제1 표적 서열에 실질적으로 상보적인 제2 표적 서열에 하이브리드화하고, 이로써 제2 하이브리드화 복합체가 형성된다. 효소를 첨가한 후, 제2 하이브리드화 복합체를 해리시키면 다수의 새로 합성된 제2 가닥이 생성된다. 따라서, 증폭은 선형 또는 비선형(예컨대, 지수적) 증폭일 수 있다.

NASBA는 일반적으로 미국 특허 번호 제5,409,818호; 문헌 [Sooknanan et al., Nucleic Acid Sequence-Based Amplification, Ch. 12 (pp. 261-285) of Molecular Methods for 바이러스 Detection, Academic Press, 1995]; 및 ["Profiting from Gene-based Diagnostics", CTB International Publishing Inc., N.J., 1996]에 기술되어 있으며, 상기 문헌은 모두 참조로 포함된다. NASBA는 TMA 및 QBR, 둘 모두와 매우 유사하다. 전사 매개 증폭(TMA: Transcription mediated amplification)은 일반적으로 미국 특허 번호 제5,399,491호, 제5,888,779호, 제5,705,365호, 제5,710,029호에 기술되어 있으며, 상기 문헌은 모두 참조로 포함된다. NASBA와 TMA의 주된 차이점은 NASBA의 경우, RNA 분해 효과를 위해 RN아제 H 부가를 사용하고, TMA는 역전사 효소의 고유한 RN아제 H 활성에 의존한다는 점이다. 일반적으로, 상기 기법은 하기와 같이 기술될 수 있다. 단일 가닥 표적 핵산, 일반적으로, RNA 표적 서열(이는 때때로 "제1 표적 서열" 또는 "제1 주형"으로 지칭된다)을 (비록 "TMA 프라이머" 또한 적합하기는 하지만) 일반적으로는 본원에서 "NASBA 프라이머"로 지칭되는 제1 프라이머와 접촉시킨다. DNA 표적 서열로부터의 출발은 하기 기술되어 있다. 상기 프라이머의 길이는 일반적으로 25∼100개의 뉴클레오티드 길이이고, 대략 50∼75개의 뉴클레오티드로 이루어진 NASBA 프라이머가 바람직하다. 제1 프라이머는 바람직하게 그의 3' 말단에, 제1 주형의 3' 말단에 실질적으로 상보적인 서열을 가지는 DNA 프라이머이다. 제1 프라이머는 또한 그의 5' 말단에 RNA 폴리머라제 프로모터(또는 시스템의 배열에 의존하여 그의 상보체(안티센스))를 가진다. 이어서, 제1 프라이머는 제1 주형에 하이브리드화함으로써 제1 하이브리드화 복합체를 형성한다. 반응 혼합물은 또한 역전사 효소인 효소("NASBA 역전사 효소") 및 4종의 dNTP로 이루어진 혼합물을 포함하며, 이로써, 제1 NASBA 프라이머는 연장되고, RNA(제1 주형) 및 DNA(새로 합성된 가닥)으로 이루어진 하이브리드화 복합체를 포함하는 변형된 제1 프라이머가 형성된다. 본원에서 "역전사 효소" 또는 "RNA 지정 DNA 폴리머라제"란, DNA 프라이머 및 RNA 주형으로부터 DNA를 합성할 수 있는 효소를 의미한다. 적합한 RNA 지정 DNA 폴리머라제로는 조류 골수아세포증 바이러스 역전사 효소("AMV RT": avian myeloblastosis virus reverse transcriptase) 및 몰로니(Moloney) 뮤린 백혈병 바이러스 RT를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 증폭 반응이 TMA일 ?, 역전사 효소인 효소는 RNA 분해 활성을 추가로 포함한다. 상기 열거된 성분 이외에도, NASBA 반응은 또한 단일 또는 이중 가닥 RNA 또는 DNA를 가수분해시키지 않으면서, RNA:DNA 하이브리드의 RNA를 가수분해시키는, 때때로는 또한 본원에서 리보뉴클레아제로서 언급되는 RNA 분해 효소를 포함한다. 적합한 리보뉴클레아제로는 E. 콜라이(E. coli) 및 송아지 흉선으로부터의 RN아제 H를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 리보뉴클레아제 활성은 하이브리드화 복합체 중의 제1 RNA 주형을 분해시켜 하이브리드화 복합체를 해리시키고, 이로써 제1 단일 가닥은 때때로 "제2 주형"으로 지칭되는 새로 합성된 DNA 가닥이 된다. 추가로, NASBA 반응은 또한 (비록 본원의 모든 프로브 및 프라이머의 경우, 핵산 유사체 또한 사용될 수 있지만) 일반적으로는 DNA를 포함하는 제2 NASBA 프라이머를 포함한다. 상기 제2 NASBA 프라이머는 그의 3' 말단에, 제2 주형의 3' 말단에 실질적으로 상보적인 서열을 가지며, 또한 기능적 프로모터에 대한 안티센스 서열 및 전사 개시 부위의 안티센스 서열을 포함한다. 따라서, 상기 프라이머 서열은 제3 DNA 주형의 합성을 위한 주형으로서 사용되는 경우, 이는 RNA 폴리머라제의 특이적이고 효율적인 결합, 및 원하는 부위에서의 전사 개시를 허용하는 데 충분한 정보를 포함한다. 다른 RNA 폴리머라제 프로모터 및 개시 부위 또한 사용될 수 있지만, 안티센스 프로모터 및 전사 개시 부위는 T7 RNA 폴리머라제의 것일 수 있다. 제2 프라이머는 제2 주형에 하이브리드화되고, "DNA 지정 DNA 폴리머라제"로도 지칭되며, 본 반응에도 또한 존재하는 DNA 폴리머라제는 제3 주형(제2 새로 합성된 DNA 가닥)을 합성하여 새로 합성된 DNA 가닥 2개를 포함하는 제2 하이브리드화 복합체를 생성한다. 마지막으로, RNA 폴리머라제 및 필요한 4개의 리보뉴클레오시드트리포스페이트(리보뉴클레오티드 또는 NTP)를 포함하면, RNA 가닥(제1 주형과 본질적으로 동일한 제3 새로 합성된 가닥)이 합성된다. 때때로 본원에서 "DNA 지정 RNA 폴리머라제"로도 지칭되는 RNA 폴리머라제는 프로모터를 인식하고, 개시 부위에서 RNA 합성을 특이적으로 개시한다. 추가로, RNA 폴리머라제는 바람직하게 DNA 이중체당 수개의 RNA 카피를 합성한다. 바람직한 RNA 폴리머라제로는 T7 RNA 폴리머라제, 및 파지 T3, 파지 φII, 살모넬라(Salmonella) 파지 sp6, 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 파지 gh-1의 것을 비롯한, 다른 박테리오파지 RNA 폴리머라제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, TMA 및 NASBA는 출발 DNA 표적 서열, RNA 폴리머라제 프로모터를 포함하는 제1 프라이머, 및 DNA 폴리머라제 효소와 함께 사용되며, 이를 통해 프로모터 서열을 포함하는 새로 합성된 가닥과의 이중 가닥 DNA 하이브리드가 생성된다. 이어서, 하이브리드를 변성시키고, 제2 프라이머를 첨가한다.

등온 증폭 반응의 또 다른 일례는 단일 프라이머 등온 증폭(SPIA: Single Primer Isothermal Amplification)이다. 상기 증폭 기법은 WO2001020035 및 미국 특허 번호 제6,251,639호에 개시되어 있으며, 상기 문헌은 본원에서 참조로 포함된다. 일반적으로, 상기 방법은 키메라 RNA/DNA 증폭 프라이머를 프로브 또는 표적에 하이브리드화시키는 단계를 포함한다. 바람직하게, 프로브의 DNA 부분은 RNA에 대하여 3'이다. 임의적으로, 상기 방법은 말단 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 복합 프라이머의 하이브리드화와 관련하여 주형에 대해 5'인 주형의 영역에 하이브리드화시키는 단계를 포함한다. 프라이머를 주형에 하이브리드화시킨 후, DNA 폴리머라제를 이용하여 프라이머를 연장시킨다. 이어서, RNA/DNA 하이브리드로부터 RNA를 절단하는 효소를 이용하여 프라이머로부터 RNA를 절단한다. 이어서, 추가의 RNA/DNA 키메라 프라이머를 주형에 하이브리드화시켜 제1 연장된 프라이머를 표적 프로브로부터 치환시킨다. 연장 반응을 반복하여 프로브 서열의 다수의 카피를 생성한다. 단 하나의 SPIA 프라이머가 사용될 때, 증폭 반응은 선형으로 진행된다. 제1 프라이머 연장 생성물에 대해 상보성인 역방향 SPIA 프라이머 또한 사용될 때, 증폭 반응은 비선형적이다.

일부 실시양태에서, 핵산 증폭 반응은 PCR 반응이다. PCR에 의한 표적 서열의 증폭에 바람직한 조건은 당업계에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있고, 다양한 프로세스 단계에서 최적화될 수 있으며, 반응 요소의 특징, 예컨대, 표적 유형, 표적 농도, 증폭시키고자 하는 서열 길이, 표적 및/또는 하나 이상의 프라이머의 서열, 프라이머 길이, 프라이머 농도, 사용되는 폴리머라제, 반응 부피, 하나 이상의 요소 대 하나 이상의 다른 요소의 비 등에 의존할 수 있으며, 이중 일부 또는 그 모두가 변경될 수 있다. 일반적으로, PCR은 증폭시키고자 하는 표적을 변성시키는 단계(이중 가닥일 경우), 하나 이상의 프라이머를 표적에 하이브리드화시키는 단계, 및 DNA 폴리머라제에 의해 프라이머를 연장시키는 단계를 포함하며, 표적 서열을 증폭시키기 위해 상기 단계는 반복(또는 "사이클링")될 수 있다. 상기 프로세스의 단계는 다양한 결과를 위해, 예컨대, 수율을 증진시키기 위해, 스퓨리어스 생성물 형성을 감소시키기 위해, 및/또는 프라이머 어닐링을 증가 또는 감소시키기 위해 최적화될 수 있다. 최적화 방법은 당업계에 공지되어 있고, 증폭 반응에서 요소의 유형 또는 양 및/또는 주어진 프로세스 단계의 조건, 예컨대, 특정 단계에서의 온도, 특정 단계의 지속 기간, 및/또는 사이클 회수의 조정을 포함한다. 일부 실시양태에서, 증폭 반응은 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 50회 이상의 사이클을 포함한다. 일부 실시양태에서, 증폭 반응은 5, 10, 15, 20, 25, 35, 50 또는 그 초과의 사이클보다 많지 않은 사이클을 포함한다. 사이클은 임의의 횟수의 단계, 예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 이상의 단계를 포함할 수 있고, 사이클링되는 단계는 사이클링되는 상기 단계에 포함되지 않은 하나 이상의 단계(예컨대, 개시 용융 단계 또는 최종 인큐베이션 단계) 이후에 및/또는 그 이전에 진행될 수 있다. 프라이머 어닐링, 프라이머 연장, 및 가닥 변성을 포함하나, 이에 한정되지 않는 단계는 주어진 단계의 목적을 달성하는 데 적합한 임의의 온도 또는 온도 구배를 포함할 수 있다. 단계는 약 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 180, 240, 300, 360, 420, 480, 540, 600초, 또는 그 초과, 또는 그보다 짧은 시간, 또는 그보다 긴 시간(수동으로 중단될 때까지 무기한인 시간 포함)을 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의의 지속 기간의 것일 수 있다. 상이한 단계를 포함하는 임의의 회차의 사이클은 임의의 순서로 조합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조합에서 총 사이클 횟수가 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 50회 이상의 사이클, 또는 그보다 적은, 또는 그보다 많도록 상이한 단계를 포함하는 상이한 사이클이 조합된다.

다양한 측면 중 어느 것의 일부 실시양태에서, 핵산 증폭 반응은 하나 이상의 프라이머, 예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 프라이머, 또는 그보다 많은 프라이머, 또는 그보다 적은 프라이머의 3' 말단 연장을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 증폭 반응에서 프라이머 연장은 단 하나의 프라이머 쌍을 포함한다. 다른 실시양태에서, 핵산 증폭 반응에서 프라이머 연장은 다수의 프라이머 쌍, 예컨대, 2, 3, 4, 5개 이상의 프라이머 쌍을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프라이머 쌍은 제1 프라이머 및 제2 프라이머로 구성되며, 여기서, 제1 프라이머는 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부에 하이브리드화 가능한 서열을 포함하고, 추가로, 여기서, 제2 프라이머는 제1 프라이머 연장 생성물의 상보체의 적어도 일부에 하이브리드화 가능한 서열을 포함한다. 표적 폴리뉴클레오티드가 이중 가닥일 때, 제1 프라이머 연장 생성물의 상보체의 적어도 일부에 하이브리드화 가능한 제2 프라이머의 서열은 또한 표적 폴리뉴클레오티드의 상보적인 가닥의 적어도 일부에 하이브리드화 가능할 수 있다. 증폭 반응이 복수 개의 프라이머 쌍을 포함할 때, 복수 개의 프라이머 쌍은 (각 쌍에 대한 2개의 상이한 프라이머에서와 같이) 상이한 쌍이거나, 중복 쌍이거나, 또는 상이한 쌍 및 중복 쌍의 조합일 수 있다. 증폭 프라이머의 길이는 임의의 적합한 길이일 수 있고, 예컨대, 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100개 이상의 뉴클레오티드 길이, 그보다 적은 뉴클레오티드 길이, 또는 그보다 많은 뉴클레오티드 길이일 수 있으며, 그의 임의의 일부 또는 그들 모두는 상응하는 표적 서열(예컨대, 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 이상의 뉴클레오티드, 그보다 적은 뉴클레오티드, 또는 그보다 많은 뉴클레오티드)에 상보적일 수 있다. 전형적으로, 프라이머가 상보적인 부분 및 비상보적인 부분을 포함할 때, 표적 서열에 상보적인 부분은 프라이머의 3' 말단에 위치한다. 프라이머 쌍은 임의의 원하는 길이의 표적 서열을 증폭시키도록 디자인될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "앰플리콘"이란 핵산 증폭 반응에서 표적 폴리뉴클레오티드로부터 단일 또는 이중 가닥 형태로 증폭되는 표적 서열을 의미한다. 앰플리콘이 프라이머 쌍에 의해 증폭될 때, 앰플리콘은 일반적으로 프라이머 쌍 측면에 위치하며, 이로써, 한 프라이머는 표적 서열의 5' 말단에서 하이브리드화되고, 나머지 다른 한 프라이머는 표적 서열의 3' 말단의 상보체에 하이브리드화된다. 일부 실시양태에서, 앰플리콘의 길이는 약 1,000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 250, 200, 175, 150, 125, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25 이하의 뉴클레오티드 길이, 또는 그보다 짧은 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 앰플리콘의 길이는 약 50, 100, 200, 300, 400, 500, 750, 1,000개 이상의 뉴클레오티드 길이, 또는 그보다 긴 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 앰플리콘 길이는 상기 종점 중 임의의 두 종점 사이의 것, 예컨대, 예컨대, 25∼1,000, 30∼500, 50∼400, 50∼250, 50∼150, 또는 100∼200 뉴클레오티드 길이이다. 프라이머는 다양한 디자인 고려 사항 중 어느 것에 대한 적합성에 기초하여 선택될 수 있으며, 이는 단독으로, 또는 본원에 개시되거나, 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 디자인 고려 사항과 함께 조합하여 사용될 수 있다. 프라이머에 대한 임의적인 디자인 고려 사항에 대한 추가의 비제한적인 예로는 같은 뉴클레오티드(예컨대, 3, 4, 5개 이상의 같은 뉴클레오티드가 일렬로) 전개되는 것을 피하는 것; (예컨대, 프라이머의 3' 말단과 같은 가닥을 따라 프로브의 5' 말단 사이의 약 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 25, 30, 40, 50, 75, 100개 이상의 뉴클레오티드, 또는 그보다 짧은 뉴클레오티드인) 중복 프로브 하이브리드화 부위 없이 프로브에 인접해 있는 것; 약 20%-80% 이내의 G-C 함량, 선택된 범위(예컨대, 약 55-65℃, 58-62℃, 또는 58-60℃) 이내의 용융 온도(T_m); 3' 말단의 마지막 5개의 뉴클레오티드 이내에 2개 이하의 G 및/또는 C 염기를 가지는 것; 한 쌍의 프라이머의 T_m이 유사한(예컨대, 동일한 T_m, 또는 서로 약 약 1-2℃ 이내인 T_m) 것; 최소 2차 구조(예컨대, 최적으로 폴딩되었을 때, m폴드(mFold)를 이용하는 분석에 의해 약 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 왓슨 크릭 쌍 형성 염기, 또는 그보다 적은 것(예컨대, 문헌 [Zuker et al., Nucl. Acid Res, 2003, 31: 3406-3415] 참조); 동종이량체 또는 이종이량체로서 반응에서 프라이머 사이의 최소 하이브리드화(예컨대, 최적으로 정렬되었을 때, 약 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 왓슨 크릭 쌍 형성 염기, 또는 그보다 적은 것); 및 프라이머와 상응하는 프로브 사이의 최소 하이브리드화(예컨대, 최적으로 정렬되었을 때, 약 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 왓슨 크릭 쌍 형성 염기, 또는 그보다 적은 것)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프라이머는 길이가 약 25, 50, 75, 100, 125, 150, 또는 175개 뉴클레오티드 길이 또는 약 25, 50, 75, 100, 125, 150, 또는 175개 이상의 뉴클레오티드 길이이고, 최적으로 정렬되었을 때, 표 1의 서열(또는 그의 상보체)과 약 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99%, 99.5% 이상의 서열 동일성 또는 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99%, 99.5% 이상의 서열 동일성을 가지는 앰플리콘을 특이적으로 증폭시킨다. 최적의 서열 정렬을 측정하는 방법 및 알고리즘은 당업계에 공지되어 있고, 그 중 어느 것이 서열 동일성(%)을 측정하는 데 사용될 수 있다. 두 서열 사이의 서열 동일성을 측정하기 위한 알고리즘의 일례로 미국 국립 생물 공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)에 의해 blast.ncbi.nlm.nih.gov에서 유지되는 바와 같은, 베이직 로컬 얼라이먼트 서치 툴(BLAST: Basic Local Alignment Search Tool)을 포함한다.

일부 실시양태에서, 프라이머 쌍은 고체 지지체 상에 고정화된다. 고체 지지체의 일례로는 무기 물질, 예컨대, 실리카 기반 기판(예컨대, 유리, 석영, 용융 실리카, 실리콘 등), 다른 반도체 물질, 및 유기 물질, 예컨대, 중합체 물질(예컨대, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 셀룰로스, 아가로스, 또는 통상 반응 매질을 위한 지지체로서 사용되는 다양한 유기 기판 물질 중 어느 것)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 고체 지지체로서 유용한 다양한 물질 이외에도, 고체 지지체 구조는 미세입자, 비드, 나노입자, 나노결정, 섬유, 미세섬유, 나노섬유, 나노와이어, 나노튜브, 매트, 평면 시트, 평면 웨이퍼, 또는 슬라이드, 다중웰 플레이트, 추가 구조를 포함하는 광학 슬라이드, 모세관, 미세유동 채널 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 물리적 배열 중 어느 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 고체 지지체 상에서의 증폭은 브릿지 증폭을 포함한다. 브릿지 증폭의 일반 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, WO/1998/044151 및 WO/2000/018957을 참조할 수 있다.

적어도 5, 10, 15, 20개 이상의 상이한 박테리아 게놈 사이에 보존되는 영역에 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 프라이머 서열이 특이 관심의 대상이 된다. 예를 들어, 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 선택된 적어도 5, 10, 15, 20개 이상의 상이한 박테리아 게놈 사이에 보존되는 별개의 영역에 하이브리드화된다. 이러한 보존 영역은 스타필로코커스 아우레우스의 16S rRNA(진뱅크 수탁 번호 NC_007622)의 9 내지 28, 32 내지 48, 522 내지 545, 888 내지 903, 916 내지 937, 939 내지 973, 975 내지 994, 957 내지 981, 1093 내지 1125, 1184 내지 1206, 1231 내지 1252, 1378 내지 1396, 1398 내지 1422, 또는 1496 내지 1516인 영역, 또는 박테리아 게놈: 스타필로코커스 아우레우스 Mu3; 스타필로코커스 에피더미디스, 스트렙토코커스 아갈락티아에, 스트렙토코커스 파이오제네스, 스트렙토코커스 뉴모니아, 에스케리치아 콜라이, 시트로박터 코세리, 클로스트리듐 퍼프린젠스, 엔테로코커스 패칼리스, 클렙시엘라 뉴모니아, 락토바실러스 애시도필러스, 리스테리아 모노사이토제네스, 세라티아 마르세센스, 바실러스 세레우스, 프로피오니박테리움 종, 스타필로코커스 아우레우스 Mu50, 예르시니아 엔테로콜리티카, 스타필로코커스 시뮬란스, 마이크로코커스 루테우스, 및 엔테로박터 에어로제네스 중 어느 하나에서의 상응하는 영역을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

일부 실시양태에서, 피험체 프라이머는 적어도 5, 10, 15, 20개 이상의 상이한 박테리아 게놈의 보존 영역에 특이적으로 하이브리드화할 수 있으며, 이로써, 적어도 5, 10, 15, 20개 이상의 상이한 박테리아 게놈 중 임의의 유형의 것을 특이적으로 증폭 및 검출할 수 있다. 상기 프라이머 디자인 및 그의 세트를 통해 광범위한 박테리아 균주 세트 간의 박테리아 감염을 동시에 측정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기와 같은 검출은 단일 프라이머 쌍을 이용하는 단일 증폭 반응으로 이루어질 수 있고, 임의적으로는 하나 이상의 임의적 프라이머와 함께 진행됨으로써 추가의 박테리아 적용 범위를 제공할 수 있다. 상기 프라이머 및 그의 세트는 본원에 개시된 프로브 또는 다른 표지화 분자, 예컨대, DNA 결합 염료(예컨대, SYBR^® 그린(SYBR^® Green)) 등과 함께 사용될 수 있다.

핵산 증폭 반응에서 프라이머 연장은 당업계에 공지된 임의의 적합한 폴리머라제, 예컨대, DNA 폴리머라제에 의해 수행될 수 있으며, 그 중 다수는 상업적으로 이용가능하다. DNA 폴리머라제는 DNA 의존 DNA 폴리머라제 활성, RNA 의존 DNA 폴리머라제 활성, 또는 DNA 의존 및 RNA 의존 DNA 폴리머라제 활성을 포함할 수 있다. DNA 폴리머라제는 열안정성 또는 비열안정성일 수 있다. DNA 폴리머라제의 예로는 Taq 폴리머라제, Tth 폴리머라제, Tli 폴리머라제, Pfu 폴리머라제, Pfu튜보(Pfutubo) 폴리머라제, 피로베스트(Pyrobest) 폴리머라제, Pwo 폴리머라제, KOD 폴리머라제, Bst 폴리머라제, Sac 폴리머라제, Sso 폴리머라제, Poc 폴리머라제, Pab 폴리머라제, Mth 폴리머라제, Pho 폴리머라제, ES4 폴리머라제, VENT 폴리머라제, DEEPVENT 폴리머라제, EX-Taq 폴리머라제, LA-Taq 폴리머라제, Expand 폴리머라제, 플래티넘 Taq 폴리머라제, Hi-Fi 폴리머라제, Tbr 폴리머라제, Tfl 폴리머라제, Tru 폴리머라제, Tac 폴리머라제, Tne 폴리머라제, Tma 폴리머라제, Tih 폴리머라제, Tfi 폴리머라제, 클레나우 단편, 및 그의 변이체, 변형된 생성물 및 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 박테리아를 사용하여 제조된 효소를 고도로 정제시켜 비주형 대조군 증폭 반응이 약 25, 30, 35, 40, 45회 이상의 PCR 반응 사이클, 또는 그보다 많은 회차의 PCR 반응 사이클 이후 배경 수준보다 큰 증폭 신호를 생성하지 못하도록 한다.

다양한 측면 중 어느 것의 일부 실시양태에서, 핵산 증폭 생성물은 증폭 프로세스 동안 및/또는 그 완료시에 검출된다. 증폭 생성물 검출은 증폭 검정법에서 실시간으로 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 증폭된 생성물은 DNA 인터컬레이터 및 DNA 그루브 결합제를 포함하나, 이에 한정되지 않는 형광성 DNA 결합제로 직접적으로 시각화될 수 있다. 이중 가닥 DNA 분자 내로 혼입되는 인터컬레이터의 양은 전형적으로 증폭되는 DNA 생성물의 양에 비례하기 때문에, 편리하게는 종래 광학 시스템을 사용하여 삽입된 염료의 형광을 정량화함으로써 증폭된 생성물의 양을 측정할 수 있다. DNA 결합 염료의 비제한적 일례로는 SYBR^® 그린, SYBR 블루, DAPI, 프로피디움 요오딘, 훽스트(Hoechst), SYBR 골드, 에티디움 브로마이드, 아크리딘, 프로플라빈, 아크리딘 오렌지, 아크리플라빈, 플루오르쿠마닌, 엘립티신, 다우노마이신, 클로로퀸, 디스타마이신 D, 크로모마이신, 호미디움, 미트라마이신, 루테니움 폴리피리딜, 안트라마이신 등을 포함한다.

일부 실시양태에서, 증폭된 생성물의 검출 및/또는 정량화를 촉진시키기 위해 핵산 증폭 반응에서 서열 특이 올리고뉴클레오티드 프로브가 사용된다. 프로브 기반 정량적 증폭은 예컨대, 프로브와, 증폭 생성물 내의 표적 서열 사이의 특이적인 하이브리드화에 의한 원하는 증폭된 생성물의 서열 특이 검출에 의존한다. 표적 특이 프로브의 예로는 제한 없이, 택맨(TaqMan)® 프로브 및 분자 비콘을 포함한다. 프로브 기반의 정량적 증폭을 수행하는 일반 방법은 당업계에 공지되어 있다(예컨대, 미국 특허 번호 제5,210,015호 참조). 하이브리드화는 다양한 엄격도하에서 수행될 수 있다. 적합한 하이브리드화 조건은 일반적으로 올리고뉴클레오티드 프로브 및/또는 프라이머와 의도하는 표적 서열 사이의 우선적인 하이브리드화를 제공하기 위해 프로브와 표적 폴리뉴클레오티드 사이의 인식 상호작용이 충분히 특이적이고, 충분히 안정적일 수 있도록 하는 조건이 된다. 하이브리드화 반응의 엄격도를 증가시키는 조건은 당업계에 공지되어 있고, 어닐링 온도 및/또는 염 농도의 최적화를 포함한다. 올리고뉴클레오티드 프로브의 길이는 임의의 적합한 길이, 예컨대, 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100개 이상의 뉴클레오티드 길이, 그보다 짧은 뉴클레오티드 길이, 또는 그보다 긴 뉴클레오티드 길이일 수 있고, 그의 임의의 일부 또는 그들 모두는 상응하는 표적 서열(예컨대, 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 이상의 뉴클레오티드, 그보다 짧은 뉴클레오티드, 또는 그보다 긴 뉴클레오티드)에 상보적일 수 있다. 일부 실시양태에서, 복수 개의 프로브, 예컨대, 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25개 이상의 프로브, 또는 그보다 적은 프로브가 단일 핵산 증폭 반응에 사용된다. 일부 실시양태에서, 단일 핵산 증폭 반응은 단 2개의 프로브, 예컨대, 하나 이상의(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상 또는 그보다 많은) 그람 양성 박테리아로부터의 서열에 특이적으로 하이브리드화하는 것 하나, 및 하나 이상의(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상 또는 그보다 많은) 그람 음성 박테리아로부터의 서열에 특이적으로 하이브리드화하는 두번째 것을 함유한다. 일부 실시양태에서, 단일 핵산 증폭 반응은 단 하나의 프로브만, 예컨대, 복수 개의 상이한 박테리아 종(예컨대, 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50개 이상의 종 또는 그보다 많은 종) 사이에 동일하고/거나, 복수 개의 상이한 속(예컨대, 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50개 이상의 속 또는 그보다 많은 속)으로부터의 박테리아 사이에 동일한 서열에 특이적으로 하이브리드화하는 프로브를 함유한다. 프로브는 다양한 디자인 고려 사항 중 어느 것에 대한 적합성에 기초하여 선택될 수 있으며, 이는 단독으로, 또는 본원에 개시되거나, 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 디자인 고려 사항과 함께 조합하여 사용될 수 있다. 프로브에 대한 임의적인 디자인 고려 사항에 대한 추가의 비제한적인 예로는 같은 뉴클레오티드(예컨대, 3, 4, 5개 이상의 같은 뉴클레오티드가 일렬로) 전개되는 것을 피하는 것; 중복 없는 증폭 프라이머 하이브리드화 부위(예컨대, 프라이머의 3' 말단과 같은 가닥을 따라 프로브의 5' 말단 사이의 약 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 25, 30, 40, 50, 75, 100개 이상의 뉴클레오티드, 또는 그보다 짧은 뉴클레오티드)에 인접해 있는 것; 약 20%-80% 이내의 G-C 함량, 선택된 범위 이내의 용융 온도(T_m)(예컨대, 상응하는 프라이머 T_m보다 약 8-10℃ 더 높은 온도); 및 G보다 C를 더 많이 가지는 것; 5' 말단 상에 G를 포함하지 않는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브는 길이가 약 25, 50, 75, 100, 125, 150, 또는 175개 뉴클레오티드 길이 또는 약 25, 50, 75, 100, 125, 150, 또는 175개 이상의 뉴클레오티드 길이이고, 최적으로 정렬되었을 때, 표 1의 서열과 약 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99%, 99.5% 이상의 서열 동일성 또는 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99%, 99.5% 이상의 서열 동일성을 가지는 앰플리콘에 특이적으로 하이브리드화한다. 최적의 서열 정렬을 측정하는 방법 및 알고리즘은 당업계에 공지되어 있고, 그 중 어느 것이 서열 동일성(%)을 측정하는 데 사용될 수 있다. 두 서열 사이의 서열 동일성을 측정하기 위한 알고리즘의 일례로 미국 국립 생물 공학 정보 센터에 의해 blast.ncbi.nlm.nih.gov에서 유지되는 바와 같은, 베이직 로컬 얼라이먼트 서치 툴(BLAST)을 포함한다.

하이브리드화 검정법을 수행하는 동안 형성되는 프로브-표적 복합체의 편리한 검출을 위해, 뉴클레오티드 프로브는 검출 가능한 표지에 컨쥬게이트될 수 있다. 적합한 검출 가능한 표지로는 광화학적, 생화학적, 분광, 면역화학적, 전기적, 광학적, 또는 화학적 수단에 의해 검출 가능한 임의의 조성물을 포함할 수 있다. 매우 다양한 적절한 검출 가능한 표지가 당업계에 공지되어 있고, 이는 형광성 표지, 화학발광성 표지, 방사성 동위원소 표지, 효소적 표지, 및 리간드를 포함한다. 하이브리드화 강도를 검출 또는 정량화하는 데 사용되는 검출 방법은 전형적으로 상기 선택된 표지에 의존할 것이다. 예를 들어, 방사성 표지는 사진 필름 또는 포스포이미저를 사용하여 검출될 수 있다. 형광성 마커는 방출된 광을 검출하는 광검출기를 사용하여 검출되고, 정량화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단일 반응에서 복수 개의 프로브는 각각 상이한 검출 가능한 표지(예컨대, 상이한 방출 스펙트럼을 가지는 형광성 염료)에 컨쥬게이트되고, 이로써 상이한 표적의 증폭에 상응하는 신호가 차별화될 수 있다. 효소적 표지는 전형적으로 효소를 기질에 제공하고, 기질에 대한 효소의 작용에 의해 생성된 반응 생성물을 측정함으로써 검출되고; 마지막으로, 비색 표지는 간단하게 색상을 띠는 표지를 시각화함으로써 검출된다.

일부 실시양태에서, 결합된 프로브의 하이브리드화는 택맨 검정법(PE 바이오시스템즈(PE Biosystems: 미국 캘리포니아주 포스터 시티); 예컨대, 미국 특허 번호 제5,962,233호 및 제5,538,848호(상기 문헌은 각각 본원에서 참조로 포함된다))을 사용하여 검출된다. 상기 검정법은 PCR 반응 동안 수행된다. 택맨 검정법은 DNA 폴리머라제 예컨대, AMPLITAQ DNA 폴리머라제의 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성을 이용한다. 서열 특이 프로브가 PCR 반응에 포함된다. 전형적인 택맨 프로브는 5' 리포터 염료(예컨대, 형광성 염료) 및 3' 소광제 염료를 포함하는 올리고뉴클레오티드이다. PCR 동안, 프로브가 그의 표적에 결합하였다면, AMPLITAQ 폴리머라제의 5'-3' 뉴클레오티드 분해 활성이 리포터 염료와 소광제 염료 사이의 프로브를 절단한다. 소광제 염료로부터 리포터 염료가 분리되면 형광은 증가하게 된다. 신호는 각 PCR 사이클마다 축적되고, 형광계로 모니터링될 수 있다. 다양한 리포터-소광제 쌍이 당업계에 공지되어 있다. 일부 쌍은 형광 공명 에너지 전이(FRET: fluorescence resonance energy transfer)를 통해 상호작용한다. FRET에서 리포터 또는 소광제로서 보편적으로 사용되는 분자로는 플루오레세인 염료(예컨대, FAM, JOE, 및 HEX), 로다민 염료(예컨대, R6G, TAMRA, ROX), 시아닌 염료(예컨대, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, 및 Cy7), DABCYL, 및 EDANS를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 형광성 염료가 리포터로서 또는 소광제로서 작용하는지 여부는 그의 여기 및 방출 스펙트럼에 의해, 및 그가 쌍을 이루는 형광성 염료에 의해 정의된다. 예를 들어, FAM은 파장 488 nm인 광에 의해 가장 효과적으로 여기되고, 500 내지 650 nm의 스펙트럼의 광을 방출하고, 525 nm일 때, 최대로 방출한다. FAM은 514 nm에서 그의 여기 최대치를 가지는, 소광제로서 예컨대, TAMRA와 함께 사용하는 데 적합한 리포터 표지이다. 형광성 염료로부터 흡수된 에너지를 소산시키는 비형광성 또는 암(dark) 소광제의 예로는 바이오서치 테크놀러지즈 인크.(Biosearch Technologies, Inc.: 미국 캘리포니아주 노바토)에 의해 시판되는 블랙 홀 켄쳐즈(Black Hole Quenchers)™를 포함한다. 블랙 홀 켄쳐즈™는 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 헤테로아릴 화합물, 또는 그의 조합으로부터 선택되는 3개 이상의 라디칼을 포함하는 구조체로서, 여기서, 잔기 중 2개 이상이 엑소사이클릭 디아조 결합을 통해 연결된 것인 구조체이다(예컨대, 국제 공개 번호 WO2001086001 참조). 다른 암 소광제로는 아이오와 블랙(Iowa Black) 소광제(예컨대, 아이오와 블랙 FQ™ 및 아이오와 블랙 RQ™), 이클립스® 다크 켄쳐즈(Eclipse® Dark Quenchers)(에포치 바이오사이언시즈, 인크.(Epoch Biosciences, Inc.: 미국 워싱턴주 보셀)), 및 젠(Zen)™ 소광제(인테그레티드 DNA 테크놀러지즈, 인크.(Integrated DNA Technologies, Inc.; 미국 아이오와주 코럴빌))를 포함한다. 소광제에 대한 추가의 비제한적인 일례 또한 미국 특허 번호 제6,465,175호에 제공되어 있다.

일부 실시양태에서, 결합된 프로브의 하이브리드화는 예컨대, 미국 특허 번호 제5,925,517호, PCT 출원 번호 WO1995013399, 및 미국 특허 번호 제6,150,097호에 기술된 것과 같은 분자 비콘 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 검출된다. 전형적인 분자 비콘에서, 중앙의 표적 인식 서열은, 프로브가 표적 가닥에 하이브리드화되지 않을 때, 서로 하이브리드화하여 헤어핀 구조를 형성하는 것인 아암 측면에 위치하고, 여기서, 표적 인식 서열은 헤어핀 구조의 단일 가닥 루프 중에 존재하고, 아암 서열은 이중 가닥 줄기 하이브리드를 형성한다. 프로브가 표적에 하이브리드화될 때, 상대적으로 강성인 나선이 형성되며, 이로써 줄기 하이브리드는 언와인딩되고, 아암은 분리된다. FRET 쌍, 예컨대, 형광단 EDANS 및 소광제 DABCYL(또는 본원에 기술되거나, 또는 당업계에 공지된 다른 쌍)은 알킬 스페이서에 의해 아암에 부착될 수 있다. 분자 비콘이 표적 가닥에 하이브리드화되지 않을 때, 형광단의 방출은 소광된다. 분자 비콘이 표적 가닥에 하이브리드화될 때, FRET 쌍은 분리되고, 형광단의 방출은 소광되지 않는다. 방출된 형광은 표적 가닥의 존재에 대한 신호를 보낸다. 신호는 핵산 증폭 반응 동안, 예컨대, PCR 반응에서 각 사이클 종료시 형광계로 검출될 수 있다. 신호 강도는 표적 서열의 양이 증가함에 따라 증가하게 된다.

문헌 [Whitcombe et al., Detection Of PCR Products Using Self-probing Amplicons and Fluorescence, Nature Biotechnology 17: 804-807 (August 1999)]에 개시되어 있는 바와 같이, PCR 생성물의 검출은 자가 프로빙 앰플리콘을 사용함으로써 달성될 수 있다. 스콜피온 프라이머(Scorpion Primer)는 프로브 요소를 포함하는 5' 연장부, 한쌍의 자가 상보성 줄기 서열, 및 형광단/소광제 쌍을 포함한다. 연장부는 차단 헥세틸렌 글리콜(HEG: hexethylene glycol) 단량체를 포함함으로써 카피되는 것으로부터 "보호된다." 프라이머로부터의 1회차의 PCR 연장 후, 이제 새로 합성된 표적 영역은 프로브와 동일한 가닥에 부착된다. 2회차 변성 및 어닐링 후, 프로브 및 표적은 하이브리드화되고, 이어서, 프로브는 형광화된다. 따라서, 본원에 기술된 바와 같은 "프로브"는 프라이머의 일부로서 존재할 수 있다.

다양한 측면 중 어느 것의 일부 실시양태에서, 핵산 증폭 반응에서 증폭되는 표적 서열은 보존되는 박테리아 폴리뉴클레오티드의 일부의 서열이다. 일부 실시양태에서, 보존 폴리뉴클레오티드의 증폭된 일부분은 상이한 박테리아 속 간에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5% 이상, 또는 그보다 더 높은 상동성을 보인다. 보존 폴리뉴클레오티드 서열의 예로는 16S rRNA 유전자, 23S rRNA 유전자, 5S rRNA 유전자, 5.8S rRNA 유전자, 12S rRNA 유전자, 18S rRNA 유전자, 28S rRNA 유전자, gyrB 유전자, rpoB 유전자, fusA 유전자, recA 유전자, cox1 유전자 및 nifD 유전자에서 발견되는 뉴클레오티드 서열을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 보존 폴리뉴클레오티드는 16S rRNA 폴리뉴클레오티드의 일부이다(예컨대, rRNA, rDNA, 증폭 생성물, 또는 그의 조합). 1,250개 뉴클레오티드 길이보다 큰 거의 40,000개의 정렬된 16S rDNA 서열의 목록은 로렌스 버클리 내셔날 라보라토리(Lawrence Berkeley National Laboratory)에 의해 운영되는 공개적으로 접근가능한 데이터베이스인 그린진스(Greengenes) 웹 어플리케이션 상에서 찾아볼 수 있다. 다른 공개적으로 접근가능한 데이터베이스로는 진뱅크, 미시간주 대학(Michigan State University) 리보솜 데이터베이스 프로젝트, 막스 플랑크 해양 미생물 실바 연구소(Max Planck Institute for Marine Microbiology's Silva) 데이터베이스, 및 미국 국립 보건원(National Institute of Health) NCBI를 포함한다. 증폭 표적 서열의 비제한적인 일례는 표 1에 제시되어 있다. 일부 실시양태에서, 앰플리콘 길이는 약 25, 50, 75, 100, 125, 150, 또는 175개의 뉴클레오티드 길이 또는 적어도 약 25, 50, 75, 100, 125, 150, 또는 175개의 뉴클레오티드 길이이고, 최적으로 정렬되었을 때, 표 1의 서열과 약 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99%, 99.5% 이상, 또는 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99%, 99.5% 이상의 서열 동일성을 가진다. 최적의 서열 정렬을 측정하는 방법 및 알고리즘은 당업계에 공지되어 있고, 그 중 어느 것이 서열 동일성(%)을 측정하는 데 사용될 수 있다. 두 서열 사이의 서열 동일성을 측정하기 위한 알고리즘의 일례로 미국 국립 생물 공학 정보 센터에 의해 blast.ncbi.nlm.nih.gov에서 유지되는 바와 같은, 베이직 로컬 얼라이먼트 서치 툴(BLAST)을 포함한다.

일부 실시양태에서, 보존 폴리뉴클레오티드의 일부는 복수 개의 상이한 박테리아 종(예컨대, 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50개 이상 또는 그보다 많은 것) 사이에 동일하고/거나, 복수 개의 상이한 속(예컨대, 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50개 이상 또는 그보다 많은 것)으로부터의 박테리아 사이에 동일한 서열에 특이적으로 하이브리드화 가능한 제1 프라이머 및 제2 프라이머로 이루어진 한쌍의 프라이머에 의해 특이적으로 증폭된다. 따라서, 단일의 범용 프라이머 쌍을 이용한 증폭은 단일 반응에서 복수 개의 상이한 유기체로부터의 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 프라이머 쌍은 그의 3' 말단에 표 1의 서열로부터의 적어도 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25개 이상의 연속하는 뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머, 및 그의 3' 말단에 같은 표 1 서열로부터의 적어도 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25개 이상의 연속하는 뉴클레오티드로 이루어진 상보체를 포함하는 제2 프라이머를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 증폭 반응에서 하나 이상의 프라이머는 그의 3' 말단에 표 2로부터 선택되는 서열의 약 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 뉴클레오티드, 또는 그들 모두를 포함한다. 일부 실시양태에서, 그의 3' 말단에 서열 번호 4로부터의 약 10개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머는 그의 3' 말단에 서열 번호 5 또는 6으로부터의 약 10개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머와 조합하여 사용된다. 일부 실시양태에서, 그의 3' 말단에 서열 번호 7로부터의 약 10개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머는 그의 3' 말단에 서열 번호 8로부터의 약 10개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머와 조합하여 사용된다. 일부 실시양태에서, 그의 3' 말단에 서열 번호 9로부터의 약 10개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머는 그의 3' 말단에 서열 번호 10으로부터의 약 10개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머와 조합하여 사용된다.

다양한 측면의 일부 실시양태에서, 복수 개의 유기체의 존재, 부재, 및/또는 양이 단일 반응에서 검출된다. 일부 실시양태에서, 검출되는 유기체는 미생물이며, 그의 비제한적인 예로는 바이러스, 바이로이드, 박테리아, 고세균, 진균, 및 원생동물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 미생물은 박테리아이다. 검출되는 박테리아는 그람 양성 박테리아, 그람 음성 박테리아, 또는 그람 양성 박테리아 및 그람 음성 박테리아의 조합일 수 있다. 단일 반응에서 검출될 수 있는 박테리아의 비제한적인 예로는 스타필로코커스 아우레우스, 스타필로코커스 아우레우스 Mu3; 스타필로코커스 에피더미디스, 스트렙토코커스 아갈락티아에, 스트렙토코커스 파이오제네스, 스트렙토코커스 뉴모니아, 에스케리치아 콜라이, 시트로박터 코세리, 클로스트리듐 퍼프린젠스, 엔테로코커스 패칼리스, 클렙시엘라 뉴모니아, 락토바실러스 애시도필러스, 리스테리아 모노사이토제네스, 프로피오니박테리움 그래눌로섬, 슈도모나스 아에루기노사, 세라티아 마르세센스, 바실러스 세레우스, 스타필로코커스 아우레우스 Mu50, 예르시니아 엔테로콜리티카, 스타필로코커스 시뮬란스, 마이크로코커스 루테우스, 및 엔테로박터 에어로제네스 중 2개 이상(예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 검출되는 박테리아는 모두 검출하고자 하는 모든 박테리아 사이에 공유되는 서열에 상보적인 단일 프로브를 이용하여 검출된다. 한쌍의 범용 프라이머 측면에 위치하고, 그에 의해 증폭되는 표적 서열은 보존 폴리뉴클레오티드를 가지는 복수 개의 상이한 유기체 사이에 상이할 수 있거나(예컨대, 하나 이상의 삽입, 결실, 치환 또는 그의 조합을 가질 수 있거나), 보존 폴리뉴클레오티드를 가지는 복수 개의 상이한 유기체 사이에 동일할 수 있거나, 또는 그의 조합일 수 있다. 전형적으로, 한쌍의 범용 프라이머 측면에 위치하고, 그에 의해 증폭되는 표적 서열은 복수 개의 상이한 박테리아 종(예컨대, 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50개 이상 또는 그보다 많은 것) 사이에 동일하고/거나, 복수 개의 상이한 속(예컨대, 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50개 이상 또는 그보다 많은 것)으로부터의 박테리아 사이에 동일한 뉴클레오티드 서열의 하나 이상의 보존 내부 영역을 포함하며, 상기 보존 내부 영역은 프로브 표적으로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 보존 내부 영역은 복수 개의 그람 양성 박테리아 사이에 동일하고, 그람 음성 박테리아 사이에는 동일하지 않거나, 또는 그 반대의 경우도 그러하다. 일부 실시양태에서, 보존 내부 영역의 길이는 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100개 이상의 뉴클레오티드 길이, 또는 적어도 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100개 이상의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 프라이머는 검출하고자 하는 종 및/또는 속 사이의 앰플리콘 서열이 검출하고자 하는 종 및/또는 속 간에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 98%, 99%, 99.5% 이상, 또는 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 98%, 99%, 99.5% 이상의 서열 동일성을 가지도록 선택된다. 일부 실시양태에서, 프라이머는 검출하고자 하는 종 및/또는 속 간의 표적 길이 범위 내의 앰플리콘, 예컨대, 본원에 기술된 임의의 앰플리콘 길이를 제조하도록 선택된다.

일부 실시양태에서, 증폭된 보존 내부 영역과 프로브 올리고뉴클레오티드 사이의 하이브리드화에 의해 복수 개의 박테리아 종 및/또는 속이 검출된다(그리고 임의적으로 정량화된다). 일반적으로, 보존 내부 영역에 특이적으로 하이브리드화하는 프로브로부터의 양성 신호가 표적 서열의 존재를 나타내며, 이는 표적 서열을 가지는 1개 이상의 유기체가 핵산이 유래된 샘플 중에 존재한다는 것을 나타내는 것이다. 이러한 방식으로, 공통 프로브를 이용하여 복수 개의 종 및/또는 속의 존재, 부재, 및/또는 양을 검출할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로브는 표 1의 서열, 또는 그에 상보적인 서열로부터의 적어도 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25개 이상의 연속하는 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 증폭 반응에서 하나 이상의 프로브는 표 3으로부터 선택되는 서열 또는 그의 상보체의 약 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 뉴클레오티드, 또는 그들 모두를 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열 번호 11, 12, 또는 13(또는 그의 상보체)으로부터의 10개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 프로브는 서열 번호 4-6에 기반한 프라이머에 의해 증폭된 증폭 생성물을 검출하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 서열 번호 14 또는 15(또는 그의 상보체)로부터의 10개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 프로브는 서열 번호 7-8에 기반한 프라이머에 의해 증폭된 증폭 생성물을 검출하는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 서열 번호 16(또는 그의 상보체)으로부터의 10개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 프로브는 서열 번호 9-10에 기반한 프라이머에 의해 증폭된 증폭 생성물을 검출하는 데 사용된다.

다양한 측면 중 어느 것의 일부 실시양태에서, 프라이머 및 프로브는 표적 폴리뉴클레오티드 검출 감도를 최대화시킬 수 있도록 선택된다. 일부 실시양태에서, 감도는 사이클 역치(C_T) 값에 의해 측정된다. 초기 PCR 사이클에서 형광 신호의 변화는 없다. 이는 증폭 플롯(사이클 수에 따른 형광 강도의 플롯)에 대한 기준선을 정의한다. 형광이 기준선보다 높게 증가하였다면, 이는 축적된 PCR 생성물이 검출되었음을 시사하는 것이다. 고정 형광 역치를 기준선보다 높게 설정할 수 있다. 파라미터 C_T는 형광이, 전형적으로 로그 선형 증폭 단계에서 기준선 또는 배경보다 통계학상 유의적으로 더 높은 강도인 고정 역치를 통과하게 되는 사이클 수 분율로서 정의된다. 주어진 반응 또는 반응 세트에서 형광 역치 수준을 계산하기 위한 소프트웨어가 전형적으로 실시간 PCR 분석 소프트웨어 패키지에 포함된다. 하나의 공통된 역치 설정 방법은 기준선(배경) 평균 신호를 측정하고, 역치를 기준선 평균 신호보다 10배 높게 설정하는 것이다. 대안으로, 역치 값은 약 10 x 기준선 방출값의 표준 편차로 설정될 수 있다. C_T에 대한 표준 세트에 관한 고치 표적 카피수의 로그 플롯은 전형적으로 직선이다. 비공지 샘플 중의 표적의 양을 정량화하는 것은 C_T를 측정하고, 표준 곡선을 사용하여 출발 카피수를 측정함으로써 달성된다. 일부 실시양태에서, 검출은 약 3, 4, 5, 6, 7, 8 로그 이상, 또는 그 초과인 값에 걸쳐 선형의 검출 범위를 보인다. 일부 실시양태에서, 약 10 pg, 5 pg, 4 pg, 3 pg, 2 pg, 1 pg, 0.5 pg, 0.1 pg, 또는 그 미만인 값, 또는 상기 값 중 임의의 값 사이의 범위(예컨대, 0.5∼4 pg, 1 pg∼5 pg, 1 pg∼3 pg 등)의, 증폭 반응에서 프로브에 의해 검출 가능한 박테리아 종 중 어느 하나로부터의 게놈 DNA의 증폭의 C_T는 30 미만이다. 일부 실시양태에서, 약 15,000, 10,000, 5,000, 2,500, 1,500, 1,000, 500, 200, 100, 50개 이하, 또는 그 미만인 값의, 증폭 반응에서 프로브에 의해 검출 가능한 표적 서열의 출발 카피의 증폭의 C_T는 30 미만이다. 일부 실시양태에서, 약 1 pg의, 증폭 반응에서 프로브에 의해 검출 가능한 박테리아 종 중 어느 하나로부터의 게놈 DNA의 증폭의 C_T는 약 30, 29, 28, 27, 26, 25 이하 또는 그 미만인 값이다. 일부 실시양태에서, 음성 대조군 샘플에 대한 C_T는 약 100 pg, 10 pg, 5 pg, 4pg, 3pg, 2pg, 1 pg, 0.5 pg, 0.1 pg, 또는 상기 값 중 임의의 값 사이의 범위(예컨대, 0.5∼4 pg, 1 pg∼5 pg, 1 pg∼3 pg, 5 pg∼10 pg 등)의, 증폭 반응에서 프로브에 의해 검출 가능한 박테리아 종 중 어느 하나로부터의 게놈 DNA를 함유하는 샘플에 대한 C_T보다 2 사이클 이상(예컨대, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 사이클 이상) 더 높다. 전형적으로, 음성 대조군은 모든 반응 시약을 포함하지만, 주형은 첨가되지 않은(예컨대, 주형 대신 물이 첨가되거나, 표적 앰플리콘을 포함하지 않는 것으로 알려져 있는 폴리뉴클레오티드, 예컨대, 박테리아 특이 앰플리콘의 경우, 인간 게놈 DNA가 첨가된 것인) 증폭 반응이다. 일부 실시양태에서, 박테리아 오염은 약 25 mL, 20 mL, 15 mL, 10 mL, 5 mL, 4 mL, 3 mL, 2 mL, 1 mL, 0.1 mL 이하 또는 그 미만인 값의 혈소판 농축물로부터의 핵산 중에서 검출된다. 일부 실시양태에서, 증폭은 먼저 샘플을 인큐베이션시켜 박테리아 성장을 촉진시키지 않고, 예컨대, 약 30℃, 35℃ 또는 37℃ 초과의 온도에서 혈소판 샘플 또는 그의 일부에 대하여 수행된다. 일부 실시양태에서, 검출은 혈소판 샘플 중 1 ml당 약 50, 25, 10, 5, 4, 3, 2, 1, 0.1 이하, 또는 그 미만인 값의 콜로니 형성 단위(CFU/mL)의 박테리아 로드를 갖는 혈소판 샘플의 박테리아 오염을 나타내는 검출 가능한 신호를 생성한다. 일부 실시양태에서, 50,000, 40,000, 30,000, 25,000, 20,000, 15,000, 10,000, 7500, 5,000, 2,500, 1,250, 1,000, 750, 500, 250, 100, 50, 25, 10, 5 이하의 CFU 미만인 것으로부터 유래된 핵산이 검출 반응에 존재할 때, 검출은 혈소판 샘플의 박테리아 오염을 나타내는 검출 가능한 신호를 생성한다. 일부 실시양태에서, 검출 가능한 신호는 5 내지 50,000 CFU, 500 내지 25,000 CFU, 1,000 내지 10,000 CFU, 또는 25 내지 2,500 CFU로부터 유래된 핵산을 함유하는 반응에 대해 수득된다. 일부 실시양태에서, 검출은 기증된 혈소판 샘플 수혈 전에 완료되고, (박테리아 오염을 시사하는) 양성 신호가 검출될 경우, 기증된 혈소판은 수혈자에게 수혈되지 않는다. 일부 실시양태에서, 개시된 검출 역치 중 임의의 값에서 또는 그보다 큰 값에서 오염을 가지는 샘플에 대한 양성 신호가 피험체로부터 샘플을 수득한 시점으로부터(예컨대, 피험체로부터 혈액을 채취한 시점으로부터) 약 약 48, 24, 12, 6, 4, 2시간 이하인 기간 이내에 검출된다.

본원에 기술된 측면 중 어느 것의 일부 실시양태에서, 검출 방법은 생물학적 샘플을 사용하기 직전이 시점에(예컨대, 혈액 샘플 또는 혈액 유래 샘플, 예컨대, 혈소판 샘플을 피험체에게 투여하기 전에) 개시되고, 샘플 수집 시점과 상관없이, 그를 사용하기 이전에 결과를 수득한다. 예를 들어, 생물학적 샘플은 생물학적 샘플을 계획된 대로 사용하기 전 약 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1시간 또는 그 시간보다 짧은 시간에 오염에 대해 테스트될 수 있고, 검출 결과는 상기와 같은 계획된 사용 시점 이전에(예컨대, 사용 전 1, 2, 3, 4, 5시간 이상) 수득된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 계획된 사용의 약 5시간 이내에 테스트되고, 결과는 상기와 같은 계획된 사용 시점 이전에 수득된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 계획된 사용의 약 2시간 이내에 테스트되고, 결과는 상기와 같은 계획된 사용 시점 이전에 수득된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 계획된 사용의 약 1시간 이내에 테스트되고, 결과는 상기와 같은 계획된 사용 시점 이전에 수득된다. 일부 실시양태에서, 검출 방법에 의해 박테리아 오염이 검출되었다면, 생물학적 샘플은 사용되지 않고 폐기된다. 일부 실시양태에서, 박테리아 오염이 검출되지 않았다면, 생물학적 샘플은 계획된 대로 사용이 진행된다. 일부 실시양태에서, 사용 전 테스트되는 샘플은 계획된 사용 시점 이전에 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10일 이상 또는 그 시간보다 더 긴 시간에 수집되었다. 일부 실시양태에서, 사용 전 테스트되는 샘플은 계획된 사용 시점 이전에 약 5일 또는 그 시간보다 더 긴 시간에 수집되었다.

한 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 방법 중 어느 것에서 사용하기 위한 시스템을 제공한다. 일부 실시양태에서, 시스템은 상이한 속으로부터의 복수 개의 박테리아 종 중 어느 것에 의한 샘플, 예컨대, 혈소판 샘플의 박테리아 오염을 검출하는 데 사용된다. 한 실시양태에서, 시스템은 샘플에 대하여 검출 반응을 수행하라는 고객 요청을 수신하도록 구성된 컴퓨터; 고객 요청에 응하여 샘플 또는 그의 일부에 대하여 핵산 증폭 반응을 수행하는 증폭 시스템으로서, 여기서, 증폭 반응은, 단일 프라이머 쌍 및 단일 프로브를 이용하여, 16S rRNA 폴리뉴클레오티드의 약 500개 이하의 염기로 이루어진 검출 가능한 양의 앰플리콘을 생성하고, 추가로, 여기서, 5개 이상의 속 중 어느 하나로부터의 1 pg∼5 pg의 DNA의 증폭은 30 미만의 C_T를 갖는 것인 증폭 시스템; 및 수신자에게 보고서를 발송하는 보고서 작성기로서, 여기서, 보고서는 프로브에 의해 생성된 신호 강도의 검출에 대한 결과를 포함하는 것인 보고서 작성기를 포함한다.

일부 실시양태에서, 컴퓨터는 하나 이상의 프로세서를 포함한다. 프로세서는 컴퓨터 시스템의 하나 이상의 컨트롤러, 연산 장치, 및/또는 다른 장치와 관련될 수 있거나, 또는 원하는 바에 따라 펌웨어에서 실행될 수 있다. 소프트웨어에서 실행될 경우, 루틴은 임의의 컴퓨터 판독 가능한 메모리, 예컨대, RAM, ROM, 플래시 메모리, 자기 디스크, 레이저 디스크, 또는 다른 저장 매체에 저장될 수 있다. 유사하게, 상기 소프트웨어는 예를 들어, 통신 채널, 예컨대, 전화 선로, 인터넷, 무선 연결 등을 통한 것을 비롯한, 임의의 공지된 전달 방법을 통해, 또는 휴대용 매체, 예컨대, 컴퓨터 판독 가능한 디스크, 플래시 드라이브 등을 통해 컴퓨팅 장치로 전달될 수 있다. 다양한 단계가 다양한 블록, 운용, 도구, 모듈 또는 기법으로서 실행될 수 있고, 이는 결국에는 하드웨어, 펌웨어, 소프트웨어, 또는 그의 임의의 조합으로 실행될 수 있다. 하드웨어에서 실행될 때, 블록, 운용, 기법 등 중 일부 또는 그들 모두는 예를 들어, 주문형 집적 회로(IC: integrated circuit), 특수 용도의 집적 회로(ASIC: application specific integrated circuit), 필드 프로그램 가능 논리 배열(FPGA: field programmable logic array), 프로그램 가능 논리 배열(PLA: programmable logic array) 등에서 실행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 컴퓨터는 샘플에 대하여 검출 반응을 수행하라는 고객 요청을 수신하도록 구성된다. 컴퓨터는 고객 요청을 직접(예컨대, 입력 장치, 예컨대, 고객 또는 고객 요청을 입력하는 사용자에 의해 작동되는 키보드, 마우스, 또는 터치 스크린에 의해), 또는 간접적으로(예컨대, 인터넷을 통해 이루어지는 것을 비롯한, 유선 또는 무선 연결을 통해) 수신할 수 있다. 고객의 비제한적인 예로는 샘플을 제공하는 피험체, 의료인, 임상의, 실험실 직원, 보험 회사 직원, 또는 건강 관리 산업 종사자를 포함한다.

일부 실시양태에서, 시스템은 컴퓨터에 의한 고객 요청 수령에 대한 반응으로 샘플 또는 그의 일부에 대하여 핵산 증폭 반응을 수행하기 위한 증폭 시스템을 포함한다. 증폭 시스템은 검출 데이터 분석을 위한 액체 취급기, 열순환기, 광학 검출기, 및/또는 프로세서를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플 프로세싱, 핵산 단리, 증폭 및/또는 분석에서 하나 이상이 단계는 증폭 시스템에 의해 자동화된다. 일부 실시양태에서, 자동화는 하나 이상의 액체 취급기 및 관련 소프트웨어를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 상기 프로세스의 자동화를 진행하는 데 수개의 상업적으로 이용가능한 액체 취급 시스템이 사용될 수 있다(예를 들어, 퍼킨-엘머(Perkin-Elmer), 캘리퍼 라이프 사이언시즈(Caliper Life Sciences), 테칸(Tecan), 에펜도르프(Eppendorf), 애프리코트 디자인(Apricot Design), 벨러시티 11(Velocity 11)로부터의 액체 취급기 참조). 일부 실시양태에서, 검출은 실시간 검출 장치를 포함한다. 예시적인 실시간 장치로는 ABI PRISM® 7000 시퀀스 디텍션 시스템(Sequence Detection System), ABI PRISM® 7700 시퀀스 디텍션 시스템, 어플라이드 바이오시스템즈 7300 리얼 타임 PCR 시스템(Real-Time PCR System), 어플라이드 바이오시스템즈 7500 리얼 타임 PCR 시스템, 어플라이드 바이오시스템즈 7900 HT 패스트 리얼 타임 PCR 시스템(Fast Real-Time PCR System)(모두 어플라이드 바이오시스템즈로부터 입수); 라이트사이클러™ 시스템(LightCycler™ System)(로슈 다이아그나스틱스 게엠베하(Roche Diagnostics GmbH); Mx3000P™ 리얼 타임 PCR 시스템, Mx3005P™ 리얼 타임 PCR 시스템, 및 Mx4000® 멀티플렉스 콴터티브 PCR 시스템(Multiplex Quantitative PCR System)(스트라테이진(Stratagene: 미국 캘리포니아주 라호야))); 및 스마트 사이클러 시스템(Smart Cycler System)(세페이드(Cepheid), 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific)에 의해 배포)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 샘플을 프로세싱 및/또는 검정하기 위한 자동 시스템에 대한 추가의 비제한적인 일례로는 COBAS® 앰플리프렙/COBAS® 택맨®(COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan®) 시스템(로슈 몰레큘라 시스템즈(Roche Molecular Systems)), TIGRIS DTS 시스템(홀로직 젠-프로브(Hologic Gen-Probe: 미국 캘리포니아주 샌디에고)), PANTHER 시스템(홀로직 젠-프로브: 미국 캘리포니아주 샌디에고), BD MAX™ 시스템(벡톤 디킨슨(Becton Dickinson)), 진X퍼트 시스템(GeneXpert System)(세페이드), 필마레이(Filmarray)®(바이오파이어 다이아그나스틱스(BioFire Diagnostics)), i큐베이트(iCubate) 시스템, IDBox 시스템(루미넥스(Luminex)), 엔콤패즈MDx™(EncompassMDx™)(레오닉스(Rheonix)), 리아트™ 애널라이저(Liat™ Aanlyzer)아이쿰(IQuum)), 바이오카르티스 몰레큘라 다이아그나스틱 플랫폼(Biocartis' Molecular Diagnostic Platform), 에니그마®(Enigma®) ML 시스템(에니그마 다이아그나스틱스(Enigma Diagnosstics)), T2Dx® 시스템(T2 바이오시스템즈(Biosystems)), 베리진®(Verigene®) 시스템(나노스피어(NanoSphere)), 그레이트 바신스 다이아그나스틱 시스템(Great Basin's Diagnostic System), 우니베로™ 시스템(Unyvero™ System)(큐레티스(Curetis)), 팬NAT(PanNAT) 시스템(마이크로닉스(Micronics)), 스파르탄(Spartan)™ RX 시스템(스파르탄 바이오사이언스(Spartan Bioscience)), 아틀라스 이오(Atlas io) 시스템(아틀라스 게네틱스(Atlas Genetics)), 이딜라(Idylla) 플랫폼(바이오카르티스), ARIES(루미넥스), 젠마크스(GenMark's) 자동화 PCR 플랫폼(예컨대, e센서(eSensor) 시스템), 3M 인테그레티드 사이클러(3M Integrated Cycler)(포커스 다이아그나스틱스(Focus Diagnostics)), 및 알레레(Alere) i 자동화 PCR 플랫폼(알레레)을 포함한다. 실시간 장치에 관한 설명은 다른 여러 곳 중에서도 그의 각 제조사의 사용자 매뉴얼; [McPherson]; [DNA Amplification: Current Technologies and Applications, Demidov and Broude, eds., Horizon Bioscience, 2004]; 및 미국 특허 번호 제6,814,934호에서 살펴볼 수 있다.

일부 실시양태에서, 시스템은 수신자에게 보고서를 발송하는 보고서 작성기로서, 여기서, 보고서는 프로브에 의해 생성된 신호 강도의 검출에 대한 결과를 포함하는 것인 보고서 작성기를 포함한다. 보고서 작성기는 예컨대, 실시간 PCR 분석 소프트웨어에 의해 수행된 데이터 분석 형태로 증폭 시스템에 의한 형광 강도 데이터 생성에 대한 반응으로 자동으로 보고서를 발송할 수 있다. 대안으로, 보고서 작성기는 오퍼레이터로부터의 명령에 대한 반응으로 보고서를 발송할 수 있다. 보고서는 신호 강도 미처리 데이터, 프로세싱된 신호 강도 데이터(예컨대, 그래픽 디스플레이, C_T 값 확인, 주형 폴리뉴클레오티드의 출발량 계산), 박테리아 오염의 검출 여부에 관한 결론, 및/또는 공급원 샘플 중 오염량의 정량화(예컨대, CFU/mL)를 포함할 수 있다. 보고서는 임의의 적합한 통신 매체를 사용하여 로컬 또는 원격 위치에 있는 수신자에게 발송될 수 있다. 예를 들어, 통신 매체는 네트워크 연결, 무선 연결, 또는 인터넷 연결일 수 있다. 보고서는 수신자에 의한 수신을 위해 및/또는 리뷰를 위해 상기 네트워크 또는 연결(또는 물리적 보고서, 예컨대, 출력물 발송을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 정보 전송을 위한 임의의 다른 적합한 수단)을 통해 전송될 수 있다. 수신자는 제한하는 것은 아니지만, 고객, 개체, 건강 관리 제공자, 건강 관리 관리자, 또는 전자 시스템(예컨대, 하나 이상의 컴퓨터, 및/또는 하나 이상의 서버)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 보고서 작성기는 수신자의 장치, 예컨대, 개인용 컴퓨터, 전화, 태블릿, 또는 다른 장치에 보고서를 발송한다. 보고서는 온라인 상에서 살펴볼 수 있거나, 수신자의 장치에 저장될 수 있거나, 또는 출력될 수 있다.

도 5는 샘플의 박테리아 오염을 검출하기 위한 예시적인 시스템을 도시한 것이다. 시스템은 매체(예컨대, 소프트웨어) 및/또는 임의적으로 고정 매체를 가지는 서버에 연결될 수 있는 네트워크 포트(예컨대, 인터넷)로부터의 명령을 판독할 수 있는 논리 장치로서 이해될 수 있다. 컴퓨터 시스템은 CPU, 디스크 드라이브, 입력 장치, 예컨대, 키보드 및/또는 마우스, 및 디스플레이(예컨대, 모니터) 중 하나 이상의 것을 포함할 수 있다. 데이터 통신, 예컨대, 명령 또는 레포트 전송은 로컬 또는 원격 위치의 서보에의 통신 매체를 통해 달성될 수 있다. 통신 매체로는 데이터를 전송 및/또는 수신하는 임의의 수단을 포함할 수 있다. 예를 들어, 통신 매체는 네트워크 연결, 무선 연결, 또는 인터넷 연결일 수 있다. 상기 연결은 월드 와이드 웹(World Wide Web)을 통한 통신을 제공할 수 있다.

한 측면에서, 본 개시내용은 하나 이상의 프로세서에 의한 실행 시, 본원에 개시된 방법 중 어느 것에 따른 방법을 방법을 수행하는 코드를 포함하는 컴퓨터 판독 가능 매체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 컴퓨터 판독 가능 매체 실행은 상이한 속으로부터의 복수 개의 박테리아 종 중 어느 것에 의한 생물학적 샘플, 예컨대, 혈소판 샘플의 박테리아 오염을 검출하는 방법을 수행한다. 한 실시양태에서, 컴퓨터 판독 가능 매체 실행은 샘플에 대하여 검출 반응을 수행하라는 고객 요청을 수신하는 단계; 고객 요청에 응하여 샘플 또는 그의 일부에 대하여 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계로서, 여기서, 증폭 반응은, 단일 프라이머 쌍 및 단일 프로브를 이용하여, 16S rRNA의 약 500개 이하의 염기로 이루어진 검출 가능한 양의 앰플리콘을 생성하고, 추가로, 여기서, 5개 이상의 속 중 어느 하나로부터의 1 pg∼5 pg의 DNA의 증폭은 30 미만의 C_T를 갖는 것인 단계; 및 프로브에 의해 생성된 신호 강도의 검출에 대한 결과를 포함하는 보고서를 작성하는 단계를 포함한다.

컴퓨터 판독 가능 매체는 유형 저장 매체, 반송파 매체, 또는 물리적 전송 매체를 포함하나, 이에 한정되지 않는 다수의 형태를 취할 수 있다. 비휘발성 저장 매체로는 예를 들어, 광 디스크 또는 자기 디스크, 예컨대, 임의의 컴퓨터(들) 내의 저장 장치 중 어느 것을 포함하고, 이는 예컨대, 산출 단계, 프로세싱 단계 등을 실행하는 데 사용될 수 있다. 휘발성 저장 매체로는 동적 메모리, 예컨대, 컴퓨터의 주기억 장치를 포함한다. 유형 전송 매체로는 동축 케이블; 구리선 및 광섬유(컴퓨터 시스템 내에 버스를 포함하는 선 포함)를 포함한다. 반송파 전송 매체는 전기 또는 전자기 신호, 또는 음파 또는 광파, 예컨대, 무선 주파수(RF: radio frequency) 및 적외선(IR) 데이터 통신 동안 생성된 것의 형태를 취할 수 있다. 그러므로, 일반적인 형태의 컴퓨터 판독 가능한 매체로는 예를 들어, 플로피 디스크, 플렉시블 디스크, 하드 디스크, 자기 테이프, 임의의 다른 자기 매체, CD-ROM, DVD 또는 DVD-ROM, 임의의 다른 광학 매체, 펀치 카드 종이 테이프, 구멍 패턴이 있는 임의의 다른 물리적 저장 매체, RAM, PROM 및 EPROM, FLASH-EPROM, 임의의 다른 메모리 칩 또는 카트리지, 반송파 전송 데이터 또는 명령, 케이블 또는 링크 수송, 예컨대, 반송파, 또는 컴퓨터가 프로그래밍 코드 및/또는 데이터를 판독할 수 있는 임의의 다른 매체를 포함한다. 이러한 형태의 컴퓨터 판독 가능한 매체들 다수가 하나 이상의 일련의 하나 이상의 명령을 실행 프로세서로 전달하는 데 관여할 수 있다.

한 측면에서, 본 개시내용은 보존 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부를 증폭 및 검출시키기 위한 조성물을 제공한다. 조성물은 다양한 측면 중 어느 것과 관련하여 본원에 개시된 하나 이상의 요소들을 임의의 조합으로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 보존 폴리뉴클레오티드는 16S rRNA 폴리뉴클레오티드(예컨대, 16S rRNA, 16S rRNA 유전자를 함유하는 DNA, 16S rRNA 및/또는 rDNA 증폭 생성물, 또는 그의 조합)이다. 일부 실시양태에서, 증폭된 16S rRNA 폴리뉴클레오티드의 일부의 길이는 약 1,000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 250, 200, 175, 150, 125, 100, 90, 80, 70, 60, 50개 이하의 뉴클레오티드 길이, 또는 그보다 적은 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 서열 번호 9의 약 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 뉴클레오티드 또는 그들 모두를 포함하는 제1 프라이머; 서열 번호 10의 약 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 뉴클레오티드 또는 그들 모두를 포함하는 제2 프라이머; 및 서열 번호 16의 약 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 뉴클레오티드 또는 그들 모두를 포함하는 프로브를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 표적 16S rRNA 폴리뉴클레오티드를 이용하는 증폭 반응에서, 길이가 50개 이상의 뉴클레오티드이고, 최적으로 정렬되었을 때, 서열 번호 1∼3 중 어느 것과 90%의 서열 동일성을 가지는 앰플리콘을 증폭시키는 프라이머; 및 앰플리콘의 어느 한 가닥에 특이적으로 하이브리드화하는 프로브를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프라이머 및 프로브는 본원에 개시된 하나 이상의 파라미터에 따라 선택된다. 예를 들어, 프라이머 및 프로브는 복수 개의 표적 종 중 어느 하나로부터의 약 1 pg∼5 pg의 DNA 증폭의 사이클 역치 값(C_T)이 30 미만이 되도록 선택될 수 있다. 조성물은 임의의 적합한 용기, 예컨대, 다중 웰 플레이트의 웰, 플레이트, 튜브, 챔버, 유동 셀, 미세유동 장치의 챔버 또는 채널, 또는 칩 중에 함유되어 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 예컨대, 용기 표면에 부착된 비드, 또는 필름과 같이, 탈수된 형태의 것이다.

한 측면에서, 본 개시내용은 보존 폴리뉴클레오티드를 증폭 및 검출시키기 위한 조성물을 제공한다. 반응 혼합물은 다양한 측면 중 어느 것과 관련하여 본원에 개시된 하나 이상의 요소들을 임의의 조합으로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 보존 폴리뉴클레오티드는 16S rRNA 폴리뉴클레오티드(예컨대, 16S rRNA, 16S rRNA 유전자를 함유하는 DNA, 16S rRNA 및/또는 rDNA 증폭 생성물, 또는 그의 조합)이다. 일부 실시양태에서, 증폭된 16S rRNA 폴리뉴클레오티드의 일부의 길이는 약 1,000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 250, 200, 175, 150, 125, 100, 90, 80, 70, 60, 50개 이하의 뉴클레오티드 길이, 또는 그보다 적은 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 반응 혼합물은 서열 번호 9의 약 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 뉴클레오티드 또는 그들 모두를 포함하는 제1 프라이머; 서열 번호 10의 약 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 뉴클레오티드 또는 그들 모두를 포함하는 제2 프라이머; 및 서열 번호 16의 약 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 뉴클레오티드 또는 그들 모두를 포함하는 프로브를 포함한다. 일부 실시양태에서, 반응 혼합물은 표적 16S rRNA 폴리뉴클레오티드를 이용하는 증폭 반응에서, 길이가 50개 이상의 뉴클레오티드이고, 최적으로 정렬되었을 때, 서열 번호 1∼3 중 어느 것과 90%의 서열 동일성을 가지는 앰플리콘을 증폭시키는 프라이머; 및 앰플리콘의 어느 한 가닥에 특이적으로 하이브리드화하는 프로브를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프라이머 및 프로브는 본원에 개시된 하나 이상의 파라미터에 따라 선택된다. 예를 들어, 프라이머 및 프로브는 복수 개의 표적 종 중 어느 하나로부터의 약 1 pg∼5 pg의 DNA 증폭의 사이클 역치 값(C_T)이 30 미만이 되도록 선택될 수 있다. 반응 혼합물은 임의의 적합한 반응 위치에 함유되어 있을 수 있다. 반응 위치는 용기, 예컨대, 다중 웰 플레이트의 웰, 플레이트, 튜브, 챔버, 유동 셀, 미세유동 장치의 챔버 또는 채널, 또는 칩있을 수 있다. 반응 위치는 용액 내의 구획, 예컨대, 소적(예컨대, 에멀션 혼합물 내의 것)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 예컨대, 용기 표면에 부착된 비드, 또는 필름과 같이, 탈수된 형태의 것이다.

한 측면에서, 본 개시내용은 생물학적 샘플, 예컨대, 혈소판 샘플의 박테리아 오염을 검출하기 위한 키트를 제공한다. 키트는 다양한 측면 중 어느 것과 관련하여 본원에 개시된 하나 이상의 요소들을 임의의 조합으로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 서열 번호 9의 약 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 뉴클레오티드 또는 그들 모두를 포함하는 제1 프라이머; 서열 번호 10의 약 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 뉴클레오티드 또는 그들 모두를 포함하는 제2 프라이머; 및 서열 번호 16의 약 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 뉴클레오티드 또는 그들 모두를 포함하는 프로브를 포함한다. 키트 중의 시약 및 다른 물질은 임의의 적합한 용기에 함유되어 있을 수 있고, 즉시 사용가능한 형태일 수 있거나, 또는 키트 중의 다른 시약 또는 사용자에 의해 공급된 시약와의 조합(예컨대, 농축된 조성물의 희석 또는 동결건조된 조성물의 재구성)을 필요로 할 수 있다. 키트는 완충제를 제공할 수 있으며, 그의 비제한적인 예로는 탄산나트륨 완충제, 중탄산나트륨 완충제, 보레이트 완충제, 트리스(Tris) 완충제, MOPS 완충제, HEPES 완충제, 및 그의 조합을 포함한다. 키트는 대조군 샘플, 예컨대, DNA 추출 방법의 대조군을 위한 공지된 박테리아, 및/또는 양성 대조군 또는 정량화 표준으로서 사용하기 위한 정제된 DNA를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 본원에 개시된 하나 이상의 방법에 따라 키트를 사용하기 위한 키트 사용 설명서를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트 사용 방법은 단일 프라이머 쌍을 이용하여 샘플 또는 그의 일부에 대해 핵산 증폭 반응을 수행하여 16S rRNA 폴리뉴클레오티드의 약 500개 이하의 염기로 이루어진 검출 가능한 양의 앰플리콘을 수득하는 단계로서, 여기서, 상이한 속으로부터의 복수 개의 박테리아 종 중 어느 하나로부터의 약 1 pg∼5 pg의 DNA의 증폭은 30 미만의 사이클 역치 값(C_T)을 갖는 것인 단계; 및 하나 이상의 검출 가능한 프로브를 이용하여 앰플리콘을 검출하는 단계로서, 여기서, 하나 이상의 검출 가능한 프로브는 각각 보존 서열에 특이적으로 하이브리드화하고, 보존 서열은 상이한 속으로부터의 복수 개의 박테리아 종 사이에 동일한 것인 단계를 포함한다.

실시예

하기 실시예는 본 발명의 다양한 실시양태를 예시하기 위한 목적으로 제공되는 것이며, 어느 방식으로든 본 발명을 제한하고자 하지 않는다. 이에 본원에 기술된 방법과 함께 본 실시예는 바람직한 실시예를 나타내고, 예시적인 것이며, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 청구범위의 범주에 의해 정의되는 바와 같은 본 발명의 정신 범위 내에 포함되는 그 안의 변화 및 다른 용도를 당업자는 떠올릴 수 있을 것이다.

실시예 1:

상응하는 앰플리콘에 대한 예시적인 프라이머 쌍 및 예시적인 프로브를 특이성, 검출 범위, 및 다수의 상이한 속으로부터의 다양한 박테리아 종을 검출할 수 있는 능력을 평가하였다. 본 실시예에서는 서열 번호 9의 서열을 가지는 프라이머, 서열 번호 10의 서열을 가지는 프라이머, 및 서열 번호 16의 서열을 가지는 프로브를 사용하여 16S rRNA 유전자의 보존되는 부분을 증폭 및 검출하였다. 서열 번호 3의 서열에 대한 프라이머 및 프로브를 디자인하였다. 명시된 양의 박테리아 게놈 DNA 뿐만 아니라, 프라이머, 프로브, 효소, dNTP, 및 다른 표준 시약을 이용하여 실시간 PCR 반응을 준비하였다.

프라이머-프로브 조합의 감도를 평가하기 위해, 10 ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg, 및 0.1 pg의 E. 콜라이 DNA 추출물을 함유하는 증폭 반응을 2중으로 준비하였다. 공통 시약은 모두 함유하지만, DNA 추출물이 물로 대체된 비주형 대조군을 사중으로 제조하였다. 실시간 PCR 증폭 결과를 그래프로 나타낸 디스플레이는 도 1에 제시되어 있다. y축을 따라 진행되는 임의의 형광 강도의 로그 스케일(0 내지 10)은 x축을 따라 진행되는 사이클 수(0 내지 40)에 대해 플롯팅된 것이다. 좌측에서 우측으로, 제1 곡선 쌍은 10 ng 샘플에 상응하는 것이고(평균 C_T는 약 14.5), 이어서, 중복되는 곡선 쌍은 1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg, 및 0.1 pg 샘플에 상응하는 것(C_T는 약 17.5, 21, 24.5, 27.5, 및 31). 이론으로 제한하고자 하지 않으면서, 4개의 비주형 대조군 샘플에 대한 대략 C_T = 36인 증폭 신호는 상업적으로 수득된 효소 중 남은 박테리아 폴리뉴클레오티드로부터 생성된 것일 수 있다. 그럼에도 불구하고, 상기의 프라이머 및 프로브 조합을 이용하여 얻은 특이 증폭 신호는 6 로그의 검출 범위를 제공하며, 0.1 pg의 출발 주형은 음성 대조군으로부터의 신호 앞의 5회 이상의 전체 사이클에서 검출된다. 실제로, 도 2에 제시된 바와 같이 상기 범위 간의 검출은 선형이고(R² = 약 0.999, 및 상기 범위 간의 증폭 효율 = 약 95.5%), 그러므로, 비공지 샘플 중의 출발 물질의 양을 정량화하는 데 사용될 수 있다.

유사한 일련의 증폭 반응에서, 비교를 위한 10 pg의 E. 콜라이, 및 비주형 대조군(NTC: no-template control)과 함께 스타필로코커스 아우레우스 Mu3 (이는 또한 메티실린 내성 스타필로코커스 아우레우스로도 공지됨), 스타필로코커스 아우레우스, 스타필로코커스 에피더미디스, 스트렙토코커스 아갈락티아에, 스트렙토코커스 파이오제네스, 및 스트렙토코커스 뉴모니아에로부터의 100 pg의 DNA를 증폭시키고, 검출하기 위해 상기 프라이머 및 프로브 세트를 모두 2중으로 테스트하였다. 테스트된 박테리아는 그람 양성 박테리아 및 그람 음성 박테리아, 둘 모두를 포함하는 것에 주의한다. 실시간 증폭 결과는 하기 표 4에 제시되어 있다("EP(endpoint)"는 종점을 나타낸다).

추가의 일련의 증폭 반응에서, 비주형 대조군(NTC)과의 비교로, 스타필로코커스 아우레우스 Mu3, 스타필로코커스 아우레우스, 스타필로코커스 에피더미디스, 스트렙토코커스 아갈락티아에, 스트렙토코커스 파이오제네스, 스트렙토코커스 뉴모니아에, 시트로박터 코세리, 클로스트리듐 퍼프린젠스, 엔테로코커스 패칼리스, 클렙시엘라 뉴모니아에, 락토바실러스 애시도필러스, 리스테리아 모노사이토제네스, 프로피오니박테리움 그래눌로섬, 슈도모나스 아에루기노사, 세라티아 마르세센스, 및 에스케리치아 콜라이로부터의 (명시된 바와 같이) 1 pg 또는 10 pg의 DNA를 증폭시키고, 검출하기 위해 같은 프라이머 및 프로브 세트의 감도를 테스트하였다. 실시간 증폭 결과는 하기 표 5A에 제시되어 있다(여기서, 별표 표시는 평균 및 표준 편차(SD: standard deviation) 계산치로부터 벗어난 이상치를 나타내고; "반응"은 약어 "rxn"으로 표시되어 있다).

비교를 위한 주형으로서 E. 콜라이 주형(100 pg) 및 비주형 대조군에 대한 별도의 반응과 함께 B. 세레우스(B. cereus)로부터의 DNA(100 pg)의 증폭을 테스트하기 위해 유사 반응을 준비하였다. 실시간 증폭 결과는 하기 표 5B에 제시되어 있다.

[표 5B]

실시예 2: 프로브 및 프라이머 세트 비교

실시예 1에서와 같이, 하기 명시되는 3개의 프라이머 세트 중 하나 및 상응하는 프로브(들)를 사용하여 100 pg의 스타필로코커스 아우레우스, 100 pg의 E. 콜라이, 또는 비주형 대조군(NTC)에 대한 실시간 PCR 반응을 준비하였다. 프라이머 세트 1은 서열 번호 4의 서열을 가지는 정방향 프라이머, 및 하나는 서열 번호 5의 서열을 가지는 것이고, 나머지 다른 하나는 서열 번호 6의 서열을 가지는 것인 2개의 역방향 프라이머로 구성되었다. 서열 번호 11-13의 서열을 가지는 3개의 프로브로 이루어진 혼합물을 이용하여 프라이머 세트 1의 증폭 생성물을 검출하였고, 이들 각각은 상이한 리포터와의 관련성에 기초하여 독립적으로 검출되었다. 프라이머 세트 1 프로브는 광범위한 박테리아를 전체적으로 검출하기 위해 디자인되었다. 예를 들어, 서열 번호 12는 S. 아우레우스 및 E. 콜라이 이외의 다른 종 검출을 위해 디자인되었다. 각 프라이머 세트 1 증폭 반응을 위한 최종 시약 농도는 하기와 같았다: 1X 택맨 유니버설 마스터 믹스 II(Taqman Universal Master Mix II); 500 nM의 각 프라이머; 및 500 nm의 각 프로브. 프라이머 세트 2는 서열 번호 7의 서열을 가지는 프라이머, 및 서열 번호 8의 서열을 가지는 것인 프라이머로 구성되었다. 서열 번호 14-15의 서열을 가지는 2개의 프로브로 이루어진 혼합물을 이용하여 프라이머 세트 2의 증폭 생성물을 검출하였고, 이들 각각은 상이한 리포터와의 관련성에 기초하여 독립적으로 검출되었다. 프라이머 세트 2 프로브는 광범위한 박테리아를 전체적으로 검출하기 위해 디자인되었으며, 서열 번호 14는 (비록 배타적인 것은 아니지만) 다중의 그람 음성 박테리아 검출을 위해 디자인되었고, 서열 번호 15는 (비록 배타적이지만) 다중의 그람 양성 박테리아 검출을 위해 디자인되었다. 각 프라이머 세트 2 증폭 반응을 위한 최종 시약 농도는 하기와 같았다: 1X 택맨 유니버설 마스터 믹스 II; 500 nM의 각 프라이머; 및 500 nm의 각 프로브. 프라이머 세트 3은 실시예 1에 상세하게 설명된 바와 같은 프라이머로 구성되었고, 그의 증폭 생성물은 서열 번호 16의 서열을 가지는 프로브를 이용하여 검출하였다. 프라이머 세트 3 프로브는 다중의 박테리아를 검출하기 위해 디자인되었다. 각 프라이머 세트 3 증폭 반응을 위한 최종 시약 농도는 하기와 같았다: 1X 택맨 유니버설 마스터 믹스 II; 500 nM의 각 프라이머; 및 500 nm의 각 프로브. 택맨 키트 제조사의 권장 사항(라이프 테크놀러지즈(Life Technologies)―어플라이드 바이오시스템즈: 미국 캘리포니아주 칼즈배드)에 따라 PCR 증폭을 수행하였다. 각 주형에 대해 각 증폭을 2중으로 수행하였고, 각 C_T(C_T 1 및 C_T 2)는 하기 표 6에 제공되어 있다. 표 6에 제시되어 있는 바와 같이, 다중 프로브를 통해 생성된 결과는 실시예 1에 기술된 프로브 프라이머 세트에 대해 수득된 것과 유사하였다. 프로브 서열 번호 12에 대한 결과는 그의 디자인 기반이 된 서열에 기초하여 예측된 바와 같았다. 서열 번호 14-15에 대한 결과는 그의 디자인 기반이 된 서열에 기초하여 예측된 바와 같았다. 예를 들어, 서열 번호 14를 통해 그람 음성 박테리아인 E. 콜라이에 대한 조기 C_T를 얻었다. 또한, 서열 번호 15를 통해 그람 양성 박테리아인 S. 아우레우스에 대하여 가장 빠른 C_T를 얻었고, 동시에 비록 C_T가 더 늦기는 하지만, E. 콜라이도 검출할 수 있었다.

실시예 3: 모의 혈소판 샘플-인간 DNA로부터의 신호 없음

환자 샘플, 예컨대, 혈소판 샘플로부터 추출된 DNA는 전형적으로 인간 게놈 DNA를 포함할 것이다. 따라서, 인간 게놈 DNA의 존재하에서 프라이머 및 프로브의 샘플 세트를 증폭 반응에서 테스트하였다. 실시예 1에서와 같이, 같은 프라이머 및 프로브를 포함하는 실시간 PCR 반응을 준비하였다. 그러나, 박테리아 DNA 대신, 증폭 반응물은 10 ng의 인간 게놈 DNA, 또는 비주형 대조군으로서 물을 포함하고, 이 둘 모두 2중으로 이루어졌다. 인간 DNA 및 비주형 대조군에 대한 실시간 PCR 증폭 결과를 나타내는 그래픽 디스플레이는 각각 도 3a 및 3b에 제시되어 있다. 약 39회차 사이클까지도 인간 DNA 샘플에 대해서는 어떤 증폭 신호도 수득되지 않았ㅇ며(FAM), 이는 프라이머 및 프로브가 박테리아 서열에 특이적이며, 인간 DNA를 함유하는 혼합 샘플 중의 상기 서열을 특이적으로 증폭시킬 것이라는 것을 시사하는 것이다. 또한, 인간 DNA 샘플에 대한 종점 신호 강도는 실제로 비주형 대조군의 것보다 더 낮았고, 이는 샘플 중 인간 DNA가 실제로 후반 사이클에서는 잠재적인 비특이 증폭 생성물의 형성을 감소시킬 수 있다는 것을 제안하는 것이다.

실시예 4: 프로브 세트 비교

실시예 1∼3은 본 개시내용에 따른 프라이머 및 프로브의 박테리아 폴리뉴클레오티드 검출 특이성 및 감도를 입증한다. 본 실시예에서는 실시예 1에 기술된 프라이머 및 프로브(총칭하여, "세트 3")의 감도를 문헌 [Liu et al. (Chin. J. Blood Transfusion, September 2008, vol. 21, No. 9)] 및 [Nadkarni et al. (Microbiology (2002), 148, 257-266)]에 기술된 프라이머 및 프로브와 비교하였다. 리우 및 나드카르니(Nadkarni)는 서열 번호 19의 서열(CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC)(총칭하여, "리우 세트")을 가지는 프로브로 검출된 박테리아 16S rRNA의 466 bp 영역을 증폭시키기 위한, 서열 번호 17의 서열(TCCTACGGGAGGCAGCAGT) 및 서열 번호 18의 서열(GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT)을 가지는 프라이머의 용도를 기술한다. 나드카르니는 다중 박테리아 간에 충분히 보존되는 상응하는 프라이머 및 프로브 표적 서열을 가지는 앰플리콘을 확인하지 못하는 무능력성에 기인하여 상기의 큰 앰플리콘을 수동식으로 선별하는 것을 기술한다. 1차 비교에서, 100 pg의 스타필로코커스 아우레우스, 100 pg의 E. 콜라이, 또는 비주형 대조군(NTC)의 실시간 PCR 증폭에 대해 검출 효율을 비교한다. 100 pg의 스타필로코커스 아우레우스의 증폭 및 검출 결과는 도 4a에 그래프로 도시되어 있으며, 여기서, 세트 3에 대한 결과는 상단에, 및 리우 세트에 대한 결과는 하단에 제시되어 있다. 100 pg의 E. 콜라이의 증폭 및 검출 결과는 도 4b에 그래프로 도시되어 있으며, 여기서, 세트 3에 대한 결과는 상단에, 및 리우 세트에 대한 결과는 하단에 제시되어 있다. 도면에는 세트 3을 사용하였을 때의 검출이 일관되고, 강력한 것으로 도시되어 있다. 리우 세트를 이용하였을 때에는 심지어 100 pg의 검출도 더 약하고, C_T는 더 늦은 시점에 존재한다.

2차 비교에서는 세트 3과 리우 세트 비교를 위하여 보다 더 낮은 저용량의 표적 DNA를 이용하여 상기 조건을 반복하였다. 이러한 2차 비교에서는 단지 10 pg의 E. 콜라이 DNA가 반응에 포함되었고, 본 반응은 비주형 대조군 반응과 함께 진행되었다. 각 반응 조건은 2중으로 수행되었다. 실시간 증폭 결과는 하기 표 7에 제시되어 있다.

표 7의 2차 비교에 대한 결과는 리우 세트가 비주형 대조군으로부터 10 pg의 박테리아 DNA를 식별하는 데 있어 충분한 감도를 가지지 않으며, 따라서, 상기와 같이 낮은 수준의 오염을 검출하는 데 있어서는 부적절하다는 것을 나타낸다. 대조적으로, 세트 3을 이용하였을 때, 10 pg의 DNA에 대한 C_T는 비주형 대조군의 것보다 약 7 사이클 더 빠르며, 이는 박테리아 DNA에 대한 감도가 실질적 증가되어 있음을 시사하는 것이다. 이론으로 제한하고자 하지 않으면서, 앰플리콘이 짧을수록(서열 번호 3에 상응하는, 세트 3의 경우, 약 143 bp; 그와 비교하여 리우 세트의 경우, 약 466 bp) 및/또는 세트 3에 대한 앰플리콘 내의 가변성이 더 낮을수록, 검정법의 감도는 개선되었다고 볼 수 있었다. 리우 세트의 더 낮은 감도에 대한 원인이 되는 다른 잠재적 기여 인자로는 서열 번호 17 프라이머의 비교적 안정적인 동종이량체화(도 6a) 및 프라이머와 서열 번호 19 프로브 사이의 하이브리드화(도 6b)를 포함한다. 프라이머-프라이머, 및 프라이머-프로브 하이브리드화를 평가하기 위해, 디폴트 설정 환경(표적 유형―DNA; 올리고 농도―0.25 μM; Na⁺ 농도―50 mM; Mg⁺⁺ 농도 ―0 mM; dNTPs 농도―0 mM)을 이용하여 올리고애널라이저 3.1(OligoAnalyzer 3.1)(www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/)를 이용함으로써 이량체 형성을 테스트하였다. 나드카르니 결과를 고려할 때, 16S rRNA 표적 서열에 대한 프라이머 및 프로브는 다중의 박테리아 종 및 속에 걸쳐 상기와 같은 감도 및 특이성을 제공할 수 있다는 것은 놀랍고도 동시에 예상치 못했던 것이었다.

실시예 4: 상이한 소광제의 효과

실시예 4에서 사용된 반응 조건 및 리우에서 사용된 것은 유사하였기 때문에, 상이한 소광제 사용으로부터의 가능한 효과를 테스트하였다. 실시예 3의 세트 3 프로브는 젠™ 내부 소광제(인테그레티드 DNA 테크놀러지즈, 인크.; 미국 아이오와주 코럴빌)를 사용한 반면, 리우 세트 프로브는 리우 등에 의해 사용된 원 위치인, 3' 말단 아이오와 블랙^R 소광제(인테그레티드 DNA 테크놀러지즈, 인크.; 미국 아이오와주 코럴빌)를 사용하였다. 상이한 소광제의 효과를 테스트하기 위해, 젠 소광제 또는 3' 말단 아이오와 블랙 소광제 중 하나와 함께 세트 3 프라이머 및 상응하는 FAM 표지화된 프로브를 사용하여 실시예 1에서와 같이 실시간 PCR 반응을 준비하였다. 하기 명시된 바와 같은 범위의 양의 E. 콜라이 DNA 검출에 대하여 상기 프라이머 프로브 조합을 테스트하였다. 각 주형에 대한 반응물을 2중으로 제조하였다. 실시간 증폭 결과는 하기 표 8에 제시되어 있다. 소광제 간의 유사한 결과로 제시된 바와 같이, 사용된 소광제 차이가 감도 차이의 원인은 아니다.

실시예 5: 혈소판 샘플 중의 S. 시뮬란스 검출

스타필로코커스 시뮬란스를 37℃에서 밤새도록 ATCC 영양 브로쓰 중에서 배양하였다. 배양물을 순수로 희석시키고, 영양 아가 플레이트 상에 플레이팅시키고, 콜로니 형성 단위(cfu) 농도를 측정하기 위해 37℃에서 밤새도록 인큐베이션시킨 후 살아있는 콜로니를 계수하였다. S. 시뮬란스 배양물을 적정하고, 5 ㎕ 순수로 정규화하여 100,000, 10,000, 1,000, 100, 50, 25, 또는 0 cfu를 포함하는 5 ㎕ 샘플을 제조하였다. 0 cfu 샘플은 단지 물이었고, 이를 음성 대조군으로서 사용하였다. 이어서, 상기 5 ㎕ 박테리아 DNA 샘플을 각각, 6일 전 성분채집술에 의해 수집된 195 ㎕의 회수된 인간 혈소판에 첨가하였다. 상기 샘플에 대해 효과적인 cfu/mL은 각각 500,000, 50,000, 5,000, 500, 250, 125, 및 0 cfu/mL였다. 진JET 게노믹 DNA 정제 키트(GeneJET Genomic DNA Purificatioion Kit)(써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 사용하여 200 ㎕ 샘플로부터 DNA를 추출하고, DNA를 45 ㎕ 용리 완충제로 용리시켰다. 30 사이클, 실시간 PCR 반응을 준비하고, 실시예 1에서와 같은 프로브 및 프라이머, 및 대략 14 uL의 각 용리액을 사용하여 3중으로 수행하였고, 이로써, 각 반응당 cfu 수치는 각각 약 31,250, 3,125, 312.5, 31.3, 15.6, 7.6, 및 0 cfu였다. 반응은 또한 고태크 MDx 핫 스타트 폴리머라제(GoTaq MDx Hot Start Polymerase)(프로메가(Promega))를 함유하였고, 스텝 원 플러스(Step One Plus) 실시간 PCR 장치(라이프 테크놀러지즈)(라이프 테크놀러지즈)를 사용하여 수행하였다. 생성된 증폭 곡선 그래프는 도 7a에 제공되어 있으며, x축을 따라 진행되는 각각의 사각형 표시는 2 사이클을 나타낸다. 좌측에서 우측으로 곡선 군은 31,250, 31,250, 3,125, 312.5, 31.3, 및 15.6에 상응하고, 가장 우측의 것은 7.6 및 0이다. 따라서, 본 실험에 대한 검출 한계는 적어도 15.6 cfu 아래있고, 평균 C_T는 약 26.9였다. 도 7a에는 상기 조건 하에서의 정량적 선형성이 그래프로 도시되어 있다. 반응당 31,250, 31,250, 3,125, 312.5, 31.3, 15.6, 7.6, 및 0 cfu에 대한 별도의 증폭 곡선은 각각 도 8a-g에 도시되어 있다. 실시간 증폭 결과는 또한 하기 표 9에 요약되어 있다. S. 시뮬란스 적정 결과는 DNA 스파이크 인 방법을 사용한 상기의 실시예에서 수득된 것과 유사하였다. PCR 증폭 효율은 높았고, 비특이적인 증폭 결과는 관찰되지 않았다.

실시예 6: 혈소판 샘플 중의 다중의 상이한 살아있는 박테리아 검출

실시예 5에서와 같이, 하기 표 10에 열거된 18개의 박테리아 종에 대한 박테리아 샘플을 제조하고, 회수된 혈소판과 조합하였다. 표 10의 박테리아 1-12를 함유하는 샘플에 대해, 및 12개의 혈소판으로만 이루어진 샘플에 대해, 맥스웰(Maxwell) 16 MDx 인스트루먼트(Instrument)(프로메가) 및 맥스웰 16 LEV 블러드(Blood) DNA 키트(프로메가)를 사용하여 DNA를 추출하였다. 표 10의 박테리아 13-18을 함유하는 샘플에 대해, 및 6개의 혈소판으로만 이루어진 샘플에 대해, 진JET 게노믹 DNA 정제 키트(써모 사이언티픽)를 사용하여 DNA를 수작업으로 추출하였다. 30 사이클, 실시간 PCR 반응을 3중으로 제조하고, (실시예 1에서와 같은 프로브 및 프라이머를 사용하여) 실시예 5에서와 같이 수행하였다. 각 반응당 cfu 수치를 포함하는 결과는 하기 표 11에 제공되어 있다. 총 72개의 혈소판 샘플을 테스트하였다. 박테리아를 함유하는 모든 샘플에 대해 양성 신호가 검출된 반면, 혈소판만으로 이루어진 대조군에 대해서는 양성 신호가 검출되지 않았다. 따라서, 상기 복합체 혼합물 조건 하에서 검정의 감도는 100%이고, 특이성은 100%였다.

실시예 7: 전혈 및 연막 중 살아있는 박테리아에 의해 오염 검출

스탠포드 블러드 센터(Stanford Blood Center)로부터 회수된 전혈 및 연막 샘플을 입수하였다. 샘플을 (실시예 5에서와 같이) E. 콜라이 박테리아, 또는 E. 콜라이 DNA를 스파이킹하였다. DN이지 블러드 & 티슈 키트(DNeasy Blood & Tissue Kit)(퀴아젠(Qiagen))를 사용하여 DNA를 스파이킹된 샘플로부터 추출하였다. 40 사이클, 실시간 PCR 반응을 준비하고, 실시예 1에서와 같은 프로브 및 프라이머를 사용하여 1회 반응당 10⁴ cfu, 또는 1회 반응당 10 pg 박테리아 DNA로 3중으로 수행하였다. (실시예 1에서와 같은 프로브 및 프라이머를 사용하여) 실시예 5에서와 같이 스텝 원 플러스(Step One Plus) 실시간 PCR 장치(라이프 테크놀러지즈)를 사용하여 실시간 PCR을 수행하였다. 스파이킹된 전혈 샘플 및 스파이킹된 연막 샘플에 대한 결과는 각각 하기 표 12 및 13에 제공되어 있다. 심지어 상기와 같은 낮은 수준에서도 오염은 검출되었으며, 이는 본 방법이 패혈증의 조기 검출에 사용될 수 있다는 것을 시사한다.

실시예 8: DNA 적정 및 혈소판 샘플 중 S. 아우레우스 DNA 검출

스타필로코커스 아우레우스 Mu3 게놈 DNA를 ATCC(품목 번호 700698D-5)로부터 입수하였다. DNA를 적정하고, 5 ㎕ 순수로 정규화하여 10000.0 pg, 3333.3 pg, 1111.1 pg, 370.4 pg, 123.5 pg, 또는 0 pg 박테리아 DNA를 포함하는 5 ㎕ 샘플을 제조하였다. 0 pg 샘플은 단지 물이었고, 이를 음성 대조군으로서 사용하였다. 이어서, 상기 5 ㎕ 박테리아 DNA 샘플을 각각, 10일 전 성분채집술에 의해 수집된 200 ㎕의 회수된 인간 혈소판에 첨가하였다. 상기 샘플에 대해 효과적인 pg/mL은 각각 48780.5, 16260.2, 5420.1, 1806.7, 602.2, 및 0 pg/mL였다. 맥스웰 16 MDx 인스트루먼트(프로메가) 및 맥스웰 16 LEV 블러드 DNA 키트(프로메가)를 사용한 자동 방법에 의해 상기 205 ㎕ 샘플로부터 DNA를 추출하였다. 30 사이클, 실시간 PCR 반응을 3중으로 준비하고(음성 대조군의 경우, 6중으로 준비), (실시예 1에서와 같은 프로브 및 프라이머를 사용하여) 실시예 5에서와 같이 수행하였다. 각 반응물은 (전체 50 ㎕로부터) 2 ㎕의 DNA 추출 용출액을 함유하였고, 이는 각각 1회 반응당 대략 400 pg, 133.3 pg, 44.4 pg, 14.8 pg, 4.9 pg, 및 0 pg의 출발 DNA를 나타낸다(효율적 회수를 100%로 가정할 때). 생성된 증폭 곡선 그래프는 도 9에 제공되어 있으며, x축을 따라 진행되는 각각의 사각형 표시는 2 사이클을 나타낸다. 좌측에서 우측으로 곡선 군은 400 pg, 133.3 pg, 44.4 pg, 14.8 pg, 4.9 pg, 및 0 pg을 함유하는 반응물에 상응하는 것이다. 정량 결과는 하기 표 14에 요약되어 있다. 혈소판 샘플 중에서의 박테리아 DNA 적정에 대하여 수득된 결과는 (예컨대, 실시예 1에서의) 완충제 중에서의 희석에 대하여 수득되 것과 유사하였다. 검출 감도는 높았고, 샘플에 대한 C_T = 약 27.5에서의 양성 검출 신호는 약 4.9 pg 이하의 출발 물질을 나타낸다. 6개의 음성 대조군 샘플 중 어느 것에 대해서도 어떤 양성 신호도 검출되지 않았는 바, 특이성은 매우 높았다. 자동 추출이 절차상 오염으로부터 유발되는 위 양성 결과를 최소화시킬 것으로 예상된다.

실시예 9: 피험체 프라이머 및 DNA 결합제를 이용한 박테리아 오염 검출

패스트 SYBR^® 그린 마스터 믹스(Fast SYBR^® Green Master Mix)(AB 어플라이드 바이오시스템즈)에서 제공된 다른 시약과 함께 250 pg의 S. 아우레우스 Mu3 DNA(ATCC700698D-5), 서열 번호 51 및 52로 이루어진 프라이머 쌍, 및 DNA 결합 염료(예컨대, SYBR^® 그린)을 함유하는 반응 혼합물을 사용하여 실시간 PCR을 수행하였다. 도 10a에는 S. 아우레우스 DNA의 지수적 증폭을 보여주는 실시간 증폭 플롯이 도시되어 있다. 결과는 3중으로 수행된 실험을 나타낸다. 이어서, 생성된 PRC 반응에 대해 용융 곡선 분석을 수행하였다. 도 10b에는 S. 아우레우스 DNA의 특이적인 증폭을 나타내는 것으로 예상되는 온도에서의 단일 피크가 도시되어 있다. 본 실험은 피험체 프라이머 쌍이 증폭된 박테리아 핵산을 염료 기반으로 검출하는 데 적용가능하다는 것을 입증한다.

실시예 10: 피험체 프 라이머를 사용한 다수의 상이한 유형의 박테리아 균주 검출

공통적으로 생물학적 샘플 중의 오염원으로서 발견되는 20개의 일부 박테리아 균주로부터의 임의의 유형의 박테리아를 검출할 수 있는 프라이머 쌍의 호스트가 본원에 개시되어 있다. 특히, 표 2 및 표 3에 기술된 프라이머 및 프로브를 테스트하였고, 이는 본원에 개시된, 또는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 수행하였을 때, 표 1의 하나 이상의 표적 박테리아 서열을 특이적으로 증폭시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. 추가로, 표 15에는 테스트되고/거나, 서열 상동성에 의해 상기 실시예에 개시된 방법을 이용하여 열거된 박테리아 균주를 특이적으로 증폭시킬 수 있는 효과적인 프라이머인 것으로 밝혀진 예시적인 서열 쌍이 열거되어 있다. 특히, 2개의 프라이머(서열 번호 9 및 10)를 함유하는 프라이머 세트 3을 테스트하였고, 이는 스타필로코커스 아우레우스, 스타필로코커스 아우레우스 Mu3; 스타필로코커스 에피더미디스, 스트렙토코커스 아갈락티아에, 스트렙토코커스 파이오제네스, 스트렙토코커스 뉴모니아, 에스케리치아 콜라이, 시트로박터 코세리, 클로스트리듐 퍼프린젠스, 엔테로코커스 패칼리스, 클렙시엘라 뉴모니아, 락토바실러스 애시도필러스, 리스테리아 모노사이토제네스, 프로피오니박테리움 그래눌로섬, 슈도모나스 아에루기노사, 세라티아 마르세센스, 바실러스 세레우스, 스타필로코커스 아우레우스 Mu50, 예르시니아 엔테로콜리티카, 스타필로코커스 시뮬란스, 마이크로코커스 루테우스, 및 엔테로박터 에어로제네스를 포함하는 20개의 일부 박테리아 균주를 특이적으로 증폭시키고, 이로써, 단일 증폭 반응에서 그를 검출할 수 있는 것으로 입증되었다.

상기 프라이머 세트 중의 다른 서열 번호(즉, 서열 번호 47 및 48)는 단일 반응에서 상기 언급된 박테리아 균주를 증폭시키는 데 요구되지 않는다는 점에서 임의적이다. 서열 번호 9 및 10을 포함하는 동일 반응 혼합물에서 사용되었을 때 서열 번호 47 및/또는 서열 번호 48은 증폭 감도를 증가시킬 수 있고, 프로피오니박테리움 종의 검출을 증진시킬 수 있다.

유사하게, 프라이머 세트 1-2 및 4-25를 각각 테스트하였고/거나, 서열 상동성에 의해 열거된 박테리아 균주를 증폭시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. "포함"으로 기재된 프라이머는 "박테리아 표적 적용 범위"로 기재된 열 하에 열거되어 있는 열거된 박테리아 균주의 보존 영역에 85%, 90% 또는 95% 이상의 서열 상동성을 나타내는 것이다. "임의적"으로 명시된 프라이머는 테스트되고/거나, 서열 상동성에 의해 "포함"으로 기재된 프라이머 중 하나 이상의 것과 함께 사용되었을 때 열거된 박테리아 게놈을 더욱 특이적으로 증폭시킬 수 있는 것으로 예측되었다. "임의적" 서열은 전형적으로 최적으로 정렬되었을 때, 표적 박테리아 게놈과 99% 이상 또는 100% 이상의 서열 상동성을 보인다. 이러한 일련의 관찰 결과는 상기 프라이머 세트가 생물학적 샘플 중에 공통적으로 존재하는 매우 광범위한 박테리아 균주에 대하여 특이적이고, 그에 적용될 수 있기 때문에 기술상 유익하다는 것을 입증한다.

본원에서는 본 발명의 바람직한 실시양태가 제시되고 기술되었지만, 상기 실시양태는 단지 일례로 제공된 것이라는 것은 당업자에게 명백하다. 이에 본 발명으로부터 벗어남 없이 다수의 변형, 변경, 및 치환이 당업자에게 이루어질 것이다. 본 발명을 실시하는 데 본원에 기술된 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 대안이 사용될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 하기 청구범위가 본 발명의 범주를 정의하며, 상기 청구범위의 범주 내의 방법 및 구조 및 그의 등가물이 그에 의해 포함되는 것으로 한다.

SEQUENCE LISTING <110> DCH MOLECULAR DIAGNOSTICS, INC. <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR DETECTING BACTERIAL CONTAMINATION <130> 44964-701.601 <140> PCT/US2014/047914 <141> 2014-07-23 <150> 61/858,495 <151> 2013-07-25 <160> 155 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1 caaggttgaa actcaaagga attgacgggg acccgcacaa gcggtggagc atgtggttta 60 attcgaagca acgcgaagaa ccttacc 87 <210> 2 <211> 138 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 2 gcaacgcgaa gaaccttacc aaatcttgac atcctttgac aactctagag atagagcctt 60 ccccttcggg ggacaaagtg acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat 120 gttgggttaa gtcccgca 138 <210> 3 <211> 143 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 3 gcaacgagcg caacccttaa gcttagttgc catcattaag ttgggcactc taagttgact 60 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Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 31 ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttatccg gaattattgg gcgtaaagcg 60 cg 62 <210> 32 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 32 ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttatccg gaattattgg gcgtaaag 58 <210> 33 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 33 tgtgtagcgg tgaaatgcgc agagatatgg aggaacacca gtggcgaagg cgactttctg 60 gtctgtaact gacgctgatg tgcgaaagcg tggggatcaa 100 <210> 34 <211> 140 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 34 tgtgtagcgg tgaaatgcgc agagatatgg aggaacacca gtggcgaagg cgactttctg 60 gtctgtaact gacgctgatg tgcgaaagcg tggggatcaa acaggattag ataccctggt 120 agtccacgcc gtaaacgatg 140 <210> 35 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 35 ccgcctgggg agtacgaccg caaggttgaa actcaaagga attgacgggg acccgcacaa 60 gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttacc 107 <210> 36 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 36 gggagtacga ccgcaaggtt gaaactcaaa ggaattgacg gggacccgca caagcggtgg 60 agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc 100 <210> 37 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 37 cgcaaggttg aaactcaaag gaattgacgg ggacccgcac aagcggtgga gcatgtggtt 60 taattcgaag caacgcgaag aaccttacc 89 <210> 38 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 38 gcaaggttga aactcaaagg aattgacggg gacccgcaca agcggtggag catgtggttt 60 aattcgaagc aacgcgaaga accttacc 88 <210> 39 <211> 138 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 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Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 82 tgtgtagcgg tgaaatgcg 19 <210> 83 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 83 ggtgtagcgg tgaaatgcg 19 <210> 84 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 84 gtgtagcggt ggaatgcg 18 <210> 85 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 85 gtggagcggt ggaatgcg 18 <210> 86 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 86 ttgatcccca cgctttcg 18 <210> 87 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 87 ttgctcccca cgctttcg 18 <210> 88 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 88 tcgctaccca tgctttcg 18 <210> 89 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 89 tcgctcccca cgctttcg 18 <210> 90 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 90 catcgtttac ggcgtgga 18 <210> 91 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 91 catcgtttac agcgtgga 18 <210> 92 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 92 catcgtttac ggcatgga 18 <210> 93 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 93 caccgtttac agcgtgga 18 <210> 94 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 94 gggagtacga ccgcaaggt 19 <210> 95 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 95 ggggagtacg gccgcaagg 19 <210> 96 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 96 ccgcctgggg agtacg 16 <210> 97 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 97 cgcaaggttg aaactcaaag g 21 <210> 98 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 98 cgcaaggtta aaactcaaat g 21 <210> 99 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 99 cgcaaggctg aaactcaaag g 21 <210> 100 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 100 cgcaaggcta aaactcaaag g 21 <210> 101 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 101 gcaaggttga aactcaaagg aatt 24 <210> 102 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<400> 114 aaggaggtga tccagccgc 19 <210> 115 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 115 aaggaggtga tccaaccgc 19 <210> 116 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 116 tttgatcctg gctcag 16 <210> 117 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 117 tttgatcatg gctcag 16 <210> 118 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 118 gaacgctggc ggc 13 <210> 119 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 119 gcctaataca tgcaagt 17 <210> 120 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 120 gcctaacaca tgcaagt 17 <210> 121 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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agctgacgac agccatgcac cacct 25 <210> 128 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 128 acacgagctg acgacaacca tgcaccacct gt 32 <210> 129 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 129 acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gt 32 <210> 130 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 130 acaggtggtg catggctgtc gtcagctcgt gt 32 <210> 131 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 131 aacgctggcg gcgtgc 16 <210> 132 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 132 aacgctggcg gcaggc 16 <210> 133 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 133 cggcgtgcct aatacatgca ag 22 <210> 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Sequence: Synthetic probe <400> 146 acaagcggtg gagcatgtgg tttaattc 28 <210> 147 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 147 acaagcggcg gagcatgcgg attaattc 28 <210> 148 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 148 acaagtagcg gagcatgtgg tttaattc 28 <210> 149 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 149 agcggtggag catgtggttt aattcg 26 <210> 150 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 150 agcggcggag catgcggatt aattcg 26 <210> 151 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 151 agtagcggag catgtggttt aattcg 26 <210> 152 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 152 aagcggtgga gcatgtggtt taattcg 27 <210> 153 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 153 agcggcggag catgcggatt aattcg 26 <210> 154 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 154 agtagcggag catgtggttt aattcg 26 <210> 155 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic probe <400> 155 tgtacacacc gcccgtca 18

Claims (47)

1. 8개 이상의 박테리아 종 중 어느 것에 의한 혈소판 샘플의 박테리아 오염을 검출하는 방법으로서,
   단일 반응 혼합물 중에서, 약 800개 이하의 염기로 이루어진 검출 가능한 양의 앰플리콘을 수득할 수 있는 조건 하에 상기 샘플 또는 그의 일부에 대해 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계로서, 상기 반응 혼합물은 단일 프라이머 쌍 및 단일 검출 가능 프로브를 포함하고, 여기서, 프라이머 쌍은 앰플리콘 측면에 위치하고, 앰플리콘은 검출 가능한 프로브가 하이브리드화하는 보존 서열을 포함하고, 보존 서열은 상기 8개 이상의 박테리아 종 사이에 동일한 것인 단계; 및
   상기 프로브에 의한 상기 앰플리콘에의 하이브리드화를 검출하는 단계로서, 여기서, 프로브에 의한 하이브리드화는, 상기 8개 이상의 박테리아 종 중 어느 것에 의한 혈소판 샘플의 박테리아 오염을 나타내는 검출 가능한 신호를 생성하는 것인 단계
   를 포함하는 방법.
2. 혈소판 샘플의 박테리아 오염을 검출하는 방법으로서,
   단일 반응 혼합물 중에서, 약 800개 이하의 염기로 이루어진 검출 가능한 양의 앰플리콘을 수득할 수 있는 조건 하에 상기 샘플 또는 그의 일부에 대해 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계로서, 상기 반응 혼합물은 단일 프라이머 쌍 및 단일 검출 가능 프로브를 포함하고, 여기서, 프라이머 쌍은 앰플리콘 측면에 위치하고, 앰플리콘은 검출 가능한 프로브가 하이브리드화하는 보존 서열을 포함하고, 상기 샘플 또는 그의 일부는 증폭 전에 35℃ 초과의 온도에서 배양되지 않은 것인 단계; 및
   상기 프로브에 의한 상기 앰플리콘에의 하이브리드화를 검출하는 단계로서, 여기서, 프로브에 의한 하이브리드화는 혈소판 샘플의 박테리아 오염을 나타내는 검출 가능한 신호를 생성하는 것인 단계
   를 포함하는 방법.
3. 혈소판 샘플 수득 후 24시간 이내에 혈소판 샘플 중의 박테리아 오염을 신속하게 검출하는 방법으로서,
   약 800개 이하의 염기로 이루어진 검출 가능한 양의 앰플리콘을 수득할 수 있는 조건 하에 단일 반응 혼합물 중에서 단일 프라이머 쌍 및 단일 검출 가능 프로브를 이용하여 상기 샘플 또는 그의 일부에 대해 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계로서, 여기서, 프라이머 쌍은 앰플리콘 측면에 위치하고, 앰플리콘은 검출 가능한 프로브가 하이브리드화하는 보존 서열을 포함하고, 종 중 어느 하나로부터의 약 1 pg∼5 pg의 DNA의 증폭은 30 미만의 사이클 역치 값(C_T)을 갖는 것인 단계; 및
   상기 샘플 수득 후 약 24시간 이내에 상기 프로브에 의한 상기 앰플리콘에의 하이브리드화를 검출하여 상기 샘플 수득으로부터 약 24시간 이내에 오염을 검출하는 단계로서, 여기서, 상기 프로브에 의한 상기 하이브리드화는 혈소판 샘플의 박테리아 오염을 나타내는 검출 가능한 신호를 생성하는 것인 단계
   를 포함하는 방법.
4. 피험체의 생물학적 샘플 중 상이한 속으로부터의 복수 개의 박테리아 종 중 어느 것에 의한 박테리아 오염을 검출하는 방법으로서,
   단일 프라이머 쌍을 이용하여 상기 샘플 또는 그의 일부에 대해 핵산 증폭 반응을 수행하여 16S rRNA 폴리뉴클레오티드의 약 800개 이하의 염기로 이루어진 검출 가능한 양의 앰플리콘을 수득하는 단계로서, 여기서, 상기 종 중 어느 하나로부터의 약 1 pg∼5 pg의 DNA의 증폭은 30 미만의 사이클 역치 값(C_T)을 갖는 것인 단계; 및
   하나 이상의 검출 가능한 프로브를 이용하여 앰플리콘을 검출하는 단계로서, 여기서, 하나 이상의 검출 가능한 프로브는 각각 보존 서열에 특이적으로 하이브리드화하고, 보존 서열은 상이한 속으로부터의 복수 개의 박테리아 종 사이에 동일한 것인 단계
   를 포함하는 방법.
5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 혈소판 샘플이 성분채집술(aphaeresis)에 의해 단리된 혈소판 농축물인 방법.
6. 제5항에 있어서, 5 mL 미만의 혈소판 농축물로부터 단리된 핵산에 대해 핵산 증폭 반응을 수행하는 것인 방법.
7. 제3항에 있어서, 검출이, mL당 약 1.0 콜로니 형성 단위(CFU/mL)의 박테리아 로드를 갖는 혈소판 샘플의 박테리아 오염을 나타내는 검출 가능한 신호를 생성하는 것인 방법.
8. 제4항에 있어서, 하기 (a) 내지 (d) 중 하나 이상을 특징으로 하는 것인 방법:
   (a) 음성 대조군 샘플에 대한 C_T가 복수 개의 박테리아 종 중 어느 하나로부터의 1 pg∼5 pg의 DNA를 함유하는 샘플에 대한 C_T보다 5 사이클 이상 더 높은 것;
   (b) 생물학적 샘플이 혈소판 샘플인 것;
   (c) 하나 이상의 검출 가능한 프로브가 5개 이하의 상이한 프로브 또는 2개 이하의 상이한 프로브를 포함하는 것; 및
   (d) 하나 이상의 검출 가능한 프로브가 2개 이하의 상이한 프로브를 포함하는 것.
9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 앰플리콘이 박테리아 16S rRNA 폴리뉴클레오티드 주형으로부터 생성되는 것인 방법.
10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 (a) 내지 (h) 중 하나 이상을 특징으로 하는 것인 방법:
    (a) 박테리아 오염 검출을 수혈자로의 수혈 전에 완료하는 것;
    (b) 증폭 반응이 300개 이하의 염기 또는 150개 이하의 염기로 이루어진 검출 가능한 양의 앰플리콘을 생성하는 것;
    (c) 증폭 반응이 100∼200개의 염기로 이루어진 검출 가능한 양의 앰플리콘을 생성하는 것;
    (d) 단일 프라이머 쌍이 서열 번호 4, 7, 또는 9에 기재된 서열의 10개 이상의 연속하는 뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머, 및 서열 번호 5, 6, 8, 또는 10에 기재된 서열의 10개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머를 포함하는 것;
    (e) 프로브가 표 3에 기재된 서열의 10개 이상의 연속하는 뉴클레오티드 또는 그의 상보체를 포함하는 것;
    (f) 핵산 증폭 반응이 박테리아 오염에 의한 출발 핵산을 5 pg 미만 함유하는 것;
    (g) 핵산 증폭 반응을 중합효소 연쇄 반응, 실시간 중합효소 연쇄 반응, 등온 증폭, 가닥 치환 증폭, 회전 환 증폭, 리가제 연쇄 반응, 전사 매개 증폭, 고체상 증폭, 핵산 서열 기반 증폭(NASBA), 및 선형 증폭으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법을 이용하여 수행하는 것;
    (h) 핵산 증폭 반응을 웰에서, 플레이트에서, 튜브에서, 챔버에서, 소적에서, 유동 셀에서, 슬라이드에서, 칩에서, 고체 기판에 부착시켜, 비드에 부착시켜, 또는 에멀션 중에서 수행하는 것.
11. 제1항 또는 제4항에 있어서, 박테리아 종이 모두 그람 양성 박테리아인 방법.
12. 제1항 또는 제4항에 있어서, 박테리아 종이 모두 그람 음성 박테리아인 방법.
13. 제1항에 있어서, 상기 8개 이상의 박테리아 종이 복수 개의 그람 양성 박테리아 종 및 복수 개의 그람 음성 박테리아 종을 포함하는 것인 방법.
14. 제4항에 있어서, 상기 복수 개의 박테리아 종이 상이한 속으로부터의 복수 개의 그람 양성 박테리아 종, 및 상이한 속으로부터의 복수 개의 그람 음성 박테리아 종을 포함하는 것인 방법.
15. 제14항에 있어서, 하나 이상의 검출 가능한 프로브가 그람 양성 박테리아 종 사이에서는 공통적이고, 그람 음성 종에는 존재하지 않는 보존 서열에 특이적으로 하이브리드화하는 제1 프로브, 및 그람 음성 박테리아 종 사이에서는 공통적이고, 그람 양성 종에는 존재하지 않는 보존 서열에 특이적으로 하이브리드화하는 제2 프로브를 포함하는 것인 방법.
16. 제1항 또는 제4항에 있어서, 박테리아 종이 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 아우레우스 Mu3; 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 스트렙토코커스 아갈락티아에(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코커스 파이오제네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia), 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 시트로박터 코세리(Citrobacter koseri), 클로스트리듐 퍼프린젠스(Clostridium perfringens), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 프로피오니박테리움 그래눌로섬(Propionibacterium granulosum), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 스타필로코커스 아우레우스 Mu50, 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 스타필로코커스 시뮬란스(Staphylococcus simulans), 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus), 및 엔테로박터 에어로제네스(Enterobacter aerogenes)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
17. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 중 10개 이상의 박테리아 종, 또는 샘플 중 15개 이상의 박테리아 종 중 어느 것에 의한 박테리아 오염을 검출하는 것을 포함하는 방법.
18. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 가능한 신호가 5 로그 이상에 걸쳐 선형의 검출 범위를 갖는 것인 방법.
19. 제18항에 있어서, 프로브 신호에 기초하여 박테리아 오염량을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
20. 제4항에 있어서, 프로브가 5 로그 이상에 걸쳐 선형의 검출 범위를 갖는 신호를 생성하는 것인 방법.
21. 제20항에 있어서, 프로브 신호에 기초하여 복수 개의 박테리아 종의 존재량(abundance)을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
22. 16S rRNA 폴리뉴클레오티드의 일부의 증폭 및 검출을 위한 조성물로서, 상기 일부는 그 길이가 약 800개 미만의 뉴클레오티드이고, 상기 조성물은
    서열 번호 9에 기재된 서열의 10개 이상의 연속하는 뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머;
    서열 번호 10에 기재된 서열의 10개 이상의 연속하는 뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머; 및
    서열 번호 16에 기재된 서열의 10개 이상의 연속하는 뉴클레오티드 또는 그의 상보체를 포함하는 프로브
    를 포함하는 것인 조성물.
23. 제22항에 있어서, 용기 내에 존재하는 조성물.
24. 16S rRNA 폴리뉴클레오티드의 일부의 증폭 및 검출을 위한 조성물로서, 상기 일부는 그 길이가 약 800개 미만의 뉴클레오티드이고, 상기 조성물은
    표적 16S rRNA 폴리뉴클레오티드를 이용하는 증폭 반응에서, 길이가 50개 이상의 뉴클레오티드이고, 최적으로 정렬되었을 때, 서열 번호 1∼3 중 어느 것과 90%의 서열 동일성을 가지는 앰플리콘을 증폭시키는 프라이머; 및
    앰플리콘의 어느 한 가닥에 특이적으로 하이브리드화하는 프로브
    를 포함하는 것인 조성물.
25. 제24항에 있어서, 용기 내에 존재하는 조성물.
26. 제24항에 있어서, 표적 16S rRNA 폴리뉴클레오티드를 이용하는 증폭 반응에서, 상기 프라이머 및 프로브에 의한, 복수 개의 표적 종 중 어느 하나로부터의 약 1 pg∼5 pg의 DNA의 증폭이 30 미만의 사이클 역치 값(C_T)을 갖는 것인 조성물.
27. 16S rRNA 폴리뉴클레오티드의 일부의 증폭 및 검출을 위한 반응 혼합물로서, 상기 일부는 그 길이가 약 800개 미만의 뉴클레오티드이고, 상기 조성물은
    샘플 핵산;
    표적 16S rRNA 폴리뉴클레오티드를 이용하는 증폭 반응에서, 길이가 50개 이상의 뉴클레오티드이고, 최적으로 정렬되었을 때, 서열 번호 1∼3 중 어느 것과 90%의 서열 동일성을 가지는 앰플리콘을 증폭시키는 프라이머;
    앰플리콘의 어느 한 가닥에 특이적으로 하이브리드화하는 프로브; 및
    폴리머라제
    를 포함하며; 여기서, 상기 반응 혼합물은 반응 위치에 존재하는 것인 반응 혼합물.
28. 제27항에 있어서, 반응 위치가 소적, 웰, 플레이트, 튜브, 챔버, 유동 셀 또는 칩인 반응 혼합물.
29. 제27항에 있어서, 표적 16S rRNA 폴리뉴클레오티드를 이용하는 증폭 반응에서, 상기 프라이머 및 프로브에 의한, 복수 개의 표적 종 중 어느 하나로부터의 약 1 pg∼5 pg의 DNA의 증폭이 30 미만의 사이클 역치 값(C_T)을 갖는 것인 반응 혼합물.
30. 혈소판 샘플의 박테리아 오염을 검출하기 위한 키트로서,
    서열 번호 9에 기재된 서열의 10개 이상의 연속하는 뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머;
    서열 번호 10에 기재된 서열의 10개 이상의 연속하는 뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머;
    서열 번호 16에 기재된 서열의 10개 이상의 연속하는 뉴클레오티드 또는 그의 상보체를 포함하는 프로브
    를 포함하는 키트.
31. 제30항의 키트를 사용하는 방법으로서,
    단일 프라이머 쌍을 이용하여 샘플 또는 그의 일부에 대해 핵산 증폭 반응을 수행하여 16S rRNA 폴리뉴클레오티드의 약 800개 이하의 염기로 이루어진 검출 가능한 양의 앰플리콘을 수득하는 단계로서, 여기서, 상이한 속으로부터의 복수 개의 박테리아 종 중 어느 하나로부터의 약 1 pg∼5 pg의 DNA의 증폭은 30 미만의 사이클 역치 값(C_T)을 갖는 것인 단계; 및
    하나 이상의 검출 가능한 프로브를 이용하여 앰플리콘을 검출하는 단계로서, 여기서, 하나 이상의 검출 가능한 프로브는 각각 보존 서열에 특이적으로 하이브리드화하고, 보존 서열은 상이한 속으로부터의 복수 개의 박테리아 종 사이에 동일한 것인 단계
    를 포함하는 방법.
32. 상이한 속으로부터의 복수 개의 박테리아 종 중 어느 것에 의한 혈소판 샘플의 박테리아 오염을 검출하기 위한 시스템으로서,
    샘플에 대하여 검출 반응을 수행하라는 고객 요청을 수신하도록 구성된 컴퓨터;
    고객 요청에 응하여 샘플 또는 그의 일부에 대하여 핵산 증폭 반응을 수행하는 증폭 시스템으로서, 여기서, 증폭 반응은, 단일 프라이머 쌍 및 단일 프로브를 이용하여, 16S rRNA 폴리뉴클레오티드의 약 800개 이하의 염기로 이루어진 검출 가능한 양의 앰플리콘을 생성하고, 추가로, 여기서, 5개 이상의 속 중 어느 하나로부터의 1 pg∼5 pg의 DNA의 증폭은 30 미만의 C_T를 갖는 것인 증폭 시스템; 및
    수신자에게 보고서를 발송하는 보고서 작성기로서, 여기서, 보고서는 프로브에 의해 생성된 신호 강도의 검출에 대한 결과를 포함하는 것인 보고서 작성기
    를 포함하는 시스템.
33. 제32항에 있어서, 보고서 작성기가 프로브에 의해 생성된 신호 강도에 기초하여 샘플의 오염 여부를 확인하는 것인 시스템.
34. 제32항에 있어서, 수신자가 고객인 시스템.
35. 5개 이상의 박테리아 종 중 어느 것에 의한 혈소판 샘플의 박테리아 오염을 검출하는 방법으로서,
    반응 혼합물 중에서, 약 800개 이하의 염기로 이루어진 검출 가능한 양의 앰플리콘을 수득할 수 있는 조건 하에 상기 샘플 또는 그의 일부에 대해 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계로서, 상기 반응 혼합물은 제1 정방향 프라이머 및 제1 역방향 프라이머를 포함하고, 여기서, 제1 정방향 프라이머 및 제1 역방향 프라이머는 각각 5개 이상의 상이한 박테리아 게놈 사이에 보존되는 별개의 영역에 하이브리드화하는 것인 단계;
    상기 반응 혼합물로부터 상기 양의 앰플리콘의 존재를 나타내는 신호를 검출하여 5개 이상의 박테리아 종 중 어느 것에 의한 혈소판 샘플의 박테리아 오염을 검출하는 단계
    를 포함하는 방법.
36. 제35항에 있어서, 제1 정방향 및 제1 역방향 프라이머가 각각 15개 이상의 상이한 박테리아 게놈 사이에 보존되는 별개의 영역에 하이브리드화하는 것인 방법.
37. 제35항에 있어서, 제1 정방향 프라이머 및 제1 역방향 프라이머가 각각 최적으로 정렬되었을 때 상기 별개의 영역과 80% 이상의 서열 상동성을 나타내는 것인 방법.
38. 제35항에 있어서, 반응 혼합물이, 최적으로 정렬되었을 때, 5개 이상의 박테리아 게놈 중 어느 것 또는 그 모두와 80% 이상의 서열 상동성을 나타내는 제2 정방향 프라이머를 추가로 포함하는 것인 방법.
39. 제35항에 있어서, 반응 혼합물이, 최적으로 정렬되었을 때, 5개 이상의 박테리아 게놈 중 어느 것 또는 그 모두와 80% 이상의 서열 상동성을 나타내는 제2 역방향 프라이머를 추가로 포함하는 것인 방법.
40. 제35항에 있어서, 상기 반응 혼합물이 검출 가능한 표지를 추가로 포함하는 것인 방법.
41. 제40항에 있어서, 상기 검출 가능한 표지가 DNA 결합 염료인 방법.
42. 제35항에 있어서, 앰플리콘이 표적 16S rRNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
43. 제35항에 있어서, 상기 5개 이상의 박테리아 종이 스타필로코커스 아우레우스, 스타필로코커스 아우레우스 Mu3; 스타필로코커스 에피더미디스, 스트렙토코커스 아갈락티아에, 스트렙토코커스 파이오제네스, 스트렙토코커스 뉴모니아, 에스케리치아 콜라이, 시트로박터 코세리, 클로스트리듐 퍼프린젠스, 엔테로코커스 패칼리스, 클렙시엘라 뉴모니아, 락토바실러스 애시도필러스, 리스테리아 모노사이토제네스, 프로피오니박테리움 그래눌로섬, 슈도모나스 아에루기노사, 세라티아 마르세센스, 바실러스 세레우스, 스타필로코커스 아우레우스 Mu50, 예르시니아 엔테로콜리티카, 스타필로코커스 시뮬란스, 마이크로코커스 루테우스, 및 엔테로박터 에어로제네스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
44. 제35항에 있어서, 핵산 증폭을, 5개 이상의 박테리아 종 중 어느 하나로부터의 약 1 pg∼5 pg의 DNA가 30 미만의 사이클 역치 값(C_T)을 갖도록 하는 조건 하에서 수행하는 것인 방법.
45. 제3항에 있어서, 박테리아 오염 검출을 상기 혈소판 샘플의 수혈자로의 수혈 전에 완료하는 것인 방법.
46. 제35항에 있어서, 박테리아 오염 검출을 상기 혈소판 샘플의 수혈자로의 수혈 전에 완료하는 것인 방법.
47. 하나 이상의 프로세서에 의한 실행 시, 상이한 속으로부터의 복수 개의 박테리아 종 중 어느 것에 의한 혈소판 샘플의 박테리아 오염을 검출하는 방법을 수행하는 코드를 포함하는 컴퓨터 판독 가능 매체로서, 상기 방법은
    샘플에 대하여 검출 반응을 수행하라는 고객 요청을 수신하는 단계;
    고객 요청에 응하여 상기 샘플 또는 그의 일부에 대하여 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계로서, 여기서, 증폭 반응은, 단일 프라이머 쌍 및 단일 프로브를 이용하여, 16S rRNA의 약 800개 이하의 염기로 이루어진 검출 가능한 양의 앰플리콘을 생성하고, 추가로, 여기서, 5개 이상의 속 중 어느 하나로부터의 1 pg∼5 pg의 DNA의 증폭은 30 미만의 C_T를 갖는 것인 단계; 및
    프로브에 의해 생성된 신호 강도의 검출에 대한 결과를 포함하는 보고서를 작성하는 단계
    를 포함하는 것인, 컴퓨터 판독 가능 매체.

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