CN109682786A - 线虫的鉴别方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种线虫的鉴别方法及其应用，涉及线虫鉴别领域。本发明的线虫的鉴别方法，包括以下步骤：收集线虫虫卵，所述线虫虫卵包括：捻转血矛线虫虫卵、奥斯特线虫虫卵、夏伯特线虫虫卵和食道口线虫虫卵；通过观察培养后的各个线虫虫卵中含幼虫虫卵的数量、线虫虫卵的气室及外观形态和线虫虫卵能否与花生凝集素相结合，以将捻转血矛线虫虫卵与奥斯特线虫虫卵、夏伯特线虫虫卵和食道口线虫虫卵区分开来。该方法操作简单，成本低，能够准确高效地将捻转血矛线虫虫卵与其他三种线虫区分开来，能够缓解动物体内捻转血矛线虫检测困难，检测成本高、操作复杂和捻转血矛线虫虫卵与其他线虫虫卵不易区分的技术问题。
Description
技术领域
本发明涉及线虫鉴别领域，尤其是涉及一种线虫的鉴别方法及其应用。
背景技术
牛羊消化道常见的线虫有捻转血矛线虫、奥斯特线虫、夏伯特线虫和食道口线虫等，其中捻转血矛线虫是致病力最强、且对牛羊危害最为严重的一种寄生线虫，该线虫主要寄生于牛羊的皱胃，偶见小肠，依靠吸食宿主血液而生。当前流行的检测寄生虫病的方法有虫卵检测方法、免疫学检测方法和核酸检测方法。这些检测方法对于鉴别诊断牛羊捻转血矛线虫病非常重要。其中，虫卵检测具有直观、准确，操作简单，能反应宿主的感染状况，是首选方法，只有在虫体或虫卵检测方法困难的情况下，才采用免疫学或分子学检测方法。但由于多数虫卵在外观形态上差异极小，仅凭显微镜拍摄照片或尺寸难以将虫卵区分开来，先前虽有较多关于捻转血矛线虫虫卵形态的描述，但却没有找到能将其与其他虫卵区分开来的独特特征。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种线虫的鉴别方法，该方法操作简单，成本低，能够准确高效地将捻转血矛线虫虫卵与奥斯特线虫虫卵、夏伯特线虫虫卵和食道口线虫虫卵区别开来，能够解决上述问题中的至少一种。
本发明的第二个目的在于提供一种线虫的鉴别方法在捻转血矛线虫与其他线虫鉴别中的应用。
为了解决上述技术问题，特采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种线虫的鉴别方法，包括以下步骤：
收集线虫虫卵，所述线虫虫卵包括：捻转血矛线虫虫卵、奥斯特线虫虫卵、夏伯特线虫虫卵和食道口线虫虫卵；
通过观察培养后的各个线虫虫卵中含幼虫虫卵的数量、线虫虫卵的气室及外观形态和线虫虫卵能否与花生凝集素相结合，以将捻转血矛线虫虫卵与奥斯特线虫虫卵、夏伯特线虫虫卵和食道口线虫虫卵区分开来。
作为进一步技术方案，所述收集线虫虫卵为采用沉淀法或漂浮法收集动物粪便中的线虫虫卵；优选采用沉淀法收集动物粪便中的线虫虫卵；
优选地，所述沉淀法包括以下步骤：将粪便粉碎，于滤网上冲洗过滤得到滤液，然后将滤液再过滤2～3次，静置得到沉淀，将沉淀用水清洗后得到虫卵；
优选地，所述滤网为40～120目，优选为60～100目；
优选地，所述动物粪便取自动物直肠；
优选地，所述动物粪便包括牛粪便和/或羊粪便。
作为进一步技术方案，所述观察为显微镜观察；
优选地，所述显微镜的放大倍数为200～640倍，优选为400倍。
作为进一步技术方案，所述培养为将收集的线虫虫卵放置于生理盐水中培养3～4天，优选为4天；
优选地，培养的温度为20～30℃，优选为25℃。
作为进一步技术方案，所述捻转血矛线虫虫卵和奥斯特线虫虫卵中含有幼虫的虫卵的数量大于夏伯特线虫虫卵和食道口线虫虫卵中含有幼虫的虫卵的数量；
优选地，所述培养后的线虫虫卵中，有超过50％的捻转血矛线虫虫卵和奥斯特线虫虫卵发育至含有幼虫的虫卵；
有不超过0.1％的夏伯特线虫虫卵和食道口线虫虫卵发育至含有幼虫的虫卵；
优选地，所述捻转血矛线虫虫卵含有气室的数量小于奥斯特线虫虫卵含有气室的数量；
优选地，有不超过0.8％的捻转血矛线虫虫卵含有气室；
有超过43％的奥斯特线虫虫卵含有气室。
作为进一步技术方案，所述奥斯特线虫虫卵和食道口线虫虫卵的长宽比大于捻转血矛线虫虫卵和夏伯特线虫虫卵的长宽比；
优选地，所述奥斯特线虫虫卵和食道口线虫虫卵的外观形态呈长椭圆形，奥斯特线虫虫卵和食道口线虫虫卵的长宽比各自独立地为1.7～1.85，优选为1.74～1.83；
所述捻转血矛线虫虫卵和夏伯特线虫虫卵的外观形态呈椭圆形，捻转血矛线虫虫卵和夏伯特线虫虫卵的长宽比各自独立地为1.45～1.6，优选为1.5～1.55；
优选地，所述捻转血矛线虫虫卵的长度和宽度小于夏伯特线虫虫卵的长度和宽度；
优选地，所述捻转血矛线虫虫卵的长度为64.22～102.2μm，优选为70～90μm；
所述捻转血矛线虫虫卵的宽度为37.96～69.3μm，优选为40～60μm。
作为进一步技术方案，所述虫卵能否与花生凝集素相结合采用荧光法判断，包括以下步骤：将线虫虫卵依次进行水洗、PBS洗、染色和PBS洗，于荧光显微镜下观察；
优选地，所述捻转血矛线虫虫卵能与花生凝集素相结合，而奥斯特线虫虫卵和夏伯特线虫虫卵不能与花生凝集素相结合。
作为进一步技术方案，所述水洗或PBS洗为将线虫虫卵与蒸馏水或PBS缓冲液混合后进行离心，去除上清液，得到虫卵沉淀；
优选地，所述离心的离心力为250～300×g；
优选地，所述离心的时间为4～6min；
和/或，所述染色为采用荧光标记的花生凝集素染色；
优选地，所述染色的时间为0.8～1h，优选为0.9～1h；
和/或，所述染色和PBS洗之间还包括离心，去除上清液的步骤。
作为进一步技术方案，所述荧光显微镜使用的荧光封片液为甘油和PBS的混合液；
优选地，所述荧光封片液中甘油与PBS的质量比为8～10:1；
和/或，所述荧光显微镜的激发光为蓝色；
优选地，所述荧光显微镜观察捻转血矛线虫虫卵呈绿色，而奥斯特线虫虫卵和夏伯特线虫虫卵未呈现绿色。
第二方面，本发明提供了一种线虫的鉴别方法在捻转血矛线虫与其他线虫鉴别中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的线虫的鉴别方法，通过收集线虫虫卵，观察培养后的各个线虫虫卵中含幼虫虫卵的数量、气室及外观形态和虫卵能否与花生凝集素相结合，以将捻转血矛线虫虫卵与奥斯特线虫虫卵、夏伯特线虫虫卵和食道口线虫虫卵区分开来。该方法操作简单，成本低，能够准确高效地将捻转血矛线虫虫卵与其他三种线虫区分开来，能够缓解动物体内捻转血矛线虫检测困难，检测成本高、操作复杂和捻转血矛线虫虫卵与其他线虫虫卵不易区分的技术问题。将本发明的线虫鉴别方法应用于捻转血矛线虫与其他线虫的鉴别，为线虫的鉴别提供了新思路。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的捻转血矛线虫虫卵的400倍显微镜观察图；
图2为本发明实施例1提供的奥斯特线虫虫卵的400倍显微镜观察图；
图3为本发明实施例1提供的夏伯特线虫虫卵的400倍显微镜观察图；
图4为本发明实施例1提供的食道口线虫虫卵的400倍显微镜观察图；
图5为本发明实施例1提供的捻转血矛线虫虫卵(左)、奥斯特线虫虫卵(中)和夏伯特线虫虫卵(右)的荧光显微镜观察图(左图为绿色荧光)。
具体实施方式
下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
第一方面，在一些具体的实施方式中提供了一种线虫的鉴别方法，包括以下步骤：
收集线虫虫卵，所述线虫虫卵包括：捻转血矛线虫虫卵、奥斯特线虫虫卵、夏伯特线虫虫卵和食道口线虫虫卵；
通过观察培养后的各个线虫虫卵中含幼虫虫卵的数量、线虫虫卵的气室及外观形态和线虫虫卵能否与花生凝集素相结合，以将捻转血矛线虫虫卵与奥斯特线虫虫卵、夏伯特线虫虫卵和食道口线虫虫卵区分开来。
首先收集捻转血矛线虫、奥斯特线虫、夏伯特线虫和食道口线虫的虫卵。
线虫是线虫动物门，是动物界中数量最丰者之一，寄生于动植物，或自由生活于土壤、淡水和海水环境中，绝大多数营自生生活，营寄生生活中，只有极少部分寄生于人体并导致疾病。
捻转血矛线虫、奥斯特线虫、夏伯特线虫和食道口线虫为四种常见的线虫，分布广泛，主要寄生于牛、羊等动物体内，能够引发相应的疾病，其中以捻转血矛线虫的致病力最强，对牛、羊危害最为严重，不利于牛、羊等动物的生长发育。因此，及时高效地对动物体内寄生线虫的检测尤为重要。
以上四种线虫在寄生的同时，会产生相应的线虫虫卵，虫卵随着动物的粪便排出体外。不同线虫虫卵具有不同的外观和特性，根据这些特有的外观和特性能够对线虫虫卵加以区分。通过检测动物粪便中的线虫虫卵，能够得知动物体内寄生线虫的种类。本发明提供了一种捻转血矛线虫与奥斯特线虫、夏伯特线虫和食道口线虫的鉴别方法，以将捻转血矛线虫与其他三种线虫区分开来。
观察培养后的线虫虫卵中含幼虫虫卵的数量。线虫虫卵在适宜的条件下会逐渐发育成含有幼虫的虫卵，根据在规定的培养时间内虫卵发育至含有幼虫的虫卵的数量来对四种线虫加以区分鉴别。
观察培养后的线虫虫卵中的气室。线虫虫卵在发育过程中，会在虫卵中形成气室，根据在规定的培养时间内虫卵发育至含有气室的虫卵的数量来对四种线虫加以区分鉴别。
观察培养后线虫虫卵的外观形态。不同种类的线虫虫卵的外观形态不同，例如虫卵的形状、长度、宽度、长宽比等存在差异，根据这些形态差异来对四种线虫加以区分鉴别。
虫卵能否与花生凝集素相结合。花生凝集素能够特异性的与某种糖蛋白结合，不同种类的线虫虫卵表面含有的糖蛋白不同，当线虫虫卵表面含有此类糖蛋白时，即能够与花生凝集素相结合。根据线虫虫卵能否与花生凝集素相结合来对四种线虫加以区分鉴别。
在本发明中，通过收集线虫虫卵，观察培养后的各个线虫虫卵中含幼虫虫卵的数量、气室及外观形态和虫卵能否与花生凝集素相结合，结合上述三种特征来将捻转血矛线虫虫卵与奥斯特线虫虫卵、夏伯特线虫虫卵和食道口线虫虫卵区分开来。该方法操作简单，成本低，能够准确高效地将捻转血矛线虫虫卵与其他三种线虫区分开来，能够缓解动物体内捻转血矛线虫检测困难，检测成本高、操作复杂和捻转血矛线虫虫卵与其他线虫虫卵不易区分的技术问题。
在一种优选的实施方式中，收集线虫虫卵为采用沉淀法或漂浮法收集动物粪便中的线虫虫卵；优选采用沉淀法收集动物粪便中的线虫虫卵。
动物体内寄生线虫产生的虫卵会通过粪便排出体外，进而传染其他动物。在本发明中，对于收集粪便中线虫虫卵的方式不做过多限制，例如为沉淀法、漂浮法，或者采用本领域技术人员所熟知的其他线虫虫卵的收集方法。
优选地，所述沉淀法包括以下步骤：将粪便粉碎，于滤网上冲洗过滤得到滤液，然后将滤液再过滤2～3次，静置得到沉淀，将沉淀用水清洗后得到虫卵。
在一种优选的实施方式中，沉淀法收集线虫虫卵包括以下步骤：直肠收集牛羊新鲜粪样，经捣碎后，80目滤网冲洗过滤，弃去粪渣，滤液再用滤网过滤2-3次，静置20-30min，倒去上清；沉淀再用清水静置20-30min，如此反复2-3次得到含有虫卵的沉淀。
优选地，所述滤网为40～120目，优选为60～100目。滤网典型但非限制性的目数为40目、50目、60目、70目、80目、90目、100目、110目或120目。
在本发明中，滤网的目数影响最后得到的沉淀中杂质和线虫虫卵的含量。滤网目数过小，会导致沉淀中杂质的含量增加；滤网的目数过大会导致沉淀中线虫虫卵的含量减小。
通过对滤网目数进行进一步的优化和调整，使得沉淀中杂质的含量较低，虫卵的含量适宜。
优选地，所述动物粪便取自动物直肠。
直肠粪便中的线虫虫卵的产生时间大致相同，产生后的外界条件相同，能够保证粪便中的线虫虫卵在同一生长阶段，排除其他因素的影响。
优选地，所述动物粪便包括但不限于牛粪便和羊粪便，或者选自其他能够被上述线虫寄生的动物的粪便。由于上述四种线虫多寄生在牛、羊等动物体内，因此优选采用牛、羊粪便。
在一种优选的实施方式中，观察为显微镜观察。
线虫虫卵个体微小，难以通过肉眼观察。在本发明中，采用显微镜观察线虫虫卵的个体大小及外观形态。
优选地，所述显微镜的放大倍数为200～640倍，优选为400倍。
通过对显微镜放大倍数进行进一步的优化和调整，使得能够更加清晰的观察虫卵的大小及外观形态，方便测量。
在一种优选的实施方式中，培养为将收集的线虫虫卵放置于生理盐水中培养3～4天，优选为4天。在适宜的条件下，线虫虫卵的内部结构会逐渐发育成形，直至最后形成幼虫破卵而出。
在本发明中，将线虫虫卵放置于生理盐水中，在适宜的条件下进行培养3～4天，根据在规定的培养时间内虫卵发育至含有幼虫的虫卵的数量来对四种线虫加以区分鉴别。
优选地，培养的温度为20～30℃。培养的温度典型但非限制性的为20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃，优选为25℃。
通过对培养的时间和温度进行进一步的优化和调整，使得能够更加明显的观察含有幼虫的虫卵和不含幼虫的虫卵。
在一种优选的实施方式中，捻转血矛线虫虫卵和奥斯特线虫虫卵中含有幼虫的虫卵的数量大于夏伯特线虫虫卵和食道口线虫虫卵中含有幼虫的虫卵的数量；
优选地，所述培养后的线虫虫卵中，有超过50％的捻转血矛线虫虫卵和奥斯特线虫虫卵发育至含有幼虫的虫卵；
有不超过0.1％的夏伯特线虫虫卵和食道口线虫虫卵发育至含有幼虫的虫卵。
不同线虫虫卵根据其种类的不同，发育至含有幼虫的虫卵的时间不同。采用显微镜对培养后的线虫进行观察，能够清晰的观察到含有幼虫的虫卵和不含幼虫的虫卵。其中，夏伯特线虫虫卵和食道口线虫虫卵几乎不会发育至含有幼虫的虫卵，而大部分的捻转血矛线虫虫卵和奥斯特线虫虫卵发育至含有幼虫的虫卵，据此可以推知，显微镜观察到的含有幼虫的虫卵基本为捻转血矛线虫虫卵和奥斯特线虫虫卵，而不含幼虫的虫卵大部分为夏伯特线虫虫卵和食道口线虫虫卵。
优选地，所述捻转血矛线虫虫卵含有气室的数量小于奥斯特线虫虫卵含有气室的数量；
优选地，有不超过0.8％的捻转血矛线虫虫卵含有气室；
有超过43％的奥斯特线虫虫卵含有气室。
根据发育至含有幼虫的虫卵中含有气室与否能够将捻转血矛线虫虫卵和奥斯特线虫虫卵区别开来。其中发育至含有幼虫的捻转血矛线虫虫卵中几乎不含气室，而发育至含有幼虫的奥斯特线虫虫卵中有接近一半的含有气室，据此可以推知，显微镜观察到的含有气室的幼虫虫卵基本为奥斯特线虫虫卵，而不含气室的幼虫虫卵大部分为捻转血矛线虫虫卵，少部分为奥斯特线虫虫卵。
在一种优选的实施方式中，奥斯特线虫虫卵和食道口线虫虫卵的长宽比大于捻转血矛线虫虫卵和夏伯特线虫虫卵的长宽比。
采用显微镜对线虫虫卵进行观察，能够清晰地观察到线虫虫卵的外观形态。根据捻转血矛线虫虫卵、奥斯特线虫虫卵、夏伯特线虫虫卵和食道口线虫虫卵的长宽比不同来对四种线虫进行区分。在显微镜下观察到的线虫虫卵中，长宽比较大的为奥斯特线虫虫卵和食道口线虫虫卵；长宽比较小的为捻转血矛线虫虫卵和夏伯特线虫虫卵。从而对四种线虫进行初步区分鉴别。
优选地，所述奥斯特线虫虫卵和食道口线虫虫卵的外观形态呈长椭圆形，奥斯特线虫虫卵和食道口线虫虫卵的长宽比各自独立地为1.7～1.85。奥斯特线虫虫卵和食道口线虫虫卵典型但非限制性的长宽比各自独立地为1.7、1.71、1.72、1.73、1.74、1.75、1.76、1.77、1.78、1.79、1.8、1.81、1.82、1.83、1.84或1.85，优选为1.74～1.83。
所述捻转血矛线虫虫卵和夏伯特线虫虫卵的外观形态呈椭圆形，捻转血矛线虫虫卵和夏伯特线虫虫卵的长宽比各自独立地为1.45～1.6。捻转血矛线虫虫卵和夏伯特线虫虫卵典型但非限制性的长宽比各自独立地为1.45、1.46、1.47、1.48、1.49、1.5、1.51、1.52、1.53、1.54、1.55、1.56、1.57、1.58、1.59、1.6，优选为1.5～1.55。
通过对上述四种线虫虫卵长宽比进行进一步的限定，使得能够更加清晰准确的对四种线虫进行区分鉴别。
优选地，所述捻转血矛线虫虫卵的长度和宽度小于夏伯特线虫虫卵的长度和宽度。
根据捻转血矛线虫虫卵和夏伯特线虫虫卵的长度和宽度不同来进行区分鉴别。在显微镜下观察到的线虫虫卵中，线虫虫卵长度和宽度较大的为夏伯特线虫，而线虫虫卵长度和宽度较小的为捻转血矛线虫虫卵，从而进一步将捻转血矛线虫虫卵从四种线虫虫卵中区分开来。
优选地，所述捻转血矛线虫虫卵的长度为64.22～102.2μm。捻转血矛线虫虫卵典型但非限制性的长度为64.22μm、67μm、70μm、74μm、77μm、80μm、84μm、87μm、90μm、94μm、97μm或102.2μm，优选为70～90μm。
所述捻转血矛线虫虫卵的宽度为37.96～69.3μm。捻转血矛线虫虫卵典型但非限制性的宽度为37.96μm、40μm、44μm、47μm、50μm、54μm、57μm、60μm、64μm、67μm或69.3μm，优选为40～60μm。
通过对捻转血矛线虫虫卵和夏伯特线虫虫卵的长度和宽度进行进一步的限定，使得能够更加清晰准确的将捻转血矛线虫虫卵从夏伯特线虫虫卵中区分开来。
在一种优选的实施方式中，虫卵能否与花生凝集素相结合采用荧光法判断，包括以下步骤：将线虫虫卵依次进行水洗、PBS洗、染色和PBS洗，于荧光显微镜下观察。
在本发明中，根据线虫虫卵能否与花生凝集素相结合来将四种线虫区分开来。采用荧光法来判断，包括以下步骤：首先将线虫虫卵用清水进行清洗，去除线虫虫卵中的杂质；然后用PBS缓冲液(磷酸缓冲盐溶液)对线虫虫卵进行清洗，为后续步骤提供一个适宜的pH条件；再加入荧光标记的花生凝集素对虫卵进行染色，使得虫卵能够与花生凝集素充分接触；最后用PBS缓冲液对线虫虫卵进行清洗，去除未与线虫虫卵结合的花生凝集素。
优选地，所述捻转血矛线虫虫卵能与花生凝集素相结合，而奥斯特线虫虫卵和夏伯特线虫虫卵不能与花生凝集素相结合。
由于花生凝集素仅能够与特定的糖蛋白进行结合，因此含有此类糖蛋白的捻转血矛线虫虫卵能与花生凝集素相结合，而不含此类糖蛋白的奥斯特线虫虫卵和夏伯特线虫虫卵不能与花生凝集素相结合。
在一种优选的实施方式中，水洗或PBS洗为将线虫虫卵与蒸馏水或PBS缓冲液混合后进行离心，去除上清液，得到虫卵沉淀。
在本发明中，水洗和PBS缓冲液洗的方式不做过多限制，例如为离心，或者采用本领域技术人员所熟知的其他方式。
优选地，所述离心的离心力为250～300×g。离心的离心力典型但非限制性的为250×g、255×g、260×g、265×g、270×g、275×g、280×g、285×g、290×g、295×g或300×g，优选为280×g。
优选地，所述离心的时间为4～6min。离心的时间典型但非限制性的为4min、4.2min、4.4min、4.6min、4.8min、5min、5.2min、5.4min、5.6min、5.8min或6min，优选为5min。
通过对离心力和离心时间进行进一步的优化和调整，使得能够更好地清洗线虫虫卵，实现线虫虫卵沉淀和溶液的分离。
在一种优选的实施方式中，所述染色为采用荧光标记的花生凝集素染色。在本发明中，将荧光标记的花生凝集素与线虫虫卵充分混合进行染色。
优选地，所述染色的时间为0.8～1h。染色的时间典型但非限制性的为0.8h、0.82h、0.84h、0.86h、0.88h、0.9h、0.92h、0.94h、0.96h、0.98h或1h，优选为0.9～1h；
通过对染色的时间进行进一步的优化和调整，使得能够更加充分地实现花生凝集素对线虫虫卵的染色，防止因染色时间过短而染色效果差、染色时间过长而干扰荧光观察的情况。
在一种优选的实施方式中，染色和PBS洗之间还包括离心，去除上清液的步骤。
染色过程中，得到的是虫卵与染色液的混合溶液，在PBS洗之前还要将除虫卵以外的溶液去除。
在一种优选的实施方式中，荧光显微镜使用的荧光封片液为甘油和PBS的混合液。
荧光封片液必须无自发荧光，否则会影响观察的准确性，封片液的pH影响荧光的亮度，因此，在本发明中采用甘油和PBS混合液作为封片液。
优选地，所述荧光封片液中甘油与PBS的质量比为8～10:1。荧光封片液中甘油与PBS的质量比典型但非限制性的为8：1、8.2：1、8.4：1、8.6：1、8.8：1、9：1、9.2：1、9.4：1、9.6：1、9.8：1或10：1，优选为9：1。
通过荧光封片液中甘油与PBS的质量比进行进一步的优化和调整，使得荧光更亮，能够更加清晰的观察到荧光。
在一种优选的实施方式中，荧光显微镜的激发光为蓝色。
优选地，所述荧光显微镜观察捻转血矛线虫虫卵呈绿色，而奥斯特线虫虫卵和夏伯特线虫虫卵未呈现绿色。
在本发明中，捻转血矛线虫虫卵含有能够与花生凝集素相结合的糖蛋白，在荧光显微镜下观察到呈绿色，而奥斯特线虫虫卵和夏伯特线虫虫卵不含能够与花生凝集素相结合的糖蛋白。在荧光显微镜下观察到呈黑色，无荧光。
在一种优选的实施方式中，采用荧光标记的花生凝集素对虫卵进行染色，包括以下步骤：
A、虫卵液280×g离心5min，用移液枪小心除去上清，沉淀加入PBS缓冲液；
B、上述含PBS的虫卵混液280×g离心5min，用移液枪小心除去上清，沉淀加入1mL荧光标记的花生凝集素(用前，用PBS溶解，重组成5μg/mL),室温摇床作用1h；
C、上述含荧光标记的花生凝集素的虫卵混液经280×g离心5min，用移液枪小心除去上清；
D、沉淀加入PBS，混匀，280×g再离心5min，用移液器小心去除上清；
E、重复D步骤，沉淀加入适量PBS液后，吸取5μL含PBS且经染色后的虫卵悬液与3μL荧光封片液(甘油和PBS按9:1混合)于载玻片，盖上盖玻片，于荧光显微镜下进行观察(蓝色激发)。
捻转血矛线虫虫卵能结合花生凝集素，在荧光显微镜400倍放大下呈明显的绿色；而奥斯特线虫、夏伯特线虫不与花生凝集素结合，显微镜下未呈现绿色。
第二方面，在一些具体的实施方式中提供了一种线虫的鉴别方法在捻转血矛线虫与其他线虫鉴别中的应用。
本发明提供的线虫的鉴别方法，操作简单，成本低，能够准确高效地将捻转血矛线虫虫卵与其他三种线虫区分开来，能够缓解动物体内捻转血矛线虫检测困难，检测成本高、操作复杂和捻转血矛线虫虫卵与其他线虫虫卵不易区分的技术问题。将本发明的线虫鉴别方法应用于捻转血矛线虫与其他线虫的鉴别，能够为线虫的鉴别提供新思路。
下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1
本实施例提供了一种线虫的鉴别方法，包括如下步骤：
1.收集线虫虫卵：采用沉淀法收集虫卵包括以下步骤，直肠收集牛羊新鲜粪样，经捣碎后，80目滤网冲洗过滤，弃去粪渣，滤液再用滤网过滤2～3次，静置20～30min，倒去上清；沉淀再用清水静置20-30min，如此反复2～3次得到虫卵；
2.培养并观察线虫虫卵中含有幼虫和气室的数量：虫卵在生理盐水中置于25℃左右环境中，放置4天，显微镜下400倍观察虫卵中含有幼虫的虫卵的数量和含有气室虫卵的数量；
3.观察线虫虫卵的外观形态(长度、宽度和长宽比)。
4.荧光标记的花生凝集素对虫卵进行染色：
A.虫卵液280×g离心5min，用移液枪小心除去上清，沉淀加入PBS缓冲液；
B.上述含PBS的虫卵混液280×g离心5min，用移液枪小心除去上清，沉淀加入1mL荧光标记的花生凝集素(用前，用PBS溶解，重组成5μg/mL),室温摇床作用1h；
C.上述含荧光标记的花生凝集素的虫卵混液经280×g离心5min，用移液枪小心除去上清；
D.沉淀加入PBS，混匀，280×g再离心5min，用移液器小心去除上清；
E.重复D步骤，沉淀加入适量PBS液后，吸取5μL含PBS且经染色后的虫卵悬液与3μL荧光封片液(甘油和PBS按9:1混合)于载玻片，盖上盖玻片，于荧光显微镜下进行观察(蓝色激发)。
对比例1
本对比例提供了一种线虫的鉴别方法，与实施例1的区别在于不包括步骤2中观察虫卵中含有幼虫的虫卵数量及含有气室虫卵数量的步骤。
对比例2
本对比例提供了一种线虫的鉴别方法，与实施例1的区别在于不包括步骤3中观察虫卵外观形态的步骤。
对比例3
本对比例提供了一种线虫的鉴别方法，与实施例1的区别在于不包括步骤4中荧光标记的花生凝集素对虫卵进行染色步骤。
试验例1
将捻转血矛线虫虫卵、奥斯特线虫虫卵、夏伯特线虫虫卵和食道口线虫虫卵分别根据本实施例1提供的鉴别方法进行观察检测，其特征如表1所示，捻转血矛线虫虫卵、奥斯特线虫虫卵、夏伯特线虫虫卵和食道口线虫虫卵的显微镜观察图分别如图1、图2、图3和图4所示。
表1捻转血矛线虫虫卵、奥斯特线虫虫卵、夏伯特线虫虫卵和食道口线虫虫卵根据实施例1提供的线虫的鉴别方法所呈现的特征
从表1中可以看出，采用本发明提供的线虫的鉴别方法观察到捻转血矛线虫的特征为：超过50％的虫卵发育至含有幼虫的虫卵，且虫卵中少见气室；虫卵长度为64.22～102.2μm，宽度为37.96～69.3μm，长宽比为1.45～1.6；采用荧光显微镜观察显绿色荧光。
试验例2
取含有捻转血矛线虫、奥斯特线虫、夏伯特线虫和食道口线虫的羊1只，采用实施例1和对比例1-3提供的线虫的鉴别方法对羊体内的捻转血矛线虫与奥斯特线虫、夏伯特线虫和食道口线虫进行鉴别区分，试验结果如表2所示。
表2实施例1和对比例1-3的线虫的鉴别方法对羊体内的捻转血矛线虫虫卵的鉴别
注：表中“x”表示长度为64.22～102.2μm，宽度为37.96～69.3μm，长宽比为1.45～1.6的虫卵占总虫卵的百分比；表中“/”表示为没有进行相应的鉴别步骤，因此也没有相应的数据。
采用实施例1提供的线虫的鉴别方法观察到有25％的线虫虫卵发育至含有幼虫的虫卵，9％的线虫虫卵发育至含有气室，能够初步判定含有捻转血矛线虫虫卵或奥斯特线虫虫卵，也含有夏伯特线虫虫卵或食道口线虫虫卵；有11％的线虫虫卵符合捻转血矛线虫虫卵的外观形态，但是由于奥斯特线虫虫卵与捻转血矛线虫虫卵的外观形态相似，仍然不能判断含有捻转血矛线虫虫卵；最后，如图5所示，通过荧光显微镜观察到绿色荧光，从而能够判断线虫虫卵中含有捻转血矛线虫虫卵，进而推断出动物体内含有捻转血矛线虫。
与实施例1相比，采用对比例1和对比例2提供的线虫的鉴别方法不能将捻转血矛线虫虫卵与食道口线虫虫卵区分开来；对比例3不能将捻转血矛线虫虫卵和奥斯特线虫虫卵区分开来。因此，本发明提供的线虫的鉴别方法需要结合以上线虫虫卵的三个特征综合判断，才能够更加准确的将捻转血矛线虫虫卵从其他三种线虫虫卵中区分开来。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种线虫的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：
收集线虫虫卵，所述线虫虫卵包括：捻转血矛线虫虫卵、奥斯特线虫虫卵、夏伯特线虫虫卵和食道口线虫虫卵；
通过观察培养后的各个线虫虫卵中含幼虫虫卵的数量、线虫虫卵的气室及外观形态和线虫虫卵能否与花生凝集素相结合，以将捻转血矛线虫虫卵与奥斯特线虫虫卵、夏伯特线虫虫卵和食道口线虫虫卵区分开来。
2.根据权利要求1所述的线虫的鉴别方法，其特征在于，所述收集线虫虫卵为采用沉淀法或漂浮法收集动物粪便中的线虫虫卵；优选采用沉淀法收集动物粪便中的线虫虫卵；
优选地，所述沉淀法包括以下步骤：将粪便粉碎，于滤网上冲洗过滤得到滤液，然后将滤液再过滤2～3次，静置得到沉淀，将沉淀用水清洗后得到虫卵；
优选地，所述滤网为40～120目，优选为60～100目；
优选地，所述动物粪便取自动物直肠；
优选地，所述动物粪便包括牛粪便和/或羊粪便。
3.根据权利要求1所述的线虫的鉴别方法，其特征在于，所述观察为显微镜观察；
优选地，所述显微镜的放大倍数为200～640倍，优选为400倍。
4.根据权利要求1所述的线虫的鉴别方法，其特征在于，所述培养为将收集的线虫虫卵放置于生理盐水中培养3～4天，优选为4天；
优选地，培养的温度为20～30℃，优选为25℃。
5.根据权利要求1所述的线虫的鉴别方法，其特征在于，所述捻转血矛线虫虫卵和奥斯特线虫虫卵中含有幼虫的虫卵的数量大于夏伯特线虫虫卵和食道口线虫虫卵中含有幼虫的虫卵的数量；
优选地，所述培养后的线虫虫卵中，有超过50％的捻转血矛线虫虫卵和奥斯特线虫虫卵发育至含有幼虫的虫卵；
有不超过0.1％的夏伯特线虫虫卵和食道口线虫虫卵发育至含有幼虫的虫卵；
优选地，所述捻转血矛线虫虫卵含有气室的数量小于奥斯特线虫虫卵含有气室的数量；
优选地，有不超过0.8％的捻转血矛线虫虫卵含有气室；
有超过43％的奥斯特线虫虫卵含有气室。
6.根据权利要求1所述的线虫的鉴别方法，其特征在于，所述奥斯特线虫虫卵和食道口线虫虫卵的长宽比大于捻转血矛线虫虫卵和夏伯特线虫虫卵的长宽比；
优选地，所述奥斯特线虫虫卵和食道口线虫虫卵的外观形态呈长椭圆形，奥斯特线虫虫卵和食道口线虫虫卵的长宽比各自独立地为1.7～1.85，优选为1.74～1.83；
所述捻转血矛线虫虫卵和夏伯特线虫虫卵的外观形态呈椭圆形，捻转血矛线虫虫卵和夏伯特线虫虫卵的长宽比各自独立地为1.45～1.6，优选为1.5～1.55；
优选地，所述捻转血矛线虫虫卵的长度和宽度小于夏伯特线虫虫卵的长度和宽度；
优选地，所述捻转血矛线虫虫卵的长度为64.22～102.2μm，优选为70～90μm；
所述捻转血矛线虫虫卵的宽度为37.96～69.3μm，优选为40～60μm。
7.根据权利要求1所述的线虫的鉴别方法，其特征在于，所述虫卵能否与花生凝集素相结合采用荧光法判断，包括以下步骤：将线虫虫卵依次进行水洗、PBS洗、染色和PBS洗，于荧光显微镜下观察；
优选地，所述捻转血矛线虫虫卵能与花生凝集素相结合，而奥斯特线虫虫卵和夏伯特线虫虫卵不能与花生凝集素相结合。
8.根据权利要求7所述的线虫的鉴别方法，其特征在于，所述水洗或PBS洗为将线虫虫卵与蒸馏水或PBS缓冲液混合后进行离心，去除上清液，得到虫卵沉淀；
优选地，所述离心的离心力为250～300×g；
优选地，所述离心的时间为4～6min；
和/或，所述染色为采用荧光标记的花生凝集素染色；
优选地，所述染色的时间为0.8～1h，优选为0.9～1h；
和/或，所述染色和PBS洗之间还包括离心，去除上清液的步骤。
9.根据权利要求7或8所述的线虫的鉴别方法，其特征在于，所述荧光显微镜使用的荧光封片液为甘油和PBS的混合液；
优选地，所述荧光封片液中甘油与PBS的质量比为8～10:1；
和/或，所述荧光显微镜的激发光为蓝色；
优选地，所述荧光显微镜观察捻转血矛线虫虫卵呈绿色，而奥斯特线虫虫卵和夏伯特线虫虫卵未呈现绿色。
10.根据权利要求1-9任一项所述的线虫的鉴别方法在捻转血矛线虫与其他线虫鉴别中的应用。
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