CN111057707B - 转基因抗虫玉米2hvb4外源插入片段的旁侧序列及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及转基因抗虫玉米2HVB4外源插入片段的旁侧序列及其检测方法。发明从转Bt cry2Ah‑vp基因的玉米植株中筛选到一个抗黏虫效果显著的转基因事件2HVB4；通过染色体步移的方法获得了其3’端边界序列和5’端边界序列，分别如SEQ ID NO.1中第947‑1849位所示和如SEQ ID NO.2中第1‑436位所示。两端的边界序列可以作为本转化事件的特异检测序列，通过两个边界序列设计引物，可以对转基因事件2HVB4特异性检测，并应用于检测试剂盒的开发。

Description

转基因抗虫玉米2HVB4外源插入片段的旁侧序列及其检测 方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是涉及转基因抗虫玉米植物的检测。

背景技术

玉米(Zea mays L.)是重要的粮食作物、饲料和工业原料，在国民经济中起着十分重要的作用。虫害一直是制约玉米产量的重要因素之一，全球范围内玉米害虫约350种。害虫对玉米穗发生侵害时，会产生真菌毒素，对牲畜的健康造成很多不良的影响，并且该毒素被怀疑可导致癌症。因此，有效地防治虫害对我国乃至全世界的农业生产具有非常重要的意义。

传统的病虫害防治方法主要包括化学防治和生物防治。化学防治杀虫谱广，见效快，应急性强，操作方便，但长期喷洒会导致严重的生态问题，包括害虫产生抗药性，对环境造成污染，对人体健康造成严重危害，毒害害虫的天敌及有益的昆虫等诸多弊端。生物防治是从生态角度寻求的一种方法，相对安全，减轻了环境污染，但其见效慢，受环境影响较大。抗虫转基因技术的发展对植物自身抗虫性的提高有十分重要的意义，为虫害的防治提供了一条新的途径。自1996年第一例转Bt基因抗虫玉米在美国被批准商业化种植以来，全球抗虫转基因玉米的种植面积逐年增加。

转Bt基因抗虫玉米的研发工作，在国外起步较早并且发展十分迅猛，如孟山都公司推出的“MON810”抗虫玉米和Syngenta公司推出的“Bt176”和“Bt11”抗虫玉米已产业化推广，它们都是以玉米螟为防治对象的转Bt cry1Ab基因的抗虫玉米；随后迪卡公司推出了转Bt cry1Ac基因抗虫玉米“DBT418”，Aventis CropScience公司和杜邦先锋公司分别推出了转Bt cry9C基因抗虫玉米“CBH351”和转Bt cry1F基因抗虫玉米“TC1507”，其防治对象主要是玉米螟。国内的抗虫玉米研究起步比较晚，发展也相对比较缓慢，到目前为止尚无产业化的转Bt基因的抗虫玉米品种。丁群星等和王国英等(丁群星等，中国科学B辑，1993，23(7)：707-713；王国英等，中国科学B辑，1995，25(1)：71-76)分别利用子房注射法和基因枪轰击法将Bt基因导入玉米中，获得了转Bt基因再生玉米植株；王罡和杜娟(王罡等，玉米科学，2002，10(1)：36-37)用花粉管道法将Bt基因导入玉米进行研究并获得了转基因植株；朱常香等(朱常香等，山东农业大学学报：自然科学版，2002，33(2)：120-125)采用共转化法将Btcry1Ab基因和bar基因转入玉米幼胚中，部分转基因植株对玉米螟表现出一定的抗性。

黏虫(Mythimna separata)是一种常见的玉米害虫，属鳞翅目夜蛾科，在幼虫时期暴食玉米叶片，严重发生时，可短期内吃光叶片，造成玉米减产甚至绝收[江幸福,张蕾,程云霞,罗礼智.我国黏虫发生危害新特点及趋势分析.应用昆虫学报,2014,51(06):1444-1449.]。现有的Bt基因对玉米螟有良好的防治效果，但在黏虫防治上还需要有效的抗虫基因[杨素娟,黄闽忠,李艳秋,周子珊,江幸福,高继国,程云霞,张杰.对黏虫具有杀虫活性的Bt蛋白筛选及分析.植物保护,2016,42(03):30-35.]。cry2Ah基因是从土壤样本中混合收集免培养获得，Cry2Ah蛋白对玉米螟有体重抑制活性，对棉铃虫有生长抑制活性，同时对cry1Ac抗性棉铃虫也有很好的生长抑制活性[Shu C L,Zhang J T,Chen Gui H,Liang GM,He K L,Crickmore N,Huang D F,Zhang J,Song F P.Use of a pooled clone methodto isolate a novel Bacillus thuringiensis Cry2A toxin with activity againstOstrinia furnacalis.Journal of Invertebrate Pathology,2013,114:31-33.]。现有的研究表明，Cry2Ah蛋白对黏虫有体重抑制，但没有致死作用并没有杀灭活性(刘臣陈琳等，四种Bt蛋白对六种重要鳞翅目害虫的杀虫活性评价，中国生物防治学报，2017，33(6)774-779)。将Cry2Ah的第354位缬氨酸后面插入一个脯氨酸而从中得到Cry2Ah-vp突变体，其在突变位置上与Cry2Ab具有相同的碳骨架。将两个基因分别转入烟草植株后，进行了棉铃虫和cry1Ac抗性棉铃虫杀虫活性的试验，结果表明Cry2Ah-vp与Cry2Ah相比具有更高的杀虫活性[Li S Y,Wang Z Y,Zhou Y Y,Li C H,Wang G P,Wang H,Zhang J,Liang G M,Lang ZH.Expression of cry2Ah1 and two domain II mutants in transgenic tobaccoconfers high resistance to susceptible and Cry1Ac-resistant cottonbollworm.Scientific Reports,2018,8(1):508.]。

由于外源基因整合到玉米基因组上的位置会影响外源基因的表达，若想获得表达量高、抗虫效果好的转基因植株，需要从大量转化事件中筛选，并经过多代的遗传稳定性检测，才可以获得有产业化前景的抗虫玉米，同时，转基因玉米事件插入玉米基因组的边界序列可作为该转基因材料的身份标签，在染色体的一个插入位点可作为一个独立的转化事件，可以利用特异性引物检测出来。本发明获得的转cry2Ah-vp基因玉米2HVB4是一个新型的转化事件，其插入玉米基因组中的位置与其他转基因事件不同，其边界序列可作为身份标签做特异性鉴定。

发明内容

本发明构建了含有Bt cry2Ah-vp基因(见专利申请“人工合成的对鳞翅目害虫高毒力杀虫基因及应用”(申请号2017101451666))的植物表达载体pC2HBvp，得到了含Btcry2Ah-vp基因的转玉米植株，筛选到一个抗黏虫效果显著的转基因事件2HVB4；通过染色体步移的方法获得了其5’端边界序列和3’端边界序列，两端的边界序列可以作为本转化事件的特异检测序列，通过两个边界序列设计引物，可以对转基因事件2HVB4特异性检测，并应用于检测试剂盒的开发。

转基因抗虫玉米2HVB4外源插入片段的3’端旁侧序列,如SEQ ID NO.1中第947-1849位所示。

转基因抗虫玉米2HVB4外源插入片段的5’端旁侧序列,如SEQ ID NO.2中第1-436位所示。

根据3’端旁侧序列设计的PCR反应检测用特异性引物。

所述3’端旁侧序列的特异性引物为：

35S-F1：5'-GCACAATCCCACTATCCTTC-3'

Left-R1：5'-ACGCACAGACAGTTACCTCA-3'

所述PCR反应得到的片段大小为1849bp。

根据5’端旁侧序列设计的PCR反应检测用特异性引物。

所述5’端旁侧序列的特异性引物为：

LacZ-F1：5'-CAGCACATCCCCCTTTCG-3'

GR：5'-CTTCCCCTGCTCCTTTGA-3'

所述PCR反应得到的片段大小为577bp。

转基因抗虫玉米2HVB4的PCR反应检测方法，其特征在于：其PCR反应中的引物为上述的特异性引物。

一种检测抗虫玉米的试剂盒，其特征在于含有3’端旁侧序列的特异性引物或/和5’端旁侧序列的特异性引物。

所述3’端旁侧序列的特异性引物为：

35S-F1：5'-GCACAATCCCACTATCCTTC-3'

Left-R1：5'-ACGCACAGACAGTTACCTCA-3'

所述5’端旁侧序列的特异性引物为：

LacZ-F1：5'-CAGCACATCCCCCTTTCG-3'

GR：5'-CTTCCCCTGCTCCTTTGA-3'

上述旁侧序列、旁侧序列的特异性引物、检测抗虫玉米试剂盒在检测转基因玉米中的应用。

本发明将载体pC2HBvp(结构见图1)通过冻融法转化到农杆菌EHA105中，PCR进行鉴定。以新鲜剥离的1.2mm左右的玉米幼胚为材料，将幼胚放到侵染培养基中一个小时后，用侵染培养基洗一次，再浸入到添加100μM乙酰丁香酮的农杆菌菌液中，并放置5分种。取出用灭菌滤纸吸干，放到共培养基上，在26℃黑暗条件下共培养3天，并设对照。再将幼胚转移至恢复培养基上培养10天至诱导出愈伤组织，然后将愈伤组织先去芽后再转移到含有相应筛选剂的筛选培养基上，每两周继代一次，经过6周的筛选将抗性愈伤组织转移到再生培养基上见光分化，见光约一周后，开始出现绿色的芽点，将愈伤块进行切分使绿色的芽点分开并转移到再生培养基上培养，利于主茎的生长，待主茎伸长至3～4cm时，将其转移至再生培养基上诱导生根，待玉米植株长得粗壮且根系发达后，将其转移至温室小花盆中生长。继续培养两周后，待转化苗生长状态良好后转移至温室大地，待雌穗吐丝后，用纸袋套住，等雄穗散粉后进行授粉，并收获果实。

种植转基因玉米于大田，在玉米长至六叶期时人工接黏虫初孵幼虫，转基因玉米2HVB4(保藏编号CGMCC No.17659)没有受到黏虫危害，抗黏虫效果显著，通过染色体步移的方法获得了其5’端边界序列和3’端边界序列，两端的边界序列可以作为本转化事件的特异检测序列，通过两个边界序列设计引物，可以对转基因事件2HVB4特异性检测，并应用于检测试剂盒的开发。

转基因玉米2HVB4，分类命名为玉米，Zea mays

保藏号为CGMCC No.17659

保藏日期：2019年11月25日

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101

附图说明

图1用于玉米转化的植物表达载体pC2HBvp示意图；

图2玉米转化植株的PCR检测结果，其中M为DM5000 DNA Marker；CK+是阳性对照，以质粒pC2HBvp为模板扩增产物；CK-为非转基因植株；0是空白对照，以水为模板扩增产物；1-5是以转基因玉米2HVB4基因组DNA为模板扩增的产物；

图3转基因玉米2HVB4田间抗虫性鉴定，左：2HVB4转基因植株；右：非转基因植株

图4插入片段酶切位点示意图；

图5转基因玉米2HVB4的southern blot杂交结果，其中CK+为cry2Ah-vp表达盒，2HVB4事件分别以Hind III、BamH I、EcoR I和Sac I酶切，CK-为非转基因玉米以HindⅢ酶切，Blank为空白对照；

图6转基因玉米2HVB4外源插入片段示意图；

图7染色体步移方法检测左边界(3’端)侧翼序列，M为DM5000 DNA Marker，1为第1轮PCR结果，2为第2轮PCR结果，3为第3轮PCR结果；

图8插入片段5’端边界序列检测PCR图，M为DM5000 DNA Marker，1为PCR扩增产物；

图9插入片段3’端边界序列检测PCR图，M为DM5000 DNA Marker，1为PCR扩增产物；

图10插入片段在玉米基因组中的位置

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。

本发明转基因玉米2HVB4由农杆菌转化玉米幼胚获得过程思路：

1).按照玉米基因密码子偏好性对Bt cry2Ah-vp基因进行密码子优化，基因序列见专利申请“人工合成的对鳞翅目害虫高毒力杀虫基因及应用”(申请号2017101451666)，构建得到的植物表达载体为pC2HBvp，其结构如图1所示，序列为在公开载体pCAMBIA3300(国际农业分子生物学应用中心CAMBIA可以提供)中插入cry2Ah-vp表达盒序列，插入序列如SEQ ID NO.3所示；

2).冻融法将表达载体转化到农杆菌EHA105；

3).以玉米幼胚为受体组织，置于含植物表达载体pC2HBvp的农杆菌EHA105的侵染培养基中侵染；

4).在26℃黑暗条件下于共培养基上培养，再转至恢复培养基上诱导培养出愈伤组织；

5).再将愈伤组织去芽后转移到含有相应筛选剂的筛选培养基上培养；

6).而后转移到再生培养基上见光分化，出现绿色芽点，将愈伤块切分使绿色芽点分开并转移到再生培养基上培养，待主茎伸长至至3～4cm时，将其转移至再生培养基上诱导生根；

7).待玉米植株长得粗壮且根系发达后，种植到花盆或温室大棚或田间。

所述培养基为侵染培养液：N6盐和N6维生素(Chu等，Science Sinica，1975，18:659-668)，1.5mg/L 2,4-D，0.7/L g脯氨酸，68.4g/L蔗糖，36g/L葡萄糖(pH 5.2)，过滤灭菌，于4℃储存；使用前加入已过滤灭菌的乙酰丁香酮(AS)，终浓度为100μM；

共培养培养基：N6盐和N6维生素，1.5mg/L 2,4-D，0.7g/L脯氨酸，30g/L蔗糖，3g/L植物凝胶(pH 5.8)，高压灭菌后加入经过滤灭菌的终浓度为0.85mg/L的硝酸银，100μM的AS，300mg/L的半胱氨酸；

恢复培养基：N6盐和N6维生素，1.5mg/L 2,4-D，0.7g/L脯氨酸，30g/L蔗糖，0.5g/LMES，4g/L植物凝胶(pH 5.8)，高压灭菌后加入经过滤灭菌的终浓度为0.85mg/L的硝酸银和200mg/L的羧苄青霉素；

筛选培养基：恢复培养基加入筛选剂1mM草胺膦；

再生培养基：MS盐和MS维生素，30g/L蔗糖，100mg/L肌醇，3g/L植物凝胶(pH 5.8)，高压灭菌。

所述玉米幼胚为新鲜剥离的1.2mm长的幼胚。

所述农杆菌菌液中添加有100μM乙酰丁香酮。

实施例1、转基因玉米事件2HVB4的获得

1、用于玉米转化的植物表达载体的构建

本研究的植物表达载体为pC2HBvp(保存于中国农业科学院生物技术研究所)，图谱见图1。植物表达载体的骨架为pCAMBIA3300，在载体的多克隆位点插入来自玉米泛素蛋白的ubiquitin启动子、改造的Bt cry2Ah-vp基因(专利号：ZL 2004 1 0009918.9)和NOS终止子，筛选标记基因是pCAMBIA3300载体自带的bar基因，该基因编码草铵膦乙酰转移酶(phosphinothricin acetyltransferase,PAT)，基因大小552bp，编码183个氨基酸，PAT能使草铵膦的自由氨基乙酰化，从而使草铵膦对植物无毒性作用。pC2HBvp载体中cry2Ah-vp表达盒序列如SEQ ID NO.3所示。

2、农杆菌转化玉米幼胚获得转化植株

将载体pC2HBvp通过冻融法转化到农杆菌EHA105中，PCR进行鉴定。以新鲜剥离的1.2mm左右的玉米幼胚为材料，将幼胚放到侵染培养基中一个小时后，用侵染培养基洗一次，再浸入到添加100μM乙酰丁香酮的农杆菌菌液中，并放置5分种。取出用灭菌滤纸吸干，放到共培养基上，在26℃黑暗条件下共培养3天，并设对照。再将幼胚转移至恢复培养基上培养10天至诱导出愈伤组织，然后将愈伤组织先去芽后再转移到含有相应筛选剂的筛选培养基上，每两周继代一次，经过6周的筛选将抗性愈伤组织转移到再生培养基上见光分化，见光约一周后，开始出现绿色的芽点，将愈伤块进行切分使绿色的芽点分开并转移到再生培养基上培养，利于主茎的生长，待主茎伸长至3～4cm时，将其转移至再生培养基上诱导生根，待玉米植株长得粗壮且根系发达后，将其转移至温室小花盆中生长。继续培养两周后，待转化苗生长状态良好后转移至温室大地，待雌穗吐丝后，用纸袋套住，等雄穗散粉后进行授粉，并收获果实。

3、转化植株的PCR检测

3.1玉米基因组DNA的小量提取(试剂盒购自北京普博欣生物公司)：

(1)取植物新鲜组织约100mg或干重组织约30mg，加入液氮充分碾磨。

(2)将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700μL 65℃预热缓冲液GP1的离心管中(实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1％)，迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。

(3)加入700μL氯仿，充分混匀，12,000rpm离心5min。

(4)小心地将上一步所得上层水相转入一个新的离心管中，加入700μL缓冲液GP2，充分混匀。

(5)将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12,000rpm离心30s，弃掉废液。

(6)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

(7)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

(8)重复操作步骤7.

(9)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液，加入40μL ddH₂O洗脱DNA。

3.2扩增cry2Ah-vp基因片段用引物：

2Ah-F1：5'-CCTCATCTTCCCGTC-3'

2Ah-R1：5'-GTGTTGCTCTGCTCG-3'

目的片段大小：1353bp

3.3 PCR反应体系如下：

扩增条件如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1.5min，扩增循环数为30；最后72℃延伸5min。

PCR检测阳性植株为转基因植株，检测结果见图2。

4、转基因植株的southern blot检测

4.1玉米基因组DNA的大量提取：

CTAB法略改进：

(1)称取5g叶片，液氮充分研磨成粉(勿使材料融化)后加入50mL的离心管中；

(2)加入15mL 2×CTAB缓冲液(Tris 100mM，NaCl 1.4M，20mM EDTA，2％CTAB，0.1％巯基乙醇)充分混匀，65℃进行水浴1小时；

(3)冷却至室温后，加入15mL的氯仿/异戊醇(24：1)，上下颠倒混匀至乳浊液，室温下放置15～60分钟；

(4)室温下12,000rpm离心15min；

(5)将上清液转入到干净离心管后，加入2/3体积的异丙醇，上下颠倒数次，挑出DNA，放入干净的1.5mL离心管；

(6)将DNA用70％乙醇清洗2次，空气干燥1小时；

(7)500μL TE溶解DNA后，再加入5μL RNase A(10mg/mL)，在4℃过夜溶解或37℃1小时溶解；

(8)加入500μL苯酚，颠倒充分混匀，12,000rpm离心5min，将上清液转移至另一离心管；

(9)分别加入250μL苯酚和氯仿，颠倒充分混匀，12,000rpm离心5min，将上清液转移至另一离心管；

(10)加入500μL氯仿，颠倒充分混匀，12,000rpm离心5min，将上清液转移至10mL离心管中；

(11)加TE至3mL，然后加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积3M NaAc，上下颠倒数次；

(12)将沉淀出的DNA用70％乙醇清洗2次；转移DNA至1.5mL离心管，空气干燥并溶于500μL TE，DNA定量，备用。

4.2基因组DNA小量酶切的预实验：

混匀后，于37℃酶切2～3hr；酶切反应物在0.7％琼脂糖上电泳分离，检查酶切效果。

4.3基因组DNA的大量酶切：

基因组DNA 100μg

酶(10U/μL) 5μL

(本实验选用Hind III、BamH I、EcoR I和Sac I酶切)

10×Buffer 40μL

Total 400μL

混匀后于37℃酶切10hr；取2μL酶切产物进行电泳分离，检查酶切效果；酶切完全后，对酶切产物进行沉淀，加入1/10体积的3M NaAc，2倍体积的无水乙醇(-20℃预冷)，混匀后，于-20℃放置2hr；于12,000rpm，4℃离心20min，弃上清，往沉淀中加入1ml 70％乙醇，12,000rpm离心2min弃上清,沉淀吹干后溶于30μL ddH₂O中备用。

4.4探针的制备

按照PCR DIG Probe Synthesis Kit说明书制备探针。

引物：

Cry2Ah-probe-F1:5'-GAGTGGATGGAGTGGAAG-3'

Cry2Ah-probe-R1:5'-CGATGTTTGGGAAGGTCT-3'

目的片段大小：862bp

PCR反应体系如下：

PCR反应条件如下：

PCR结束后电泳检测DIG标记的探针并测定浓度。

4.5Southern blot杂交

(1)制备0.7％的琼脂糖凝胶，在30μL基因组DNA酶切产物中加入6μL 6×loadingbuffer进行电泳分离，上样后静置10min，开始时采用低电压，待溴酚蓝跑出加样孔2～3cm后，加大电压至50V，电泳5～6小时；

(2)电泳结束后，依次对凝胶进行如下处理：0.125M盐酸中浸泡胶10min，凝胶中溴酚蓝变为黄色；蒸馏水处理凝胶5min；中和液中浸泡胶30min；

(3)采用毛细管转移方法将DNA转移至尼龙膜(具体操作见《分子克隆》实验手册)；

(4)转膜结束后6×SSC浸泡尼龙膜5min，将尼龙膜置超净台内吹干或室温晾干；

(5)80℃，烘膜2hr，固定DNA样品；

(6)DIG标记探针的制备：按照PCR DIG Probe Synthesis Kit试剂盒(购自Roche公司)中探针制备的方法进行，以质粒pC2HBvp为模板，Cry2Ah-PF1、Cry2Ah-PR1为引物，探针大小为862bp，测定探针的浓度；

(7)预杂交：用镊子小心将尼龙膜装入杂交管中，小心操作不要产生气泡，然后加入42℃预热的DIG Easy Hyb杂交液(地高辛标记和检测试剂盒Ⅱ购自Roche公司)10mL，42℃预杂交3hr；

(8)杂交：首先进行探针的处理，将标记的探针于99℃变性6min，立即放于冰中冷却2min。取7mL DIG Easy Hyb杂交液，加入处理过的探针(25ng/ml Hyb杂交液)，轻轻混匀小心不要产生气泡，放入杂交炉中，42℃杂交16～20hr；

(9)洗膜：先用50mL的2×SSC，0.1％SDS溶液室温下洗涤两次，每次15min。然后用0.5×SSC，0.1％SDS溶液50mL65℃洗涤两次，每次30min。用镊子将膜小心取出转入装有50mL Washing buffer的平皿中振荡洗涤1～5min；

(10)用100ml 1×Blocking solution室温孵育60min；

(11)用20ml Antibody solution孵育30min；

(12)用50ml Washing buffer洗涤2次，每次30min；

(13)在20ml Detection buffer中平衡2～5min；

(14)用镊子将膜平放于两层保鲜膜之间，先将上层保鲜膜提起，然后加入1mlCSPD底物，从一端缓慢放下上层保鲜膜，使底物均匀地覆盖在膜的表面，于室温静置5min；

(15)用玻璃棒赶出多余液体，用滤纸吸干膜外的底物，37℃孵育10min；

(16)将封好的尼龙膜至于相夹中，在暗室中用X光片压片并进行曝光、显影、定影。

5、转基因植株的抗虫性鉴定

(1)玉米植株生长至6～8片叶时，将黏虫初孵幼虫接在玉米心叶中，每株接40头左右的黏虫初孵幼虫，隔一天以后重复接虫1次，接虫2周后调查食叶级别。

(2)抗虫性标准采用以下9级分级标准：

玉米叶片受黏虫为害程度的分级标准

食叶级别	症状描述
		1	叶片无被害，或仅叶片上有针刺状(≤1mm)虫孔
2	仅个别叶片上有少量弹孔大小(≤5mm)虫孔
		3	少数叶片上有弹孔大小(≤5mm)虫孔
4	个别叶片上缺刻(≤10mm)
		5	少数叶片上有缺刻(≤10mm)
6	部分叶片上有缺刻(≤10mm)
		7	个别叶片部分被取吃，少数叶片上有大片缺刻(≤10mm)
8	少数叶片被取吃，部分叶片上有大片缺刻(≤10mm)
		9	大部叶片被取吃

玉米对黏虫的抗性评价标准

心叶期食叶级别平均值	抗性类型
		1.0～2.0	高抗HR
2.1～4.0	抗R
		4.1～6.0	中抗MR
6.1～8.0	感S
		8.1～9.0	高感HS

(3)选择非转基因玉米作为阴性对照，接虫方法与转基因材料完全相同。2周后，统计玉米植株受黏虫危害情况：在检测的93株转基因植株中，有1-4.0级的转基因植株26株，4.1-6.0级的有19株，7-9级的植株有48株，其中有一株只有针尖大小的虫孔，并且在茎秆和花穗均没有黏虫危害，该植株为2HVB4(图3)。

实施例2、转基因玉米事件2HVB4的外源基因插入位点分析

根据转基因玉米事件2HVB4的Southern blot结果进行分析：如图4所示的载体酶切位点，在插入表达盒中有1个Hind III酶切位点，1个BamHⅠ酶切位点，2个EcoR I酶切位点(ubiquitin启动子中的EcoR I酶切位点一般不会切开)和1个Sac I酶切位点，这些酶切位点均位于cry2Ah-vp基因的两端，不会影响对cry2Ah-vp基因拷贝数的鉴定。以大小为862bp的地高辛标记的cry2Ah-vp基因片段作为探针进行杂交，结果显示Hind III、BamHⅠ、EcoR I和Sac I的酶切产物都杂交出1个条带(图5)，证明cry2Ah-vp基因是1个拷贝插入玉米的基因组中。

实施例3、通过染色体步移获得转基因事件2HVB4的5’端和3’端旁侧序列

插入到玉米基因组的外源片段如图6所示，因为ubiquitin启动子是来自玉米泛素蛋白基因，玉米基因组中含有该基因，所以用染色体步移方法不易获得右边界侧翼序列，因此从bar基因开始设计引物，从bar基因的5’端往3’端扩增左边界(3’端)的侧翼序列。

1、通过染色体步移获得转基因事件2HVB4的左边界(3’端)侧翼序列

扩增左边界(3’端)侧翼序列的特异性引物设计如下：

Bar-SP1：5’-GCACCATCGTCAACCACTACATCG-3’(位于bar基因上)

Bar-SP2：5’-CCCCTGGAAGGCACGCAACG-3’(位于bar基因上)

Bar-SP3：5’-GTCCTGCCCGTCACCGAGAT-3’(位于bar基因上)

染色体步移试剂盒(Genome Walking Kit)购自TaKaRa公司，试剂盒里有4种简并引物，用Bar-SP1、Bar-SP2分别和4种简并引物(AP1、AP2、AP3、AP4)进行2轮扩增，根据扩增效果，最后选择了AP4引物，用AP4引物与Bar-SP3进行了第三轮的扩增，得到的条带送去测序。

(1)第1轮PCR反应

以Bar-SP1为上游引物，4种简并引物分别为下游引物，以AP4为例，进行第1轮PCR反应。

反应体系：

反应条件：

(2)第2轮PCR反应

取第1轮PCR反应产物5μL电泳(图7)，根据第一轮电泳条带亮度选择稀释倍数。取1μL第1轮PCR反应稀释产物作为模板进行第2轮PCR反应，以Bar-SP2为上游引物，4种简并引物分别为下游引物，以AP4为例，进行第2轮PCR反应。

反应体系：

反应条件：

(3)第3轮PCR反应

取第2轮PCR反应产物5μL电泳(图7)，根据第2轮电泳条带亮度选择稀释倍数。取1μL第2轮PCR反应稀释产物作为模板进行第3轮PCR反应，以Bar-SP3为上游引物，AP4为下游引物，进行第3轮PCR反应。

反应体系：

反应条件：

(4)取第3轮PCR反应产物5μL，1％的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳图见图7，切胶回收清晰的电泳条带，以Bar-SP3为引物对第3轮PCR产物进行DNA测序。

测序结果见SEQ ID NO.1。经过序列比对SEQ ID NO.1的1-946bp为载体序列，载体序列左边界3’端缺失7bp。SEQ ID NO.1的947-1849bp为玉米基因组序列，玉米基因组序列为第2号染色体chr2:15127965-15128867(Zea mays(B73_RefGen_v4))。

2、插入片段的右边界(5’端)侧翼序列的获得

根据已经获得的左边界(3’端)侧翼序列，检索已知的玉米基因组序列，在载体的LacZ序列(由于ubiquitin启动子序列在玉米基因组中也存在着相同序列，利用染色体步移的方法很难获得边界序列)和推测的右边界(5’端)侧翼序列设计特异性引物进行PCR扩增。

特异性引物：

LacZ-F1：5’-CAGCACATCCCCCTTTCG-3’(在LacZ序列上)

GR：5’-CTTCCCCTGCTCCTTTGA-3’(在玉米基因组上)

反应体系：

反应条件：

取2μLPCR产物电泳检测，结果见图8。剩余PCR产物进行DNA测序。

测序结果见SEQ ID NO.2。经过序列比对SEQ ID NO.2的1-436bp为玉米基因组序列，玉米基因组序列为第2号染色体chr2:15127459-15127894(Zea mays(B73_RefGen_v4))。SEQ ID NO.2的437-577bp为载体序列，载体序列右边界内(包含右边界)5’端缺失58bp。由于外源片段的插入，玉米基因组中有70bp缺失，对应chr2:15127895-15127964(Zeamays(B73_RefGen_v4))。

插入片段在玉米中的位置见图10所示。转基因玉米2HVB4外源插入基因序列及玉米基因组的5’侧翼序列和3’侧翼序列如SEQ ID NO.4。

实施例4、转基因玉米事件2HVB4旁侧序列的应用

为了检测转基因玉米事件，设计特异性引物检测转基因玉米2HVB4事件，按照3’端侧翼序列和插入片段序列设计引物如下：

35S-F1：5′-GCACAATCCCACTATCCTTC-3′(35S启动子中)

Left-R1：5′-ACGCACAGACAGTTACCTCA-3′(插入片段3’端序列)

片段大小1849bp

反应体系：

反应条件：

PCR产物在1％的琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果见图9，可扩增出1849bp的条带。

插入片段5’侧翼序列特异性引物

LacZ-F1：5’-CAGCACATCCCCCTTTCG-3’(在LacZ序列上)

GR：5’-CTTCCCCTGCTCCTTTGA-3’(在玉米基因组上)

片段大小577bp

反应体系：

反应条件：

PCR产物在1％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图8。可扩增出577bp的条带。

因为本研究的转基因事件的插入位点是特异性的，可以利用5’侧翼序列与载体序列和3’侧翼序列与载体序列设计特异性引物检测该转化事件，并利用特异性引物开发检测试剂盒。

序列表

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 转基因抗虫玉米2HVB4外源插入片段的旁侧序列及其检测方法

<141> 2019-12-09

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1849

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcacaatccc actatccttc gcaagacctt cctctatata aggaagttca tttcatttgg 60

agaggacacg ctgaaatcac cagtctctct ctacaaatct atctctctcg agtctaccat 120

gagcccagaa cgacgcccgg ccgacatccg ccgtgccacc gaggcggaca tgccggcggt 180

ctgcaccatc gtcaaccact acatcgagac aagcacggtc aacttccgta ccgagccgca 240

ggaaccgcag gagtggacgg acgacctcgt ccgtctgcgg gagcgctatc cctggctcgt 300

cgccgaggtg gacggcgagg tcgccggcat cgcctacgcg ggcccctgga aggcacgcaa 360

cgcctacgac tggacggccg agtcgaccgt gtacgtctcc ccccgccacc agcggacggg 420

actgggctcc acgctctaca cccacctgct gaagtccctg gaggcacagg gcttcaagag 480

cgtggtcgct gtcatcgggc tgcccaacga cccgagcgtg cgcatgcacg aggcgctcgg 540

atatgccccc cgcggcatgc tgcgggcggc cggcttcaag cacgggaact ggcatgacgt 600

gggtttctgg cagctggact tcagcctgcc ggtaccgccc cgtccggtcc tgcccgtcac 660

cgagatttga ctcgagtttc tccataataa tgtgtgagta gttcccagat aagggaatta 720

gggttcctat agggtttcgc tcatgtgttg agcatataag aaacccttag tatgtatttg 780

tatttgtaaa atacttctat caataaaatt tctaattcct aaaaccaaaa tccagtacta 840

aaatccagat cccccgaatt aattcggcgt taattcagta cattaaaaac gtccgcaatg 900

tgttattaag ttgtctaagc gtcaatttgt ttacaccaca atatatgaga tgtgtgtgtt 960

ttgtgtttgc aaaacacaca gattttcctt taaaagaaat ctgcgtgttt tttcagctaa 1020

aaacacacgt gtgttttttg ggcaaaaatt gcccatgtgc tatatagaca gccccttctt 1080

aaattattta aggtgcttcc tttgtaaaaa aaaacccgaa gaaaccttag cagcattcgg 1140

tcgtatagct gccatttcac tgtttcacaa aacaacattc ataatttaca tatataatta 1200

tatatagctc atacaaggtg gtcttctact acaactatta cattacttgc tacagcacat 1260

gacaaccatt gacctctgaa cctgcacagc taggggaaaa ttacaacact cgagatgaaa 1320

atggaaacac tagtcccgaa ctatacaatg gcagacagga acccacagtc gcctccattt 1380

gtggaaggct gcttcagttc caatccgcct ctcataagta gcagcagaga accagaatgg 1440

tcttcctgca aaacatcagt actgcactgc tgtactgtac tagtcatatg tgttcgagta 1500

gcagcaaaaa ttatccacag agtagaggtg ggtggcaagg gcccagaatt ctacaggcac 1560

agccttgtca gctctctatc tgcctcctcg ccaggtgcca ccggctgcag caccttgctc 1620

cgagctgtgc acttcttgta cggtacaaaa cctcgacggc aggctggaat tgcgcccgcg 1680

catttccttg aacctggaac gggtacagcc actttgtctt cacctctgtt tactttcgta 1740

gattctgcag gatctgaatt ctgagctgtt ccaggcacgc tgctggaggt ttcgatcgac 1800

tccgtccatg gccggctccg ctgcttgttt gaggtaactg tctgtgcgt 1849

<210> 2

<211> 577

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cttcccctgc tcctttgatt ttggttcgca tcatttgtaa tgtctatcgt gatttttgac 60

tttatgaagt tgttttagtt tttttcaatg ttatatattt ttttattttt gtctttgcta 120

ggtggagaaa agcctaggga tcatgaagct gaaaaagttg aagtaccaag tatccacttc 180

ccttgcaatg tacgttattt tcatgtgatg tatgatctgt tttgtgagtt tttgcttcat 240

catttttttc tagatttgtg tctaagtagc aaatttttca aaagtgtttg gcctcatgca 300

ggcaactact gttatctgag cacataacag tgttttttgt gttagaggtc atttatgttg 360

ttctacatct atttttcaca agacaacatg ttaaatatta acacaacaac ttgtattgtt 420

tttttgtata ttagtttaaa ctgaaggcgg gaaacgacaa tctgatccaa gctcaagctg 480

ctctagcatt cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct 540

tcgctattac gccagctggc gaaaggggga tgtgctg 577

<210> 3

<211> 4480

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcatgcctgc agtgcagcgt gacccggtcg tgcccctctc tagagataat gagcattgca 60

tgtctaagtt ataaaaaatt accacatatt ttttttgtca cacttgtttg aagtgcagtt 120

tatctatctt tatacatata tttaaacttt actctacgaa taatataatc tatagtacta 180

caataatatc agtgttttag agaatcatat aaatgaacag ttagacatgg tctaaaggac 240

aattgagtat tttgacaaca ggactctaca gttttatctt tttagtgtgc atgtgttctc 300

cttttttttt gcaaatagct tcacctatat aatacttcat ccattttatt agtacatcca 360

tttagggttt agggttaatg gtttttatag actaattttt ttagtacatc tattttattc 420

tattttagcc tctaaattaa gaaaactaaa actctatttt agttttttta tttaataatt 480

tagatataaa atagaataaa ataaagtgac taaaaattaa acaaataccc tttaagaaat 540

taaaaaaact aaggaaacat ttttcttgtt tcgagtagat aatgccagcc tgttaaacgc 600

cgtcgacgag tctaacggac accaaccagc gaaccagcag cgtcgcgtcg ggccaagcga 660

agcagacggc acggcatctc tgtcgctgcc tctggacccc tctcgagagt tccgctccac 720

cgttggactt gctccgctgt cggcatccag aaattgcgtg gcggagcggc agacgtgagc 780

cggcacggca ggcggcctcc tcctcctctc acggcacggc agctacgggg gattcctttc 840

ccaccgctcc ttcgctttcc cttcctcgcc cgccgtaata aatagacacc ccctccacac 900

cctctttccc caacctcgtg ttgttcggag cgcacacaca cacaaccaga tctcccccaa 960

atccacccgt cggcacctcc gcttcaaggt acgccgctcg tcctcccccc ccccccctct 1020

ctaccttctc tagatcggcg ttccggtcca tggttagggc ccggtagttc tacttctgtt 1080

catgtttgtg ttagatccgt gtttgtgtta gatccgtgct gctagcgttc gtacacggat 1140

gcgacctgta cgtcagacac gttctgattg ctaacttgcc agtgtttctc tttggggaat 1200

cctgggatgg ctctagccgt tccgcagacg ggatcgattt catgattttt tttgtttcgt 1260

tgcatagggt ttggtttgcc cttttccttt atttcaatat atgccgtgca cttgtttgtc 1320

gggtcatctt ttcatgcttt tttttgtctt ggttgtgatg atgtggtctg gttgggcggt 1380

cgttctagat cggagtagaa ttctgtttca aactacctgg tggatttatt aattttggat 1440

ctgtatgtgt gtgccataca tattcatagt tacgaattga agatgatgga tggaaatatc 1500

gatctaggat aggtatacat gttgatgcgg gttttactga tgcatataca gagatgcttt 1560

ttgttcgctt ggttgtgatg atgtggtgtg gttgggcggt cgttcattcg ttctagatcg 1620

gagtagaata ctgtttcaaa ctacctggtg tatttattaa ttttggaact gtatgtgtgt 1680

gtcatacatc ttcatagtta cgagtttaag atggatggaa atatcgatct aggataggta 1740

tacatgttga tgtgggtttt actgatgcat atacatgatg gcatatgcag catctattca 1800

tatgctctaa ccttgagtac ctatctatta taataaacaa gtatgtttta taattatttt 1860

gatcttgata tacttggatg atggcatatg cagcagctat atgtggattt ttttagccct 1920

gccttcatac gctatttatt tgcttggtac tgtttctttt gtcgatgctc accctgttgt 1980

ttggtgttac ttctgcaggt cgactctaga ggatccatcc tatttttaca acaattacca 2040

acaacaacaa acaacaaaca acattacaat tactatttac aataaccatg aacaacgtcc 2100

tcaacagcgg cagggctacg aacggcgacg cgtacaacgt ggtcgcccac gaccccttct 2160

ccttccagca caagagcctc gacaccatcc aggaggagtg gatggagtgg aagaaggaca 2220

accacatcct ctacgtggac ccgatcgtgg gcaccgtcgc ctccttcctc ctgaagaagg 2280

tcggcagcct cgtcgagaag cgcatcctct ccgagctgag gaacctcatc ttcccgtccg 2340

gcagcacgaa cctcatgcag gacatcctgc gcgagaccga gaagttcctg aaccagcgcc 2400

tcaacacgga caccctggct agggtcaacg ctgagctgac cggcctccag gctaacgtcg 2460

aggagttcaa ccgccaggtg gacaacttcc tcaacccgaa caggaacgcc gtccccctgt 2520

ccatcacgtc cagcgtgaac accatgcagc agctcttcct gaacaggctc ccccagttcc 2580

agatgcaggg ctaccagctc ctgctcctgc cactgttcgc tcaggctgcg aacctccacc 2640

tgtccttcat ccgcgacgtg atcctgaacg ctgacgagtg gggcatcagc gctgctacgc 2700

tcaggaccta ccagaaccac ctgcgcaact acacgaggga gtactccaac tactgcatca 2760

ccacgtacca gacggcgttc cgcggcctga acaccaggct ccacgacatg ctggagttcc 2820

gcacctacat gttcctcaac gtgttcgagt atgtgtccat ctggagcctg ttcaagtacc 2880

agagcctcct ggtctccagc ggcgccaacc tctacgcttc cggcagcggc ccacagcaga 2940

cgcagtcctt caccagccag gactggccgt tcctgtactc cctcttccag gtgaacagca 3000

actacgtcct caacggcttc tccggcgcta ggctgacgca gaccttccca aacatcgtgg 3060

gcctgccagg caccacgacc acgcacgcgc tcctggctgc tagggtgaac tactccggcg 3120

gcgtctccag cggcgacatc ggcgctgtgc ccttcaacca gaacttctcc tgcagcacgt 3180

tcctcccacc actcctgacc ccattcgtcc gcagctggct ggactccggc agcgacaggg 3240

gcggcatcaa cacggtgacc aactggcaga cggagagctt cgagaccacg ctcggcctgc 3300

gctccggcgc cttcaccgcg aggggcaaca gcaactactt cccggactac ttcatccgca 3360

acatctccgg cgtgcccctc gtggtcagga acgaggacct ccgcaggccg ctgcactaca 3420

accagatcag gaacatcgag tccccaagcg gcaccccagg cggcctcagg gcgtacatgg 3480

tgagcgtcca taacaggaag aacaacatct acgcggtcca cgagaacggc acgatgatcc 3540

acctggcccc ggaggactac acgggcttca ccatctcccc catccacgcg acccaggtga 3600

acaaccagac gcgcaccttc atcagcgaga agttcggcaa ccagggcgac tccctcaggt 3660

tcgagcagag caacaccacg gctaggtaca ccctgagggg caacggcaac tcctacaacc 3720

tctacctgcg cgtctccagc atcggcaaca gcacgatccg cgtgaccatc aacggcaggg 3780

tctacaccgc ctccaacgtg aacaccacga ccaacaacga cggcgtgaac gacaacggcg 3840

cgaggttctc cgacatcaac atcggcaacg tggtcgccag cgacaacacg aacgtccccc 3900

tcgacatcaa cgtgacgctg aacagcggca cccagttcga gctgatgaac atcatgttcg 3960

tgccgaccaa cctgccgccc ctctactgag gtaccgggcc ccccctcgag gctgagtaag 4020

gttaactttg agtattatgg cattggaaaa gccattgttc tgcttgtaat ttactgtgtt 4080

ctttcagttt tgttttcgga catcaagtta acaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaattt 4140

aacaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaattt aacaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaatt 4200

taaagagctc gaatttcccc gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga 4260

atcctgttgc cggtcttgcg atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg 4320

taataattaa catgtaatgc atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc 4380

cgcaattata catttaatac gcgacgcgat agaaaacaaa atatagcgcg caaactagga 4440

taaattatcg cgcgcggtgt catctatgtt actagatcgg 4480

<210> 4

<211> 7904

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cttcccctgc tcctttgatt ttggttcgca tcatttgtaa tgtctatcgt gatttttgac 60

tttatgaagt tgttttagtt tttttcaatg ttatatattt ttttattttt gtctttgcta 120

ggtggagaaa agcctaggga tcatgaagct gaaaaagttg aagtaccaag tatccacttc 180

ccttgcaatg tacgttattt tcatgtgatg tatgatctgt tttgtgagtt tttgcttcat 240

catttttttc tagatttgtg tctaagtagc aaatttttca aaagtgtttg gcctcatgca 300

ggcaactact gttatctgag cacataacag tgttttttgt gttagaggtc atttatgttg 360

ttctacatct atttttcaca agacaacatg ttaaatatta acacaacaac ttgtattgtt 420

tttttgtata ttagtttaaa ctgaaggcgg gaaacgacaa tctgatccaa gctcaagctg 480

ctctagcatt cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct 540

tcgctattac gccagctggc gaaaggggga tgtgctgcaa ggcgattaag ttgggtaacg 600

ccagggtttt cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcca gtgccaagct tgcatgcctg 660

cagtgcagcg tgacccggtc gtgcccctct ctagagataa tgagcattgc atgtctaagt 720

tataaaaaat taccacatat tttttttgtc acacttgttt gaagtgcagt ttatctatct 780

ttatacatat atttaaactt tactctacga ataatataat ctatagtact acaataatat 840

cagtgtttta gagaatcata taaatgaaca gttagacatg gtctaaagga caattgagta 900

ttttgacaac aggactctac agttttatct ttttagtgtg catgtgttct cctttttttt 960

tgcaaatagc ttcacctata taatacttca tccattttat tagtacatcc atttagggtt 1020

tagggttaat ggtttttata gactaatttt tttagtacat ctattttatt ctattttagc 1080

ctctaaatta agaaaactaa aactctattt tagttttttt atttaataat ttagatataa 1140

aatagaataa aataaagtga ctaaaaatta aacaaatacc ctttaagaaa ttaaaaaaac 1200

taaggaaaca tttttcttgt ttcgagtaga taatgccagc ctgttaaacg ccgtcgacga 1260

gtctaacgga caccaaccag cgaaccagca gcgtcgcgtc gggccaagcg aagcagacgg 1320

cacggcatct ctgtcgctgc ctctggaccc ctctcgagag ttccgctcca ccgttggact 1380

tgctccgctg tcggcatcca gaaattgcgt ggcggagcgg cagacgtgag ccggcacggc 1440

aggcggcctc ctcctcctct cacggcacgg cagctacggg ggattccttt cccaccgctc 1500

cttcgctttc ccttcctcgc ccgccgtaat aaatagacac cccctccaca ccctctttcc 1560

ccaacctcgt gttgttcgga gcgcacacac acacaaccag atctccccca aatccacccg 1620

tcggcacctc cgcttcaagg tacgccgctc gtcctccccc cccccccctc tctaccttct 1680

ctagatcggc gttccggtcc atggttaggg cccggtagtt ctacttctgt tcatgtttgt 1740

gttagatccg tgtttgtgtt agatccgtgc tgctagcgtt cgtacacgga tgcgacctgt 1800

acgtcagaca cgttctgatt gctaacttgc cagtgtttct ctttggggaa tcctgggatg 1860

gctctagccg ttccgcagac gggatcgatt tcatgatttt ttttgtttcg ttgcataggg 1920

tttggtttgc ccttttcctt tatttcaata tatgccgtgc acttgtttgt cgggtcatct 1980

tttcatgctt ttttttgtct tggttgtgat gatgtggtct ggttgggcgg tcgttctaga 2040

tcggagtaga attctgtttc aaactacctg gtggatttat taattttgga tctgtatgtg 2100

tgtgccatac atattcatag ttacgaattg aagatgatgg atggaaatat cgatctagga 2160

taggtataca tgttgatgcg ggttttactg atgcatatac agagatgctt tttgttcgct 2220

tggttgtgat gatgtggtgt ggttgggcgg tcgttcattc gttctagatc ggagtagaat 2280

actgtttcaa actacctggt gtatttatta attttggaac tgtatgtgtg tgtcatacat 2340

cttcatagtt acgagtttaa gatggatgga aatatcgatc taggataggt atacatgttg 2400

atgtgggttt tactgatgca tatacatgat ggcatatgca gcatctattc atatgctcta 2460

accttgagta cctatctatt ataataaaca agtatgtttt ataattattt tgatcttgat 2520

atacttggat gatggcatat gcagcagcta tatgtggatt tttttagccc tgccttcata 2580

cgctatttat ttgcttggta ctgtttcttt tgtcgatgct caccctgttg tttggtgtta 2640

cttctgcagg tcgactctag aggatccatc ctatttttac aacaattacc aacaacaaca 2700

aacaacaaac aacattacaa ttactattta caataaccat gaacaacgtc ctcaacagcg 2760

gcagggctac gaacggcgac gcgtacaacg tggtcgccca cgaccccttc tccttccagc 2820

acaagagcct cgacaccatc caggaggagt ggatggagtg gaagaaggac aaccacatcc 2880

tctacgtgga cccgatcgtg ggcaccgtcg cctccttcct cctgaagaag gtcggcagcc 2940

tcgtcgagaa gcgcatcctc tccgagctga ggaacctcat cttcccgtcc ggcagcacga 3000

acctcatgca ggacatcctg cgcgagaccg agaagttcct gaaccagcgc ctcaacacgg 3060

acaccctggc tagggtcaac gctgagctga ccggcctcca ggctaacgtc gaggagttca 3120

accgccaggt ggacaacttc ctcaacccga acaggaacgc cgtccccctg tccatcacgt 3180

ccagcgtgaa caccatgcag cagctcttcc tgaacaggct cccccagttc cagatgcagg 3240

gctaccagct cctgctcctg ccactgttcg ctcaggctgc gaacctccac ctgtccttca 3300

tccgcgacgt gatcctgaac gctgacgagt ggggcatcag cgctgctacg ctcaggacct 3360

accagaacca cctgcgcaac tacacgaggg agtactccaa ctactgcatc accacgtacc 3420

agacggcgtt ccgcggcctg aacaccaggc tccacgacat gctggagttc cgcacctaca 3480

tgttcctcaa cgtgttcgag tatgtgtcca tctggagcct gttcaagtac cagagcctcc 3540

tggtctccag cggcgccaac ctctacgctt ccggcagcgg cccacagcag acgcagtcct 3600

tcaccagcca ggactggccg ttcctgtact ccctcttcca ggtgaacagc aactacgtcc 3660

tcaacggctt ctccggcgct aggctgacgc agaccttccc aaacatcgtg ggcctgccag 3720

gcaccacgac cacgcacgcg ctcctggctg ctagggtgaa ctactccggc ggcgtctcca 3780

gcggcgacat cggcgctgtg cccttcaacc agaacttctc ctgcagcacg ttcctcccac 3840

cactcctgac cccattcgtc cgcagctggc tggactccgg cagcgacagg ggcggcatca 3900

acacggtgac caactggcag acggagagct tcgagaccac gctcggcctg cgctccggcg 3960

ccttcaccgc gaggggcaac agcaactact tcccggacta cttcatccgc aacatctccg 4020

gcgtgcccct cgtggtcagg aacgaggacc tccgcaggcc gctgcactac aaccagatca 4080

ggaacatcga gtccccaagc ggcaccccag gcggcctcag ggcgtacatg gtgagcgtcc 4140

ataacaggaa gaacaacatc tacgcggtcc acgagaacgg cacgatgatc cacctggccc 4200

cggaggacta cacgggcttc accatctccc ccatccacgc gacccaggtg aacaaccaga 4260

cgcgcacctt catcagcgag aagttcggca accagggcga ctccctcagg ttcgagcaga 4320

gcaacaccac ggctaggtac accctgaggg gcaacggcaa ctcctacaac ctctacctgc 4380

gcgtctccag catcggcaac agcacgatcc gcgtgaccat caacggcagg gtctacaccg 4440

cctccaacgt gaacaccacg accaacaacg acggcgtgaa cgacaacggc gcgaggttct 4500

ccgacatcaa catcggcaac gtggtcgcca gcgacaacac gaacgtcccc ctcgacatca 4560

acgtgacgct gaacagcggc acccagttcg agctgatgaa catcatgttc gtgccgacca 4620

acctgccgcc cctctactga ggtaccgggc cccccctcga ggctgagtaa ggttaacttt 4680

gagtattatg gcattggaaa agccattgtt ctgcttgtaa tttactgtgt tctttcagtt 4740

ttgttttcgg acatcaagtt aacaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaatt taacaaaaaa 4800

aaaaaaaaaa aaaaaaaatt taacaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaat ttaaagagct 4860

cgaatttccc cgatcgttca aacatttggc aataaagttt cttaagattg aatcctgttg 4920

ccggtcttgc gatgattatc atataatttc tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta 4980

acatgtaatg catgacgtta tttatgagat gggtttttat gattagagtc ccgcaattat 5040

acatttaata cgcgacgcga tagaaaacaa aatatagcgc gcaaactagg ataaattatc 5100

gcgcgcggtg tcatctatgt tactagatcg ggaattcgta atcatggtca tagctgtttc 5160

ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt 5220

gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc 5280

ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg 5340

ggagaggcgg tttgcgtatt ggctagagca gcttgccaac atggtggagc acgacactct 5400

cgtctactcc aagaatatca aagatacagt ctcagaagac caaagggcta ttgagacttt 5460

tcaacaaagg gtaatatcgg gaaacctcct cggattccat tgcccagcta tctgtcactt 5520

catcaaaagg acagtagaaa aggaaggtgg cacctacaaa tgccatcatt gcgataaagg 5580

aaaggctatc gttcaagatg cctctgccga cagtggtccc aaagatggac ccccacccac 5640

gaggagcatc gtggaaaaag aagacgttcc aaccacgtct tcaaagcaag tggattgatg 5700

tgataacatg gtggagcacg acactctcgt ctactccaag aatatcaaag atacagtctc 5760

agaagaccaa agggctattg agacttttca acaaagggta atatcgggaa acctcctcgg 5820

attccattgc ccagctatct gtcacttcat caaaaggaca gtagaaaagg aaggtggcac 5880

ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggctatcgtt caagatgcct ctgccgacag 5940

tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac 6000

cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga tatctccact gacgtaaggg atgacgcaca 6060

atcccactat ccttcgcaag accttcctct atataaggaa gttcatttca tttggagagg 6120

acacgctgaa atcaccagtc tctctctaca aatctatctc tctcgagtct accatgagcc 6180

cagaacgacg cccggccgac atccgccgtg ccaccgaggc ggacatgccg gcggtctgca 6240

ccatcgtcaa ccactacatc gagacaagca cggtcaactt ccgtaccgag ccgcaggaac 6300

cgcaggagtg gacggacgac ctcgtccgtc tgcgggagcg ctatccctgg ctcgtcgccg 6360

aggtggacgg cgaggtcgcc ggcatcgcct acgcgggccc ctggaaggca cgcaacgcct 6420

acgactggac ggccgagtcg accgtgtacg tctccccccg ccaccagcgg acgggactgg 6480

gctccacgct ctacacccac ctgctgaagt ccctggaggc acagggcttc aagagcgtgg 6540

tcgctgtcat cgggctgccc aacgacccga gcgtgcgcat gcacgaggcg ctcggatatg 6600

ccccccgcgg catgctgcgg gcggccggct tcaagcacgg gaactggcat gacgtgggtt 6660

tctggcagct ggacttcagc ctgccggtac cgccccgtcc ggtcctgccc gtcaccgaga 6720

tttgactcga gtttctccat aataatgtgt gagtagttcc cagataaggg aattagggtt 6780

cctatagggt ttcgctcatg tgttgagcat ataagaaacc cttagtatgt atttgtattt 6840

gtaaaatact tctatcaata aaatttctaa ttcctaaaac caaaatccag tactaaaatc 6900

cagatccccc gaattaattc ggcgttaatt cagtacatta aaaacgtccg caatgtgtta 6960

ttaagttgtc taagcgtcaa tttgtttaca ccacaatata tgagatgtgt gtgttttgtg 7020

tttgcaaaac acacagattt tcctttaaaa gaaatctgcg tgttttttca gctaaaaaca 7080

cacgtgtgtt ttttgggcaa aaattgccca tgtgctatat agacagcccc ttcttaaatt 7140

atttaaggtg cttcctttgt aaaaaaaaac ccgaagaaac cttagcagca ttcggtcgta 7200

tagctgccat ttcactgttt cacaaaacaa cattcataat ttacatatat aattatatat 7260

agctcataca aggtggtctt ctactacaac tattacatta cttgctacag cacatgacaa 7320

ccattgacct ctgaacctgc acagctaggg gaaaattaca acactcgaga tgaaaatgga 7380

aacactagtc ccgaactata caatggcaga caggaaccca cagtcgcctc catttgtgga 7440

aggctgcttc agttccaatc cgcctctcat aagtagcagc agagaaccag aatggtcttc 7500

ctgcaaaaca tcagtactgc actgctgtac tgtactagtc atatgtgttc gagtagcagc 7560

aaaaattatc cacagagtag aggtgggtgg caagggccca gaattctaca ggcacagcct 7620

tgtcagctct ctatctgcct cctcgccagg tgccaccggc tgcagcacct tgctccgagc 7680

tgtgcacttc ttgtacggta caaaacctcg acggcaggct ggaattgcgc ccgcgcattt 7740

ccttgaacct ggaacgggta cagccacttt gtcttcacct ctgtttactt tcgtagattc 7800

tgcaggatct gaattctgag ctgttccagg cacgctgctg gaggtttcga tcgactccgt 7860

ccatggccgg ctccgctgct tgtttgaggt aactgtctgt gcgt 7904

Claims (10)

1.转基因抗虫玉米2HVB4外源插入片段的3’端旁侧序列, 如SEQ ID NO.1中第 947-1849 位所示。

2.转基因抗虫玉米2HVB4外源插入片段的5’端旁侧序列, 如SEQ ID NO.2中第1-436位所示。

3.根据权利要求1所述的3’ 端旁侧序列设计的PCR反应检测用特异性引物。

4.根据权利要求3所述的3’端旁侧序列的特异性引物为：

35S-F1：5'-GCACAATCCCACTATCCTTC-3'，

Left-R1：5'-ACGCACAGACAGTTACCTCA-3'，

所述PCR反应得到的片段大小为1849bp。

5.根据权利要求2所述的5’端旁侧序列设计的PCR反应检测用特异性引物。

6.根据权利要求5所述的5’端旁侧序列的特异性引物为：

LacZ-F1：5'-CAGCACATCCCCCTTTCG-3'，

GR：5'-CTTCCCCTGCTCCTTTGA-3'，

所述PCR 反应得到的片段大小为577bp。

7.转基因抗虫玉米2HVB4的PCR反应检测方法，其特征在于：其PCR反应中的引物为权利要求3-6任一所述的特异性引物。

8.一种检测抗虫玉米的试剂盒，其特征在于含有权利要求3或4所述的3’端旁侧序列的特异性引物，或/和含有权利要求5或6所述的5’端旁侧序列的特异性引物。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，所述3’端旁侧序列的特异性引物为：

35S-F1：5'-GCACAATCCCACTATCCTTC-3'，

Left-R1：5'-ACGCACAGACAGTTACCTCA-3'；

所述5’端旁侧序列的特异性引物为：

LacZ-F1：5'-CAGCACATCCCCCTTTCG-3'，

GR：5'-CTTCCCCTGCTCCTTTGA-3'。

10.权利要求1或2所述的旁侧序列、权利要求3-6任一所述的旁侧序列的特异性引物、权利要求8或9所述的检测抗虫玉米试剂盒在检测转基因玉米中的应用。

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