KR20060023809A - 식물의 색소체 형질전환 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 식물의 색소체 형질전환 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 식물로부터 유도된 캘러스를 색소체 형질전환용 벡터로 형질전환 하는 것을 특징으로 하는 식물의 색소체 형질전환 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 방법은 형질전환체가 성체로 발달하여도 형질전환 된 색소체가 소멸되지 않으며 색소체에 이식된 유전자가 다음 세대로 전달되는 효과가 있다.

색소체, 형질전환, 식물, 캘러스

Description

식물의 색소체 형질전환 방법{Method for plastid transformation in plants}

도 1a는 sgfp 유전자 포함되지 않은 본 발명에 따른 색소체 형질전환용 벡터 pLD-RCtV의 제조과정을 나타낸 모식도이다.

도 1b는 본 발명에 따른 색소체 형질전환용 벡터 pLD-RCtV-sGFP의 모식도이다.

도 1c는 본 발명에 따른 색소체 형질전환용 벡터와 천연의 색소체 게놈간의 상동 재조합 과정을 나타낸 모식도이다.

도 2a는 벼의 캘러스를 스트렙토마이신이 각각 다른 농도로 첨가된 MS(Murachige and Skoog) 배지에 치상하고 광조건 하에서 배양한 것이다.

a: 스트렙토마이신 0mg/L 첨가

b: 스트렙토마이신 100mg/L 첨가

c: 스트렙토마이신 200mg/L 첨가

도 2b는 벼의 캘러스를 스트렙토마이신이 각각 다른 농도로 첨가된 MS 배지에 치상하고 암조건 하에서 배양한 것이다.

a: 스트렙토마이신 0mg/L 첨가

b: 스트렙토마이신 500mg/L 첨가

c: 스트렙토마이신 1000mg/L 첨가

도 3a는 본 발명의 방법에 따라 벼의 캘러스를 색소체 형질전환용 벡터로 형질전환하고 스트렙토마이신이 첨가된 선별배지에서 배양한 경우 스트렙토마이신에 저항성을 나타내는 캘러스에서 신초(shoot)가 유도된 사진이다.

도 3b는 본 발명의 방법에 따라 벼의 캘러스를 색소체 형질전환용 벡터로 형질전환하고 스트렙토마이신이 첨가된 선별배지에서 선별하고 재분화함으로써 수득한 형질전환체를 나타낸 사진이다.

도 4는 본 발명의 방법에 따라 선별된 형질전환체를 토양에 순화시키는 경우 스트렙토마이신의 처리 농도에 따른 영향을 나타낸 것이다.

도 5a는 본 발명의 상동 재조합에 사용된 trnI와 trnA 유전자, 선별 유전자인 aadA 유전자, 목적 유전자로 사용된 sgfp 유전자의 크기를 나타낸 모식도이다.

도 5b는 본 발명의 방법에 따라 형질전환 된 벼에서 sgfp 유전자가 존재하는 지를 확인하기 위하여 형질전환된 벼의 게놈 DNA를 PCR 증폭하여 아가로스 겔에서 확인한 결과이다.

도 6은 본 발명의 방법에 따라 형질전환 된 벼에서 aadA 유전자가 존재하는 지를 확인하기 위하여 형질전환된 벼의 게놈 DNA를 서던 블롯법으로 분석한 결과이다.

도 7a는 본 발명의 방법에 따라 형질전환 된 벼에서 상동 재조합 부위의 왼쪽 경계면 단편이 존재하는지를 확인하기 위하여 벼의 게놈 DNA를 PCR 증폭하여 아가로스 겔에서 확인한 결과이다.

도 7b는 본 발명의 방법에 따라 형질전환 된 벼에서 상동 재조합 부위의 오른쪽 경계면 단편이 존재하는지를 확인하기 위하여 벼의 게놈 DNA를 PCR 증폭하여 아가로스 겔에서 확인한 결과이다.

도 8은 본 발명의 방법에 따라 형질전환 된 벼에서 sGFP가 발현되는지를 웨스턴 블롯 분석법으로 확인한 결과이다.

도 9는 본 발명의 방법에 따라 형질전환된 벼를 자가수정하여 수확한 종자를 배양함으로써 획득한 T1 세대의 벼에서 sGFP가 발현됨을 공초점형광현미경으로 확인한 사진이다(연녹색: sGFP, 붉은색: 엽록체, 노란색: sGFP가 엽록체에서 발현된 부분).

본 발명은 식물의 색소체 형질전환 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 식물로부터 유도된 캘러스를 색소체 형질전환용 벡터로 형질전환 하는 것을 특징으로 하는 식물의 색소체 형질전환 방법에 관한 것이다.

일반적으로 식물의 형질전환에 사용되는 핵 형질전환(nuclear transformation) 기술은 이식 유전자의 낮은 발현수준, 유전자의 삽입 위치에 따른 발현양의 차이(position effect) 및 발현의 불안정성(gene silencing) 등의 문제점 이 있다. 또한, 핵 형질전환 기술에 의해 생산된 유전자 재조합 식물체들은 형질전환에 사용된 외래이입 유전자가 꽃가루를 통하여 다른 유사 야생 식물종으로 전이될 수 있기 때문에 심각한 생태계 문제를 야기할 수 있다. 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 최근에는 색소체 형질전환 기술이 핵 형질전환 기술의 대안으로서 주목받고 있다.

색소체는 광합성을 담당하는 엽록체(chloroplast), 꽃 및 열매의 색에 관여하는 유색체(chromoplast), 전분저장 기능을 수행하는 전분체(amyloplast), 색소를 포함하지 않는 백색체(leucoplast) 및 미분화된 상태로서 상술한 색소체들의 모체가 되는 전색소체(proplastid)로 구분된다. 색소체는 자체 게놈(genome)을 가지고 있으며 모계유전에 의하여 그 유전정보가 후대에 전달된다. 따라서, 색소체 형질전환을 이용하면 식물에 이입된 외래 유전자가 다른 식물종으로 전이되는 것을 방지할 수 있다. 또한, 멘델의 유전분리에 의한 형질전환 계통을 선발하고 유지할 필요성이 없으며 균일한 종자를 대량으로 생산할 수 있는 장점이 있다. 나아가, 식물세포에는 대략적으로 100여개의 색소체가 존재하며 각 색소체는 10-100개의 게놈을 가지고 있기 때문에 각 세포 당 1,000-10,000개의 카피 유전자가 존재한다. 따라서, 각 세포당 1-2개의 게놈을 가지고 있는 핵을 형질전환하는 기술에 비해 색소체를 형질전환하는 경우 이식된 유전자의 발현 수준이 월등히 높고 유전자의 안정적인 발현을 기대할 수 있다. 또한, 색소체는 원핵생물의 유전자 발현 시스템을 가지고 있어 다중 유전자의 발현이 가능한 장점이 있다.

식물의 색소체 형질전환은 담배에서 최초로 보고 된 바 있으며, 애기장대(Sikdar, S. et al., Plant Cell Rep. 18, 20-25, 1998), 감자(Sidorov. V. et al., Plant J. 19, 209-216, 1999), 토마토(Ruf, S. et al., Nat. Biotechnol. 19, 870-875, 2001) 및 레스쿠에렐라(Lesquerella)(Skarjinskaia M. et al., Transgenic Res., 12, 115-122, 2003)를 포함하는 식물종에서의 색소체 형질전환이 보고 된 바 있다.

한편, 지금까지 보고 된 색소체 형질전환에 성공한 식물들은 모두 쌍자엽 식물에 속하는 것이며 현재까지 단자엽 식물의 색소체 형질전환으로는 벼의 세포현탁 을 이용한 사례가 유일하게 보고 되어 있을 뿐이다(Khan M. et al., Nat. Biotechnol, 17, 910-915, 1999). 그러나 벼의 세포현탁을 형질전환 대상으로 설정하여 색소체 형질전환 된 벼는 색소체의 지극히 일부만이 형질전환되어 형질전환체가 성체로 발달하는 과정에서 형질전환 된 색소체가 점차 소멸될 수 있는 가능성이 있었으며, 특히 색소체에 이식된 유전자가 다음세대로 전달되지 못한 단점이 있다.

이에 본 발명자들은 효과적인 식물의 색소체 형질전환 방법을 연구하던 중, 식물로부터 유도된 캘러스를 형질전환 대상으로 선정하여 색소체 형질전환용 벡터로 형질전환한 결과 형질전환체가 성체로 발달하더라도 형질전환된 색소체가 소멸되지 않으며 색소체에 이식된 유전자가 다음 세대로 전달됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 식물로부터 유도된 캘러스를 색소체 형질전환용 벡터로 형질전환하는 것을 특징으로 하는 식물의 색소체 형질전환 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 식물로부터 유도된 캘러스를 색소체 형질전환용 벡터로 형질전환하는 것을 특징으로 하는 식물의 색소체 형질전환 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 식물의 색소체 형질전환 방법은 식물로부터 유도된 캘러스를 색소체 형질전환용 벡터로 형질전환하는 것을 특징으로 한다. 지금까지 성공한 식물의 색소체 형질전환은 식물의 잎 조직이나 세포현탁을 그 대상으로 하였으나, 본 발명은 식물로부터 유도된 캘러스를 형질전환 대상으로 선정하였다는 데에 특징이 있다.

식물의 색소체를 형질전환하는 경우 일차적으로 색소체의 엽육 세포에 존재 하는 약 10,000개의 색소체 DNA 카피 중 소수의 색소체 게놈 카피만이 형질전환이 되게 된다. 따라서, 일차적으로 형질전환 세포에는 야생형과 형질전환 된 색소체가 혼합된 상태로 존재하게 된다. 이러한 세포, 조직 및 식물체를 이형 세포질 상태(heteroplasmy)라 한다. 상기 이형 세포질 상태는 일반적으로 불안정해서 야생형 또는 형질전환형의 둘 중 하나의 상태로 게놈이 전환되게 되는 동형 세포질 상태(homoplasmy)를 요구하게 된다. 따라서, 형질전환된 식물의 유전적 안전성을 높이고 색소체의 모든 세포가 완전히 형질전환 된 동형 세포질 상태를 유도할 필요성이 있다. 상기와 같은 동형 세포질 상태는 높은 선별 압력 하에서 충분한 세포 분열의 수에 의하여 획득될 수 있다.

이에 본 발명자들은 식물로부터 유도된 캘러스를 형질전환을 위한 대상으로 선정하여 색소체 형질전환용 벡터로 형질전환 다음 선별 배지에 치상하여 높은 선별 압력 하에서 재분화시켜 충분한 세포 분열이 일어나도록 하여 동형 세포질 상태를 유도함으로써 캘러스가 성체로 분화되었을 때에도 형질전환 색소체가 소멸되지 않도록 하였다.

구체적으로 본 발명에 따른 식물의 색소체 형질전환 방법은 (a) 식물의 종자, 조직 및 세포 현탁액으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 어는 하나를 캘러스 유도용 배지에서 배양하여 캘러스를 유도하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계의 식물의 캘러스를 색소체 형질전환용 벡터로 형질전환하 는 단계;

(c) 상기 (b) 단계에서 형질전환된 캘러스를 선별 배지에서 배양하여 형질전환된 캘러스를 선별하는 단계; 및

(d) 상기 (c) 단계에서 선별된 캘러스를 발근용 배지에서 배양하여 뿌리를 유도하고 토양에 옮겨 순화시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 (a) 단계에서 식물은 특별히 한정되지 않으며 모든 종류의 식물일 수 있다. 바람직하게는, 단자엽 식물일 수 있다. 상기 단자엽 식물의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 벼, 밀, 보리, 죽순, 옥수수, 토란, 아스파라거스, 양파, 마늘, 파, 부추, 달래, 마 및 생강이 있다. 바람직하게는, 상기 단자엽 식물로는 벼를 사용한다.

상기 (a) 단계에서 캘러스를 유도하는 방법은 당업계에 공지된 통상의 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 바람직하게는, 식물의 종자, 조직 및 세포 현탁액으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 어느 하나를 캘러스 유도용 배지에서 배양한다. 상기 식물의 조직은 잎, 줄기 및 뿌리의 일부분일 수 있다. 바람직하게는, 식물이 단자엽 식물인 경우에는 식물의 종자 또는 세포 현탁액으로부터 캘러스를 유도하며 식물이 쌍자엽인 경우에는 조직의 일부분으로부터 캘러스를 유도할 수 있다. 상기 캘러스 유도용 배지로는 N6 배지, MS(Murashige & Skoog) 배지, WHITE 배지, B5 배지, R2 배지 등을 사용할 수 있다. 이때, 식물의 종(species), 식물의 나이, 배양 종자의 숙도 등을 고려하여 배양하고자 하는 식물에 적합한 배지를 선택하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 배지에 생장조절제를 추가로 첨가할 수 있다. 상기 생장조절제로는 이에 한정되지는 않으나, IAA(3-indoleacetic acid), IAld(3-indoleacet aldehyde), IPA(3-indolepyruvic acid), IAN(3-indoleacetonitrile), IAE(ethyl ester of indoleacetic acid)와 같은 옥신(auxin) 및 2,4-D(2,4-dichlorphenoxy acidic acid), NAA(naphthaleneacetic acid)와 같은 상기 옥신의 유도체; 및 키네틴(kinetin), BA(benzoic acid), CPPU((N-2-chloro-4-pyridyl)-N'-phenylurea)와 같은 사이토키닌(cytokinin) 및 그 유도체를 포함한다. 바람직한 캘러스 유도 방법은 다음과 같다. 식물의 종자를 수득하여 탄수화물이나 아미노산과 같은 유기 성분, 질소, 인산, 칼륨과 같은 무기 양분 및 옥신과 같은 식물 호르몬을 함유한 고체배지에서 배양한 다음 식물 종자로부터 세포분열이 일어나 세포의 덩어리인 캘러스가 생성되면 배지로부터 캘러스를 분리하여 신선한 고체배지 위에 파종한다. 이후, 일정 간격으로 계대배양한다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에서는 화청벼 종자를 N6 배지에 파종한 후 28℃에서 암조건으로 2-3주간 배양하여 벼의 캘러스를 수득하였다(실시예 2 참조).

한편, 본 발명에서는 총 캘러스(total callus) 또는 배발생 캘러스(embryogenic callus)를 사용할 수 있으나 바람직하게는 배발생 캘러스와 함께 재분화 되지 않은 캘러스를 모두 포함하는 총 캘러스를 사용한다. 이는 본 발명의 예비 실험에서 배발생 캘러스를 사용하는 경우에 비해 총 캘러스를 사용한 경우 보 다 높은 재분화 효율을 나타냈기 때문이다(결과 미도시).

상기 (b) 단계에서 색소체 형질전환용 벡터는 구입하여 사용하거나 당 업계에 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다. 바람직하게는, 상기 색소체 형질전환용 벡터는 식물의 색소체에 존재하는 상동 재조합 부위의 왼쪽 경계면 영역, 선별 마커, 목적 유전자 및 상동 재조합 부위의 오른쪽 경계면 영역을 포함하고 있는 것을 특징으로 한다.

일반적으로 색소체의 형질전환은 목적 유전자를 상동 재조합(homologous recombination) 방법에 의해 색소체 게놈의 목적 부위에 삽입함으로써 수행된다. 따라서, 색소체 형질전환용 벡터는 색소체 게놈으로 도입되는 부위와 동일한 색소체 게놈 서열이 목적 유전자의 양쪽 측면에 인접하여 있다. 상기 상동 재조합 부위의 왼쪽 경계면 영역과 오른쪽 경계면 영역은 대상 식물에 따라 달라질 수 있으며, 공지된 식물의 색소체 게놈 서열로부터 제조될 수 있다. 예를 들면, 벼, 담배, 옥수수와 같은 식물의 색소체 게놈의 염기서열은 모두 공지되어 있다. 한편, 상기 식물의 유전자 배열 구조는 식물 간에 매우 유사한 것으로 알려져 있기 때문에 상기 상동 재조합 부위는 다른 식물종간에 교차되어 사용될 수 있다. 바람직하게는 상동 재조합 부위로는 고등 식물체간에 높게 보존되어 있는 서열인 벼의 trnI-trnA 영역 서열을 사용할 수 있다.

상기 선별 마커는 대상 식물의 색소체에 외래의 유전자가 도입되었음을 확인하는 지표가 되는 유전자를 말한다. 상기 선별 마커로는 이에 한정되는 지는 않으 나 항생제 저항성 유전자, 제초제 저항성 유전자, 대사관련 유전자, 발광 유전자, GFP(green fluorescence protein), GUS(β-glucuronidase) 유전자, GAL(β-galactosidase) 유전자 등이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 항생제 저항성 유전자를 사용한다. 상기 항생제 저항성 유전자로는 이에 한정되지는 않으나, 스트렙토마이신과 스펙티노마이신 저항성 유전자인 aadA(Svab Z. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 913-917, 1993), 가나마이신 저항성 유전자인 neo(Kuroda H. et al., Plant Physiol. 125, 430-436, 2001; Kuroda H. et al., Nucleic Acids Res. 29, 970-975, 2001))및 aphA-6(Huang FC et al., Mol. Genet. Genom. 268, 19-27, 2002)이 있다.

상기 목적 유전자로는 특별히 한정되지 않으며 식물의 색소체에 도입하여 식물이 유용한 형질을 수득할 수 있도록 하는 것이라면 모두 사용할 수 있다. 상기 목적 유전자는 공지된 서열로부터 당 분야에 공지된 방법에 의해 재조합함으로써 수득하거나 상기 유전자를 포함하는 플라스미드를 상업적으로 구입함으로써 수득할 수 있다.

상기 식물의 색소체 형질전환용 벡터는 상술한 유전자 외에 유전자의 발현을 조절할 수 있는 조절서열을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 유전자의 전사를 개시하는 프로모터 및 전사를 종결하는 터미네이터 서열을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 상동 재조합 벼의 게놈 DNA로부터 상동 재조합 부위의 왼쪽 경계면 영역으로 벼의 trnI 유전자, 색소체 rRNA 프로모터인 Prrn, 항생제 저항성 유전자인 aadA 유전자, 목적 유전자로 사용한 sgfp 유전자, psbA 터미네이터 및 상동 재조합 부위의 오른쪽 경계면 영역으로 벼의 trnA 유전자가 순차적으로 연결되도록 벼 색소체 형질전환용 벡터를 제조하였다(실시예 1 및 도 1 참조). 상기 목적 유전자로 sgfp(green fluorescent protein)를 사용한 것은 벼의 색소체 형질전환 여부를 시각적으로 확인하기 위한 것이다.

상기 (b) 단계에서 색소체 형질전환용 벡터를 이용한 캘러스의 형질전환은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 입자 충격법(particle bombardment), PEG(polyethylene glycerol) 처리법, 전기천공법 및 미세주사법(microinjection)을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 입자 충격법을 사용할 수 있다.

한편, 본 발명은 상기 (b) 단계에서 캘러스를 형질전환한 다음 형질전환체의 선별단계를 거치기 전에 항생제가 포함되지 않은 배지에서 암조건으로 일정기간 배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 단계는 형질전환 과정시 손상된 세포들이 회복되도록 하는 단계이다. 바람직하게는, 본 발명은 상기 (b) 단계에서 형질전환 된 캘러스를 항생제가 포함되지 않고 생장조절제가 첨가된 MS 또는 N6배지에서 암조건으로 25∼30℃하에서 1∼3일간 배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있 다.

상기 (c) 단계에서 형질전환된 캘러스의 선별은 상기 캘러스를 선별 배지에 배양하여 성장하는 캘러스만을 선택적으로 선별함으로써 수행될 수 있다. 상기 선별 배지는 캘러스의 선별 마커에 따라 다양할 수 있다. 예를 들어, 선별 마커를 항생제 저항성 유전자를 사용한 경우에는 항생제가 포함된 배지를 선별 배지로서 사용할 수 있다. 한편, 상기 캘러스의 선별 단계를 다단계로 수행하여 형질전환체의 동형 세포질(homoplasmy) 형태를 유도할 수 있다. 바람직하게는 형질전환된 캘러스의 선별은 상기 (b) 단계에서 형질전환된 캘러스를 100∼500mg/L의 항생제가 포함된 배지에서 광조건으로 배양하여 항생제 저항성을 나타내는 캘러스를 일차적으로 선별한 다음 이를 다시 300∼500mg/L의 항생제가 포함된 배지에 옮겨서 배양하여 항생제 저항성을 나타내는 캘러스를 이차적으로 선별함으로써 수행될 수 있다.

상기에서 항생제로는 당 업계 공지되어 있는 모든 종류를 사용할 수 있으며 바람직하게는, 스트렙토마이신을 사용한다.

본 발명의 일 실시예에서는 색소체가 형질전환된 벼의 선별에 사용되는 스트렙토마이신의 최적 농도를 결정하기 위하여 발아 후 2-3주된 캘러스를 다양한 농도의 스트렙토마이신이 포함된 배지에 치상하고 광조건 또는 암조건 하에서 재분화시켰다. 실험 결과, 광조건 하에서는 스트렙토마이신의 첨가 농도가 증가할수록 캘 러스의 성장이 저해되었으나 암조건 하에서는 스트렙토마이신의 첨가 농도가 캘러스의 성장에 큰 영향을 주지 않았다. 따라서, 본 발명의 색소체 형질전환에 있어서 본 발명자들은 형질전환체를 광조건 하에서 선별하였으며 스트렙토마이신의 최적 농도는 선별 초기 단계의 경우 100∼500mg/L로 하였으며 그 후의 선별 단계에서는 300-500mg/L로 하였다.

또한, 본 발명의 다른 실시예에서 상기에서 결정한 농도로 항생제가 포함된 선별배지를 이용하여 형질전환된 캘러스를 선별하였다. 즉, 형질전환된 캘러스를 스트렙토마이신 200mg/L가 포함된 배지에서 배양하여 재분화를 유도하고 항생제 저항성을 나타내는 캘러스를 일차적으로 선별하였다. 그 다음 상기 선별된 캘러스를 300mg/L의 스트렙토마이신이 포함된 신선한 선별 배지로 옮기고 한달간 배양하고 스트렙토마이신 저항성을 나타내는 신초를 이차적으로 선별하고 500mg/L 스트렙토마이신이 포함된 배지에서 발근시켰다(실시예 3 참조). 실험 결과, 2개의 독립적인 스트렙토마이신 저항성 계통을 수득하고 각각 sGFP-1 및 sGFP-2로 명명하였다(도 3b 참조).

상기 (d) 단계에서는 상기 (c) 단계에서 선별된 색소체 형질전환 캘러스를 발근용 배지에 배양하여 뿌리를 유도하고 토양에 옮겨 순화시켰다. 상기에서 발근용 배지는 항생제가 300∼1000mg/L로 포함되어 있고 호르몬이 첨가되지 않은 MS 배지를 사용하는 것이 바람직하다. 상기에서 배지에 포함되는 항생제는 선별 마커의 종류에 따라 적합한 항생제를 선택하여 사용할 수 있다. 본 발명에서 예시된 것은 스트렙토마이신이다.

상기에서 뿌리가 유도된 식물체를 토양에 옮겨 순화시킬 때 일주일 간격으로 토양 1L 당 500∼1500mg의 항생제를 상기 식물체가 종자를 맺어 수확할 때 까지 처리함으로써 색소체 내의 모든 세포가 형질전환된 상태로 전환되도록 유도하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 항생제를 토양 1L 당 500∼1000mg의 농도로 처리할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 형질전환된 캘러스를 발근용 배지에서 배양하여 뿌리를 유도한 다음 이를 토양에 치상하여 유식물이 충분한 수로 자랐을 때, 상기 유식물을 각각 별개의 토양에 치상하고 스트렙토마이신을 농도별로 처리한 다음 유식물의 성장 정도를 조사하여 적합한 처리 농도를 결정하였다(실시예 4 참조). 그 결과, 스트렙토마이신을 토양 1L 당 500∼1000mg의 범위로 처리할 수 있음을 확인하였다(도 4 참조).

이에 본 발명자들은 상기 본 발명의 방법에 따라 제조되고 선별된 형질전환체의 색소체가 색소체 형질전환용 벡터에 의해 안정적으로 형질전환 되었는지 여부를 조사하였다. 본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 방법에 따라 선별된 형질전환 벼의 게놈 DNA를 분석하여 형질전환 벼에 목적 유전자인 sgfp 유전자가 존재하는지를 조사하였다(실시예 6 참조). 그 결과, 선별된 모든 형질전환 벼에서 sgfp 유전자가 존재함을 확인할 수 있었으며(도 5a 및 도 5b 참조)

본 발명의 다른 실시예에서는 형질전환 벼에 항생제 저항성 유전자인 aadA 유전자가 존재하는지를 확인하기 위하여 aadA 유전자에 특이적인 프로브를 사용하여 서던 블롯 분석을 수행하였다(실시예 7 참조). 그 결과, 형질전환 벼에 aadA 유전자가 존재함을 확인할 수 있었다(도 6 참조)

또한, 본 발명의 다른 실시예에서는 형질전환 벼의 색소체 게놈 내에 부위 특이적으로 목적 유전자인 sgfp 유전자와 항생제 저항성 유전자인 aadA 유전자가 인테그레이션되었는지를 조사하였다(실시예 8 참조). 실험 결과, aadA 유전자와 sgfp 유전자가 벼의 색소체 게놈 안의 trnI 및 trnA 유전자 사이에 존재함을 확인할 수 있었다(도 7).

또한, 본 발명의 다른 실시예에서는 형질전환 벼에서 sGFP가 발현되는지 여부를 웨스턴 블롯 분석으로 조사하였다(실시예 9 참조). 그 결과, 형질전환 벼에 sGFP가 발현됨을 확인할 수 있었다(도 8 참조).

본 발명자들은 상기와 같은 실험 결과로부터 본 발명의 방법에 따라 형질전환 된 벼의 색소체 게놈 내에 목적으로 하는 유전자가 도입되었음을 확인할 수 있었으며 형질전환체가 성체로 자랐을 때에도 형질전환된 색소체가 소멸되지 않음을 확인할 수 있었다.

나아가, 본 발명자들은 상기 형질전환 벼를 자가수정하여 종자를 수득하고 이를 파종하여 배양함으로써 형질전환된 벼의 색소체에 이식된 유전자가 다음 세대(T1 progeny)까지 전이되는지 여부를 조사하였다(실시예 10 참조). 그 결과, 본 발명의 방법에 따라 벼의 색소체에 이식된 유전자가 다음 세대로 전이됨을 확인할 수 있었다(도 9 참조)

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다.

하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

벼 색소체 형질전환용 벡터의 제조

벼 색소체 형질전환용 벡터를 제조하기 위하여 화청 벼(서울대학교 육종학과 고희종 교수님으로부터 제공받음)의 잎 조직에서 공지된 방법에 따라 총 게놈 DNA를 추출하였다(Doyle J. et al. Phytochem. Bull. 19:11-15, 1987). 상기에서 분리한 게놈 DNA를 주형으로 하여 상동 재조합 사이트(homologus recombination site)로 사용할 trnI 유전자(서열번호 1)와 trnA 유전자(서열번호 2)를 하기의 프라이머 쌍(서열번호 3 및 서열번호 4)을 사용하여 PCR 증폭하였다. PCR 증폭 조건은 94℃에서 30초간 변성, 60℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 2분간 신장하는 단계로 이루어진 과정을 30회 반복하였다.

정방향 프라이머(서열번호 3)

5'- CGAGGCCTCCCAAAGGGAGGCCCGCGCGA-3'

역방향 프라이머(서열번호 4)

5'-GCTGATATCCAACTTTCATCGTACTGTGCTCT-3'

상기 PCR 증폭 산물을 StuI과 EcoRV 제한효소로 처리한 후 pUC19 벡터(strataene)의 PvuII 제한효소 부위에 클로닝하였다. 그 다음 색소체 형질전환 벡터인 pZS197(Svab, Z et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 913-917, 1993)에서 16S rRNA 프로모터인 Prrn, 항생제 저항성 유전자인 aadA 유전자, psbA 터미네이터를 NotI 제한효소로 처리하여 NotI-NotI 단편으로 분리하였다. 이를 클리노우 효소로 처리한 다음 앞서 제조한 pUC19 벡터의 trnI과 trnA 사이에 존재하는 PvuII 제한효소 부위에 도입하여 pLD-RCtV 벡터를 제조하였다(도 1a).

시각적으로 형질전환 여부를 구별할 수 있도록 하기 위해, 상기 pLD-RCtV 벡터에 선별 마커 유전자로 GFP(green fluorescent protein) 유전자를 도입하였다. 이를 위해, 벼에서 독성이 없는 것으로 알려진 gfp 유전자의 변형 유전자인 sgfp 유전자를 PCR 방법으로 증폭하였다. 이때, 상기 sgfp 유전자의 앞부분에 리보좀 결합영역(ribosome binding site)을 가지도록 하였다. 상기 sgfp 유전자(서열번호 5)의 PCR 증폭은 pSK-RG 플라스미드(Jang E. et al., Plant Physiol, 129, 1-9, 2002)를 주형으로 하고 하기의 프라이머 쌍(서열번호 6 및 서열번호 7)을 사용하여 수행하였다. 하기 프라이머 서열에서 밑줄은 XbaI 부위를 의미하며 이탤릭체로 표시된 부분은 리보좀 결합 영역을 의미한다.

정방향 프라이머(서열번호 6)

5'- GCTCTAGAGTTGTAGGGAGGGACGTATGGCCAAGGGCGAGGAGCTGTT-3'

역방향 프라이머(서열번호 7)

5'-GCTCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3'

상기 PCR 증폭 산물을 pLD-RCtV 벡터의 aadA 유전자와 psbA의 3'UTR 사이에 존재하는 XbaI 부위에 도입하여 pLD-RCtV-sGFP 벡터를 제조하였다(도 1b 및 도 1c).

<실시예 2>

형질전환된 벼의 선별을 위한 선별배지 내 스트렙토마이신 함량 및 선별조건의 최적화

형질전환된 벼의 선별에 사용되는 스트렙토마이신의 최적 농도를 결정하기 위하여, 발아 후 2-3주된 캘러스를 다양한 농도의 스트렙토마이신이 포함된 배지에 치상하고 재분화시켰다. 상기 캘러스는 화청벼 종자를 2,4-디클로로페녹시 아세트산(2,4-D) 2mg/L, 카제인 가수분해물(casein hydrolysate) 1g/L, 수크로오스 (sucrose) 30g/L 및 젤라이트(Gelrite) 2g/L로 이루어진 N6 배지에 파종하여 28℃, 암조건 하에서 2주 내지 3주간 배양하여 수득하였다.

상기 캘러스를 스트렙토마이신이 각각 0, 100, 200, 500 및 1000mg/L의 농도로 첨가된 MS(Murachige and Skoog) 배지에 치상하고 광조건으로 2달간 배양하였다. 또한, 상기와 동일한 배지에 캘러스를 치상하고 암조건으로 1달간 배양하였다.

실험 결과, 광조건 하에서 스트렙토마이신을 100mg/L로 첨가한 배지에서 배양한 경우 캘러스의 성장은 부분적으로 저해되는 것으로 나타났으며 뿌리가 유도되지 않았다. 또한, 스트렙토마이신을 200mg/L로 첨가한 경우에는 성장이 더욱 저해되는 것으로 나타났다(도 2a). 스트렙토마이신을 500mg/L의 농도로 첨가한 경우에도 캘러스의 성장이 저해되는 것으로 나타났으며 스트렙토마이신의 농도가 1000mg/L인 경우에는 모든 캘러스가 3주 내에 갈색으로 변화되었다.

반면, 암조건 하에서는 스트렙토마이신을 1000mg/L을 첨가한 경우에도 캘러스의 성장은 큰 저해를 받지 않았다(도 2b)

상기 실험 결과로부터, 암조건 하에서는 캘러스가 항생제에 민감하지 않음을 알 수 있었으며 이로 인해 형질전환체의 선별시 암조건 하에서 캘러스를 배양하는 것은 적합하지 않음을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명의 형질전환체는 광조건하에서 선별하는 것이 바람직하며, 배지에 첨가하는 스트렙토마이신의 최적 농도는 부분적으로 성장을 저해하는 것으로 나타난 100mg/L와 캘러스가 거의 성장할 수 없는 경우인 1000mg/L를 제외하고 200mg/L 내지 500mg/L의 농도 범위가 적합함을 알 수 있었다.

<실시예 3>

입자 충격법에 의한 벼 색소체의 형질전환 및 재분화

상기 실시예 2와 동일한 방법으로 벼의 종자로부터 유도한 캘러스를 상기 실시예 1에서 제조한 벼 색소체 형질전환용 벡터인 pLD-RCtV-sGFP DNA를 코팅한 0.6㎛ 지름의 금입자(gold particle)와 PDH-1000/He 유전자 전달 시스템(Bio-Rad)을 사용하여 가속력(acceleration power) 1,100psi, 표적 거리(target distance) 6cm의 조건으로 형질전환하였다. 그 다음 상기 캘러스를 암조건 하에서 28℃로 이틀간 배양하고 NAA 2mg/L, 키네틴 2mg/L, 피트아가(phytagar) 14g/L 및 스트렙토마이신 200mg/L가 첨가된 MS(Murachige and Skoog) 배지에서 50 μE의 광조건으로 배양하여 재분화를 유도하였다. 그 결과, 스트렙토마이신-저항성 캘러스는 선별 배지에서 한달이 지난 후 녹색 스팟으로 나타났고 다음 달에는 캘러스에서 신초가 발생하였다(도 3a).

상기 스트렙토마이신에 저항성을 나타내는 캘러스에서 어린잎이 생기면 스트렙토마이신 농도가 300mg/L로 증가된 새로운 배지에 옮겨 치상한 후 동일한 광조건으로한달간 배양하였다. 이 후 스트렙토마이신에 저항성을 나타내는 신초(shoot)를 발근용 배지인 스트렙토마이신 500mg/L가 첨가되어 있고 호르몬이 첨가되지 않은 MS 배지에 치상하여 배양함으로써 뿌리 형성을 유도하였다.

약 4000개의 캘러스를 사용하여 상기와 같은 방법으로 10번의 독립적인 실험을 수행한 결과, 2개의 독립적인 계통이 선별되었고 재분화되었다(도 3b). 상기 2개의 스트렙토마이신-저항성 계통은 각각 sGFP-1 및 sGFP-2로 명명하였다.

<실시예 4>

색소체 형질전환 벼의 토양 순화시 스트렙토마이신의 최적 처리량 결정

상기 실시예 3에서 선별된 sGFP-1 및 sGFP-2 계통을 토양이 담긴 화분에 옮겨 순화시키고 토양 1L 당 스트렙토마이신 500mg을 일주일 간격으로 처리하였다. 상기 sGFP-1 및 sGFP-2의 유식물이 충분한 수가 되었을 때, 상기 유식물들을 구분하여 각각 별개의 토양이 담긴 3개의 화분에 치상하고 토양 1L 당 스트렙토마이신 500, 1000 및 1500mg을 일주일 간격으로 식물체가 종자를 맺어 수확할 때까지 각각 처리하였다. 이때, 대조군으로는 형질전환하지 않은 벼의 유식물을 사용하였다.

실험 결과, 토양 1L 당 스트렙토마이신 500mg을 처리한 경우 형질전환하지 않은 벼는 성장이 저해된 반면, sGFP-1 및 sGFP-2의 유식물의 생장은 영향을 받지 않았으며 종자가 생산되었다. 토양 1L당 스트렙토마이신 1000mg를 처리한 경우에는 형질전환하지 않은 벼의 성장은 크게 저해되는 것으로 나타났으며, sGFP-1 및 sGFP-2의 유식물의 영양 성장은 크게 영향을 받지 않았으나 종자가 소량으로 생산되었다. 토양 1L 당 스트렙토마이신 1500mg을 처리한 경우에는 sGFP-1 및 sGFP-2의 유식물의 생장이 조금 저해되는 것으로 나타났으며 종자도 생산되지 않았다(도 4).

상기에서 스트렙토마이신의 농도를 달리하여 처리한 각각에서 항생제 저항성을 나타내는 sGFP-1 및 sGFP-2의 유식물체를 선별하여 6개의 개체를 수득하였다.

<실시예 6>

색소체 형질전환 벼의 게놈 DNA 분석

상기 실시예 5에서 선별된 형질전환 벼들에 sgfp 유전자가 존재하는지를 확인하기 위하여 벼의 게놈 DNA를 PCR 증폭하여 분석하였다.

상기 형질전환 벼의 입 조직으로부터 총 게놈 DNA를 공지된 방법에 따라 추출하였다(Doyle J. et al., Phytochem. Bull. 19, 11-15, 1987). 또한, 대조군으로 사용하기 위해 형질전환되지 않은 야생벼의 입 조직으로부터 동일한 방법으로 총 게놈 DNA를 추출하였다. 상기에서 추출한 게놈 DNA 100ng을 주형으로 하고 DNA 중합효소(Excel Taq DNA polymerase, Corebio, Seoul, South Korea)를 사용하여 sgfp 유전자를 증폭할 수 있는 하기의 프라이머 쌍(서열번호 8 및 서열번호 9)을 사용하여 PCR 증폭하였다. PCR 증폭 조건으로는 94℃에서 30초간 변성, 63℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 40초간 신장하는 단계로 이루어진 과정을 30회 반복하였다. 상기의 PCR 증폭 산물을 아가로스 겔(1%)에서 확인하였다.

sgfp의 정방향 프라이머(서열번호 8)

5'-GACCCTGAAGTTCATCTGAC-3'

sgfp의 역방향 프라이머(서열번호 9)

5'-ACTTGTACAGCT CGTCCATG-3'

실험 결과, 상기 실시예 5에서 선별된 형질전환 6개의 개체 모두 717bp 크기의 sgfp 유전자가 존재함을 확인할 수 있었다(도 5a 및 5b).

<실시예 7>

색소체 형질전환 벼의 서던 블롯 분석

상기 실시예 5에서 선별된 형질전환 벼의 색소체 게놈 내에 aadA 유전자가 존재하는지를 확인하기 위하여 서던 블롯 분석을 수행하였다. 이때 상기 실시예 5에서 선별한 6개의 형질전환된 개체 중 토양에 스트렙토마이신을 500mg/L 농도로 처리하여 선별한 2개의 개체를 시료로 사용하였다.

상기 실시예 6과 동일한 방법으로 추출한 총 게놈 DNA를 BamHI으로 소화시켜 수득한 DNA 18μg을 시료로 사용하였다. 상기 시료를 0.7% 아가로스 겔에서 분리하고 하이본드-N+ 나일론 막(Amersham)에 옮기고 [α-32P]dCTP로 표지된 aadA에 특이적인 프로브와 혼성화하고 X-레이 필름으로 감광하였다. aadA에 특이적인 프로브는 aadA 유전자를 포함하는 상기 실시예 1의 pLD-RCtV 벡터를 주형으로 하여 하기의 프라이머(서열번호 10 및 서열번호 11)로 PCR 증폭함으로써 제조하였다. PCR 증폭 조건으로는 94℃에서 30초간 변성, 60℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 40초간 신장하는 단계로 이루어진 과정을 30회 반복하였다.

aadA 프로브의 정방향 프라이머(서열번호 10)

5'-GATCGCCGAAGTATCGACTC-3'

aadA 프로브의 역방향 프라이머(서열번호 11)

5'-ATTTGCCGACTACCTTGGTG-3'

실험 결과, sGFP-1 및 sGFP-2에서 3.3kb 크기의 단편이 검출되었다(도 6). 이로부터 상기 sGFP-1 및 sGFP-2에 aadA 유전자가 존재하고 발현됨을 확인할 수 있었다.

<실시예 8>

형질전환 벼의 색소체 게놈 내에 목적 유전자가 부위 특이적으로 도입되었는지 여부 조사

상기 실시예 5에서 선별된 형질전환 벼의 색소체 게놈 내에 부위 특이적으로 sgfp 및 aadA 유전자가 인테그레이션되었는지를 확인하기 위하여 벼의 게놈 DNA를 PCR 증폭하여 분석하였다.

형질전환 벼의 총 게놈 DNA는 상기 실시예 6과 동일한 방법으로 추출하고 게놈 DNA 100-500ng을 주형으로 하여 벼 색소체의 왼쪽 경계면 및 오른쪽 경계면을 각각 증폭할 수 있는 하기의 프라이머 쌍(서열번호 12 내지 서열번호 15)을 사용하여 PCR 증폭하였다.

왼쪽 경계면 정방향 프라이머(서열번호 12)

5'-TCAGCCATACGGCGGTGAATCCG-3'

왼쪽 경계면 역방향 프라이머(서열번호 13)

5'-CCGCGTTGTTTCATCAAGCCTTACG-3'

오른쪽 경계면 정방향 프라이머(서열번호 14)

5'-CGGGATCACTCACGGCATGGACGAG-3'

오른쪽 경계면 역방향 프라이머(서열번호 15)

5'-TACCATAGAGGCCAACGATAGACAATAA-3'

왼쪽 경계면의 PCR 증폭은 94℃에서 30초간 변성, 63℃에서 30초간 어닐링 및 72℃에서 2분간 신장하는 단계로 이루어진 과정을 35회 반복하여 수행하였다.

오른쪽 경계면의 PCR 증폭은 94℃에서 30초간 변성, 63℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 1분 30초간 신장하는 단계로 이루어진 과정을 10회 반복한 다음 94℃에서 30초간 변성, 60℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 1분 30초간 신장하는 단계로 이루어진 과정을 25회 반복하여 수행하였다.

상기의 PCR 증폭 산물을 아가로스 겔(1%)에서 확인한 후 겔 상의 DNA 만을 순수분리하여 pGEM-T Easy 벡터(Promega, Madison, WI)에 클로닝하고 서열분석회사인 코아바이오사에 의뢰하여 서열을 분석함으로써 aadA와 gfp 유전자의 삽입된 위치가 벼의 색소체 게놈안의 trnI과 trnA 사이 부분임을 확인하였다.

실험 결과, 형질전환 벼들에서 각각 1.9kb 및 1.3kb 크기의 벼 색소체의 왼쪽 경계면 단편(도 7a) 및 오른쪽 경계면 단편이 검출되었다(도 7b). 상기 PCR 증폭 산물의 서열을 분석한 결과, aadA 유전자와 sgfp 유전자가 벼의 색소체 게놈안의 trnI 및 trnA 유전자 사이에 존재함을 확인할 수 있었다(결과 미도시).

<실시예 9>

색소체 형질전환 벼의 웨스턴 블롯 분석

상기 실시예 5에서 선별된 형질전환 벼에서 GFP가 발현되는지 여부를 웨스턴 블롯 분석법으로 조사하였다.

상기 형질전환 벼의 잎 조직으로부터 가용성 단백질을 단백질 추출용 완충액(0.1M Tris-HCl, pH 8.3, 0.5M NaCl, 5mM 디티오트레이톨, 5mM EDTA, 2mM 페닐메틸설포닐플루오라이드)을 사용하여 추출하였다. 대조군으로 사용하기 위해 형질전환되지 않은 벼의 잎으로부터 상기와 동일한 방법으로 단백질을 추출하였다. 상기에 서 추출한 가용성 단백질 2μg을 12% SDS-PAGE 젤에서 전기영동하고 면역블롯팅을 수행하기 위해 니트로셀룰로오스 막(Amersham)으로 옮겼다. 일차 항체로는 단클론 항-GFP(Sigma)를 1:500으로 희석하여 사용하였고, 이차 항체로는 알카라인 포스파타아제 결합 염소-항마우스 IgG(Sigma)를 1:10,000으로 희석하여 사용하였다. GFP의 검출은 BCIP/NBP 콤보(Gibco BRL)를 사용하여 수행하였다.

실험 결과, sGFP-1 및 sGFP-2 계통에서 27kDa의 밴드가 생성되었고 이로부터 sGFP가 생성되었음을 확인하였다(도 8).

<실시예 10>

색소체 형질전환 벼의 자손 획득 및 분석

상기 실시예 5에서 선별된 색소체 형질전환된 벼를 자가수정하여 종자를 수득하고 상기 종자를 스트렙토마이신 농도가 100mg/L이며 호르몬이 첨가되지 않은 MS 배지에 파종하여 28℃에서 광조건으로 2주간 배양하였다. 배양된 벼를 공초점형광현미경으로 관찰하여 GFP의 발현여부를 조사하였다. 또한, 상기 GFP가 형질전환된 벼의 엽록체(chloroplast)에 위치해 있는지를 확인하였다. 즉, 상기 색소체 형질전환 벼의 자손에 488nm 여기 파장과 510nm의 방출파장 필터를 사용하여 레이저를 조사하고 녹색의 GFP 형광이 발현되는지를 공초점형광현미경(Carl Zeiss 510 CLSM, Jena, Germany)을 사용하여 확인하였다.

실험 결과, 엽록체, 어린 엽록체 및 잎 표피에서 sGFP 형광이 나타났다(도 9). 따라서, 벼 색소체에 삽입된 유전자가 다음 세대로 전이됨을 확인할 수 있었다.

본 발명에 따른 식물의 색소체 형질방법은 식물의 캘러스를 색소체 형질전환용 벡터로 형질전환함으로써 형질전환체가 성체로 발달하여도 형질전환 된 색소체가 소멸되지 않으며 색소체에 이식된 유전자가 다음 세대로 전달되는 효과가 있다.

<110> Seoul National University Industry <120> Method for plastid transformation in the plant <130> NP04-0114 <160> 15 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1045 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> gene <222> (1)..(1045) <223> trnI <400> 1 cctcccaaag ggaggcccgc gcgacgggct attagctcag tggtagagcg cgcccctgat 60 aattgcgtcg ttgtgcctgg gctgtgaggg ctctcagcca catggatagt tcaatgtgct 120 catcagcgcc tgacccgaag atgtggatca tccaaggcac attagcatgg cgtactcctc 180 ctgtttgaat cggagtttga aaccaaacaa acttctcctc aggaggatag atggggcgat 240 tcaggtgaga tcccatgtag atctaacttt ctattcactc gtgggatccg ggcggtccgg 300 ggggggcact acggctcctc tcttctcgag aatccataca tcccttatca gtgtatggag 360 agctatctct cgagcacagg ttgaggttcg tcctcaatgg gaaaatggag cacctaacaa 420 cgcatcttca cagaccaaga actacgagat caccctttca ttctggggtg acggagggat 480 cgtaccattc gagccttttt ttcatgcttt tcccggcggt ctggagaaag cagcaatcaa 540 taggacttcc ctaatcctcc cttcctgaaa ggaagaacgt gaaattcttt ttcctttccg 600 cagggaccag gaggttggat ctagccataa gaggaatgct tggtataaat aagccacttc 660 ttggtcttcg actccctaag tcactacgag cgccctcgat cagtgcaatg ggatgtggct 720 atttatctat ctcttgactc gaaatgggag cagagcaggt ttgaaaaagg atcttagagt 780 gtctagggtt gggccaggag ggtctcttaa cgccttcctt tttctgccca tcggagttat 840 ttcccaagga cttgccatgg taagggggag aaggggaaga agcacacttg aagagcgcag 900 tacaacggag agttgtatgc tgcgttcggg aaggatgaat cgctcccgaa aaggagtcta 960 ttgattctct cccaattggt tggatcgtag gggcgatgat ttacttcacg ggcgaggtct 1020 ctggttcaag tccaggatgg cccag 1045 <210> 2 <211> 823 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> gene <222> (1)..(823) <223> trnA <400> 2 ctgcgccagg gaaaagaata gaagaagcat ctgactcttt catgcatact ccacttggct 60 cggggggata tagctcagtt ggtagagctc cgctcttgca attgggtcgt tgcgattacg 120 ggttggctgt ctaattgtcc aggcggtaat ggtagtatct tgtacctgaa ccggtggctc 180 actttttcta agtaatgggg aagaggactg aaacatgcca ctgaaagact ctactgagac 240 aaaaagatgg gctgtcaaaa aggtagagga ggtaggatgg gcagttggtc agatctagta 300 tggatcgtac atggacgata gttggagtcg gcggctctcc taggcttccc tcatctggga 360 tccctgggga agaggatcaa gtgtggccct tgcgaatagc ttgatgcact atctcccttc 420 aaccctttga gcgaaatgtg gcaaaaggaa ggaaaatcca tggaccgacc ccattatctc 480 caccccgtag gaactacgag atcaccccaa ggacgccttc ggcgtccagg ggtcacggac 540 cgaccataga ccctgttcaa taagtggaac acattagccg tccgctctcc ggttgggcag 600 taagggtcgg agaagggcaa tcactcgttc ttaaaaccag cattcttaag tttaagatca 660 aagagtcggg cggaaaaagg ggagagctcc ccgttcctgg ttctcctgta gctggattcc 720 ccggaaccac aagaatcctt agaatgggat tccaactcag caccttttgt tttgagattt 780 tgagaagagt tgctctttgg agagcacagt acgatgaaag ttg 823 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cgaggcctcc caaagggagg cccgcgcga 29 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gctgatatcc aactttcatc gtactgtgct ct 32 <210> 5 <211> 717 <212> DNA <213> Jellyfish Aequorea victoria <220> <221> gene <222> (1)..(717) <223> sgfp <400> 5 atggccaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc 60 gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc 120 aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc 180 gtgaccacct tcacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcag 240 cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc 300 aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg 360 aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag 420 ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc 480 atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac 540 cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac 600 ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg 660 ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact cacggcatgg acgagctgta caagtaa 717 <210> 6 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gctctagagt tgtagggagg gacgtatggc caagggcgag gagctgtt 48 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 gctctagatt acttgtacag ctcgtccatg 30 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gaccctgaag ttcatctgac 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 acttgtacag ctcgtccatg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gatcgccgaa gtatcgactc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 atttgccgac taccttggtg 20 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 tcagccatac ggcggtgaat ccg 23 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 ccgcgttgtt tcatcaagcc ttacg 25 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 cgggatcact cacggcatgg acgag 25 <210> 15 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 taccatagag gccaacgata gacaataa 28

Claims (11)

1. (a) 식물의 종자, 조직 및 세포 현탁액으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 어느 하나를 캘러스 유도용 배지에서 배양하여 캘러스를 유도하는 단계;

   (b) 상기 (a) 단계의 식물의 캘러스를 색소체 형질전환용 벡터로 형질전환하는 단계;

   (c) 상기 (b) 단계에서 형질전환된 캘러스를 선별 배지에서 배양하여 형질전환된 캘러스를 선별하는 단계;

   (d) 상기 (c) 단계에서 선발된 캘러스를 발근용 배지에서 배양하여 뿌리를 유도하고 토양에 옮겨 순화시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물의 색소체 형질전환 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 식물은 단자엽 식물임을 특징으로 하는 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 단자엽 식물이 벼, 밀, 보리, 죽순, 옥수수, 토란, 아스파라거스, 양파, 마늘, 파, 부추, 달래, 마 및 생강으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 단자엽 식물이 벼인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 색소체 형질전환용 벡터는 상동 재조합 부위의 왼쪽 경계면 영역, 선별 마커, 목적 유전자 및 상동 재조합 부위의 오른쪽 경계면 영역을 포함하고 있는 것임을 특징으로 하는 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 선별 마커는 스트렙토마이신 저항성 유전자이고 상동 재조합 부위의 왼쪽 경계면 영역 및 오른쪽 경계면 영역이 각각 벼의 trnI 및 trnA 유전자임을 특징으로 하는 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 형질전환은 입자 충격법(particle bombardment)에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 캘러스를 형질전환한 다음 항생제가 포함되지 않은 N6 또는 MS배지에서 암조건으로 25∼30℃로 1∼3일간 배양하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계에서 형질전환된 캘러스의 선별은 상기 (b) 단계에서 형질전환된 캘러스를 100∼500mg/L의 항생제가 포함된 MS 배지에서 광조건으로 배양하여 항생제에 저항성을 나타내는 캘러스를 일차적으로 선발한 다음 이를 다시 300∼500mg/L의 항생제가 포함된 MS 배지에 옮겨 치상한 후 배양하여 항생제 저항성 캘러스를 이차적으로 선별함으로써 수행되는 것임을 특징으로 하는 방법.
10. 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계의 발근용 배지는 항생제가 300∼1000mg/L가 포함되어 있고 호르몬이 첨가되지 않은 MS 배지임을 특징으로 하는 방법.
11. 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계에서 식물체를 토양에 옮겨 순화시킬 때 일주일 간격으로 토양 1L 당 500∼1500mg의 항생제를 상기 식물체가 종자를 맺어 수확할 때 까지 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.

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