CN105087597B - 使植物的生物量增产的基因及其利用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题是通过抑制在细胞内的囊泡转运中发挥功能的基因的表达或阻碍由该基因编码的蛋白质的功能来使生物量增产。本发明的用于解决课题的方法是，抑制编码外被体衔接物的ζ亚基的基因的表达或阻碍外被体衔接物的ζ亚基，或者抑制编码网格蛋白衔接物的小亚基即σ亚基的基因的表达或阻碍网格蛋白衔接物的小亚基即σ亚基。

Description

使植物的生物量增产的基因及其利用方法
技术领域
本发明涉及抑制了规定的基因的表达的植物体、通过抑制该基因的表达来使生物量增产的方法、生物量增产了的植物体的制造方法。
背景技术
生物量(biomass)一般是指每一定面积生息或存在的生物的总量，特别在以植物为对象的情况下，表示每单位面积的干重量。生物量的单位用质量或能量数值化。对于生物量这样的表述，“生物体量”、“生物量”也是同义语，在植物生物量的情况下有时还使用“现存量(Standing crop)”的用语。因为植物生物量是使用太阳能固定大气中的二氧化碳而生成的，所以能够作为所谓碳中和的能量而被捕获。因此，使植物的生物量增加，具有保护地球环境、防止地球温暖化、降低温室效果气体排放的效果。因此，使植物生物量增产的技术在产业上的重要性高。
另一方面，植物是以其一部分的组织自身(种子、根、叶茎等)作为目的而栽培，或者是以油脂等各种物质生产作为目的而栽培的。例如，作为由植物生产的油脂，自古以来已知大豆油、芝麻油、橄榄油、椰子油、米糠油、棉籽油、向日葵油、玉米油、红花油、棕榈油和菜籽油等，在家庭用途、工业用途中被广泛利用。另外，由植物所生产的油脂还作为生物柴油燃料、生物塑料的原料使用，作为石油代替能源适用性正在扩大。
特别是对于甘蔗等能量作物，是生物燃料的原料，因而期待使植物自身的总量(植物生物量)增产。在这样的状况下，为了使植物生物量增产，需要提高每单位耕地面积的生产性。这里如果假定每单位耕地面积的栽培个体数为一定，则判断需要提高每个个体的生物量。
然而，植物生物量被认为与多个基因相关(所谓量的性质的一种)，因而被认为不能通过个别基因导入或缺损、基因操作而有效地增产。例如，专利文献1中公开了通过将列举了180种之多的多肽中的1种或多种向植物体中进行导入(活化)，从而提高植物体的氮利用效率，使生物量增产这样的技术。这180种多肽包含网格蛋白相关蛋白复合物小亚基(clathrin associated protein complex small subunit，酵母的AP-2；Yjr058c)。但是，对于网格蛋白相关蛋白复合物小亚基，并未公开显示生物量增产效果的实测数据。
此外，囊泡转运是指介由囊泡进行细胞内的物质的转运或向细胞外的物质的转运的机制。作为被囊泡转运的物质，遍及蛋白质、脂质等多种。一般已知如果阻碍细胞内的囊泡转运，则虽然细胞自身变大，但作为生物量却少(非专利文献1)。另外，非专利文献2中列举了通过生物信息学分析来预想参与叶绿体的类囊体膜转运的蛋白，以及通过同源性分析而确定与酵母中的参与膜转运的蛋白相关的拟南芥基因组上的同源物。非专利文献2中，作为与酵母的Ret3有同源性的蛋白，指出了拟南芥中的At3g09800和At4g08520。
此外，尚不知道拟南芥中的At3g09800过表达或缺损了的植物体。但是，专利文献1～5中公开了，通过使与由At3g09800所编码的蛋白质具有例如70％左右以上的序列类似性的蛋白质的编码基因过表达，而使生物量增产。
现有技术文献
专利文献1：US7834146
专利文献2：US7214786
专利文献3：US8299318
专利文献4：US7569389
专利文献5：WO2009/037279
非专利文献
非专利文献1：Tahara et al(2007)Clathrin is involved in organization ofmitotic spindle and phragmoplast as well as in endocytosis in tobacco cellcultures.Protoplasma,230:1-11.
非专利文献2：Andersson,M.X.and Sandelius,A.S.(2004)A chloroplast-localized vesicular transport system:a bio-informatics approach.BMC Genomics,5:40.
发明内容
发明所要解决的课题
然而，通过抑制在细胞内的囊泡转运中发挥功能的基因的表达或阻碍由该基因编码的蛋白质的功能是否有助于生物量的增产是不明的。因此，本发明的目的是提供通过抑制在细胞内的囊泡转运中发挥功能的基因的表达或阻碍由该基因编码的蛋白质的功能而生物量增产了的植物体、使生物量增产的方法、生物量增产了的植物体的制造方法。
用于解决课题的方法
为了实现上述目的，本发明者们进行了深入研究，结果发现，通过抑制在植物细胞内的囊泡转运中发挥功能的特定基因，而生物量增产，从而完成了本发明。
本发明包含以下(1)～(12)。
(1)植物体，其中，抑制了编码外被体衔接物(coatomer adaptor)的ζ亚基的基因的表达或阻碍了外被体衔接物的ζ亚基，或者抑制了编码网格蛋白衔接物(clathrinadaptor)的小(σ)亚基的基因的表达或或阻碍了网格蛋白衔接物的小(σ)亚基。
(2)根据(1)所述的植物体，其特征在于，所述基因编码以下(a)～(c)的任一蛋白质，
(a)包含序列号2或4所示的氨基酸序列的蛋白质，
(b)包含与序列号2或4所示的氨基酸序列具有60％以上的序列类似性的氨基酸序列、且作为外被体衔接物的ζ亚基或网格蛋白衔接物的小(σ)亚基发挥功能的蛋白质，
(c)由与包含序列号1或3所示的碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸编码、且作为外被体衔接物的ζ亚基或网格蛋白衔接物的小(σ)亚基发挥功能的蛋白质。
(3)根据(1)所述的植物体，其特征在于，所述基因编码包含序列号1～62中的偶数序列号所示的氨基酸序列的蛋白质，或具有序列号1～62中的奇数序列号所示的碱基序列。
(4)根据(1)所述的植物体，其特征在于，通过RNA干涉法而抑制了所述基因的表达。
(5)使植物体的生物量增产的方法，其中，对于植物，抑制编码外被体衔接物的ζ亚基的基因的表达或阻碍外被体衔接物的ζ亚基，或者抑制编码网格蛋白衔接物的小(σ)亚基的基因的表达或阻碍网格蛋白衔接物的小(σ)亚基。
(6)根据(5)所述的方法，其特征在于，所述基因编码以下(a)～(c)的任一蛋白质，
(a)包含序列号2或4所示的氨基酸序列的蛋白质，
(b)包含与序列号2或4所示的氨基酸序列具有60％以上的序列类似性的氨基酸序列、且作为外被体衔接物的ζ亚基或网格蛋白衔接物的小(σ)亚基发挥功能的蛋白质，
(c)由与包含序列号1或3所示的碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸编码、且作为外被体衔接物的ζ亚基或网格蛋白衔接物的小(σ)亚基发挥功能的蛋白质。
(7)根据(5)所述的方法，其特征在于，所述基因编码包含序列号1～62中的偶数序列号所示的氨基酸序列的蛋白质，或具有序列号1～62中的奇数序列号所示的碱基序列。
(8)根据(5)所述的方法，其特征在于，通过RNA干涉法而抑制所述基因的表达。
(9)植物体的制造方法，包括：
对于植物，抑制编码外被体衔接物的ζ亚基的基因的表达或阻碍外被体衔接物的ζ亚基，或者抑制编码网格蛋白衔接物的小(σ)亚基的基因的表达或阻碍网格蛋白衔接物的小(σ)亚基的工序，和
测定上述工序之后的后代植物的生物量，筛选该生物量有意义地提高了的系统的工序。
(10)根据(9)所述的制造方法，其特征在于，所述基因编码以下(a)～(c)的任一蛋白质，
(a)包含序列号2或4所示的氨基酸序列的蛋白质，
(b)包含与序列号2或4所示的氨基酸序列具有60％以上的序列类似性的氨基酸序列、且作为外被体衔接物的ζ亚基或网格蛋白衔接物的小(σ)亚基发挥功能的蛋白质，
(c)由与包含序列号1或3所示的碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸编码、且作为外被体衔接物的ζ亚基或网格蛋白衔接物的小(σ)亚基发挥功能的蛋白质。
(11)根据(9)所述的制造方法，其特征在于，所述基因编码包含序列号1～62中的偶数序列号所示的氨基酸序列的蛋白质，或具有序列号1～62中的奇数序列号所示的碱基序列。
(12)根据(9)所述的制造方法，其特征在于，通过RNA干涉法而抑制所述基因的表达。
发明的效果
根据本发明，通过抑制在植物细胞内的囊泡转运中发挥功能的特定基因，能够使植物的生物量增产，能够制造生物量优异的植物。
附图说明
图1是显示通过实时PCR来分析转化体中的At3g09800基因的表达量的结果的特性图。
图2是显示通过实时PCR来分析转化体中的At4g08520基因的表达量的结果的特性图。
图3是对过表达At3g09800基因的转化体和抑制了At3g09800基因的表达的转化体拍摄的照片。
图4是对载体对照株和抑制了At4g08520基因的表达的转化体拍摄的照片。
具体实施方式
以下，详细说明本发明。
本发明的植物体具有：通过抑制在细胞内的囊泡转运中发挥功能的基因的表达和/或阻碍由该基因编码的蛋白质的功能，从而生物量增产这样的特征。这里，所谓在囊泡转运中发挥功能的基因具体是编码外被体衔接物(coatomer adaptor)的ζ亚基(ζ-COP)的基因和编码网格蛋白衔接物(clathrin adaptor)的小(σ)亚基的基因的任意一方或两方。这里，生物量增产是指与具有上述基因的野生型植物相比较时，生物量有意义地增加。
另外，既可以在植物体的全体中抑制上述的基因的表达或阻碍由该基因编码的蛋白质的功能，也可以在植物组织的至少一部分中抑制基因的表达或阻碍由该基因编码的蛋白质的功能。这里，植物组织是包含叶、茎、种子、根和花等植物器官的含义。
在本发明中，抑制基因的表达是包含使该基因缺损、使该基因的表达量抑制或减少的含义。使基因缺损，是指使包含该基因的编码区的一部分或全部的区域从染色体缺失，在该基因的编码区插入转座子等来破坏该基因。另外，作为使基因的表达量减少的方法，不特别限定，可以列举改变该基因的表达控制区域而降低转录量的方法、使该基因的转录产物选择性地分解的方法等。
作为本发明中抑制基因的表达的方法，可列举所谓转座子法、转基因法、转录后基因沉默法、RNAi法、无义介导的衰减(Nonsense mediated decay,NMD)法、核酶法、反义法、miRNA(微RNA，micro-RNA)法、siRNA(小干扰RNA，small interfering RNA)法、共抑制(co-suppression)法、锌指核酸酶(Zinc finger nuclease(ZFN))法、TALE(转录激活样效应因子，Transcription Activator-Like Effector)核酸酶法、和CRISPR(成簇的规律间隔性短回文重复，Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)法等。
另外，阻碍由外被体衔接物的ζ亚基基因编码的蛋白质的功能，是指阻碍该蛋白质作为外被体衔接物复合体发挥功能。同样地，阻碍由网格蛋白衔接物的小(σ)亚基基因编码的蛋白质的功能，是指阻碍该蛋白质作为网格蛋白衔接物复合体发挥功能。具体地，可以列举使以这些蛋白质作为抗原的抗体表达、使具有针对该蛋白质的拮抗剂活性的蛋白质表达这样的方法。
编码外被体衔接物的ζ亚基(ζ-COP)的基因和编码网格蛋白衔接物的小(σ)亚基的基因可以在各种植物中作为固有基因而特定。例如，在拟南芥中，编码外被体衔接物的ζ亚基(ζ-COP)的基因和编码网格蛋白衔接物的小(σ)亚基的基因分别作为At3g09800和At4g08520已知。
由At3g09800所特定的基因的碱基序列和由该基因编码的蛋白质的氨基酸序列分别示于序列号1和2。由At4g08520所特定的基因的碱基序列和由该基因编码的蛋白质的氨基酸序列分别示于序列号3和4。
但是，成为抑制表达的对象的、编码外被体衔接物的ζ亚基(ζ-COP)的基因和编码网格蛋白衔接物的小(σ)亚基的基因，并不限于由序列号1和2所特定的At3g09800以及由序列号3和4所特定的At4g08520。即，也可以抑制在拟南芥中固有的同源基因、在除拟南芥以外的植物中固有的同源基因的表达。对这些同源基因不特别限定，可以通过检索归纳了各种生物的基因序列的数据库来特定。即，可以以序列号1～4所示的碱基序列、氨基酸序列作为查询序列，检索例如DDBJ/EMBL/GenBank国际碱基序列数据库、SWISS-PROT数据库，从而从公知的数据库容易地进行检索、鉴定。
这里，同源基因一般是指由共同的祖先基因进化分枝而得的基因，是指包含2种类的种的同源基因(直系同源物(ortholog))和在同一种内通过重复分枝而生成的同源基因(旁系同源物(paralog))的含义。换言之，上述的“同源基因”是包含直系同源物、旁系同源物这样的同源基因的含义。
将在拟南芥中固有的同源基因和除拟南芥以外的植物中的同源基因示于表1。此外，表1中还列举了酵母中的同源基因。另外，表1中对于各同源基因的碱基序列和由该同源基因编码的蛋白质的氨基酸序列记载了序列号。
表1
来源 基因 碱基序列 氨基酸序列
拟南芥 At4g08520 序列号3 序列号4
拟南芥 At3g09800 序列号1 序列号2
拟南芥 At1g60970 序列号5 序列号6
拟南芥 At1g15370 序列号7 序列号8
拟南芥 At1g47830 序列号9 序列号10
拟南芥 At2g17380 序列号11 序列号12
拟南芥 At2g19790 序列号13 序列号14
拟南芥 At3g50860 序列号15 序列号16
拟南芥 At4g35410 序列号17 序列号18
毛果杨 ABK92638(Populus trichocarpa) 序列号19 序列号20
云杉 ABR17033(Picea sitchensis) 序列号21 序列号22
玉米 ACG48704(Zea mays) 序列号23 序列号24
玉米 ACN27243(Zea mays) 序列号25 序列号26
日本百脉根 AFK49535(Lotus japonicus) 序列号27 序列号28
油菜 BAA92778(Brassica rapa) 序列号29 序列号30
大麦 BAK05989(Hordeum Vulgare) 序列号31 序列号32
蒺藜苜蓿 CAI29266(Medicago truncatula) 序列号33 序列号34
小球藻 EFN57218(Chlorella variabilis) 序列号35 序列号36
胶球藻 EIE23550(Coccomyxa subellipsoidea) 序列号37 序列号38
稻 NP_001046672(Oryza sativa)Os02g0317400 序列号39 序列号40
番茄 NP_001233898(Solanum lycopersicum) 序列号41 序列号42
番茄 NP_001233904(Solanum lycopersicum) 序列号43 序列号44
大豆 NP_001236887(Glycine max) 序列号45 序列号46
莱茵衣藻 XP_001701294(Chlamydomonas reinhardtii) 序列号47 序列号48
小立碗藓 XP_001753235(Physcomitrella patens) 序列号49 序列号50
葡萄 XP_002277175(Vitis vinifera) 序列号51 序列号52
深山南芥 XP_002872400(Arabidopsis lyrata) 序列号53 序列号54
团藻 XP_002958079(Volvox carteri) 序列号55 序列号56
卷柏 XP_002975157(Selaginella moellendorffii) 序列号57 序列号58
大豆 XP_003542071(Glycine max) 序列号59 序列号60
二穗短柄草 XP_003564572(Brachypodium distachyon) 序列号61 序列号62
酵母 APS1(YLR170C) 序列号63 序列号64
酵母 APS2(YJR058C) 序列号65 序列号66
酵母 APS3(YJL024C) 序列号67 序列号68
酵母 RET3(YPL010W) 序列号69 序列号70
表1所列举的基因编码对序列号2或4所示的氨基酸序列具有60％以上的序列类似性的蛋白质，是编码与由At3g09800或At4g08520编码的蛋白质具有相同功能的蛋白质的概率非常高的基因。因此，通过抑制表1中列举的基因的表达，或者阻碍由表1所列举的基因编码的蛋白质，可以使表1所示的对应的植物的生物量增产。
这里，序列类似性是指以默认的设定使用Genetyx(Ver.9)、BLAST、PSI-BLAST、HMMER这样的序列类似性检索软件，作为显示2个氨基酸序列之间的类似性的值而算出的值。
对于表1所示的同源基因，将At3g09800与At4g08520的氨基酸水平上的同一性(Identity)和序列类似性(Similarity)归纳于表2。
表2
如上，本发明的植物体中作为抑制对象的基因，也可以是编码包含与序列号2或4所示的氨基酸序列有60％以上、优选70％以上、更优选80％以上、进一步优选90％以上、最优选95％以上的序列类似性的氨基酸序列，且作为外被体衔接物的ζ亚基或网格蛋白衔接物的小(σ)亚基发挥功能的蛋白质的基因。此外，本发明的植物体中作为抑制对象的基因，也可以是编码包含与序列号2或4所示的氨基酸序列有60％以上、优选70％以上、更优选80％以上、进一步优选90％以上、最优选95％以上的同一性的氨基酸序列，且作为外被体衔接物的ζ亚基或网格蛋白衔接物的小(σ)亚基发挥功能的蛋白质的基因。
另外，本发明的植物体如上所述，在抑制对象的基因不明的情况下，应用通常的方法特定同源基因即可。即，如果植物的基因组信息不明，则按照常规方法制作基因组文库或cDNA文库，通过以序列号1或3所示的碱基序列的互补碱基序列的全部或一部分作为探针的杂交而特定应抑制的基因。换言之，同源基因可以作为编码由与包含序列号1或3所示的碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸编码、且作为外被体衔接物的ζ亚基或网格蛋白衔接物的小(σ)亚基发挥功能的蛋白质的基因而特定。
这里，严格条件是指形成所谓特异性杂种、不形成非特异性杂种的条件。可列举例如，在45℃、6×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)下杂交、然后在50～65℃、0.2～1×SSC、0.1％SDS下洗涤，或者作为这样的条件，可列举在65～70℃、1×SSC下杂交、然后在65～70℃、0.3×SSC下洗涤。杂交按照J.Sambrook et al.Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2ndEd.,Cold Spring Harbor Laboratory(1989)所记载的方法等现有公知的方法来进行。
此外，作为以高蓄积可溶糖的方式进行改变的植物，不特别限定，可以是任何植物。作为成为对象的植物，可列举例如，双子叶植物、单子叶植物，属于例如十字花科、禾本科、茄科、豆科、杨柳科等的植物(参照下述)，但不限于这些植物。
十字花科：拟南芥(Arabidopsis thaliana)、油菜(Brassica rapa、Brassicanapus)、卷心菜(Brassica oleracea var.capitata)、油菜籽(Brassica rapa、Brassicanapus)、青菜(Brassica rapa var.chinensis)、芜青(Brassica rapa var.rapa)、野泽菜(Brassica rapa var.hakabura)、日本芜青(Brassica rapa var.lancinifolia)、小松菜(Brassica rapa var.peruviridis)、小白菜(パクチョイ，Brassica rapavar.chinensis)、萝卜(Brassica Raphanus sativus)、山葵(Wasabia japonica)等。
茄科：烟草(Nicotiana tabacum)、茄子(Solanum melongena)、马铃薯(Solaneumtuberosum)、番茄(Lycopersicon lycopersicum)、辣椒(Capsicum annuum)、矮牵牛(Petunia)等。
豆科：大豆(Glycine max)、豌豆(Pisum sativum)、蚕豆(Vicia faba)、多花紫藤(Wisteria floribunda)、花生(Arachis.hypogaea)、日本百脉根(Lotus corniculatusvar.japonicus)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、赤小豆(Vigna angularis)、金合欢(Acacia)等。
菊科：菊(Chrysanthemum morifolium)、向日葵(Helianthus annuus)等。
棕榈科：油棕(非洲油棕(Elaeis guineensis)、美洲油棕(Elaeis oleifera))、椰子(Cocos nucifera)、海枣(Phoenix dactylifera)、巴西棕榈(Copernicia)等。
漆树科：野漆树(Rhus succedanea)、腰果(Anacardium occidentale)、漆树(Toxicodendron vernicifluum)、芒果(Mangifera indica)、阿月浑子(Pistacia vera)等。
葫芦科：南瓜(笋瓜(Cucurbita maxima)、中国南瓜(Cucurbita moschata)、美洲南瓜(Cucurbita pepo))、黄瓜(Cucumis sativus)、王瓜(Trichosanthes cucumeroides)、葫芦(Lagenaria siceraria var.gourda)等。
蔷薇科：扁桃(Amygdalus communis)、玫瑰(Rosa)、草莓(Fragaria)、樱(Prunus)、苹果(Malus pumila var.domestica)等。
石竹科：康乃馨(Dianthus caryophyllus)等。
杨柳科：杨(毛果杨(Populus trichocarpa)、黑杨(Populus nigra)、欧洲山杨(Populus tremula))等。
桃金娘科：桉(大桉(Eucalyptus camaldulensis)、赤桉(Eucalyptus grandis))等。
禾本科：玉米(Zea mays)、稻(Oryza sativa)、大麦(Hordeum vulgare)、小麦(Triticum aestivum)、毛竹属(Phyllostachys)、甘蔗(Saccharum officinarum)、象草(Pennisetum pupureum)、沙生蔗茅(Erianthus ravenae)、条芒(芒)(Miscanthusvirgatum)、高粱属(Sorghum)、黍属(Panicum)等。
百合科：郁金香属(Tulipa)、百合属(Lilium)等。
其中，优选以单子叶植物为对象，制造能够高蓄积可溶糖的单子叶植物。单子叶植物中，特别优选以稻、小麦、大麦、甘蔗、玉米等禾本科的植物为对象。
其他工序、其他方法
上述的抑制基因的表达或阻碍由该基因编码的蛋白质的功能的工序之后，可以按照现有公知的方法进行从植物体中筛显示适当的表型的个体的筛选工序。对筛选的方法不特别限制，测定植物体本身或任意器官和/或组织的重量，筛选出与野生型相比有意义地增产的植物体即可。
另外可以由所得的植物按照常规方法获得后代植物。即，对于生物量增产了的后代植物，可以以其生物量为基准进行筛选，从而制成生物量增产了的稳定的植物系统。
此外，所谓本发明中的植物体，包括长成的植物个体、植物细胞、植物组织、愈伤组织、种子的至少任一者。即，在本发明中，只要处于最终能生长成植物个体的状态即全部可看作是植物体。另外，上述植物细胞包括各种形态的植物细胞。作为所述植物细胞，包含例如，悬浮培养细胞、原生质体、叶的切片等。通过使这些植物细胞增殖、分化可以获得植物体。此外，由植物细胞再生植物体可以根据植物细胞的种类使用现有公知的方法来进行。
如以上所说明的那样，根据本发明，通过抑制上述的基因的表达或阻碍由该基因编码的蛋白质的功能，能够提供与野生型的植物体相比，每个个体的生物量有意义地增产了的植物体。这里，生物量有意义地增产，是指与野生型相比每一个体的总重量在统计上有意义地变大。此时，即使植物体的一部分组织特异性地变大、其他组织与野生型同等，只要植物体整体的总重量大，则判断为生物量增产了。
根据本发明，由于植物体的生物量增产，因而在以植物体全体作为生产目的的情况和以植物体的一部分组织(例如种子等)和/或含有成分作为生产目的的情况的任一情况下，都能实现生产性的提高。例如，在以植物种子所含的油脂作为生产目的的情况下，能够大幅提高每单位耕作面积能回收的油脂量。这里作为油脂，不特别限定，可例示例如，大豆油、芝麻油、橄榄油、椰子油、米糠油、棉籽油、向日葵油、玉米油、红花油和菜籽油等来源于植物的油脂。另外，制造的油脂能够在家庭用途、工业用途中广泛利用，还能够作为生物柴油燃料的原料使用。即，根据本发明，通过利用抑制了上述的基因的表达或阻碍了由该基因编码的蛋白质的功能的植物体，能够低成本地制造上述的家庭用途或工业用途的油脂、生物柴油燃料等。
实施例
以下，通过实施例更详细地说明本发明，但本发明的技术范围不限于以下实施例。
〔实施例1〕
在本实施例中，制作使拟南芥中的At3g09800基因或At4g08520过表达的转化体、和抑制了At3g09800基因或At4g08520的表达的转化体，验证生物量增产效果。
＜构建体的制作＞
为了使At3g09800基因或At4g08520过表达，制作pBI 35S:At3g09800和pBI 35S:At4g08520。具体地，首先，以拟南芥(Arabidopsis thaliana Col-0)的cDNA作为模板，用引物(At3g09800:5’-tccccgggtggtcagtcccttatgtctcctgattcttgtcct-3’(序列号71)、5’-ttgaacgatcggggaaattcgagctctcatgtaagcagacttcttgc-3’(序列号72)和5’-ttggagagaacacgggggactctagaggatcccgggtggtcagtc-3’(序列号73)；At4g08520:5’-tccccgggtggtcagtcccttatggcagggactaatgattct-3’(序列号74)、5’-ttgaacgatcggggaaattcgagctcttatgtaagaagacttctcgc-3’(序列号75)和5’-ttggagagaacacgggggactctagaggatcccgggtggtcagtc-3’(序列号76))进行PCR扩增，分别分离At3g09800和At4g08520的ORF。使用In-Fusion Dry-Down PCR Cloning Kit w/CloningEnhancer(Clontech社制)将这些DNA片段克隆化到用BamHI和SacI切断的pBI121载体中(In-Fusion反应)，得到pBI 35S:At3g09800和pBI 35S:At4g08520。
另一方面，为了抑制At3g09800基因或At4g08520的表达，制作pBI35SS:At3g09800RNAi和pBI 35SS:At4g08520RNAi。具体地，首先以拟南芥(Arabidopsisthaliana Col-0)的cDNA作为模板，用引物(At3g09800:5’-atgtctcctgattcttgtcct-3’(序列号77)和5’-cacctcatgtaagcagacttcttgc-3’(序列号78)；At4g08520:5’-atggcagggactaatgattct-3’(序列号79)和5’-caccttatgtaagaagacttctcgc-3’(序列号80))进行PCR扩增，分别分离At3g09800和At4g08520的ORF，使用pENTR Directional TOPOCloning Kits(Invitrogen社制)，克隆化到pENTR/D-TOPO载体中(pENTR At3g09800和pENTR At4g08520)。使用Gateway LR Clonase II Enzyme Mix(Invitrogen社制)将这些载体中的At3g09800和At4g08520的ORF克隆化到pBI-sense,antisense-GW(INPLANTAINNOVATIONS INC社制)中(LR反应)，得到pBI 35SS:At3g09800RNAi和pBI 35SS:At4g08520RNAi。
＜拟南芥转化体的制作＞
使用floral-dip法(Clough and Bent,1998)将上述4种载体转化到野生型的拟南芥(Col-0)中。T1植物的筛选在包含卡那霉素(终浓度30mg/mL)和羧苄青霉素(终浓度100mg/mL)的MS培养基中进行。然后，使用SuperMix A(サカタ的タネ社制)进行移植。
＜基因的表达抑制的确认＞
对于上述所得转化体和载体对照株，通过实时PCR来分析At3g09800基因或At4g08520基因的表达量。此外，对于这些转化体和载体对照株使用T3种子。
首先，将各株系的T3种子接种于MS培养基(无蔗糖)(用结冷胶(终浓度0.5％)制作)，进行3天的春化处理。然后，以22℃、16小时光条件/8小时暗条件使其生长23～26天(包含春化处理的时间)，将所得的植物体的全部地上部进行取样(每2个个体一个池)。
接着，使用RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN社制)和RNase-Free DNase Set(QIAGEN社制)，进行所取样的植物体的总RNA的提取。然后，使用High-Capacity RNA-to-cDNA kit(ABI社制)以在每20μL反应溶液中2.0μg总RNA的组成进行cDNA合成。然后，使用POWER SYBR GREEN PCR MASTER MIX(Applied Biosystems社制)，按照表3的组成进行实时PCR。
表3
PCR和荧光检测中，使用7000Sequence Detection System(Applied Biosystems社制)，在以下的条件进行检测。
表4
此外，将表达分析中使用的各基因的引物示于表5。
表5
＜结果＞
首先，对于导入了pBI 35SS:At3g09800RNAi或pBI 35SS:At4g08520RNAi的转化体和载体对照株，通过实时PCR来分析At3g09800基因或At4g08520基因的表达量，结果分别示于图1和2。此外，图1和2所示的、At3g09800基因和At4g08520基因的表达量是用At4g27960的表达量标准化而得的值。如图1和2所示那样，在所得的转化体中，明显At3g09800基因和At4g08520基因的表达量分别与载体对照株相比有意义地被抑制。
另外，将对导入了pBI 35S:At3g09800的拟南芥转化体和导入了pBI 35SS:At3g09800RNAi的拟南芥转化体拍摄的照片示于图3，将对载体对照株和导入了pBI 35SS:At4g08520RNAi的拟南芥转化体拍摄的照片示于图4。此外，图3和4的照片是移植后第12天的植物体(播种后第36天)。另外，图3和4中的比例尺表示10mm。如图3和4所示，At3g09800基因的过表达株与导入了pBI121(35S:GUS)的对照株个体大小为同程度，但导入了pBI 35SS:At3g09800RNAi或pBI 35SS:At4g08520RNAi的拟南芥转化体与对照株相比个体大小显著增加。
由以上的结果明确了，通过抑制At3g09800基因或At4g08520基因的表达，植物体的生物量增产。

Claims (5)

1.编码外被体衔接物的ζ亚基的基因或编码网格蛋白衔接物的小亚基即σ亚基的基因用于使植物体的生物量增产的用途，其中，对于植物，抑制编码外被体衔接物的ζ亚基的基因的表达，或者抑制编码网格蛋白衔接物的小亚基即σ亚基的基因的表达，
所述基因编码由序列号2或4所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，通过RNA干涉法而抑制所述基因的表达。
3.使植物体的生物量增产的方法，其中，对于植物，阻碍外被体衔接物的ζ亚基的功能，或者阻碍网格蛋白衔接物的小亚基即σ亚基的功能，
编码所述外被体衔接物的ζ亚基或所述网格蛋白衔接物的小亚基即σ亚基的基因，编码由序列号2或4所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
4.植物体的制造方法，包括：
对于植物，抑制编码外被体衔接物的ζ亚基的基因的表达或阻碍外被体衔接物的ζ亚基的功能，或者抑制编码网格蛋白衔接物的小亚基即σ亚基的基因的表达或阻碍网格蛋白衔接物的小亚基即σ亚基的功能的工序，和
测定上述工序之后的后代植物的生物量，筛选该生物量有意义地提高了的系统的工序，
所述基因编码由序列号2或4所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
5.根据权利要求4所述的制造方法，其特征在于，通过RNA干涉法而抑制所述基因的表达。
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