ES2929770T3 - Proteínas insecticidas - Google Patents

Abstract

Se describen composiciones y métodos para controlar plagas de plantas. En particular, se proporcionan proteínas insecticidas novedosas que tienen toxicidad sobre plagas de insectos coleópteros y/o lepidópteros. También se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican las nuevas proteínas insecticidas. También se describen métodos para preparar las proteínas insecticidas y métodos para usar las proteínas insecticidas y los ácidos nucleicos que codifican las proteínas insecticidas de la invención, por ejemplo, en plantas transgénicas para conferir protección contra daños por insectos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas insecticidas

LISTADO DE SECUENCIAS

Se proporciona un Listado de secuencias en formato de texto ASCII, presentado bajo 37 C.F.R. § 1.821, titulado "8ll51_ST25.txt", 23 kilobytes en tamaño, generado el 14 de septiembre de 2017 y presentado vía EFS-Web, en lugar de una copia en papel. Este Listado de Secuencias se incorpora con ello como referencia en la memoria descriptiva de sus divulgaciones.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a los campos de la ingeniería de proteínas, la biología molecular de las plantas y el control de plagas. Más particularmente, la invención se refiere a una novedosa proteína y a sus variantes que tienen actividad insecticida, a ácidos nucleicos cuya expresión da como resultado las proteínas insecticidas, y a métodos de preparación y métodos de uso de las proteínas insecticidas y ácidos nucleicos correspondientes para controlar insectos.

ANTECEDENTES

Las plagas de insectos son una causa importante de pérdidas de cultivos. En los EE. UU. solo, cada año se pierden billones de dólares debido a la infestación por diversos géneros de insectos. Además de las pérdidas en los cultivos de campo, las plagas de insectos también son una carga para los cultivadores de verduras y frutas, para los productores de flores ornamentales, y son una molestia para los jardineros y propietarios.

Las especies de gusano de la raíz del maíz se consideran las plagas de maíz más destructoras. En los Estados Unidos, las tres especies importantes son Diabrotica virgifera virgifera, el gusano occidental de la raíz del maíz, D. longicornis barberi, el gusano del norte de la raíz del maíz y D. undecimpunctata howardi, el gusano del sur de la raíz del maíz. Solo los gusanos occidental y del norte de la raíz del maíz son considerados plagas primarias del maíz en el cinturón del maíz de EE. UU. Además, una plaga importante de gusano de la raíz del maíz en el sur de EE. UU. es el gusano mexicano de la raíz del maíz, Diabrotica virgifera zeae. Las larvas del gusano de la raíz del maíz causan el daño a las plantas del maíz más sustancial alimentándose casi exclusivamente de las raíces de maíz. Se ha mostrado que esta lesión aumenta el encamado de las plantas, reduciendo el rendimiento de grano y el rendimiento vegetativo, así como alterando el contenido de nutrientes del grano. La alimentación de las larvas también provoca efectos indirectos sobre el maíz por abertura de avenidas a través de las raíces para infecciones bacterianas y fúngicas que conducen a enfermedades de podredumbre de las raíces y del tallo. Los gusanos adultos de la raíz del maíz son activos en maizales a finales del verano, donde se alimentan de mazorcas, sedas y polen, interfiriendo así con la polinización normal.

Los gusanos de la raíz del maíz se controlan principalmente por aplicaciones intensivas de pesticidas químicos, que son activas mediante la inhibición del crecimiento de insectos, la prevención de la alimentación o reproducción de insectos, o provocan la muerte. Por lo tanto, se puede alcanzar el buen control de los gusanos de la raíz del maíz, pero estos productos químicos pueden algunas veces también afectar a otros organismos beneficiosos. Otro problema resultante del uso generalizado de los pesticidas químicos es la aparición de variedades de insectos resistentes. Otro problema más es debido al hecho de que las larvas del gusano de la raíz del maíz se alimentan bajo tierra, lo que dificulta aplicar tratamientos de rescate de insecticidas. Por lo tanto, la mayoría de las aplicaciones insecticidas se hacen profilácticamente en el momento de la siembra. Esta práctica da como resultado una gran carga medioambiental. Ésta ha sido aliviada parcialmente por diversas prácticas de gestión agrícola, pero existe una necesidad cada vez mayor de mecanismos alternativos de control de plagas.

Se han aplicado agentes de control de plagas biológicos, tales como las cepas de Bacillus thuringiensis (Bt) que expresan toxinas pesticidas como 5-endotoxinas (delta-endotoxinas; también denominadas toxinas cristal o proteínas Cry), a plantas de cultivo con resultados satisfactorios contra plagas de insectos. Las 5-endotoxinas son proteínas mantenidas dentro de una matriz cristalina que son conocidas por poseer actividad insecticida cuando son ingeridas por ciertos insectos. Se han expresado varias proteínas nativas Cry de Bacillus thuringiensis, o proteínas Cry manipuladas, en plantas de cultivo transgénicas y explotado comercialmente para controlar ciertas plagas de insectos lepidópteros y coleópteros. Por ejemplo, a partir de 2003, están disponibles comercialmente en los EE. UU. híbridos de maíz transgénico que controlan el gusano de la raíz del maíz expresando una proteína Cry3Bb1, Cry34Ab1/Cry35Ab1 o Cry3A (mCry3A) o Cry3Ab (eCry3.1Ab) modificada.

Aunque se ha mostrado que el uso de plantas transgénicas que expresan proteínas Cry es extremadamente eficaz, se conocen plagas de insectos que tienen ahora resistencia contra las proteínas Cry expresadas en ciertas plantas transgénicas. Por lo tanto, sigue existiendo una necesidad de identificar agentes de control de plagas nuevos y eficaces que proporcionen un beneficio económico a los agricultores y que sean medioambientalmente aceptables. Se necesitan particularmente proteínas que sean tóxicas para especies de Diabrotica, una plaga importante del maíz, que tenga un modo de acción diferente de los productos de control de insectos existentes como una forma de mitigar el desarrollo de resistencia. Además, se desea la administración de agentes de control de insectos mediante productos que minimizan la carga sobre el entorno, como mediante plantas transgénicas.

El documento de la base de datos UniParc «UniParc-UPI000318FC09» y «UniParc-UPI000848B53» desvelan polipéptidos. Algunas proteínas insecticidas se desvelan en los documentos WO2016/105696, WO2014/047505, WO2013/192256, WO2014/047511, US2016/230186, US2014/283208, US2012/278954 y algunas proteínas que contienen dominios de perforina se desvelan en el documento de la base de datos UNIPROTKB "Solitalea canadensis (cepa ATCC29591/DSM3403/NBRC15130/NCIMB12057/USAM 9D)(Flexibacter canadensis) MAC/ proteína que contiene dominio de perforina.

SUMARIO

En vista de estas necesidades, la presente invención proporciona un casete de expresión que comprende un promotor operativamente unido a una molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica proteínas insecticidas, concretamente HmassCRW, y proteínas que son sustancialmente idénticas a HmassCRW y sus variantes. Las proteínas tienen toxicidad para el gusano de la raíz del maíz (Diabrotica spp). Las proteínas también pueden tener toxicidad para otros coleópteros y/o para lepidópteros. También se desvelan moléculas de ácidos nucleicos que codifican HmassCRW o sus variantes, sus complementos, o que son sustancialmente idénticas a HmassCRW y sus variantes.

También se incluyen en la invención vectores que contienen dichos ácidos nucleicos recombinantes (o complementarios a los mismos); una planta o microorganismo que incluye y permite la expresión de dichos ácidos nucleicos; plantas transformadas con dichos ácidos nucleicos, por ejemplo plantas de maíz transgénico; la descendencia de dichas plantas que contienen los ácidos nucleicos establemente incorporados, y/o las semillas de dichas plantas y dicha descendencia. También se desvelan métodos de cultivo para introducir un transgén que comprende una molécula de ácido nucleico de la invención en una planta de descendencia y en diversos germoplasmas.

También se desvelan composiciones y formulaciones que contienen HmassCRW o sus variantes, que son capaces de inhibir la capacidad de las plagas de insectos para sobrevivir, crecer y/o reproducirse, o de daño o pérdida limitante relacionado con los insectos a las plantas de cultivo, por ejemplo, aplicando HmassCRW o sus variantes como parte de composiciones o formulaciones a áreas o plantas infestadas con insectos, o a tratar profilácticamente áreas o plantas susceptibles a los insectos para conferir protección contra las plagas de insectos.

Se desvela un método de preparación de HmassCRW o sus variantes y métodos de uso de los ácidos nucleicos, por ejemplo en microorganismos para controlar insectos o en plantas transgénicas para conferir protección del daño por los insectos.

Las proteínas descritas en el presente documento son activas contra insectos. Por ejemplo, en realizaciones, las proteínas se pueden usar para controlar plagas de insectos económicamente importantes, que incluyen insectos coleópteros, tales como el gusano occidental de la raíz del maíz (WCR), el gusano del norte de la raíz del maíz (NCR), el gusano del sur de la raíz del maíz (SCR) y/o el gusano mexicano de la raíz del maíz (D. virgifera zeae). Las proteínas insecticidas se pueden usar individualmente o en combinación con otras estrategias de control de insectos para conferir una eficiencia del control de plagas potenciada contra la misma plaga de insectos y/o para aumentar el espectro de insectos diana con impacto medioambiental mínimo.

Otros aspectos y ventajas de la presente invención serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de un estudio de la siguiente descripción de la invención

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS EN EL LISTADO DE SECUENCIAS

SEQ ID NO: 1 es la secuencia de nucleótidos nativa de HmassCRW.

SEQ ID NO: 2 es la secuencia de nucleótidos optimizada para E. co lide HmassCRW

SEQ ID NO: 3 es la secuencia de nucleótidos optimizada para codones del maíz de HmassCRW.

SEQ ID NO: 4 es la secuencia de aminoácidos de HmassCRW.

SEQ ID NO: 5 es un fragmento de la secuencia de aminoácidos de HmassCRW.

SEQ ID NO: 6 es una secuencia de nucleótidos nativa alternativa de HmassCRW.

SEQ ID NO: 7 es una secuencia de nucleótidos optimizada para E. coli de SEQ ID NO: 6.

SEQ ID NO: 8 es una secuencia de nucleótidos optimizada para maíz de SEQ ID NO: 6.

SEQ ID NO: 9 es la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

DEFINICIONES

Por claridad, ciertos términos usados en la memoria descriptiva se definen y presentan del siguiente modo:

"Actividad" de las proteínas insecticidas significa que las proteínas insecticidas funcionan de agentes de control de insectos activos por vía oral, tienen un efecto tóxico y/o son capaces de alterar o disuadir la alimentación de los insectos, que puede o puede no provocar la muerte del insecto. Cuando una proteína insecticida ef se suministra al insecto, el resultado es normalmente la muerte del insecto, o el insecto no se alimenta de la fuente que hace que la proteína insecticida esté disponible para el insecto. "Pesticida" se define como una actividad biológica tóxica capaz de controlar una plaga, tal como un insecto, nematodo, hongo, bacteria o virus, preferentemente matándolos o destruyéndolos. "Insecticida" se define como una actividad biológica tóxica capaz de controlar insectos, preferentemente matándolos. Un "agente pesticida" es un agente que tiene actividad pesticida. Un "agente insecticida" es un agente que tiene actividad insecticida.

"Asociados a / operativamente unidos a" se refiere a dos ácidos nucleicos que están relacionados físicamente o funcionalmente. Por ejemplo, se dice que una secuencia de ADN promotora o reguladora está "asociada a" una secuencia de ADN que codifica ARN o una proteína si las dos secuencias están unidas operativamente, o situadas de forma que la secuencia de ADN reguladora afecte el nivel de expresión de la secuencia de ADN codificante o estructural.

Una "secuencia codificante" es una secuencia de ácido nucleico que se transcribe en forma de ARN tal como ARNm, ARNr, ARNt, ARNnp, ARN sentido o ARN antisentido. Preferentemente, el ARN se traduce posteriormente en un organismo para producir una proteína.

"Controlar" insectos significa inhibir, mediante un efecto tóxico, la capacidad de las plagas de insectos para sobrevivir, crecer, alimentarse y/o reproducirse, o para limitar el daño o la pérdida relacionada con los insectos en plantas de cultivo. "Controlar" insectos puede o puede no significar matar los insectos, aunque significa preferentemente matar los insectos.

"Suministrar" una proteína insecticida significa que la proteína insecticida se pone en contacto con un insecto, dando como resultado un efecto tóxico y el control del insecto. La proteína insecticida se puede administrar de muchas formas reconocidas, por ejemplo, a través de una planta transgénica que expresa la proteína insecticida, composición (composiciones) de proteína formulada, composición (composiciones) de proteína pulverizable, una matriz de cebo, o cualquier otro sistema de administración de toxinas reconocido en la técnica.

"Cantidad de control de insectos eficaz" significa aquella concentración de una proteína insecticida que inhibe, mediante un efecto tóxico, la capacidad de los insectos para sobrevivir, crecer, alimentarse y/o reproducirse, o para limitar el daño o la pérdida relacionada con los insectos en plantas de cultivo. "Cantidad de control de insectos eficaz" puede o puede no significar matar los insectos, aunque significa preferentemente matar los insectos.

"Casete de expresión", como se usa en el presente documento, significa una secuencia de ácido nucleico capaz de dirigir la expresión de una secuencia de nucleótidos particular en una célula hospedadora apropiada, que comprende un promotor operativamente unido a la secuencia de nucleótidos de interés que está operativamente unida a señales de terminación. También comprende normalmente las secuencias requeridas para la traducción correcta de la secuencia de nucleótidos. El casete de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos de interés puede tener al menos uno de sus componentes heterólogos con respecto a al menos uno de sus otros componentes. El casete de expresión también puede ser de origen natural, pero que se haya obtenido en una forma recombinante útil para la expresión heteróloga. Normalmente, sin embargo, el casete de expresión es heterólogo con respecto al hospedador, es decir, la secuencia de ácido nucleico particular del casete de expresión no ocurre naturalmente en la célula hospedadora y debe haber sido introducida en la célula hospedadora o un ancestro de la célula hospedadora por un evento de transformación. La expresión de la secuencia de nucleótidos en el casete de expresión puede ser bajo el control de un promotor constitutivo o de un promotor inducible que inicia la transcripción solo cuando la célula hospedadora se expone a algún estímulo externo particular. En el caso de un organismo multicelular, tal como una planta, el promotor también puede ser específico para un tejido, un órgano o una etapa de desarrollo particular.

Un casete de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos de interés puede ser quimérica, que significa que al menos uno de sus componentes es heterólogo con respecto a al menos uno de sus otros componentes. Un casete de expresión también puede ser uno que comprende un promotor nativo que conduce su gen nativo; sin embargo, se ha obtenido en una forma recombinante útil para la expresión heteróloga. Dicho uso de un casete de expresión hace que no se produzca de forma natural en la célula en la que se ha introducido.

Un casete de expresión también puede incluir opcionalmente una región de terminación transcripcional y/o traduccional (es decir, región de terminación) que es funcional en plantas. Está disponible una variedad de terminadores transcripcionales para su uso en casetes de expresión y son responsables de la terminación de la transcripción más allá de la secuencia de nucleótidos heteróloga de interés y la correcta poliadenilación de ARNm. La región de terminación puede ser nativa con la región de iniciación de la transcripción, puede ser nativa con la secuencia de nucleótidos operativamente unida de interés, puede ser nativa con el hospedador de la planta, o puede derivar de otra fuente (es decir, extraña o heteróloga al promotor, la secuencia de nucleótidos de interés, el hospedador de la planta, o cualquier combinación de los mismos). Los terminadores transcripcionales apropiados incluyen, pero no se limitan a, el terminador CAMV 35S, el terminador tml, el terminador de la nopalina sintasa y/o el terminador rbcs E9 del guisante. Estos se pueden usar en tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas. Además, se puede usar un terminador de la transcripción nativo de la secuencia codificante. Se puede usar cualquier terminador disponible conocido por funcionar en plantas en el contexto de la presente invención.

El término "expresión", cuando se usa con referencia a un polinucleótido, tal como un gen, ORF o porción del mismo, o un transgén en plantas, se refiere al proceso de convertir la información genética codificada en un gen en ARN (por ejemplo, ARNm, ARNr, ARNt o ARNnp) mediante "transcripción" del gen (es decir, por la acción enzimática de una ARN polimerasa), y en proteína si procede (por ejemplo, si un gen codifica una proteína), mediante "traducción" de ARNm. La expresión génica se puede regular en muchas etapas en el proceso. Por ejemplo, en el caso de construcciones de ARN antisentido o ARNbc, respectivamente, la expresión se puede referir a la transcripción del ARN antisentido solo o el ARNbc solo. En realizaciones, "expresión" se refiere a la transcripción y acumulación estable de ARN sentido (ARNm) o funcional. "Expresión" también se puede referir a la producción de proteína.

Un "gen" es una región definida que se localiza dentro de un genoma y comprende una secuencia de ácido nucleico codificante y normalmente también comprende otros ácidos nucleicos, principalmente reguladores, responsables del control de la expresión, es decir, la transcripción y la traducción, de la porción codificante. Un gen puede comprender también otras secuencias no traducidas 5' y 3', y secuencias de terminación. Otros elementos que pueden estar presentes son, por ejemplo, los intrones. La secuencia de ácido nucleico reguladora del gen puede no estar normalmente operativamente unida a la secuencia de ácido nucleico asociada como se encuentra en la naturaleza y así sería un gen quimérico.

"Gen de interés" se refiere a cualquier molécula de ácido nucleico que, cuando se transfiere a una planta, confiere a la planta un rasgo deseado, tal como resistencia a antibióticos, resistencia a virus, resistencia a insectos, resistencia a enfermedades o resistencia a otras plagas, tolerancia a herbicidas, tolerancia a estrés abiótico, esterilidad masculina, metabolismo modificado de los ácidos grasos, metabolismo modificado de los hidratos de carbono, valor nutritivo mejorado, rendimiento mejorado en un proceso industrial o capacidad reproductiva alterada. El "gen de interés" también puede ser aquel que se transfiere a las plantas para producir enzimas o metabolitos con valor comercial en la planta.

Una secuencia de ácido nucleico "heteróloga" o molécula de ácido nucleico es una secuencia de ácido nucleico o molécula de ácido nucleico que no se asocia naturalmente a una célula hospedadora en la que se introduce, que incluye múltiples copias que no existen de forma natural de una secuencia de ácido nucleico que existe de forma natural. Una secuencia del ácido nucleico heteróloga o molécula de ácido nucleico puede comprender una secuencia quimérica, tal como un casete de expresión quimérico, donde el promotor y la región codificante derivan de múltiples organismos fuente. La secuencia promotora puede ser una secuencia promotora constitutiva, una secuencia promotora específica de tejido, una secuencia promotora químicamente inducible, una secuencia promotora inducible por herida, una secuencia promotora inducible por estrés, o una secuencia promotora específica de la etapa de desarrollo.

Una secuencia de ácido nucleico "homóloga" es una secuencia de ácido nucleico asociada de forma natural con una célula huésped en la que se introduce.

"Recombinación homóloga" es el intercambio recíproco de fragmentos de ácido nucleico entre moléculas de ácidos nucleicos homólogas.

"Identidad de secuencia" o "identidad en porcentaje" se refiere al grado de similitud entre dos secuencias del ácido nucleico o de proteínas. Para la comparación de secuencias, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia con la que se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia se entran en un ordenador, se designan coordenadas de subsecuencia si fuera necesario, y se designan parámetros del programa de algoritmo de secuencias. Luego, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad de secuencia para la o las secuencias de ensayo en relación con la secuencia de referencia, en función de los parámetros de programa designados. La expresión "sustancialmente idénticas", en el contexto de dos ácidos nucleicos o dos secuencias de aminoácidos, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que tienen al menos aproximadamente 50 % de identidad de nucleótidos o de resto de aminoácidos cuando se comparan y se alinean para máxima correspondencia como se mide usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o por inspección visual. En ciertas realizaciones, secuencias sustancialmente idénticas tienen al menos aproximadamente 60 %, o al menos aproximadamente 70 %, o al menos aproximadamente 80 %, o al menos aproximadamente 85 %, o incluso al menos aproximadamente 90 % o 95 % de identidad de restos de nucleótidos o de aminoácidos. En ciertas realizaciones, existe identidad sustancial a lo largo de una región de las secuencias que tiene al menos aproximadamente 50 restos de longitud, o a lo largo de una región de al menos aproximadamente 100 restos, o las secuencias son sustancialmente idénticas a lo largo de al menos aproximadamente 150 restos. En realizaciones adicionales, las secuencias son sustancialmente idénticas cuando son idénticas a lo largo de la longitud entera de las regiones codificantes.

El alineamiento óptimo de secuencias para la comparación se puede realizar, por ejemplo, por el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), por el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman & Wunsch, J. Biol. Mol. 48: 443 (1970), por el método de búsqueda de similitud de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), por implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o por inspección visual (véase, en general, Ausubel et al., abajo).

Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencias es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). El software para realizar los análisis de BLAST está públicamente disponible del Centro Nacional para información Biotecnológica (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica identificar en primer lugar pares de secuencias de alta puntuación (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que coinciden o satisfacen alguna puntuación T de umbral de valor positivo cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se denomina el umbral de puntuación de palabra vecina (Altschul et al., 1990). Estas coincidencias iniciales de palabras vecinas actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largos que las contengan. Luego, las coincidencias de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada una de las secuencias hasta que se pueda aumentar la puntuación de alineamiento acumulativa. Las puntuaciones acumulativas se calculan utilizando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos coincidentes; siempre > 0) y N (puntuación de penalización para residuos de emparejamiento erróneo; siempre < 0). Para las secuencias de aminoácidos, se utiliza una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de los aciertos de palabras en cada una de las direcciones se detiene cuando la puntuación de alineamiento acumulativa cae en la cantidad X de su valor máximo alcanzado, la puntuación acumulativa llega a cero o por debajo debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuos de puntuación negativa, o se alcanza el final de cualquiera de las secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, un corte de 100, M = 5, N = - 4 y una comparación de ambas cadenas. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una esperanza (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)).

Además de calcular el porcentaje de identidad de secuencia, el algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993)). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad mediante la cual se produzca una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos por casualidad. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico de prueba se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación de la secuencia de ácido nucleico de prueba con la secuencial de ácido nucleico de referencia es inferior a aproximadamente 0,1, más preferentemente inferior a aproximadamente 0,01, y lo más preferentemente inferior a aproximadamente 0,001.

Otro programa informático ampliamente usado y aceptado para realizar los alineamientos de secuencias es CLUSTALW v1.6 (Thompson, et al. Nuc. Acids Res., 22: 4673-4680, 1994). El número de bases o aminoácidos de correspondencia se divide entre el número total de bases o aminoácidos, y se multiplica por 100 para obtener un porcentaje de identidad. Por ejemplo, si dos secuencias de 580 pares de bases tuvieran 145 bases de correspondencia, serían el 25 por ciento idénticas. Si las dos secuencias comparadas son de diferentes longitudes, el número de correspondencias se divide entre la más corta de las dos longitudes. Por ejemplo, si hubo 100 aminoácidos de correspondencia entre proteínas de 200 y 400 aminoácidos, son el 50 por ciento idénticas con respecto a la secuencia más corta. Si la secuencia más corta es inferior a 150 bases o 50 aminoácidos de longitud, el número de correspondencias se divide entre 150 (para las bases de ácidos nucleicos) o 50 (para aminoácidos), y se multiplica por 100 para obtener un porcentaje de identidad.

Otra indicación de que dos ácidos nucleicos son sustancialmente idénticos es que las dos moléculas se hibridan entre sí en condiciones rigurosas. La expresión "hibridar específicamente con" se refiere a la unión, duplexado o hibridación de una molécula solo con una secuencia de nucleótidos particular en condiciones rigurosas cuando esa secuencia está presente en una mezcla compleja (por ejemplo, ADN o ARN total celular). "Se une(n) sustancialmente" se refiere a hibridación complementaria entre un ácido nucleico de sonda y un ácido nucleico diana y engloba discrepancias menores que se pueden acomodar reduciendo la rigurosidad de los medios de hibridación para lograr la detección deseada de la secuencia del ácido nucleico diana.

Las "condiciones de hibridación rigurosas" y "condiciones de lavado de hibridación rigurosas", en el contexto de los experimentos de hibridación de ácidos nucleicos, tales como las hibridaciones de Southern y Northern, dependen de la secuencia y son diferentes para parámetros ambientales diferentes. Las secuencias más largas hibridan específicamente a temperaturas más elevadas. Una guía extensa para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes parte I capítulo 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays" Elsevier, Nueva York. En general, se seleccionan condiciones de hibridación y de lavado altamente rigurosas para ser aproximadamente 5 °C inferiores al punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. Normalmente, en "condiciones rigurosas", una sonda se hibridará con su subsecuencia diana, pero no con otras secuencias.

La Tm es la temperatura (a un pH y una fuerza iónica definidos) a la que el 50% de la secuencia diana se hibrida con una sonda perfectamente coincidente. Se seleccionan condiciones muy estrictas para que sean iguales a la Tm para una sonda particular. Un ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas para la hibridación de ácidos nucleicos complementarios que tienen más de 100 residuos complementarios sobre un filtro en una transferencia Southern o Northern es el 50 % de formamida con 1 mg de heparina a 42 °C, siendo la hibridación llevada a cabo durante la noche. Un ejemplo de condiciones de lavado altamente rigurosas es NaCl 0,15 M a 72 °C durante aproximadamente 15 minutos. Un ejemplo de condiciones de lavado rigurosas es un lavado con 0,2x SSC a 65 °C durante 15 minutos (véase, Sambrook, abajo, para una descripción de tampón SSC). A menudo, un lavado de rigurosidad alta va precedido por un lavado de rigurosidad baja para eliminar la señal de fondo de la sonda. Un ejemplo de lavado de rigurosidad media para un dúplex de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos, es 1 x SSC a 45 °C durante 15 minutos. Un ejemplo de lavado de baja rigurosidad para un dúplex de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos, es 4-6x SSC a 40 °C durante 15 minutos. Para sondas cortas (por ejemplo, aproximadamente 10 a 50 nucleótidos), las condiciones rigurosas normalmente implican concentraciones de sales inferiores a ion Na aproximadamente 1,0 M, normalmente una concentración de ion Na aproximadamente 0,01 a 1,0 M (u otras sales) a pH 7,0 a 8,3, y la temperatura normalmente es al menos aproximadamente 30 °C. Las condiciones rigurosas también se pueden lograr con la adición de agentes desestabilizantes, tales como formamida. En general, una relación entre la señal y el ruido de 2x (o superior) respecto a la observada para una sonda no relacionada en el ensayo de hibridación particular indica la detección de una hibridación específica. Los ácidos nucleicos que no hibridan entre sí en condiciones rigurosas siguen siendo sustancialmente idénticos si las proteínas que codifican son sustancialmente idénticas. Esto ocurre, p. ej., cuando se crea una copia de un ácido nucleico utilizando la degeneración máxima del codón permitida por el código genético.

Lo siguiente son ejemplos de conjuntos de condiciones de hibridación/ lavado que se pueden usar para clonar secuencias de nucleótidos homólogas que son sustancialmente idénticas a la secuencias de nucleótidos de referencia de la presente invención: una secuencia de nucleótidos de referencia se hibrida preferentemente con la secuencia de nucleótidos de referencia en 7 % de dodecilsulfato de sodio (SDS), NaPO40,5 M, EDTA 1 mM a 50 °C con lavado en 2X SSC, 0,1 % de SDS a 50 °C, más deseablemente en 7 % de dodecilsulfato de sodio (SDS), NaPO40,5 M, EDTA 1 mM a 50 °C con lavado en 1X SSC, 0,1 % de SDS a 50 °C, más deseablemente todavía en 7 % de dodecilsulfato de sodio (SDS), NaPO40,5 M, EDTA 1 mM a 50 °C con lavado en 0,5X SSC, 0,1 % de SDS a 50 °C, preferentemente en 7 % de dodecilsulfato de sodio (SDS), NaPO40,5 M, EDTA 1 mM a 50 °C con lavado en 0,1X SSC, 0,1 % de SDS a 50 °C, más preferentemente en 7 % de dodecilsulfato de sodio (SDS), NaPO40,5 M, EDTA 1 mM a 50 °C con lavado en 0,1X SSC, 0,1 % de SDS a 65 °C.

Una indicación adicional de que dos ácidos nucleicos o proteínas sean sustancialmente idénticos es que la proteína codificada por el primer ácido nucleico reacciona inmunológicamente de forma cruzada con, o se une específicamente a, la proteína codificada por el segundo ácido nucleico. Por lo tanto, una proteína es normalmente sustancialmente idéntica a una segunda proteína, por ejemplo, donde las dos proteínas se diferencian solo por sustituciones conservativas.

Una secuencia de ácido nucleico es "isocodificante con" una secuencia de ácido nucleico de referencia cuando la secuencia de ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico de referencia.

Una molécula de ácido nucleico "aislada" o una toxina aislada es una molécula de ácido nucleico o toxina que, por la mano del hombre, existe aparte de su entorno nativo y, por lo tanto, no es un producto de la naturaleza. Una molécula de ácido nucleico aislada o toxina puede existir en una forma purificada o puede existir en un entorno no nativo, tal como, por ejemplo sin limitación, una célula microbiana recombinante, célula de planta, tejido de planta, o planta.

Una "molécula de ácido nucleico" o "secuencia de ácido nucleico" es un segmento de ADN o ARN mono- o bicatenario que se puede aislar de cualquier fuente. En el contexto de la presente invención, la molécula de ácido nucleico normalmente es un segmento de ADN. En algunas realizaciones, las moléculas de ácidos nucleicos de la invención son moléculas de ácidos nucleicos aisladas.

Los términos "proteína", "péptido" y "polipéptido" se usan indistintamente en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, una secuencia "optimizada en codones" significa la secuencia de nucleótidos de un polinucleótido recombinante, transgénico o sintético, en donde los codones se eligen para reflejar la preferencia codónica particular que puede tener una célula hospedadora. Esto se hace de tal forma que se conserve la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por el polinucleótido optimizado en codones. En ciertas realizaciones, la secuencia de nucleótidos de la construcción de ADN recombinante incluye una secuencia que se ha optimizado en codones para la célula (por ejemplo, una célula de animal, planta o fúngica) en la que la construcción se va a expresar. Por ejemplo, una construcción a expresar en una célula de planta puede tener toda o parte de su secuencia (por ejemplo, el primer elemento de supresión génica o el elemento de supresión génica) optimizada en codones para la expresión en una planta. Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. N.° 6.121.014.

Una "planta" es cualquier planta en cualquier etapa de desarrollo, particularmente una planta de semilla.

Una "célula vegetal" es una unidad estructural y fisiológica de una planta, que comprende un protoplasto y una pared celular. La célula de planta puede estar en forma de una célula individual aislada o una célula cultivada, o como una parte de una unidad organizada superior, tal como, por ejemplo, tejido de planta, un órgano de planta, o una planta completa.

"Cultivo celular de planta" significa cultivos de unidades de planta tales como, por ejemplo, protoplastos, células de cultivo celular, células en tejidos de planta, polen, tubos de polen, óvulos, sacos embrionarios, cigotos y embriones en diversas etapas de desarrollo.

"Material vegetal" se refiere a hojas, tallos, raíces, flores o partes de la flor, frutos, polen, óvulos, cigotos, semillas, esquejes, cultivos celulares o tisulares, o cualquier otra parte o producto de una planta.

Un "órgano de una planta" es una parte distinta y visiblemente estructurada y diferenciada de una planta, tal como una raíz, un tallo, una hoja, una yema floral o un embrión.

"Tejido vegetal", como se usa en este documento, se refiere a un grupo de células vegetales organizadas en una unidad estructural y funcional. Se incluye cualquier tejido de una planta in planta o en cultivo. Esta expresión incluye, aunque sin limitación, plantas enteras, órganos vegetales, semillas de plantas, histocultivo y cualquier grupo de células vegetales organizadas en unidades estructurales y/o funcionales. El uso de esta expresión junto con, o en ausencia de, cualquier tipo específico de tejido vegetal, como los enumerados anteriormente o que esté contemplado de otra manera por esta definición, no pretende ser exclusivo de ningún otro tipo de tejido vegetal.

Un "promotor" es una secuencia de ADN sin traducir en la dirección 5' de la región codificante que contiene el sitio de unión para la ARN polimerasa e inicia la transcripción del ADN. La región promotora también puede incluir otros elementos que actúan de reguladores de la expresión génica.

"Elementos reguladores" se refiere a secuencias que participan en el control de la expresión de una secuencia de nucleótidos. Los elementos reguladores comprenden un promotor operativamente unido a la secuencia de nucleótidos de interés y señales de terminación. También engloban normalmente secuencias requeridas para la apropiada traducción de la secuencia de nucleótidos.

La "transformación" es un proceso para introducir ácidos nucleicos heterólogos en una célula u organismo huésped. En realizaciones particulares, la "transformación" significa la integración estable de una molécula de ADN en el genoma (nuclear o plástido) de un organismo de interés. En algunas realizaciones particulares, la introducción de una planta, parte de planta y/o célula de planta es por transformación mediada por bacterias, transformación por bombardeo de partículas, transformación mediada por fosfato de calcio, transformación mediada por ciclodextrina, electroporación, transformación mediada por liposomas, transformación mediada por nanopartículas, transformación mediada por polímero, suministro de ácido nucleico mediado por virus, suministro de ácido nucleico mediado por fibras cortas monocristalinas, microinyección, sonicación, infiltración, transformación mediada por polietilenglicol, transformación por protoplastos, o cualquier otro mecanismo eléctrico, químico, físico y/o biológico que da como resultado la introducción de ácido nucleico en la planta, parte de planta y/o célula de la misma, o una combinación de los mismos.

Procedimientos para transformar plantas son bien conocidos y rutinarios en la técnica y se describen a lo largo de la bibliografía. Los ejemplos no limitantes de métodos para la transformación de plantas incluyen transformación por suministro de ácidos nucleicos mediado por bacterias (por ejemplo, por bacterias del género Agrobacterium), suministro de ácidos nucleicos mediado por virus, suministro de ácidos nucleicos mediado por fibras cortas monocristalinas de carburo de silicio o ácido nucleico, suministro de ácidos nucleicos mediado por liposomas, microinyección, bombardeo con micropartículas, transformación mediada por fosfato cálcico, transformación mediada por ciclodextrina, electroporación, transformación mediada por nanopartículas, sonicación, infiltración, captación de ácidos nucleicos mediada por PEG, así como cualquier otro mecanismo eléctrico, químico, físico (mecánico) y/o biológico que da como resultado la introducción de ácido nucleico en la célula de planta, que incluye cualquier combinación de los mismos. Las pautas generales para diversos métodos de transformación de plantas conocidos en la técnica incluyen Miki et al. ("Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants" en Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. y Thompson, J. E., Eds. (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993), páginas 67-88) y Rakowoczy-Trojanowska (2002, Cell Mol Biol Lett 7:849-858 (2002)).

"Transformado/transgénico/recombinante" se refieren a un organismo huésped, tal como una bacteria o una planta, en el cual se ha introducido una molécula de ácido nucleico heterólogo. La molécula de ácido nucleico se puede integrar de forma estable en el genoma del huésped o la molécula de ácido nucleico también puede estar presente como una molécula extracromosómica. Tal molécula extracromosómica puede autorreplicarse. Se sobreentenderá que las células, los tejidos o las plantas transformados no abarcan únicamente el producto final de un proceso de transformación, sino también la progenie transgénica de éste. Un huésped "no transformado", "no transgénico" o "no recombinante" se refiere a un organismo natural, p. ej., una bacteria o planta, que no contiene la molécula de ácido nucleico heterólogo.

Los nucleótidos se indican por sus bases por las siguientes abreviaturas convencionales: adenina (A), citosina (C), timina (T), y guanina (G). Los aminoácidos son asimismo indicados por las siguientes abreviaturas convencionales: alanina (Ala; A), arginina (Arg; R), asparagina (Asn; N), ácido aspártico (Asp; D), cisteína (Cys; C), glutamina (Gln; Q), ácido glutámico (Glu; E), glicina (Gly; G), histidina (His; H), isoleucina (Ile; 1), leucina (Leu; L), lisina (Lys; K), metionina (Met; M), fenilalanina (Phe; F), prolina (Pro; P), serina (Ser; S), treonina (Thr; T), triptófano (Trp; W), tirosina (Tyr; Y) y valina (Val; V).

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Se desvelan proteínas insecticidas que tienen actividad contra coleópteros, por ejemplo, Diabrotica virgifera virgifera (gusano occidental de la raíz del maíz; WCR), Diabrotica barberi (gusano del norte de la raíz del maíz; NCR) y/o Diabrotica undecimpunctata howardi (gusano del sur de la raíz del maíz; SCR) y/u otras especies de Diabrotica que incluyen Diabrotica virgifera zeae (gusano mexicano de la raíz del maíz) y/o escarabajo de la patata de Colorado. La proteína insecticida desvelada en el presente documento puede tener actividad contra especies de lepidópteros. La presente invención se refiere a ácidos nucleicos cuya expresión da como resultado proteínas insecticidas, y a la preparación y al uso de las proteínas insecticidas para controlar plagas de insectos. En realizaciones, la expresión de los ácidos nucleicos da como resultado proteínas insecticidas que se pueden usar para controlar insectos coleópteros, tales como gusano occidental, del norte y/o del sur de la raíz del maíz, particularmente cuando se expresan en una planta transgénica, tal como una planta de maíz transgénica.

La presente invención engloba además una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína insecticida. La secuencia de nucleótidos se puede optimizar para la expresión en bacterias, tal como Escherichia coli, o para la expresión en una planta, tal como Zea mays. Una secuencia de nucleótidos optimizada para la expresión en un organismo heterólogo, tal como una especie de bacteria diferente de donde se originó o una planta, no existe de forma natural. En un aspecto de esta realización, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2, 3. Las enseñanzas específicamente ejemplificadas de métodos para preparar las moléculas de ácidos nucleicos que codifican las proteínas insecticidas se pueden encontrar en los ejemplos de la presente solicitud. Los expertos en la técnica reconocerán que las modificaciones se pueden hacer a los métodos ejemplificados para preparar las proteínas insecticidas

Un experto reconocería que un transgén para uso comercial, tal como una molécula de ácido nucleico que comprende cualquiera de SEQ ID NO: 1 a 3, puede tener modificaciones relativamente menores a la secuencia de ácido nucleico para que cumpla las normas reglamentarias gubernamentales. Dichas modificaciones no afectarían la función de la molécula resultante, que sería sustancialmente idéntica a SEQ ID NO: 1 a 3. Un experto reconocería que la molécula de ácido nucleico modificada sería esencialmente la misma que la molécula de partida, y está englobada por la presente invención.

La presente invención también engloba una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2, 3.

La presente invención engloba además un casete de expresión que comprende un promotor operativamente unido a una secuencia de nucleótidos heteróloga que comprende: (a) una secuencia de nucleótidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 1 a 3; (b) una secuencia de nucleótidos que es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o es 100 % idéntica a la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 1 a 3; (c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido, en donde la secuencia de aminoácidos del polipéptido comprende SEQ ID NO: 4, y tiene actividad de control de insectos; (d) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido, en donde la secuencia de aminoácidos del polipéptido es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o es 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; o (e) una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de (a) a (d) anteriores. El casete de expresión comprende un promotor operativamente unido a una secuencia de nucleótidos heteróloga y no existe de forma natural.

La presente invención también engloba vectores recombinantes o construcciones, que también se pueden denominar vectores o construcciones, que comprenden los casetes de expresión y/o las moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención. En dichos vectores, los ácidos nucleicos están preferentemente en casetes de expresión que comprenden elementos reguladores para la expresión de las moléculas de nucleótido en una célula hospedadora capaz de expresar las moléculas de nucleótido. Dichos elementos reguladores comprenden normalmente señales promotoras y de terminación y preferentemente también comprenden elementos que permiten la eficiente traducción de polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos de la presente invención. Los vectores que comprenden los ácidos nucleicos pueden ser capaces de replicación en células hospedadoras particulares, preferentemente como moléculas extracromosómicas, y se usan, por lo tanto, para amplificar los ácidos nucleicos de la presente invención en las células hospedadoras. La presente invención también engloba una célula hospedadora que contiene un casete de expresión o una molécula de ácido nucleico de la invención. En una realización, las células hospedadoras para dichos vectores son microorganismos, tales como bacterias, en particular Bacillus thuringiensis o E. coli, o tales como hongos tales como levadura. En otra realización, las células hospedadoras para dichos vectores recombinantes son endófitas o epífitas. En otra realización más, dichos vectores son vectores víricos y se usan para la replicación de las secuencias de nucleótidos en células hospedadoras particulares, por ejemplo células de insecto o células vegetales. Los vectores recombinantes también se usan para la transformación de moléculas de nucleótidos de la presente invención en células hospedadoras, por lo que las moléculas de nucleótidos se integran establemente en el ADN de un hospedador transgénico. En una realización, el hospedador transgénico es una planta, por ejemplo una planta monocotiledónea, tal como una planta de maíz. En realizaciones, la planta hospedadora transgénica es una planta dicotiledónea, tal como una planta de soja o una planta de algodón.

En otra realización, al menos uno de los ácidos nucleicos de la invención se inserta en un casete de expresión apropiado, que comprende un promotor y señal de terminación. La expresión del ácido nucleico puede ser constitutiva, o se puede usar un promotor inducible que responde a diversos tipos de estímulos para iniciar la transcripción. En otra realización, la célula en la que se expresa la proteína insecticida ef es un microorganismo, tal como un virus, una bacteria o un hongo. En otra realización más, un virus, tal como un baculovirus, contiene un ácido nucleico de la invención en su genoma y expresa grandes cantidades de la proteína insecticida correspondiente después de la infección de células eucariotas apropiadas que son adecuadas para la replicación vírica y la expresión del ácido nucleico. La proteína insecticida así producida se usa como agente insecticida. Alternativamente, los baculovirus manipulados para incluir el ácido nucleico se usan para infectar insectos in vivo y matarlos, ya sea por expresión de la toxina insecticida o por una combinación de infección vírica y expresión de la toxina insecticida. En una realización adicional, la presente invención también engloba un método de producción de un polipéptido con actividad insecticida, que comprende cultivar la célula hospedadora en condiciones en las que se expresa la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido.

Las células bacterianas también son hospedadores para la expresión de los ácidos nucleicos de la invención. En una realización, se usan bacterias simbióticas no patógenas, que son capaces de vivir y replicarse dentro de tejidos de planta, las denominadas endófitas, o bacterias simbióticas no patógenas, que son capaces de colonizar la filosfera o la rizosfera, las denominadas epífitas. Dichas bacterias incluyen bacterias de los géneros Agrobacterium, Alcaligenes, Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Clavibacter, Enterobacter, Erwinia, Flavobacter, Klebsiella, Pseudomonas, Rhizobium, Serratia, Streptomyces y Xanthomonas. Los grupos simbióticos, tales como Trichoderma y Gliocladium, también son posibles hospedadores para la expresión de los ácidos nucleicos inventivos para el mismo fin.

Las técnicas para estas manipulaciones genéticas son específicas para los diferentes hospedadores disponibles y se conocen en la técnica. Por ejemplo, los vectores de expresión pKK223-3 y pKK223-2 se pueden usar para expresar genes heterólogos en E. coli, ya sea en fusión transcripcional o traduccional, detrás del promotor tac o trc. Para la expresión de operones que codifican múltiples ORF, el procedimiento más simple es insertar el operón en un vector, tal como pKK223- 3 en fusión transcripcional, lo que permite que se use el sitio de unión al ribosoma relacionado de los genes heterólogos. Las técnicas para la expresión en exceso en especies Gram-positivas, tales como Bacillus, también se conocen en la técnica y se pueden usar en el contexto de la presente invención (Quax et al. En: Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics, Eds. Baltz et al., American Society for Microbiology, Washington (1993)).

Los sistemas alternos para la expresión en exceso se basan en, por ejemplo, vectores de levadura e incluyen el uso de Pichia, Sacaromyces y Kluyveromyces (Sreekrishna, en: Industrial microorganisms: basic and applied molecular genetics, Baltz, Hegeman, and Skatrud eds., American Society for Microbiology, Washington (1993); Dequin & Barre, Biotechnology L2:173- 177 (1994); van den Berg et al., Biotechnology 8:135-139 (1990)).

Las proteínas insecticidas tienen actividad de control de insectos cuando se prueban contra plagas de insectos en bioensayos. En una realización, las proteínas insecticidas son activas contra insectos coleópteros y/o lepidópteros. Los insectos en el orden Lepidoptera incluyen, sin limitación, cualquier insecto conocido ahora o identificado después que se clasifica como lepidóptero, que incluye las especies de insecto dentro de los subórdenes Zeugloptera, Glossata y Heterobathmiina, y cualquier combinación de los mismos. Los insectos lepidópteros a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, Ostrinia spp. tales como O. nubilalis (barrenador europeo del maíz); Plutella spp. tal como P. xylostella (polilla dorso de diamante); Spodoptera spp. tal como S. frugiperda (gusano cogollero del otoño), S. ornithogalli (gusano cogollero de rayas amarillas), S. praefica (gusano cogollero de rayas amarillas occidental), S. eridania (gusano cogollero del sur) y S. exigua (gusano cogollero de la remolacha); Agrotis spp. tal como A. ipsilon (gusano cortador negro), A. segetum (gusano cortador común), A. gladiaria (gusano cortador de espalda de arcilla) y A. orthogonia (gusano cortador occidental pálido); Striacosta spp. tal como S. albicosta (gusano cortador occidental del frijol); Helicoverpa spp. tal como H. zea (gusano elotero del maíz), H. punctigera (gusano nativo de las yemas), S. littoralis (gusano de la hoja de algodón egipcio) y H. armígera (gusano de la cápsula del algodón); Heliothis spp. tal como H. virescens (gusano de las yemas del tabaco); Diatraea spp. tal como D. grandiosella (barrenador del maíz del suroeste) y D. saccharalis (barrenador de la caña de azúcar); Trichoplusia spp. tal como T. ni (taladrillo de la col); Sesamia spp. tal como S. nonagroides (barrenador del maíz mediterráneo); Pectinophora spp. tal como P. gossypiella (gusano elotero rosado); Cochylis spp. tal como C. hospes (polilla de bandas del girasol); Manduca spp. tal como M. sexta (gusano del tabaco) y M. quinquemaculata (gusano del tomate); Elasmopalpus spp. tal como E. lignosellus (barrenador menor del tallo del maíz); Pseudoplusia spp. tal como P. includens (falso medidor de la soja); Anticarsia spp. tal como A. gemmatalis (oruga de las leguminosas); Plathypena spp. tal como P. scabra (gusano verde del trébol); Pieris spp. tal como P. brassicae (mariposa de la col), Papaipema spp. tal como P. nebris (taladrador del tallo); Pseudaletia spp. tal como P. unipuncta (gusano cogollero común); Peridroma spp. tal como P. saucia (gusano cortador variegado); Keiferia spp. tal como K. lycopersicella (gusano alfiler del tomate); Artogeia spp. tal como A. rapae (gusano de la col importado); Phthorimaea spp. tal como P. operculella (palomilla de la patata); Crymodes spp. tal como C. devastator(gusano cortador vidrioso); Feltia spp. tal como F. ducens (gusano cortador negro); y cualquier combinación de los anteriores. En un aspecto de esta realización, las proteínas insecticidas son activas contra el gusano cortador negro, el barrenador de la caña de azúcar y/o el barrenador del maíz del suroeste.

Los insectos en el orden de los coleópteros incluyen, pero no se limitan a, cualquier insecto coleóptero conocido ahora o identificado después que incluye aquellos en los subórdenes Archostemata, Myxophaga, Adephaga y Polyphaga, y cualquier combinación de los mismos.

En un aspecto de esta realización, las proteínas insecticidas son activas contra Diabrotica spp. Diabrotica es un género de escarabajos del orden Coleoptera comúnmente denominados "gusanos de la raíz del maíz" o "escarabajos del pepino". La especie Diabrotica a modo de ejemplo incluye, sin limitación, Diabrotica barberi (gusano del norte de la raíz del maíz), D. virgifera virgifera (gusano occidental de la raíz del maíz), D. undecimpunctata howardii (gusano del sur de la raíz del maíz), D. balteata (escarabajo en bandas del pepino), D. undecimpunctata undecimpunctata (escarabajo occidental manchado del pepino), D. significata (escarabajo de la hoja de 3 manchas), D. speciosa (escarabajo del crisantemo), D. virgifera zeae (gusano mejicano de la raíz del maíz), D. beniensis, D. cristata, D. curviplustalata, D. dissimilis, D. elegantula, D. emorsitans, D. graminea, D. hispanloe, D. lemniscata, D. linsleyi, D. milleri, D. nummularis, D. occlusal, D. porrecea, D. scutellata, D. tibialis, D. trifasciata y D. viridula; y cualquier combinación de los mismos.

Otros ejemplos no limitantes de plagas de insectos coleópteros incluyen Leptinotarsa spp. tal como L. decemlineata (escarabajo de la patata de Colorado); Chrysomela spp. tal como C. scripta (escarabajo de la hoja del álamo); Hypothenemus spp. tal como H. hampei (barrenador de las bayas de café); Sitophilus spp. tal como S. zeamais (gorgojo del maíz); Epitrix spp. tal como E. hirtipennis (pulguilla del tabaco) y E. cucumeris (pulguilla de la patata); Phyllotreta spp. tal como P. cruciferae (pulguilla de las crucíferas) y P. pusilla (pulguilla negra occidental); Anthonomus spp. tal como A. eugenii (gorgojo del pimiento); Hemicrepidus spp. tal como H. memnonius (gusanos alambre); Melanotus spp. tal como M. communis (gusano alambre); Ceutorhychus spp. tal como C. assimilis (gorgojo del tegumento de la col); Phyllotreta spp. tal como P. cruciferae (pulguilla de las crucíferas); Aeolus spp. tal como A. mellillus (gusano alambre); Aeolus spp. tal como A. mancus (gusano alambre del trigo); Horistonotus spp. tal como H. uhlerii (gusano alambre de la arena); Sphenophorus spp. tal como S. maidis (chicharrita del maíz), S. zeae (chinche de Timothy), S. parvulus (chinche del bluegrass) y S. callosus (chinche del sur del maíz); Phyllophaga spp. (gusanos blancos); Chaetocnema spp. tal como C. pulicaria (pulguilla del maíz); Popillia spp. tal como P. japonica (escarabajo japonés); Epilachna spp. tal como E. varivestis (escarabajo mejicano del frijol); Cerotoma spp. tal como C. trifurcate (escarabajo de la hoja del frijol); Epicauta spp. tal como E. pestifera y E. lemniscata (escarabajos de las ampollas); y cualquier combinación de los anteriores.

Las proteínas insecticidas también pueden ser activas contra hemípteros, dípteros, Lygus spp., y/u otros insectos perforadores y succionadores, por ejemplo del orden Orthoptera o Thysanoptera. Los insectos en el orden Diptera incluyen, pero no se limitan a, cualquier insecto díptero ahora conocido o identificado después que incluye, pero no se limita a, Liriomyza spp. tal como L. trifolii (minador de las hojas) y L. sativae (minador de las hojas de las verduras); Scrobipalpula spp. tal como S. absoluta (minador de las hojas del tomate); Delia spp. tal como D. platura (gusano de la semilla del maíz), D. brassicae (gusano de la col) y D. radicum (mosca de la raíz de la col); Psilia spp. tal como P. rosae (mosca de la roya de la zanahoria); Tetanops spp. tal como T. myopaeformis (gusano de la raíz de la remolacha azucarera); cualquier combinación de los anteriores.

Los insectos en el orden Orthoptera incluyen, pero no se limitan a, cualquier insecto ortóptero ahora conocido o identificado después que incluye, pero no se limita a, Melanoplus spp. tal como M. differentialis (saltamontes diferencial), M. femurrubrum (saltamontes de patas rojas), M. bivittatus (saltamontes de dos rayas); y cualquier combinación de los mismos.

Los insectos en el orden Thysanoptera incluyen, pero no se limitan a, cualquier insecto tisanóptero ahora conocido o identificado después que incluye, pero no se limita a, Frankliniella spp. tal como F. occidentalis (trips occidental de las flores) y F. fusca (trips del tabaco); y Thrips spp. tal como T. tabaci (trips de la cebolla), T. palmi (trips del melón); y cualquier combinación de los anteriores.

Las proteínas insecticidas también pueden ser activas contra nematodos. El término "nematodo", como se usa en el presente documento, engloba cualquier organismo que es ahora conocido o identificado después que se clasifica en el reino animal, filo Nematoda, que incluye sin limitación nematodos dentro de la clase Adenophorea (incluyendo, por ejemplo, los órdenes Enoplida, Isolaimida, Mononchida, Dorylaimida, Trichocephalida, Mermithida, Muspiceida, Araeolaimida, Chromadorida, Desmoscolecida, Desmodorida y Monhysterida) y/o la clase Secernentea (incluyendo, por ejemplo, los órdenes Rhabdita, Strongylida, Ascaridida, Spirurida, Camallanida, Diplogasterida, Tylenchida y Aphelenchida).

Los nematodos incluyen, pero no se limitan a, nematodos parasíticos, tales como nematodos de los nudos de la raíz, nematodos de quiste y/o nematodos de lesión. Los géneros de nematodos a modo de ejemplo según la presente invención incluyen, pero no se limitan a, Meloidogyne (nematodos de los nudos de la raíz), Heterodera (nematodos de quiste), Globodera (nematodos de quiste), Radopholus (nematodos barrenadores), Rotylenchulus (nematodos reniformes), Pratylenchus (nematodos de lesión), Aphelenchoides (nematodos foliares), Helicotylenchus (nematodos en espiral), Hoplolaimus (nematodos de lanza), Paratrichodorus (nematodos de raíz rechoncha), Longidorus, Nacobbus (nematodos de los nudos de la raíz falsa), Subanguina, Belonlaimus (nematodos de picadura), Criconemella, Criconemoides (nematodos de anillo), Ditylenchus, Dolichodorus, Hemicriconemoides, Hemicycliophora, Hirschmaniella, Hypsoperine, Macroposthonia, Melinius, Punctodera, Quinisulcius, Scutellonema, Xiphinema (nematodos daga), Tylenchorhynchus (nematodos acrobáticos), Tylenchulus, Bursaphelenchus (gusanos redondos), y cualquier combinación de los mismos.

Los nematodos de plantas parasíticas a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, Belonolaimus gracilis, Belonolaimus longicaudatus, Bursaphelenchus xylophilus (nematodo de la madera del pino), Criconemoides ornata, Ditylenchus destructor (nematodo de la podredumbre de la patata), Ditylenchus dipsaci (nematodo de tallos y bulbos), Globodera pallida (nematodo de quiste de la patata), Globodera rostochiensis (nematodo dorado), Heterodera glycines (nematodo de quiste de la soja), Heterodera schachtii (nematodo de quiste de la remolacha azucarera); Heterodera zeae (nematodo de quiste del maíz)), Heterodera avenae (nematodo de quiste del cereal), Heterodera carotae, Heterodera trifolii, Hoplolaimus columbus, Hoplolaimus galeatus, Hoplolaimus magnistylus, Longidorus breviannulatus, Meloidogyne arenaria, Meloidogyne chitwoodi, Meloidogyne hapla, Meloidogyne incognita, Meloidogyne javanica, Mesocriconema xenoplax, Nacobbus aberrans, Naccobus dorsalis, Paratrichodorus christiei, Paratrichodorus minor, Pratylenchus brachyurus, Pratylenchus crenatus, Pratylenchus hexincisus, Pratylenchus neglectus, Pratylenchus penetrans, Pratylenchus projectus, Pratylenchus scribneri, Pratylenchus tenuicaudatus, Pratylenchus thornei, Pratylenchus zeae, Punctodera chaccoensis, Quinisulcius acutus, Radopholus similis, Rotylenchulus reniformis, Tylenchorhynchus dubius, Tylenchulus semipenetrans (nematodo de los cítricos), Siphinema americanum, X. Mediterraneum, y cualquier combinación de los anteriores.

Se describe un método de producción de una proteína insecticida que es activa contra insectos, que comprende: (a) obtener una célula hospedadora que comprende un gen, que él mismo comprende un casete de expresión y/o una molécula de ácido nucleico de la invención; y (b) cultivar la célula hospedadora transgénica de tal forma que exprese una proteína insecticida que es activa contra insectos.

En todavía una realización adicional, la invención engloba un método de control de una población de plaga de lepidópteros o coleópteros que comprende poner en contacto dicha población con una cantidad de control de insectos eficaz de un polipéptido con actividad insecticida, en donde el polipéptido se selecciona del grupo que consiste en:

a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; y

2.

b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:

4.

En una realización, al menos una de las proteínas insecticidas se expresa en un organismo superior, tal como una planta. En este caso, las plantas transgénicas que expresan cantidades eficaces de control de insectos de la proteína insecticida se protegen ellas mismas de las plagas de insectos. Cuando el insecto empieza a alimentarse de dicha planta transgénica, también ingiere la proteína insecticida expresada. Esto disuadirá al insecto de morder más el tejido de la planta y/o puede incluso dañar o matar al insecto. Un ácido nucleico de la presente invención se inserta en un casete de expresión, que entonces se puede integrar establemente en el genoma de la planta. En otra realización, el ácido nucleico se incluye en un virus autorreplicante no patógeno. Las plantas transformadas según la presente invención pueden ser monocotiledóneas o dicotiledóneas e incluyen, pero no se limitan a, maíz, trigo, avena, césped, hierba de pasto, lino, cebada, centeno, boniato, frijol, guisante, achicoria, lechuga, col, coliflor, brócoli, nabo, rábano, espinaca, espárrago, cebolla, ajo, pimienta, apio, calabaza alargada, calabaza, cáñamo, calabacín, manzana, pera, membrillo, melón, ciruela, cereza, melocotón, nectarina, albaricoque, fresa, uva, frambuesa, mora, piña, aguacate, papaya, mango, banana, soja, tomate, sorgo, caña de azúcar, remolacha azucarera, girasol, colza, clavo, tabaco, zanahoria, algodón, alfalfa, arroz, patata, berenjena, pepino, Arabidopsis y plantas leñosas, tales como coníferas y árboles de hoja caduca.

En otra realización, la invención engloba un método de producción de una planta o parte de planta que tiene resistencia potenciada a los insectos en comparación con una planta o parte de planta de control, que comprende: (a) introducir una molécula de ácido nucleico que comprende un casete de expresión de la invención por transformación; y (b) cultivar la parte de planta en una planta que expresa la molécula de ácido nucleico heteróloga del casete de expresión y que tiene resistencia potenciada a los insectos en comparación con una planta de control o parte de planta que no se ha transformado con una molécula de ácido nucleico que comprende el casete de expresión. En una realización preferida, el casete de expresión puede codificar un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o es 100 % idéntica o similar a SEQ ID NO: 4. En una realización preferida, el casete de expresión puede codificar un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es SEQ ID NO: 4. La resistencia "potenciada" a insectos se puede medir como un aumento de la actividad insecticida. La resistencia potenciada a insectos puede ser superior al 0 %, al menos 1 %, al menos 2 %, al menos 3 %, al menos 4 %, al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 15 %, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 100 %, al menos 125 %, al menos 150 %, al menos 200 %, al menos 300 %, al menos 400 %, al menos 500 %, al menos 600 %, al menos 700 %, al menos 800 %, al menos 900 %, o al menos 1000 % mayor actividad insecticida en comparación con una planta de control. Una planta o parte de planta que tiene resistencia potenciada a los insectos en comparación con una planta o parte de planta de control se puede producir por métodos de transformación de plantas, cultivo de tejido de plantas, o cultivo. La planta o parte de planta se puede producir por métodos de propagación sexual o asexual. Se puede usar cualquier planta o parte de planta de control adecuada, por ejemplo, una planta del mismo acervo genético o similar cultivada en el mismo entorno. En realizaciones, la planta o parte de planta de control es del mismo acervo genético y está creciendo en el mismo entorno que la planta descrita, pero no comprende una molécula de la invención, mientras que la planta descrita sí comprende una molécula de la invención.

En otra realización, la invención engloba un método de potenciamiento de la resistencia a insectos en una planta o parte de planta en comparación con una planta o parte de planta de control, que comprende expresar en la planta o parte de planta una molécula de ácido nucleico o un casete de expresión de la invención, en donde la expresión del ácido nucleico heterólogo del casete de expresión da como resultado resistencia potenciada a insectos en una planta o parte de planta en comparación con una planta o parte de planta de control. En realizaciones, el casete de expresión 0 molécula de ácido nucleico comprende un promotor operativamente unido a una molécula de ácido nucleico heteróloga que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende: (a) una secuencia de nucleótidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 1 a 3; (b) una secuencia de nucleótidos que es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o es 100 % idéntica a la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 1 a 3 (c); una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido, en donde la secuencia de aminoácidos del polipéptido comprende SEQ ID NO: 4, y tiene actividad de control de insectos; (d) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido, en donde la secuencia de aminoácidos del polipéptido es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o es 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; o (e) una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de (a) a (d) anteriores. La molécula de ácido nucleico o casete de expresión se puede introducir en la planta. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico o casete de expresión se puede introducir en una parte de planta y una planta que comprende la molécula de ácido nucleico o casete de expresión se puede producir a partir de la parte de planta.

En otra realización, la invención engloba un método de producción de una planta que tiene resistencia potenciada a insectos en comparación con una planta de control, que comprende detectar, en una parte de planta, un ácido nucleico heterólogo que comprende una molécula de ácido nucleico o un casete de expresión de la invención y producir una planta a partir de la parte de planta, produciendo así una planta que tiene resistencia potenciada a insectos en comparación con una planta de control. En una realización adicional, la invención engloba un método de identificación de una planta o parte de planta que tiene resistencia potenciada a insectos en comparación con una planta o parte de planta de control, que comprende detectar, en la planta o parte de planta, una molécula de ácido nucleico o un casete de expresión de la invención, identificando así una planta o parte de planta que tiene resistencia potenciada a insectos. En una realización adicional, el casete de expresión o un fragmento de diagnóstico del mismo se detecta en un producto de amplificación de una muestra de ácido nucleico de la planta o parte de planta. El fragmento de diagnóstico puede ser una molécula de ácido nucleico de al menos 10 nucleótidos contiguos de longitud que es única para el casete de expresión de la invención. Los métodos de detección se conocen bien en la técnica e incluyen métodos basados en PCR, métodos de secuenciación y métodos de hibridación, en los que se usan cebadores o sondas que son únicas para las secuencias del ácido nucleico de diagnóstico. En algunas realizaciones, los cebadores o sondas para al menos 10 nucleótidos contiguos de SEQ ID NOs: 1 a 3, o un complemento de los mismos, se producen y son útiles para un método de detección de una molécula de ácido nucleico de la invención.

También se desvela un método de producción de una planta que tiene resistencia potenciada a insectos en comparación con una planta o parte de planta de control, que comprende cruzar una primera planta progenitora con una segunda planta progenitora, en donde al menos la primera planta progenitora comprende dentro de su genoma un ácido nucleico heterólogo que comprende una molécula de ácido nucleico o un casete de expresión de la invención y que produce una generación de descendencia, en donde la generación de descendencia comprende al menos una planta que posee el ácido nucleico heterólogo dentro de su genoma y que presenta resistencia potenciada a insectos en comparación con una planta de control.

En realizaciones preferidas, los métodos de la invención confieren resistencia potenciada a insectos en una planta o parte de planta contra una plaga de insectos coleópteros y/o lepidópteros. El control de insectos de tanto plagas de insectos coleópteros como lepidópteros se demuestra en los ejemplos. En realizaciones adicionales, los métodos de la invención confieren resistencia potenciada a insectos en una planta o parte de planta contra especies de Diabrotica, que incluyen Diabrotica virgifera virgifera, Diabrotica barberi, Diabrotica undecimpunctata howardi, Diabrotica virgifera zeae y/o Diabrotica speciosa, y/o especies relacionadas.

En realizaciones preferidas, los métodos de la invención confieren resistencia potenciada a insectos en una planta monocotiledónea.

La presente invención engloba además una planta transgénica que comprende una molécula de ácido nucleico heteróloga o un casete de expresión de la invención, que cuando se transcribe y traduce confiere resistencia potenciada a insectos. En realizaciones preferidas, la molécula de ácido nucleico heteróloga comprende una secuencia al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 % al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % al menos 99 %, o 100 % idéntica a una cualquiera de SEQ ID NOs: 1 a 3. En una realización adicional, la planta transgénica comprende una molécula de ácido nucleico heteróloga que comprende una secuencia al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 % al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % al menos 99 %, o 100 % idéntica a SEQ ID NO: 3. En realizaciones, la planta transgénica es una planta dicotiledónea. En realizaciones preferidas, la planta transgénica es una planta monocotiledónea. En realizaciones adicionales, la planta transgénica es alfalfa, eneldo, manzana, albaricoque, alcachofa, rúcula, espárrago, aguacate, banana, judías, remolacha, mora, arándano, brócoli, coles de Bruselas, col, canola, cantalupo, zanahoria, yuca, coliflor, apio, cereza, cilantro, cítricos, clementina, café, maíz, algodón, pepino, abeto Douglas, berenjena, escarola, eucalipto, hinojo, higos, calabaza de peregrino, uva, pomelo, melón rocío de miel, jícama, kiwi, lechuga, puerros, limón, lima, pino Loblolly, mango, melón, champiñón, nuez, ocra, cebolla, naranja, una planta ornamental, papaya, perejil, guisante, melocotón, cacahuete, pera, pimienta, caqui, pino, piña, plátano, ciruela, granada, álamo, patata, calabaza, membrillo, pino radiata, achicoria, rábano, frambuesa, arroz, centeno, sorgo, pino del sur, soja, espinaca, calabaza de invierno, fresa, remolacha azucarera, girasol, boniato, liquidámbar americano, mandarina, té, tabaco, tomate, césped, una vid, sandía, ñame o calabacín. En realizaciones preferidas, la planta transgénica es mijo, pasto varilla, maíz, sorgo, trigo, avena, hierba de césped, hierba de pasto, lino, arroz, caña de azúcar, colza o cebada.

En otra realización más, una planta transgénica de la invención comprende una molécula de ácido nucleico heteróloga que comprende una secuencia promotora. En otra realización más, una planta transgénica de la invención puede comprender una molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica al menos un rasgo deseado adicional. El rasgo adicional puede codificar la misma molécula de ácido nucleico heteróloga que una molécula de la invención, o puede codificar una segunda molécula de ácido nucleico heteróloga. El rasgo deseado adicional puede conferir resistencia a insectos a una segunda plaga de insectos, resistencia a insectos a la misma plaga de insectos, tolerancia al estrés abiótico, esterilidad masculina, resistencia a herbicidas, resistencia a enfermedades bacterianas, resistencia a enfermedades fúngicas, resistencia a enfermedades víricas, resistencia a nematodos, metabolismo modificado de los ácidos grasos, metabolismo modificado de los hidratos de carbono, valor nutritivo mejorado, rendimiento mejorado en un proceso industrial o capacidad reproductiva alterada. El rasgo deseado adicional también puede inducir la producción dentro de la planta de una enzima o metabolito comercialmente valioso.

En realizaciones, el rasgo añadido deseado es un segundo agente pesticida. El segundo agente pesticida puede ser activo en cualquier plaga de planta, que incluye insectos, nematodos, hongos, virus o bacterias. Los ejemplos de plagas de insectos de las plantas incluyen y no se limitan a Nilaparvata spp. (por ejemplo, N. lugens(saltamontes marrón)); Laodelphaxspp. (por ejemplo, L. striatellus (saltamontes marrón pequeño)); Nephotettixspp. (por ejemplo, N. virescens o N. cincticeps (chicharra verde), o N. nigropictus (chicharra del arroz)); Sogatella spp. (por ejemplo, S. furcifera (saltamontes de dorso blanco)); Blissus spp. (por ejemplo, B. leucopterus leucopterus (chinche de los cereales)); Scotinophora spp. (por ejemplo, S. vermidulate (chinche negro del arroz)); Acrosternum spp. (por ejemplo, A. hilare (chinche verde hediondo)); Parnara spp. (por ejemplo, P. guttata (saltador del arroz)); Chilo spp. (por ejemplo, C. suppressalis (barrenador rayado del tallo del arroz), C. auricilius (barrenador de flecos dorados del tallo), o C. polychrysus(barrenador de cabeza oscura del tallo)); Chilotraea spp. (por ejemplo, C. polychrysa(barrenador del tallo del arroz)); Sesamia spp. (por ejemplo, S. inferens (barrenador rosa del arroz)); Tryporyza spp. (por ejemplo, T. innotata (barrenador blanco del arroz), o T. incertulas (barrenador amarillo del arroz)); Cnaphalocrocis spp. (por ejemplo, C. medinalis (enrroladores de hojas del arroz)); Agromyza spp. (por ejemplo, A. oryzae(minador de hojas), o A. parvicorni (minadores de hojas con manchas del maíz)); Diatraea spp. (por ejemplo, D. saccharalis(barrenador de la caña de azúcar), o D. grandiosella (barrenador del maíz del suroeste)); Narnaga spp. (por ejemplo, N. aenescens (oruga verde del arroz)); Xanthodes spp. (por ejemplo, X. transversa (oruga verde)); Spodoptera spp. (por ejemplo, S. frugiperda (gusano cogollero de otoño), S. exigua (gusano cogollero de la remolacha), S. littoralis (gusano cortador trepador) o S. praefica (gusano cogollero occidental de rayas amarillas)); Mythimna spp. (por ejemplo, Mythimna (Pseudaletia) seperata (gusano cogollero)); Helicoverpa spp. (por ejemplo, H. zea (gusano elotero del maíz)); Colaspis spp. (por ejemplo, C. brunnea (colaspis de la uva)); Lissorhoptrus spp. (por ejemplo, L. oryzophilus (gorgojo acuático del arroz)); Echinocnemus spp. (por ejemplo, E. squamos (gorgojo de la planta del arroz)); Diclodispa spp. (por ejemplo, D. armígera (hispa del arroz)); Oulema spp. (por ejemplo, O. oryzae (escarabajo de la hoja); Sitophilus spp. (por ejemplo, S. oryzae (gorgojo del arroz)); Pachydiplosis spp. (por ejemplo, P. oryzae (mosquito de la agalla del arroz)); Hydrellia spp. (por ejemplo, H. griseola (minador de hojas del arroz pequeño), o H. sasakii(gusano del tallo del arroz)); Chlorops spp. (por ejemplo, C. oryzae (gusano del tallo)); Diabrotica spp. (por ejemplo, D. virgifera virgifera (gusano occidental de la raíz del maíz), D. barberi (gusano del norte de la raíz del maíz), D. undecimpunctata howardi (gusano del sur de la raíz del maíz), D. virgifera zeae (gusano mexicano de la raíz del maíz); D. balteata (escarabajo en bandas del pepino)); Ostrinia spp. (por ejemplo, O. nubilalis (barrenador europeo del maíz)); Agrotis spp. (por ejemplo, A. ipsilon (gusano cortador negro)); Elasmopalpus spp. (por ejemplo, E. lignosellus (barrenador menor del tallo del maíz)); Melanotus spp. (gusanos alambre); Cyclocephala spp. (por ejemplo, C. borealis (escarabajo enmascarado del norte), o C. immaculata (escarabajo enmascarado del sur)); Popillia spp. (por ejemplo, P. japonica (escarabajo japonés)); Chaetocnema spp. (por ejemplo, C. pulicaria (pulguilla del maíz)); Sphenophorus spp. (por ejemplo, S. maidis (chicharrita del maíz)); Rhopalosiphum spp. (por ejemplo, R. maidis(áfido de la hoja del maíz)); Anuraphis spp. (por ejemplo, A. maidiradicis (áfido de la raíz del maíz)); Melanoplus spp. (por ejemplo, M. femurrubrum (saltamontes de patas rojas), M. differentialis (saltamontes diferencial) o M. sanguinipes (saltamontes migratorio)); Hylemya spp. (por ejemplo, H. platura (gusano de la semilla del maíz)); Anaphothrips spp. (por ejemplo, A. obscrurus(trips del césped)); Solenopsis spp. (por ejemplo, S. milesta (hormiga ladrona)); o spp. (por ejemplo, T. urticae (ácaro de dos puntos), T. cinnabarinus (ácaro carmín); Helicoverpa spp. (por ejemplo, H. zea (gusano del algodón), o H. armigera (gusano americano)); Pectinophora spp. (por ejemplo, P. gossypiella (gusano rosa)); Earias spp. (por ejemplo, E. vittella (gusano moteado)); Heliothis spp. (por ejemplo, H. virescens (gusano de las yemas del tabaco)); Anthonomus spp. (por ejemplo, A. grandis (gorgojo del algodón)); Pseudatomoscelis spp. (por ejemplo, P. seriatus(pulga saltona del algodón)); Trialeurodes spp. (por ejemplo, T. abutiloneus (mosca blanca con bandas en las alas) T. vaporariorum (mosca blanca de los invernaderos)); Bemisia spp. (por ejemplo, B. argentifolii (mosca blanca de la hoja plateada)); Aphis spp. (por ejemplo, A. gossypii (áfido del algodón)); Lygus spp. (por ejemplo, L. lineolaris (chinche opaca de las plantas) o L. hesperus (chinche opaca occidental de las plantas)); Euschistus spp. (por ejemplo, E. conspersus (chinche hedionda consperse)); Chlorochroa spp. (por ejemplo, C. sayi (chinche hedionda Say)); Nezara spp. (por ejemplo, N. viridula (chinche hedionda verde del sur)); Thrips spp. (por ejemplo, T. tabaci (trips de la cebolla)); Frankliniella spp. (por ejemplo, F. fusca (trips del tabaco), o F. occidentalis (trips occidental de las flores)); Leptinotarsa spp. (por ejemplo, L. decemlineata (escarabajo de la patata de Colorado), L. juncta (escarabajo de la patata falso), o L. texana (escarabajo de la patata de Texas)); Lema spp. (por ejemplo, L. trilineata (escarabajo de la patata de tres líneas)); Epitrixspp. (por ejemplo, E. cucumeris (pulguilla de la patata), E. hirtipennis (pulguilla), o E. tuberis (pulguilla de los tubérculos)); Epicauta spp. (por ejemplo, E. vittata (escarabajo rayado de las ampollas)); Phaedon spp. (por ejemplo, P. cochleariae (escarabajo de las hojas de la mostaza)); Epilachna spp. (por ejemplo, E. varivetis (escarabajo mexicano del frijol)); Acheta spp. (por ejemplo, A. domesticus (grillo doméstico)); Empoasca spp. (por ejemplo, E. fabae (chicharra de la patata)); Myzus spp. (por ejemplo, M. persicae (áfido del melocotón verde)); Paratrioza spp. (por ejemplo, P. cockerelli (psílido)); Conoderus spp. (por ejemplo, C. falli (gusano alambre del sur de la patata), o C. vespertinus (gusano alambre del tabaco)); Phthorimaea spp. (por ejemplo, P. operculella (gusano del tubérculo de la patata)); Macrosiphum spp. (por ejemplo, M. euphorbiae (áfido de la patata)); Thyanta spp. (por ejemplo, T. pallidovirens (chinche hedionda de dorso rojo)); Phthorimaea spp. (por ejemplo, P. operculella (gusano del tubérculo de la patata)); Helicoverpa spp. (por ejemplo, H. zea (gusano del fruto del tomate); Keiferia spp. (por ejemplo, K. lycopersicella (gusano alfiler del tomate)); Limonius spp. (gusanos alambre); Manduca spp. (por ejemplo, M. sexta (gusano del tabaco), o M. quinquemaculata (gusano del tomate)); Liriomyza spp. (por ejemplo, L. sativae, L. trifollio L. huidobrensis (minador de hojas)); Drosophilla spp. (por ejemplo, D. melanogaster, D. yakuba, D. pseudoobscura o D. simulans); Carabus spp. (por ejemplo, C. granulatus); Chironomus spp. (por ejemplo, C. tentanus); Ctenocephalides spp. (por ejemplo, C. felis (pulga de gato)); Diaprepes spp. (por ejemplo, D. abbreviatus (gorgojo de la raíz)); Ips spp. (por ejemplo, I. pini (escarabajo grabador del pino)); Tribolium spp. (por ejemplo, T. castaneum (escarabajo rojo de la harina)); Glossina spp. (por ejemplo, G. morsitans (mosca tse-tsé)); Anopheles spp. (por ejemplo, A. gambiae (mosquito de la malaria)); Helicoverpa spp. (por ejemplo, H. armigera (gusano de la cápsula africano)); Acyrthosiphon spp. (por ejemplo, A. pisum (áfido del guisante)); Apis spp. (por ejemplo, A. melifera (abeja melífera)); Homalodisca spp. (por ejemplo, H. coagulate (francotirador de alas vidriosas)); Aedes spp. (por ejemplo, Ae. aegypti (mosquito de la fiebre amarilla)); Bombyx spp. (por ejemplo, B. mori (gusano de seda)); Locusta spp. (por ejemplo, L. migratoria (langosta migratoria)); Boophilus spp. (por ejemplo, B. microplus (pulga del ganado)); Acanthoscurria spp. (por ejemplo, A. gomesiana (tarántula chocolate de pelo rojo)); Diploptera spp. (por ejemplo, D. punctata (cucaracha escarabajo del Pacífico)); Heliconius spp. (por ejemplo, H. erato (mariposa de la flor de la pasión roja) o H. melpomene (mariposa cartero)); Curculio spp. (por ejemplo, C. glandium (gorgojo de la bellota)); Plutella spp. (por ejemplo, P. xylostella (polilla de dorso diamante)); Amblyomma spp. (por ejemplo, A. variegatum (pulga del ganado)); Anteraea spp. (por ejemplo, A. yamamai (mariposa de seda)); y Armigeres spp. (por ejemplo, A. subalbatus).

Las proteínas insecticidas se pueden usar en combinación con otros agentes pesticidas (por ejemplo, proteínas Bt Cry) para aumentar el alcance del objetivo de la plaga. Además, el uso de las proteínas insecticidas en combinación con un agente insecticida que tiene un modo de acción diferente u objetivo en diferente receptor en el intestino del insecto tiene utilidad particular para la prevención y/o el tratamiento de la resistencia a insectos.

El segundo agente pesticida puede ser una proteína insecticida derivada de Bacillus thuringiensis. Una proteína insecticida de B. thuringiensis puede ser cualquiera de varias proteínas insecticidas que incluyen, pero no se limitan a, una proteína Cry1, una proteína Cry3, una proteína Cry7, una proteína Cry8, una proteína Cry11, una proteína Cry22, una proteína Cry23, una proteína Cry36, una proteína Cry37, una proteína Cry34 junto con una proteína Cry35, una proteína insecticida binaria CryET33 y CryET34, una proteína insecticida binaria TIC100 y TIC101, una proteína insecticida binaria PS149B1, una VIP (proteína insecticida vegetativa, desvelada en las patentes de EE. UU. 5.849.870 y 5.877.012), una TIC900 o proteína relacionada, una TIC901, TIC1201, TIC407, TIC417, una proteína Cry3A modificada, o proteínas híbridas o quimeras preparadas a partir de cualquiera de las proteínas insecticidas precedentes. En otras realizaciones, la proteína insecticida de B. thuringiensis se selecciona del grupo que consiste en Cry3Bb1, Cry34Ab1 junto con Cry35Ab1, mCry3A (patente de EE. UU. N.° 7.276.583), eCry3.1Ab (patente de EE. UU. N.° 8.309.516) y proteínas Vip3A, que incluyen Vip3Aa (patente de EE. UU. N.° 6.137.033).

En otras realizaciones, una planta transgénica de la invención puede comprender un segundo agente pesticida que puede derivar de fuentes distintas de B. thuringiensis. El segundo agente insecticida puede ser un agente seleccionado del grupo que comprende una a-amilasa, una peroxidasa, una colesterol oxidasa, una patatina, una proteasa, un inhibidor de la proteasa, una ureasa, un inhibidor de alfa-amilasa, una proteína formadora de poros, una quitinasa, una lectina, un anticuerpo modificado o fragmento de anticuerpo, una proteína insecticida de Bacillus cereus, una proteína insecticida de Xenorhabdus spp. (tal como X. nematophila o X. bovienii), una proteína insecticida de Photorhabdus spp. (tal como P. luminescens o P. asymobiotica), una proteína insecticida de Brevibacillus spp. (tal como B. laterosporous), una proteína insecticida de Lysinibacillus spp. (tal como L. sphearicus), una proteína insecticida de Chromobacterium spp. (tal como C. subtsugae o C. piscinae), una proteína insecticida de Yersinia spp. (tal como Y. entomophaga), una proteína insecticida de Paenibacillus spp. (tal como P. propylaea), una proteína insecticida de Clostridium spp. (tal como C. bifermentans), una Pseudomonas spp. (tal como P. fluorescens) y una lignina. En otras realizaciones, el segundo agente puede ser al menos una proteína insecticida derivada de un complejo de toxina insecticida (Tc) de Photorhabdus, Xenorhabus, Serratia o Yersinia. En otras realizaciones, la proteína insecticida puede ser una ADP-ribosiltransferasa derivada de una bacteria insecticida, tal como Photorhabdus ssp. En otras realizaciones más, la proteína insecticida puede ser Axmi205 o derivada de Axmi205 (patente de EE. UU. N.° 8.575.425 y N.° 9.394.345). En otras realizaciones, la proteína insecticida puede ser una proteína VIP, tal como VIP1 y/o VIP2 de B. cereus. En otras realizaciones más, la proteína insecticida puede ser una toxina binaria derivada de una bacteria insecticida, tal como ISP1A y ISP2A de B. laterosporous o BinA y BinB de L. sphaericus. En otras realizaciones más, la proteína insecticida se puede manipular o pueden ser un híbrido o quimera de cualquiera de las proteínas insecticidas precedentes.

En algunas realizaciones, la planta transgénica de la invención puede comprender y/o expresar al menos un segundo agente pesticida que es no proteináceo. En algunas realizaciones, el segundo agente pesticida puede estar presente sobre la superficie de la planta, por ejemplo como administración tópica. En realizaciones preferidas, el segundo agente pesticida es una molécula de ARN interferente. Un ARN interferente comprende normalmente al menos un fragmento de ARN contra un gen diana, una secuencia espaciadora y un segundo fragmento de ARN que es complementario al primero, de manera que se pueda formar una estructura de ARN bicatenario. La interferencia por ARN (iARN) ocurre cuando un organismo reconoce moléculas de ARN bicatenario (ARNbc) y las hidroliza. Los productos de hidrólisis resultantes son fragmentos de ARN pequeños de aproximadamente 19-24 nucleótidos de longitud, denominados ARN interferente pequeño (ARNip). Los ARNip difunden entonces o son llevados a través del organismo, que incluye a través de las membranas celulares, donde se hibridan con ARNm (u otros ARN) y provocan la hidrólisis del ARN. Los ARN interferentes son reconocidos por el complejo de silenciamiento de interferencia por ARN (RISC) en el que se carga una cadena efectora (o "cadena guía") del ARN. Esta cadena guía actúa de plantilla para el reconocimiento y la destrucción de las secuencias de dúplex. Este proceso se repite cada vez que el ARNip se hibrida con su diana de ARN complementaria, previniendo eficazmente que los ARNm se traduzcan, y "silenciando" así la expresión de genes específicos de los que se transcribieron los ARNm. Los ARN interferentes son conocidos en la técnica por ser útiles para el control de insectos (véase, por ejemplo, la publicación WO2013/192256). Un ARN interferente diseñado para su uso en el control de insectos produce un ARN bicatenario que no existe de forma natural, que se aprovecha de las vías de iARN nativas en el insecto para desencadenar la regulación por disminución de genes diana que pueden conducir al cese de la alimentación y/o el crecimiento y pueden dar como resultado la muerte de la plaga de insectos. La molécula de ARN interferente puede conferir resistencia a insectos contra la misma plaga objetivo que la proteína de la invención, o puede dirigirse a una plaga diferente. La plaga de las plantas por insectos objetivo se puede alimentar por masticación, succión o perforación. Los ARN interferentes se conocen en la técnica por ser útiles para el control de insectos. En realizaciones, el ARNbc útil para el control de insectos se describe en las solicitudes de patente PCT N.° PCT/US17/044825; PCT/US17/044831; PCT/US17/044832. En realizaciones, el ARNbc útil para el control de insectos se describe en las patentes de EE. UU. N.° 9.238.8223, 9.340.797 u 8.946.510. En realizaciones, el ARNbc útil para el control de insectos se describe en las solicitudes de patente de EE. UU. N.° 12/868.994, 13/831.230, 14/207.313, o 14/207318. En otras realizaciones, el ARN interferente puede conferir resistencia contra una plaga de las plantas no por insectos, tal como una plaga por nematodos o un plaga por virus.

La coexpresión de más de un agente pesticida en la misma planta transgénica se puede lograr preparando un único vector recombinante que comprende secuencias codificantes de más de un agente pesticida en una denominada pila molecular y manipulando genéticamente una planta para contener y expresar todos los agentes pesticidas en la planta transgénica. Dichas pilas moleculares también se pueden preparar usando minicromosomas como se describe, por ejemplo, en la patente de EE. UU. 7.235.716. Alternativamente, una planta transgénica que comprende un ácido nucleico que codifica un primer agente pesticida pueden ser re-transformada con un ácido nucleico diferente que codifica un segundo agente pesticida, etc. Alternativamente, una planta, Progenitor 1, puede ser genéticamente manipulada para la expresión de genes de la presente invención. Una segunda planta, Progenitor 2, puede ser genéticamente manipulada para la expresión de un segundo agente pesticida. Cruzando Progenitor 1 con Progenitor 2, se obtienen plantas descendientes que expresan todos los genes introducidos en los Progenitores 1 y 2.

Las plantas transgénicas o la semilla de la invención que comprenden y/o que expresan una proteína insecticida también se pueden tratar con un insecticida o recubrimiento de semilla insecticida como se describe en las patentes de EE. UU. N.° 5.849.320 y 5.876.739. En realizaciones, donde tanto el insecticida o el recubrimiento de semilla insecticida como la planta transgénica o semilla de la invención son activos contra el mismo insecto diana, por ejemplo, una plaga de coleópteros o una plaga objetivo de Diabrotica, la combinación es útil (i) en un método para el potenciamiento adicional de la actividad de la composición contra el insecto diana, y/o (ii) en un método para prevenir el desarrollo de resistencia a la composición proporcionando otro mecanismo de acción más contra el insecto diana. Por lo tanto, en realizaciones, la invención proporciona un método de potenciamiento del control de una población de insectos de Diabrotica que comprende proporcionar una planta transgénica o semilla de la invención y aplicar a la planta o la semilla un insecticida o recubrimiento de semilla insecticida a una planta transgénica o semilla de la invención.

Incluso donde el insecticida o recubrimiento de semilla insecticida sea activo contra un insecto diferente, el insecticida o recubrimiento de semilla insecticida es útil para ampliar la gama de control de insectos, por ejemplo, añadiendo un insecticida o recubrimiento de semilla insecticida que tiene actividad contra insectos lepidópteros a una semilla transgénica de la invención, que, en algunas realizaciones, tiene actividad contra coleópteros y algunos insectos lepidópteros, la semilla transgénica recubierta producida controla tanto plagas de insectos lepidópteros como coleópteros.

Ejemplos de dichos insecticidas y/o recubrimientos de semilla insecticidas incluyen, sin limitación, un carbamato, un piretroide, un organofosfato, un friprol, un neonicotinoide, un organocloruro, una nereistoxina, o una combinación de los mismos. En otra realización, el insecticida o recubrimiento de semilla insecticida se seleccionan del grupo que consiste en carbofurano, carbarilo, metomil, bifentrina, teflutrina, permetrina, ciflutrina, lambda-cihalotrina, cipermetrina, deltametrina, clorpirifos, cloretoxifos, dimetoato, etoprofos, malatión, metil-paratión, forato, terbufos, tebupirimifos, fipronil, acetamiprid, imidacloprid, tiacloprid, tiametoxam, endosulfan, bensultap, y una combinación de los mismos. Los productos comerciales que contienen dichos insecticidas y recubrimientos de semilla insecticidas incluyen, sin limitación, Furadan® (carbofuran), Lanate® (metomil, mesomil), Sevin® (carbaril), Talstar® (bifentrina), Force® (teflutrina), Ammo® (cipermetrina), Cymbush® (cipermetrina), Delta Gold® (deltametrina), Karate® (lambda-cihalotrina), Ambush® (permetrina), Pounce® (permetrina), Brigade® (bifentrina), Capture® (bifentrina), ProShield® (teflutrina), Warrior® (lambda-cihalotrina), Dursban® (clorpirifos), Fortress® (cloretoxifos), Mocap® (etoprop), Thimet® (forato), AAstar® (forato, flucitinato), Rampart® (forato), Counter® (terbufos), Cygon® (dimetoato), Dicapthon, Regent® (fipronil), Cruiser® (tiametoxam), Gaucho® (imidacloprid), Prescribe® (imidacloprid), Poncho® (clotianidina) y Aztec® (ciflutrina, tebupirimfos).

También se desvela una composición que comprende una cantidad eficaz de control de insectos de una proteína insecticida. En realizaciones adicionales, la composición comprende un vehículo agrícola adecuado y un polipéptido con actividad insecticida. El vehículo agrícola puede incluir adyuvantes, mezcladores, potenciadores, etc., beneficiosos para la aplicación de un principio activo, tal como un polipéptido, que incluye un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, o 100 % idéntica a la de cualquiera de SEQ ID NO: 4. Los vehículos adecuados no deben ser fitotóxicos para cultivos valiosos, particularmente en las concentraciones empleadas en la aplicación de las composiciones en presencia de cultivos, y no deben reaccionar químicamente con los compuestos del principio activo en el presente documento, concretamente un polipéptido, u otros componentes de la composición. Dichas mezclas se pueden diseñar para aplicación directamente a cultivos, o pueden ser concentrados o formulaciones que normalmente se diluyen con vehículos y adyuvantes adicionales antes de la aplicación. Pueden incluir componentes inertes o activos y pueden ser sólidos, tales como, por ejemplo, polvos para espolvorear, polvos, gránulos, gránulos dispersables en agua o polvos humectables, o líquidos, tales como, por ejemplo, concentrados emulsionables, disoluciones, emulsiones o suspensiones. Los vehículos agrícolas adecuados pueden incluir vehículos líquidos, por ejemplo agua, tolueno, xileno, nafta de petróleo, aceite de cultivo, acetona, metil etil cetona, ciclohexanona, tricloroetileno, percloroetileno, acetato de etilo, acetato de amilo, acetato de butilo, monometil éter de propilenglicol y monometil éter de dietilenglicol, metanol, etanol, isopropanol, amil alcohol, etilenglicol, propilenglicol, glicerina y similares. El agua es, en general, el vehículo de elección para la dilución de concentrados. Los vehículos sólidos adecuados pueden incluir talco, arcilla de pirofilita , sílice, arcilla atapulgítica, diatomita, caliza, tierra de diatomeas, cal, carbonato cálcico, arcilla de bentonita, arcilla esmectítica, cascarillas de semilla de algodón, harina de trigo, harina de soja, piedra pómez, harina de madera, harina de cáscaras de nueces, lignina y similares. En otra realización, un polipéptido se puede encapsular en una matriz sintética, tal como un polímero, y aplicarse a la superficie de un hospedador, tal como una planta. La ingestión de las células hospedadoras por un insecto permite la administración de los agentes de control de insectos al insecto y da como resultado un efecto tóxico en la plaga de insectos.

Una composición puede ser un polvo, polvo para espolvorear, pella, gránulo, espray, emulsión, coloide o disolución. Una composición se puede preparar por desecación, liofilización, homogenización, extracción, filtración, centrifugación, sedimentación o concentración de un cultivo de células bacterianas. Una composición de puede comprender al menos 1 %, al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 35 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97 %, o al menos 99 % en peso de un polipéptido.

En realizaciones, una composición puede comprender al menos un segundo agente pesticida (por ejemplo, que se puede expresar transgénicamente de la planta y/o se incorpora en la composición), que puede ser insecticida, nematicida, fungicida o bactericida. Al menos un segundo agente pesticida puede ser insecticida para el mismo insecto que un polipéptido o para un insecto diferente. El segundo agente pesticida puede ser un polipéptido. El agente pesticida puede ser un ARN interferente (por ejemplo, un ARNbc). El segundo agente pesticida puede ser un microorganismo, tal como una bacteria, que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un agente pesticida y/o contiene un agente pesticida, tal como un polipéptido o ARN interferente. El microorganismo se puede atenuar, inactivar por calor o liofilizar. El microorganismo puede estar muerto o ser incapaz de reproducirse. El segundo agente pesticida puede ser un insecticida, por ejemplo, carbofurano, carbarilo, metomil, bifentrina, teflutrina, permetrina, ciflutrina, lambda-cihalotrina, cipermetrina, deltametrina, clorpirifos, cloretoxifos, clotianidina, dimetoato, etoprofos, malatión, metil-paratión, forato, terbufos, tebupirimifos, fipronil, acetamiprid, imidacloprid, tiacloprid, tiametoxam, endosulfan, bensultap, o una combinación de los mismos, o un producto comercial que contiene dichos insecticidas y recubrimientos de semillas insecticidas como se ha descrito anteriormente.

Una composición, por ejemplo una composición que comprende un polipéptido y un vehículo agrícolamente aceptable, se puede usar en métodos agrícolas convencionales. Un vehículo agrícolamente aceptable es una formulación útil para la aplicación de una composición que comprende un polipéptido a una planta o semilla. Por ejemplo, las composiciones se pueden mezclar con agua y/o fertilizantes y se pueden aplicar preemergencia y/o postemergencia a un lugar deseado mediante cualquier medio, tal como tanques de pulverización por avión, equipo de riego, equipo de pulverización por inyección directa, tanques de pulverización de mochila, cubas de inmersión de ganado vacuno, equipo agrícola usado en pulverización terrestre (por ejemplo, pulverizadores de barra, pulverizadores manuales), y similares. El lugar deseado puede ser el suelo, plantas y similares.

Una composición se puede aplicar a una semilla o propágula de planta en cualquier estado fisiológico, en cualquier momento entre la recogida de la semilla y la siembra de la semilla; durante o después de la siembra; y/o después de la germinación. Se prefiere que la semilla o propágula de planta esté en un estado suficientemente duradero que no incurra en ningún daño o en un daño mínimo, que incluye daño físico o daño biológico, durante el proceso de tratamiento. Una formulación se puede aplicar a las semillas o propágulas de planta usando técnicas y máquinas de recubrimiento convencionales, tales como técnicas en lecho fluidizado, el método de molino de rodillos, tratadores de semillas rotoestáticos y recubridoras de tambor.

La presente invención también comprende un método de control de una población de plagas de lepidópteros y/o coleópteros que comprende poner en contacto dicha población con una cantidad eficaz para el control de insectos de un polipéptido con actividad insecticida, donde el polipéptido es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o es 100 % idéntica a SEQ ID NO: 4. Poner en contacto incluye miembros de la población de plagas que se alimentan o ingieren el polipéptido. El polipéptido se puede incorporar en el alimento de la dieta de insectos o se puede expresar en o presentar en un tejido de planta que entonces ingiere el insecto. En realizaciones adicionales, el control de las poblaciones de plagas de lepidópteros y/o coleópteros incluye matar los insectos poniendo en contacto los insectos con una cantidad de control de insectos eficaz de un polipéptido.

Se describe un método de protección de una planta de una plaga de insectos, que comprende expresar en una planta o célula de planta una secuencia de nucleótidos o casete de expresión que codifica un polipéptido insecticida. En realizaciones, la secuencia de nucleótidos es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o es 100 % idéntica a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NOs: 1 a 3 o codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o es 100 % idéntica a SEQ ID NO: 4. En realizaciones adicionales, la planta o célula de planta produce un polipéptido insecticida que tiene actividad insecticida contra una plaga de lepidópteros y/o coleópteros.

Se describe un método de aumento del rendimiento en una planta que comprende cultivar en un campo una planta, o una semilla de la misma, que ha incorporado establemente en su genoma una molécula de ácido nucleico de un casete de expresión de la invención, y en donde dicho campo está infestado con una plaga contra la que dicho polipéptido tiene actividad insecticida.

Una vez se ha transformado un ácido nucleico en una especie de planta particular, se puede propagar en esa especie o se traslada a otras variedades de la misma especie, particularmente que incluyen variedades comerciales, usando técnicas de cultivo tradicionales.

En realizaciones, un ácido nucleico de la presente invención se expresa en plantas transgénicas, por lo que se provoca así la biosíntesis de la proteína insecticida correspondiente en las plantas transgénicas. De esta forma, se generan plantas transgénicas con resistencia potenciada a insectos, particularmente el gusano de la raíz del maíz. Para su expresión en plantas transgénicas, los ácidos nucleicos de la invención se pueden modificar y optimizar opcionalmente. Aunque en muchos casos genes de organismos microbianos se pueden expresar en plantas en altos niveles sin modificación, puede resultar la baja expresión en plantas transgénicas de ácidos nucleicos microbianos que tienen codones que no son preferidos en las plantas. Se conoce en la técnica que todos los organismos tienen preferencias específicas para el uso de codones, y los codones de los ácidos nucleicos descritos en la presente invención se pueden cambiar para adaptarse a las preferencia de las plantas, mientras se mantienen los aminoácidos así codificados. Además, la alta expresión en plantas se logra mejor de secuencias codificantes que tienen al menos aproximadamente 35 % de contenido de GC, preferentemente superior a aproximadamente el 45 %, más preferentemente superior a aproximadamente el 50 %, y lo más preferentemente superior a aproximadamente el 60 %. Los ácidos nucleicos microbianos que tienen bajos contenidos de GC se pueden expresar malamente en plantas debido a la existencia de motivos ATTTA que pueden desestabilizar mensajeros, y motivos de AATAAA que pueden provocar la poliadenilación inapropiada. En realizaciones, las secuencias se pueden modificar para explicar las preferencias de codones específicas y las preferencias de contenido de GC de monocotiledóneas o dicotiledóneas, ya que se ha mostrado que se diferencian estas preferencias (Murray et al. Nucl. Acids Res. 17:477-498 (1989)). Además, los ácidos nucleicos se criban para la existencia de sitios de corte y empalme ilegítimos que puedan causar la truncación de mensajeros. Todos los cambios que se requieren hacer dentro de los ácidos nucleicos, tales como los descritos anteriormente, se pueden hacer usando técnicas bien conocidas de mutagénesis dirigida al sitio, PCR y construcción de genes sintéticos, por ejemplo, usando los métodos descritos en las solicitudes de patente publicadas EP 0385962, EP 0359472 y WO 93/07278.

En una realización, se prepara una secuencia codificante para una proteína insecticida según el procedimiento desvelado en la patente de EE. UU. 5.625.136. En este procedimiento, se usan los codones preferidos del maíz, es decir, el codón individual que codifica más frecuentemente el aminoácido en maíz. El codón preferido del maíz para un aminoácido particular podría derivar, por ejemplo, de secuencias de genes conocidas del maíz. El uso de codones del maíz para 28 genes de plantas de maíz se encuentra en Murray et al., Nucleic Acids Research 17:477-498 (1989).

De este modo, las secuencias de nucleótidos se pueden optimizar para la expresión en cualquier planta. Se reconoce que toda o cualquier parte de la secuencia de genes se puede optimizar o ser sintética. Es decir, también se pueden usar secuencias sintéticas o parcialmente optimizadas.

Para un inicio de la traducción más eficiente, se pueden modificar las secuencias adyacentes a la metionina inicial. Por ejemplo, se pueden modificar por la inclusión de secuencias que se sabe que son eficaces en plantas. Joshi ha sugerido un consenso apropiado para plantas (NAR 15:6643-6653 (1987)) y Clontech sugiere un iniciador de la traducción de consenso adicional (catálogo de 1993/1994, página 210). Estas secuencias consenso son adecuadas para su uso con los ácidos nucleicos de la presente invención. En realizaciones, las secuencias se incorporan en construcciones que comprenden los ácidos nucleicos, hasta y que incluyen ATG (mientras que queda el segundo aminoácido sin modificar), o alternativamente hasta y que incluye el g Tc posterior a ATG (con la posibilidad de modificar el segundo aminoácido del transgén).

La expresión de los ácidos nucleicos en plantas transgénicas es conducida por promotores que funcionan en plantas. La elección del promotor variará dependiendo de los requisitos temporales y espaciales para la expresión, y también dependiendo de la especie diana. Por lo tanto, se prefiere la expresión de los ácidos nucleicos de la presente invención en hojas, en tallos subterráneos o tallos aéreos, en mazorcas, en inflorescencias (por ejemplo, espigas, panículas, zuros, etc.), en raíces, y/o plantas de semillero. En muchos casos, sin embargo, se busca la protección contra más de un tipo de plaga de insectos, y así se desea la expresión en múltiples tejidos. Aunque se ha mostrado que muchos promotores de dicotiledóneas están operativos en monocotiledóneas y viceversa, se seleccionan idealmente promotores de dicotiledóneas para la expresión en dicotiledóneas, y promotores de monocotiledóneas para la expresión en monocotiledóneas. Sin embargo, no hay restricción a la procedencia de promotores seleccionados; es suficiente que sean operacionales en la conducción de la expresión de los ácidos nucleicos en la célula deseada.

En una realización se usan promotores que se expresan constitutivamente que incluyen los promotores de actina o de ubiquitina o de CMP o los promotores de CaMV 35S y 19S. Los ácidos nucleicos de la presente invención también se pueden expresar en la regulación de promotores que están químicamente regulados. La tecnología preferida para la inducción química de la expresión génica se detalla en la solicitud publicada EP 0332 104 (a Ciba-Geigy) y la patente de EE. UU. 5.614.395. Un promotor preferido para la inducción química es el promotor PR-1a del tabaco.

En otra realización, se puede usar una categoría de promotores que es inducible por heridas. Se han descrito numerosos promotores que se expresan en sitios de heridas y también en los sitios de infección fitopatógena. Idealmente, dicho promotor solo debe ser activo localmente en los sitios de infección, y de esta forma las proteínas insecticidas solo se acumulan en células que necesitan sintetizar las proteínas para matar las plagas de insectos invasoras. Los promotores preferidos de este tipo incluyen los descritos por Stanford et al. Mol. Gen. Genet. 215:200-208 (1989), Xu et al. Plant Molec. Biol. 22:573-588 (1993), Logemann et al. Plant Cell 1:151-158 (1989), Rohrmeier & Lehle, Plant Molec. Biol. 22:783-792 (1993), Firek et al. Plant Molec. Biol. 22:129-142 (1993) y Warner et al. Plant J.

3:191-201 (1993).

Los promotores específicos de tejido o preferenciales de tejido útiles para la expresión de genes que codifican proteínas insecticidas en plantas, particularmente maíz, son los que dirigen la expresión en raíz, médula, hoja o polen, particularmente raíz. Dichos promotores, por ejemplo los aislados de PEPC o trpA, se desvelan en la patente de EE. UU. N.° 5.625.136, o MTL, desvelado en la patente de EE. UU. N.° 5.466.785.

Además, se pueden usar promotores funcionales en plástidos. Los ejemplos no limitantes de dichos promotores incluyen el gen 9 del bacteriófago T35' UTR y otros promotores desvelados en la patente de EE. UU. N.° 7.579.516. Otros promotores útiles con la invención incluyen, pero no se limitan a, el promotor de RuBP carboxilasa de la subunidad S-E9 pequeña y el promotor génico del inhibidor de tripsina de Kunitz (Kti3).

En aspectos adicionales, las secuencias de nucleótidos de la invención pueden estar asociadas operativamente a un promotor que es inducible por heridas o inducible por plaga o infección de patógeno (por ejemplo, una plaga de plantas por insectos o nematodos). Se han descrito numerosos promotores que se expresan en sitios de herida y/o en los sitios de ataque de plagas (por ejemplo, alimentación de insectos/nematodos) o infección por fitopatógenos. Idealmente, dicho promotor debe ser activo solo localmente en o adyacente a los sitios de ataque, y de esta forma la expresión de las secuencias de nucleótidos de la invención se centrará en las células que están siendo invadidas o alimentadas. Dichos promotores incluyen, pero no se limitan a, los descrito por Stanford et al., Mol. Gen. Genet.

215:200-208 (1989), Xu et al. Plant Molec. Biol. 22:573-588 (1993), Logemann et al. Plant Cell 1:151-158 (1989), Rohrmeier y Lehle, Plant Molec. Biol. 22:783-792 (1993), Firek et al. Plant Molec. Biol. 22:129-142 (1993), Warner et al. Plant J. 3:191-201 (1993), patente de EE. UU. N.° 5.750.386, patente de EE. UU. N.° 5.955.646, patente de EE. UU. N.° 6.262.344, patente de EE. UU. N.° 6.395.963, patente de EE. UU. N.° 6.703.541, patente de EE. UU. N.° 7.078.589, patente de EE. UU. N.° 7.196.247, patente de EE. UU. N.° 7.223.901 y publicación de solicitud de patente de EE. UU. 2010043102.

En algunas realizaciones de la presente invención, se usa un "promotor mínimo" o "promotor basal". Un promotor mínimo es capaz de reclutar y unir el complejo de ARN polimerasa II y sus proteínas accesorias para permitir la iniciación de la transcripción y elongación. En algunas realizaciones, se construye un promotor mínimo que comprende solo los nucleótidos/secuencias de nucleótidos de un promotor seleccionado que se requieren para la unión de los factores de transcripción y transcripción de una secuencia de nucleótidos de interés que están operativamente asociados al promotor mínimo que incluyen, pero no se limita a, secuencias de la caja TATA. En otras realizaciones, el promotor mínimo carece de secuencias en cis que reclutan y se unen a factores de la transcripción que modulan (por ejemplo, potencian, reprimen, confieren especificidad por tejido, confieren inducibilidad o represibilidad) la transcripción. Un promotor mínimo se pone, en general, aguas arriba (es decir, 5') de una secuencia de nucleótidos a expresar. Por lo tanto, se pueden seleccionar nucleótidos/secuencias de nucleótidos de cualquier promotor útil con la presente invención para su uso como un promotor mínimo.

Se pueden incorporar numerosas otras secuencias en los casetes de expresión descritos en la presente invención. Estas incluyen secuencias que se ha mostrado que potencian la expresión, tales como secuencias de intrones (por ejemplo, de Adhl y bronzel) y secuencias conductoras víricas (por ejemplo, de TMV, MCMV y AMV).

Puede ser preferible dirigir la expresión de los ácidos nucleicos de la presente invención a diferentes localizaciones celulares en la planta. En algunos casos, la localización en el citosol puede ser conveniente, mientras que en otros casos se puede preferir la localización en algún orgánulo subcelular. La localización subcelular de las enzimas localizadas por transgenes se realiza usando técnicas bien conocidas en la técnica. Normalmente, el ADN que codifica el péptido diana de un producto génico dirigido a orgánulos conocido se manipula y fusiona en la dirección 5’ del ácido nucleico. Muchas de dichas secuencias diana son conocidas por el cloroplasto y se ha mostrado su funcionamiento en construcciones heterólogas. La expresión de los ácidos nucleicos de la presente invención también se dirige al retículo endoplásmico o a las vacuolas de las células hospedadoras. Las técnicas para lograr esto se conocen bien en la técnica.

Se conocen bien en la técnica vectores adecuados para la transformación en plantas. Para la transformación mediada por Agrobacterium, son adecuados vectores binarios o vectores que llevan al menos una secuencia límite de T-ADN, mientras que para la transferencia génica directa es adecuado cualquier vector y se puede preferir ADN lineal que contiene solo la construcción de interés. En el caso de transferencia génica directa, se puede usar la transformación o co-transformación con una única especie de ADN (Schocher et al. Biotechnology 4:1093- 1096 (1986)). Para tanto la transferencia génica directa como la transferencia mediada por Agrobacterium, la transformación se realiza normalmente (pero no necesariamente) con un marcador de selección que puede proporcionar resistencia a un antibiótico (kanamicina, higromicina o metotrexato) o un herbicida (Basta). Los vectores de transformación en planta que comprenden las moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención también pueden comprender genes (por ejemplo, fosfomanosa isomerasa; PMI) que proporcionan selección positiva de las plantas transgénicas como se desvela en las patentes de EE. UU. 5.767.378 y 5.994.629. La elección del marcador de selección no es, sin embargo, crítica para la invención.

En realizaciones, el ácido nucleico se puede transformar en el genoma nuclear. En otra realización, un ácido nucleico de la presente invención se transforma directamente en el genoma de plástido. Una ventaja importante de la transformación en plástidos es que los plástidos son, en general, capaces de expresar genes bacterianos sin optimización de codones sustancial, y los plástidos son capaces de expresar múltiples marcos de lectura abiertos bajo el control de un único promotor. La tecnología de transformación de plástidos se describe ampliamente en las patentes de EE. UU. N.25.451.513, 5.545.817 y 5.545.818, en la solicitud PCT N.2 WO 95/16783, y en McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91,7301 -7305. La técnica básica para la transformación de cloroplastos implica introducir regiones de ADN de plástido clonado que flanquea un marcador de selección junto con el gen de interés en un tejido diana adecuado, por ejemplo, usando biolística o transformación de protoplastos (por ejemplo, transformación mediada por cloruro de calcio o PEG). Las regiones flanqueantes de 1 a 1,5 kb, denominadas secuencias de direccionamiento, facilitan la recombinación homóloga con el genoma del plástido y así permiten la sustitución o modificación de regiones específicas del plastoma. Inicialmente, las mutaciones puntuales en el 16S ARNr de cloroplastos y genes rps12 que confieren resistencia a espectinomicina y/o estreptomicina se utilizan como marcadores de selección para la transformación (Svab, Z., Hajdukiewicz, P., y Maliga, P. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8526-8530; Staub, J. M., and Maliga, P. (1992) Plant Cell 4, 39-45). Esto produjo transformantes homoplásmicos estables a una frecuencia de aproximadamente uno por 100 bombardeos de hojas diana. La presencia de sitios de clonación entre estos marcadores permitió la creación de un vector que se dirige a plástido para la introducción de genes extraños (Staub, J.M., y Maliga, P. (1993) EMBO J. 12, 601-606). Aumentos sustanciales en la frecuencia de transformación se obtienen por sustitución de genes de resistencia a antibióticos de ARNr recesivo o r-proteína con un marcador de selección dominante, el gen aadA bacteriano que codifica la enzima desintoxicante de espectinomicina aminoglucósido-3'-adeniltransferasa (Svab, Z., y Maliga, P. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 913-917). Previamente, este marcador se había usado satisfactoriamente para la transformación a alta frecuencia del genoma de plástido del alga verde Chlamydomonas reinhardtii (Goldschmidt-Clermont, M. (1991) Nucl. Acids Res. 19:4083-4089). Otros marcadores de selección útiles para la transformación de plástidos se conocen en la técnica y están englobados dentro del alcance de la invención. Normalmente, se requieren aproximadamente 15-20 ciclos de división celular tras la transformación para alcanzar un estado homoplastídico. La expresión de plásticos, en la que los genes se insertan por recombinación homóloga en todas las diversas miles de copias del genoma de plástido circular presente en cada célula de planta, se aprovecha de la enorme ventaja del número de copias con respecto a los genes expresados en el núcleo para permitir niveles de expresión que pueden superar fácilmente el 10 % de la proteína de planta soluble total. En una realización preferida, un ácido nucleico de la presente invención se inserta en un vector de direccionamiento de plástido y se transforma en el genoma de plástido de un hospedador de planta deseado. Las plantas homoplásticas para los genomas de plástido que contienen un ácido nucleico de la presente invención se obtienen, y son preferentemente capaces de alta expresión del ácido nucleico.

EJEMPLOS

La invención se describirá adicionalmente como referencia a los siguientes ejemplos detallados. Las técnicas convencionales de ADN recombinante y clonación molecular aquí usadas son bien conocidas en la técnica y se describen por J. Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001); por T.J. Silhavy, M.L. Berman y L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) y por Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, New York, John Wiley and Sons Inc., (1988), Reiter, et al., Methods in Arabidopsis Research, World Scientific Press (1992), y Schultz et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers (1998).

Ejemplo 1: Identificación de una proteína con actividad insecticida contra el gusano occidental de la raíz del maíz

Se identificó una proteína insecticida (SEQ ID NO: 4; codificada por SEQ ID NO: 1) y una versión alternativa con un extensión en el extremo N (SEQ ID NO: 9; codificada por SEQ ID NO: 6) de Holdemania massiliensis. Se sintetizaron versiones optimizadas en E. coli de este gen (SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 7) y se clonaron en vectores pET29a, creando construcciones pET29a(Hmass) y pET29a(Hmass_v2). Las construcciones pET29a(Hmass) y pET29a(Hmass_v2) se transformaron en cepas de E. coli JM109 (DE3) o BL21*(DE3) y se llevó a cabo la expresión de proteínas en medios de auto-inducción ZYP-5052 a 25 °C durante 24 horas. Se prepararon lisados a partir de estos cultivos y se probaron para su bioactividad en el gusano occidental de la raíz del maíz. Brevemente, se mezclaron lisados de E. coli con un volumen igual de dieta artificial calentada de insectos (Bioserv, Inc., Frenchtown, NJ) en tubos de centrifugadora de 1,5 ml y luego se aplicaron a placas de Petri pequeñas. Después de la mezcla dieta-muestra enfriada y solidificada, se añadieron 12 larvas de WCR a cada placa. Las placas se taparon y se mantuvieron en condiciones ambiente del laboratorio con respecto a la temperatura, iluminación y humedad relativa. Se usaron lisados de cultivos de E. coli JM109 (DE3) que alojaban el vector pET29a como controles negativos. La mortalidad se evaluó en el día 4 y el día 6.

Como se muestra en la Tabla 1, el lisado del cultivo que expresa pET29a(Hmass) o pET29a(Hmass_v2) mostró una fuerte bioactividad contra WCR. La proteína de H. massiliensis Hmass se renombró HmassCRW.

Tabla 1: Actividad insecticida contra el gusano occidental de la raíz del maíz

Ejemplo 2: HmassCRW purificado posee actividad insecticida contra el gusano occidental de la raíz del maíz

Se produjo una construcción de pET-6his-SUMO que comprende SEQ ID NO: 2 para HmassCRW. La construcción de pET-6his-SUMO-HmassCRW se transformó en BL21 *(DE3) de E. coli para la producción de proteínas. La proteína marcada con SUMO se purificó usando técnicas convencionales para una proteína marcada con His y posteriormente se escindió con la proteína SUMO para liberar la proteína HmassCRW libre de marca. La proteína purificada se probó para su eficacia contra WCR en un bioensayo de incorporación de dieta, realizado como se describe en el Ejemplo 1, excepto que la proteína purificada se mezcló con dieta artificial calentada en lugar de lisados bacterianos. Como se muestra en la Tabla 2, HmassCRW purificada mostró una fuerte bioactividad para WCR con respecto al intervalo de concentraciones probadas (60-900 pg/ml).

Tabla 2: Actividad insecticida de HmassCRW contra WCR

Ejemplo 3: HmassCRW posee actividad insecticida contra el gusano del norte de la raíz del maíz

Se purificó HmassCRW como en el Ejemplo 2 y se probó para su eficacia contra el gusano del norte de la raíz del maíz (NCR) en un ensayo de incorporación de dieta, realizado esencialmente como se describe en el Ejemplo 1, excepto que la mortalidad se evaluó en el día 3 y el día 7. HmassCRW se probó a una concentración de 0,2 mg/ml. El control negativo solo tuvo 1xPBS. Como se muestra en la Tabla 3, HmassCRW demuestra actividad insecticida contra NCR.

Tabla 3: Actividad insecticida de HmassCRW contra NCR

Ejemplo 4: HmassCRW posee actividad insecticida contra el gusano del sur de la raíz del maíz

Se purificó HmassCRW como en el Ejemplo 2 y se probó para su eficacia contra el gusano del sur de la raíz del maíz (SCR) en un ensayo de incorporación de dieta, realizado esencialmente como se describe en el Ejemplo 1, excepto que la mortalidad se evaluó en los días 2, 5 y 8. HmassCRW se probó en dos concentraciones diferentes, 0,5 mg/ml y 0,25 mg/ml. El control negativo solo tuvo IxPBS. Como se muestra en la Tabla 4, HmassCRW demuestra actividad insecticida contra SCR.

Tabla 4: Actividad insecticida de HmassCRW contra SCR

Ejemplo 5: HmassCRW posee actividad insecticida contra el gusano occidental de la raíz del maíz resistente a Cry

Para determinar si la toxicidad de HmassCRW es mediante un modo de acción separado de las proteínas relacionadas con Cry3, HmassCRW se purificó como en el Ejemplo 2 y se probó para su eficacia contra una cepa de WCR que es resistente a la proteína mCry3A (mCry3A-R) y contra una cepa de WCR que es resistente a la toxina eCry3.1Ab (eCry3.1Ab-R). Los ensayos de incorporación en la dieta se realizaron esencialmente como se describe en el Ejemplo 1, excepto que la mortalidad se evaluó en el día 4 y el día 6. HmassCRW se probó en dos concentraciones diferentes, 0,6 mg/ml y 0,3 mg/ml. El control negativo solo tuvo 1xPBS. También se ensayó WCR que no es resistente a mCry3A o eCry3.1Ab (sus = susceptible). Como se muestra en la Tabla 5, HmassCRW demuestra actividad insecticida contra cepas WCR resistentes a Cry.

Tabla 5: Actividad insecticida de HmassCRW contra Cry-R WCR

Ejemplo 6: HmassCRW no posee actividad insecticida contra el gusano cogollero del otoño

Para determinar si HmassCRW tiene actividad insecticida contra el gusano cogollero del otoño, se probó la proteína HmassCRW purificada para su bioactividad para el gusano cogollero del otoño (FAW) en un bioensayo de superposición de dietas, usando bioensayos convencionales de dieta artificial. Se probaron 12 larvas L1 para cada experimento, en una concentración de HmassCRW de 0,2 mg/ml. Se usó 1xPBS como control negativo. Un grupo de control positivo consistió en larvas expuestas a lisados de B121* (DE3) de E. coli que expresan Vip3D. La mortalidad se evaluó en el día 5 y el día 7. Las larvas que alcanzan el estadio L3 no estuvieron afectadas significativamente por el tratamiento. Si las larvas solo alcanzan el estadio L2, entonces es posible que el tratamiento cause la inhibición del crecimiento. Si las larvas siguen en el estadio L1 durante todo el tratamiento, entonces ocurrió la inhibición del crecimiento. Esto también se puede considerar "mortalidad eficaz", ya que las larvas no se desarrollarán más allá del estadio L1 aunque sigan vivas. HmassCRW no fue activo contra FAW en estas condiciones experimentales (Tabla 6).

Tabla 6: Actividad insecticida de HmassCRW contra el gusano cogollero del otoño

Ejemplo 7: HmassCRW no posee actividad insecticida contra los lepidópteros probados

Se probó la proteína HmassCRW purificada para su bioactividad en un panel de plagas de insectos de lepidópteros usando bioensayos de superposición de dietas. Se probaron cada uno del barrenador del maíz europeo (ECB), el gusano cortador negro (BCW) y el gusano elotero del maíz (CEW) para la actividad insecticida de HmassCRW para un ensayo basado en dieta similar al del Ejemplo 6. Se probaron 12 larvas L1 para cada experimento, en una concentración de HmassCRW de 0,2 mg/ml. Un grupo de control positivo consistió en larvas expuestas a lisados de Bl21* (DE3) de E. coli que expresan Vip3D. Se usó 1xPBS como control negativo. Como en el Ejemplo 6, también se usaron los lisados de cultivos bacterianos de Bl21* (DE3) que alojan el vector pET29 vacío como controles negativos. La mortalidad se evaluó en el día 5 y el día 7. Las larvas que alcanzan el estadio L3 no estuvieron afectadas significativamente por el tratamiento. Si las larvas solo alcanzan el estadio L2, entonces es posible que el tratamiento cause la inhibición del crecimiento. Si las larvas siguen en el estadio L1 durante todo el tratamiento, entonces ocurrió la inhibición del crecimiento. Esto también se puede considerar "mortalidad eficaz", ya que las larvas no se desarrollarán más allá del estadio L1 aunque sigan vivas. HmassCRW no fue activo contra las plagas de insectos lepidópteros probadas en estas condiciones experimentales (Tabla 7).

Tabla 7: Actividad insecticida de HmassCRW contra lepidópteros

Insecto Tratamiento

Día 4

Día 6

Muertos % de Observaciones Muertos % de Observaciones mortalidad mortalidad

L1 = 1° estadio, L2 = 2° estadio, L3 = 3° estadio

Ejemplo 8: Transformación de maíz con HmassCRW

Se generó la construcción 23474 para experimentos de transformación de maíz con HmassCRW. La construcción 23474 comprende un casete de expresión que comprende cPMI, que codifica el marcador de selección fosfomanosa isomerasa (PMI)) que confiere la capacidad para metabolizar manosa (patentes de EE. UU. N.° 5.767.378 y 5.994.629), y un casete de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos optimizada en codones del maíz que codifica HmassCRW optimizada en codones de maíz (SEQ ID NO: 3).

La construcción 23474 se transformó en Agrobacterium tumefaciens usando técnicas convencionales de biología molecular conocidas por los expertos en la técnica. Para preparar las agrobacterias para la transformación, las células se cultivaron en medio YPC líquido a 28 °C y 220 rpm durante la noche. La transformación en Agrobacterium de embriones inmaduros de maíz se realizó esencialmente como se describe en Negrotto et al., 2000 (Plant Cell Reports 19: 798-803). Para este ejemplo, todos los constituyentes de medio son esencialmente como se describen en Negrotto et al., arriba. Sin embargo, se pueden sustituir diversos constituyentes de medio conocidos en la técnica.

T ras la transformación, selección y regeneración, las plantas se ensayaron para la presencia del gen pmi y la secuencia codificante optimizada en codones de maíz HmassCRW (SEQ ID NO: 3) usando análisis TaqMan®. Las plantas también se probaron para la presencia del esqueleto de vector. 27 plantas negativas para el esqueleto de vector y que comprenden una copia del transgén de la construcción 23474 se transfirieron al invernadero y se probaron para la resistencia al daño por WCR.

Ejemplo 9: Plantas de maíz que expresan HmassCRW tienen actividad insecticida contra WCR

La presencia de HmassCRW se detectó por ELISA en ng/mg de proteína soluble total (TSP) en tejido de hoja y raíz de cada evento. Se tomaron muestras de tejido de raíz de maíz de cada evento cuando los eventos de maíz que expresan HmassCRW alcanzaron el estadio V3-V4. Se dispuso tejido de raíz de maíz en una placa de Petri y luego se infectó con 12 larvas de WCR en un bioensayo de segmentos de raíz. Se evaluaron dos muestras de tejido de raíz (Rep1 y Rep2) para orificios de alimentación (FH) y daño por cicatrización en el día 3. El tejido de raíz de maíz no transformado (nulo) sirvió de control negativo. El tejido de raíz de una planta transgénica del evento MIR604 (patentes de EE. UU. N.° 7.361.803 y 7.897.748), que comprende mCry3A, se usó como control positivo. La expresión de HmassCRW en eventos de maíz proporcionaron protección de WCR en la mayor parte del tejido de raíz transgénico de HmassCRW cuando se comparó con el tejido de raíz de muestra nula (Tabla 8).

Tabla 8: Actividad insecticida de maíz HmassCRW transgénico contra WCR

Claims (17)

REIVINDICACIONES

1. Un casete de expresión que comprende un promotor operativamente unido a una molécula de ácido nucleico heteróloga que comprende:

(a) una secuencia de nucleótidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 1 a 3;

(b) una secuencia de nucleótidos que es al menos 80 % idéntica a la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de SEQ ID NOs: 1 a 3;

(c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido, en donde la secuencia de aminoácidos del polipéptido comprende SEQ ID NO: 4;

(d) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido, en donde la secuencia de aminoácidos del polipéptido es al menos 80 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4;

(e) una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de (a) a (d) anteriores.

2. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3.

3. Una planta transgénica o semilla de la misma que comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.

4. Un vector que comprende el casete de expresión de la reivindicación 1.

5. Una célula hospedadora que contiene el casete de expresión de la reivindicación 1.

6. Un método de producción de una planta o parte de planta que tiene resistencia potenciada a insectos en comparación con una planta o parte de planta de control, que comprende:

(a) introducir una molécula de ácido nucleico que comprende el casete de expresión de la reivindicación 1 en una parte de planta por transformación; y

(b) cultivar la parte de planta en una planta que expresa la molécula de ácido nucleico y que tiene resistencia potenciada a insectos en comparación con una planta o parte de planta de control que no comprende una molécula de ácido nucleico que comprende el casete de expresión de la reivindicación 1.

7. El método de la reivindicación 6, en donde el casete de expresión codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 85 % idéntica a SEQ ID NO: 4.

8. Un método de potenciamiento de la resistencia a insectos en una planta o parte de planta en comparación con una planta o parte de planta de control, que comprende expresar en la planta o parte de planta el casete de expresión de la reivindicación 1, en donde la expresión del casete de expresión da como resultado resistencia potenciada a insectos en una planta o parte de planta en comparación con una planta o parte de planta de control.

9. Un método de producción de una planta que tiene resistencia potenciada a insectos en comparación con una planta de control, que comprende detectar, en una parte de planta, un ácido nucleico que comprende el casete de expresión de la reivindicación 1 y producir una planta a partir de la parte de planta, produciendo así una planta que tiene resistencia potenciada a insectos en comparación con una planta de control.

10. Un método de identificación de una planta o parte de planta que tiene resistencia potenciada a insectos en comparación con una planta o parte de planta de control, que comprende detectar, en la planta o parte de planta, un ácido nucleico de la reivindicación 2, identificando así una planta o parte de planta que tiene resistencia potenciada a insectos.

11. El método de la reivindicación 9, en donde la resistencia potenciada a insectos es contra Diabrotica virgifera virgifera, Diabrotica barberi y/o Diabrotica undecimpunctata howardi.

12. El método de la reivindicación 6, en donde la planta es mijo, pasto varilla, maíz, sorgo, trigo, avena, hierba de césped, hierba de pasto, lino, arroz, caña de azúcar, colza oleaginosa o cebada.

13. Una planta transgénica que comprende una molécula de ácido nucleico que confiere resistencia potenciada a insectos, en donde dicha molécula de ácido nucleico comprende el casete de expresión de la reivindicación 1.

14. La planta transgénica de la reivindicación 13, en donde dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia al menos 80 % idéntica a una cualquiera de SEQ ID NO: 1 a 3.

15. La planta transgénica de la reivindicación 13, en donde dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia al menos 95 % idéntica a SEQ ID NO: 3.

16. La planta transgénica de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en donde dicha planta es mijo, pasto varilla, maíz, sorgo, trigo, avena, hierba de césped, hierba de pasto, lino, arroz, caña de azúcar, colza oleaginosa o cebada.

17. Un método de control de una población de plagas de lepidópteros o coleópteros que comprende poner en contacto dicha población con una cantidad eficaz de control de insectos de un polipéptido con actividad insecticida, en donde el polipéptido se selecciona del grupo que consiste en:

a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; y

b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.