BR112019014369B1 - Cassete de expressão, polipeptídeo, vetor, célula hospedeira e método para controlar uma população de pragas de coleópteros - Google Patents

Abstract

CASSETE DE EXPRESSÃO, POLIPEPTÍDEO, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA E MÉTODO PARA CONTROLAR UMA POPULAÇÃO DE PRAGAS DE COLEÓPTEROS. São divulgadas composições e métodos para controlar pragas de plantas. Em particular, são proporcionadas novas proteínas inseticidas que têm toxicidade contra pragas de insetos Coleópteros e/ou Lepidópteros. São também proporcionadas moléculas de ácido nucleico que codificam as novas proteínas inseticidas. Métodos de produção das proteínas inseticidas e métodos de uso das proteínas inseticidas e ácidos nucleicos que codificam as proteínas inseticidas da presente invenção, por exemplo, em plantas transgênicas para conferir proteção contra danos causados por insetos, são também divulgados.

Description

PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] O presente pedido reivindica o benefício do pedido provisório US N° 62/445,429, depositado a 12 de janeiro de 2017, e incorporado por referência na sua totalidade no presente documento.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0002] Uma Listagem de Sequências em formato de texto ASCII, submetida sob 37 C.F.R. § 1.821, intitulada "81158_PCT_T25.txt", 305 kilobytes de tamanho, gerada a 28 de novembro de 2017 e depositada através de EFS-Web é fornecida em vez de uma cópia em papel. Esta Listagem de Sequências é deste modo incorporada por referência no relatório descritivo quanto às suas divulgações.

ÁREA DA INVENÇÃO

[0003] A presente invenção se relaciona com os campos de engenharia de proteína, biologia molecular vegetal e controle de praga. Mais particularmente, a invenção se relaciona com uma nova proteína e suas variantes tendo atividade inseticida, ácidos nucleicos cuja expressão resultada nas proteínas inseticidas, e métodos de fabrico e métodos de uso das proteínas inseticidas e ácidos nucleicos correspondentes para controlar insetos.

ANTECEDENTES

[0004] As pragas de insetos são uma causa importante na perda de culturas. Somente nos EUA, bilhões de dólares são perdidos anualmente devido a infestações por vários gêneros de insetos. Adicionalmente às perdas nas culturas agrícolas, as pragas de insetos são também um peso para os horticultores e fruticultores, para os produtores de flores ornamentais, e eles são um incômodo para jardineiros e proprietários.

[0005] Espécies de lagarta-da-raiz do milho são consideradas como sendo as mais destrutivas das pragas de milho. Nos Estados Unidos, as três espécies importantes são Diabrotica virgifera virgifera, a lagarta-da-raiz do milho do oeste, D. longicornis barberi, a lagarta-da- raiz do milho do norte e D. undecimpunctata howardi, a lagarta-da-raiz do milho do sul. Apenas as lagarta-da-raiz do milho do oeste e norte são consideradas pragas primárias de milho no Cinturão do Milho dos EUA. Além disso, uma importante praga da lagarta-da-raiz do milho no sul dos EUA é a lagarta-da-raiz do milho mexicana, Diabrotica virgifera zeae. Larvas de lagarta-da-raiz do milho causam o dano mais substancial da planta, uma vez que se alimentam quase exclusivamente de raízes do milho. Este dano tem demonstrado aumentar o acamamento de planta, reduzir o rendimento de grãos e o rendimento vegetativo, bem como alterar o teor de nutrientes do grão. A alimentação larval também causa efeitos indiretos no milho, abrindo avenidas através das raízes para infecções bacterianas e fúngicas que levam a doenças de podridão da raiz e do caule. Lagartas-da-raiz do milho adultas são ativas em searas no final do verão, onde se alimentam de espigas, sedas e pólen, interferindo assim com a polinização normal.

[0006] As lagartas-da-raiz do milho são principalmente controladas por aplicações intensivas de pesticidas químicos, que são ativos por inibição do crescimento de insetos, prevenção da alimentação ou reprodução de insetos ou por causarem a morte. Um bom controle da lagarta-da-raiz do milho pode assim ser alcançado, mas estes químicos podem por vezes afetar também outros organismos benéficos. Outro problema que resulta do uso amplo de pesticidas químicos é o aparecimento de variedades de insetos resistentes. Ainda outro problema é devido ao fato de que as larvas da lagarta-da- raiz do milho se alimentarem no subsolo, dificultando assim a aplicação de tratamentos de inseticidas de resgate. Portanto, a maioria das aplicações de inseticidas é feita profilaticamente no momento do plantio. Essa prática resulta em um grande impacto ambiental. Isto tem sido parcialmente minimizado por várias práticas de gestão agrícola, mas existe uma necessidade crescente de mecanismos alternativos de controle de pragas.

[0007] Os agentes biológicos de controle de pragas, tais como estirpes de Bacillus thuringiensis (Bt) expressando toxinas pesticidas do tipo d-endotoxinas (delta-endotoxinas; também chamadas toxinas cristalinas ou proteínas Cry), têm sido aplicadas a plantas de culturas com resultados satisfatórios contra pragas de insetos. As d- endotoxinas são proteínas contidas em uma matriz cristalina que são conhecidas por possuírem atividade inseticida quando ingeridas por certos insetos. Várias proteínas Cry nativas de Bacillus thuringiensis ou proteínas Cry manipuladas, têm sido expressas em plantas transgênicas cultivadas e exploradas comercialmente para controlar certas pragas de insetos lepidópteros e coleópteros. Por exemplo, começando em 2003, híbridos transgênicos de milho que controlam a lagarta-da-raiz do milho por expressão de uma proteína Cry3Bb1, Cry34Ab1/Cry35Ab1 ou Cry3A modificada (mCry3A) ou Cry3Ab (eCry3.1Ab) têm estado disponíveis comercialmente nos EUA.

[0008] Embora o uso de plantas transgênicas expressando proteínas Cry tenha se mostrado extremamente eficaz, são conhecidas pragas de insetos que agora têm resistência contra as proteínas Cry expressas em certas plantas transgênicas. Em conformidade, permanece a necessidade de identificar agentes de controle de pragas novos e eficazes que forneçam um benefício econômico aos fazendeiros e que sejam aceitáveis em relação ao ambiente. Particularmente necessárias são proteínas que são tóxicas para as espécies de Diabrotica, uma das principais pragas do milho, que tenham um modo de ação diferente dos produtos de controle de insetos existentes como forma de mitigar o desenvolvimento de resistência. Além disso, administração de agentes de controle de insetos através de produtos que minimiza a carga sobre o meio ambiente, como através de plantas transgênicas, são desejáveis. SUMÁRIO

[0009] Tendo em vista estas necessidades, a presente invenção proporciona novas proteínas inseticidas, nomeadamente WoodsCRW, as suas variantes e proteínas que são substancialmente idênticas a WoodsCRW e às suas variantes. As proteínas da invenção têm toxicidade para a lagarta da raiz do milho (Diabrotica spp). As proteínas a invenção podem também ter toxicidade para outros Coleópteros e/ou para Lepidópteros. A invenção se refere adicionalmente a moléculas de ácido nucleico que codificam WoodsCRW ou suas variantes, seus complementos, ou que são substancialmente idênticas a WoodsCRW e suas variantes.

[0010] Também incluídos na invenção estão os vetores que contenham tais ácidos nucleicos recombinantes (ou complementares aos mesmos); uma planta ou microrganismo que inclui e permite a expressão de tais ácidos nucleicos; plantas transformadas com tais ácidos nucleicos, por exemplo, plantas de milho transgênicas; a progênie de tais plantas que contêm os ácidos nucleicos estavelmente incorporados e hereditários de uma forma Mendeliana e/ou as sementes de tais plantas e tal progênie. A invenção também inclui métodos de manipulação para introduzir um transgene compreendendo uma molécula de ácido nucleico da invenção em uma planta de progênie e em vários germoplasmas.

[0011] A invenção também inclui composições e formulações contendo WoodsCRW ou suas variantes, que são capazes de inibir a capacidade de pragas de insetos para sobreviver, crescer e/ou reproduzir, ou de limitar os danos relacionados com o inseto ou de perda de plantas de cultura, por exemplo aplicando WoodsCRW ou suas variantes como parte de composições ou formulações para áreas ou plantas infestadas de insetos, ou para tratar profilaticamente áreas ou plantas susceptíveis a insetos para conferir proteção contra as pragas de insetos.

[0012] A invenção se refere adicionalmente a um método de fabrico de WoodsCRW, ou suas variantes, e a métodos de uso dos ácidos nucleicos, por exemplo, em microrganismos para controlar insetos ou em plantas transgênicas para conferir proteção contra danos causados por insetos.

[0013] As novas proteínas descritas aqui são ativas contra insetos. Por exemplo, em modalidades, as proteínas da presente invenção podem ser usadas para controlar pragas de insetos economicamente importantes, incluindo insetos Coleópteros, como lagarta-da-raiz do milho do oeste (WCR), lagarta-da-raiz do milho do norte (NCR), lagarta-da-raiz do milho do sul (SCR) e/ou lagarta-da-raiz do milho mexicana (D. virgifera zeae). As proteínas inseticidas da invenção podem ser usadas isoladamente ou em combinação com outras estratégias de controle de insetos para conferir eficácia melhorada de controle de pragas contra a mesma praga de insetos e/ou para aumentar o espectro de insetos alvo com impacto ambiental mínimo.

[0014] Outros aspectos e vantagens da presente invenção se tornarão evidentes para o perito na técnica a partir de um estudo da seguinte descrição da invenção e dos exemplos não limitadores. BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS NA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SEQ ID NO: 1 é a sequência de aminoácidos WoodsCRW. SEQ ID NO: 2 é sequência de nucleotídeos otimizada WoodsCRW de E. coli SEQ ID NO: 3 é a sequência de nucleotídeos nativa WoodsCRW. SEQ ID NO: 4 é sequência de nucleotídeos variante C485S de WoodsCRW. SEQ ID NO: 5 é sequência de nucleotídeos variante C435S de WoodsCRW. SEQ ID NO: 6 é sequência de nucleotídeos variante C398S de WoodsCRW. SEQ ID NO: 7 é sequência de nucleotídeos variante C383S de WoodsCRW. SEQ ID NO: 8 é sequência de nucleotídeos variante C313S de WoodsCRW. SEQ ID NO: 9 é sequência de nucleotídeos variante Y194W de WoodsCRW. SEQ ID NO: 10 é sequência de nucleotídeos variante Y194F de WoodsCRW. SEQ ID NO: 11 é sequência de nucleotídeos variante C383S/C485S de WoodsCRW. SEQ ID NO: 12 é sequência de nucleotídeos variante C435S/C485S de WoodsCRW. SEQ ID NO: 13 é sequência de nucleotídeos variante C398S/C435S de WoodsCRW. SEQ ID NO: 14 é sequência de nucleotídeos variante C398S/C485S de WoodsCRW. SEQ ID NO: 15 é sequência de nucleotídeos variante C383S/C435S/C485S de WoodsCRW. SEQ ID NO: 16 é sequência de nucleotídeos variante C313S/C383S/C398S/C435S/C485S de WoodsCRW. SEQ ID NO: 17 é sequência de nucleotídeos variante K396L de WoodsCRW. SEQ ID NO: 18 é sequência de nucleotídeos variante K406L de WoodsCRW. SEQ ID NO: 19 é sequência de nucleotídeos variante C383A/C485A de WoodsCRW. SEQ ID NO: 20 é sequência de nucleotídeos variante C398A/C485A de WoodsCRW. SEQ ID NO: 21 é sequência de nucleotídeos variante C383L de WoodsCRW. SEQ ID NO: 22 é sequência de nucleotídeos variante C398L de WoodsCRW. SEQ ID NO: 23 é sequência de nucleotídeos variante I77L/I83L/Y98F de WoodsCRW. SEQ ID NO: 24 é sequência de nucleotídeos variante Y248F/I264L/Y277F de WoodsCRW. SEQ ID NO: 25 é sequência de nucleotídeos variante Y326F/I340L/I351L de WoodsCRW. SEQ ID NO: 26 é sequência de nucleotídeos variante I209L/Y223F/I228L de WoodsCRW. SEQ ID NO: 27 é sequência de nucleotídeos variante I447L/Y464F/I469L de WoodsCRW. SEQ ID NO: 28 é sequência de nucleotídeos variante C435L de WoodsCRW. SEQ ID NO: 29 é sequência de nucleotídeos variante C485L de WoodsCRW. SEQ ID NO: 30 é sequência de nucleotídeos variante I403L/I404L de WoodsCRW. SEQ ID NO: 31 é sequência de nucleotídeos variante V399L de WoodsCRW. SEQ ID NO: 32 é sequência de nucleotídeos variante V399F de WoodsCRW. SEQ ID NO: 33 é sequência de nucleotídeos variante C398F de WoodsCRW. SEQ ID NO: 34 é sequência de nucleotídeos variante C398Y de WoodsCRW. SEQ ID NO: 35 é sequência de nucleotídeos variante C398I de WoodsCRW. SEQ ID NO: 36 é sequência de nucleotídeos variante C398M de WoodsCRW. SEQ ID NO: 37 é sequência de aminoácidos variante C485S de WoodsCRW. SEQ ID NO: 38 é sequência de aminoácidos variante C435S de WoodsCRW. SEQ ID NO: 39 é sequência de aminoácidos variante C398S de WoodsCRW. SEQ ID NO: 40 é sequência de aminoácidos variante C383S de WoodsCRW. SEQ ID NO: 41 é sequência de aminoácidos variante C313S de WoodsCRW. SEQ ID NO: 42 é sequência de aminoácidos variante Y194W de WoodsCRW. SEQ ID NO: 43 é sequência de aminoácidos variante Y194F de WoodsCRW. SEQ ID NO: 44 é sequência de aminoácidos variante K396L de WoodsCRW. SEQ ID NO: 45 é sequência de aminoácidos variante K406L de WoodsCRW. SEQ ID NO: 46 é sequência de aminoácidos variante C383S/C485S de WoodsCRW. SEQ ID NO: 47 é sequência de aminoácidos variante C435S/C485S de WoodsCRW. SEQ ID NO: 48 é sequência de aminoácidos variante C398S/C435S de WoodsCRW. SEQ ID NO: 49 é sequência de aminoácidos variante C398S/C485S de WoodsCRW. SEQ ID NO: 50 é sequência de aminoácidos variante C383S/C435S/C485S de WoodsCRW. SEQ ID NO: 51 é sequência de aminoácidos variante C313S/C383S/C398S/C435S/C485S de WoodsCRW. SEQ ID NO: 52 é sequência de aminoácidos variante C383A/C485A de WoodsCRW. SEQ ID NO: 53 é sequência de aminoácidos variante C398A/C485A de WoodsCRW. SEQ ID NO: 54 é sequência de aminoácidos variante C383L de WoodsCRW. SEQ ID NO: 55 é sequência de aminoácidos variante C398L de WoodsCRW. SEQ ID NO: 56 é sequência de aminoácidos variante I77L/I83L/Y98F de WoodsCRW. SEQ ID NO: 57 é sequência de aminoácidos variante Y248F/I264L/Y277F de WoodsCRW. SEQ ID NO: 58 é sequência de aminoácidos variante Y326F/I340L/I351L de WoodsCRW. SEQ ID NO: 59 é sequência de aminoácidos variante I209L/Y223F/I228L de WoodsCRW. SEQ ID NO: 60 é sequência de aminoácidos variante I447L/Y464F/I469L de WoodsCRW. SEQ ID NO: 61 é sequência de aminoácidos variante C435L de WoodsCRW. SEQ ID NO: 62 é sequência de aminoácidos variante C485L de WoodsCRW. SEQ ID NO: 63 é sequência de aminoácidos variante I403L/I404L de WoodsCRW. SEQ ID NO: 64 é sequência de aminoácidos variante V399L de WoodsCRW. SEQ ID NO: 65 é sequência de aminoácidos variante V399F de WoodsCRW. SEQ ID NO: 66 é sequência de aminoácidos variante C398F de WoodsCRW. SEQ ID NO: 67 é sequência de aminoácidos variante C398Y de WoodsCRW. SEQ ID NO: 68 é sequência de aminoácidos variante C398I de WoodsCRW. SEQ ID NO: 69 é sequência de aminoácidos variante C398M de WoodsCRW. SEQ ID NO: 70 e 71 são sequências de aminoácidos de fragmentos de WoodsCRW. SEQ ID NO: 72 é uma sequência de aminoácidos de WoodsCRW, em que "X" pode ser qualquer aminoácido. SEQ ID NO: 73 é a sequência de nucleotídeos da variante D397-Leu- Leu-C398 de WoodsCRW, compreendendo dois resíduos de leucina inseridos. SEQ ID NO: 74 é a sequência de nucleotídeos da variante C398-Leu- Leu-V399 de WoodsCRW, compreendendo dois resíduos de leucina inseridos. SEQ ID NO: 75 é sequência de nucleotídeos da variante D397-Leu- C398-Leu de WoodsCRW, compreendendo dois resíduos de leucina inseridos. SEQ ID NO: 76 é a sequência de nucleotídeos da variante Y436F de WoodsCRW. SEQ ID NO: 77 é a sequência de nucleotídeos da variante D397-Leu- C398 de WoodsCRW, compreendendo um resíduo de leucina inserido. SEQ ID NO: 78 é a sequência de nucleotídeos da variante C398-Leu- V399 de WoodsCRW, compreendendo um resíduo de leucina inserido. SEQ ID NO: 79 é a sequência de nucleotídeos da variante L382-Leu- C383 de WoodsCRW, compreendendo um resíduo de leucina inserido. SEQ ID NO: 80 é a sequência de nucleotídeos da variante C383-Leu- Y384 de WoodsCRW, compreendendo um resíduo de leucina inserido. SEQ ID NO: 81 é a sequência de nucleotídeos da variante L434-Leu- C435 de WoodsCRW, compreendendo um resíduo de leucina inserido. SEQ ID NO: 82 é a sequência de nucleotídeos da variante C435-Leu- Y436 de WoodsCRW, compreendendo um resíduo de leucina inserido. SEQ ID NO: 83 é a sequência de nucleotídeos da quimera Plu1415- Woods. SEQ ID NO: 84 é a sequência de nucleotídeos da quimera Woods- Plu1415. SEQ ID NO: 85 é a sequência de aminoácidos da proteína Plu1415. SEQ ID NO: 86 é a sequência de aminoácidos da variante D397-Leu- Leu-C398 de WoodsCRW, compreendendo dois resíduos de leucina inseridos. SEQ ID NO: 87 é a sequência de aminoácidos da variante C398-Leu- Leu-V399 de WoodsCRW, compreendendo dois resíduos de leucina inseridos. SEQ ID NO: 88 é sequência de aminoácidos da variante D397-Leu- C398-Leu de WoodsCRW, compreendendo dois resíduos de leucina inseridos. SEQ ID NO: 89 é a sequência de aminoácidos da variante Y436F de WoodsCRW. SEQ ID NO: 90 é a sequência de aminoácidos da variante D397-Leu- C398 de WoodsCRW, compreendendo um resíduo de leucina inserido. SEQ ID NO: 91 é a sequência de aminoácidos da variante C398-Leu- V399 de WoodsCRW, compreendendo um resíduo de leucina inserido. SEQ ID NO: 92 é a sequência de aminoácidos da variante L382-Leu- C383 de WoodsCRW, compreendendo um resíduo de leucina inserido. SEQ ID NO: 93 é a sequência de aminoácidos da variante C383-Leu- Y384 de WoodsCRW, compreendendo um resíduo de leucina inserido. SEQ ID NO: 94 é a sequência de aminoácidos da variante L434-Leu- C435 de WoodsCRW, compreendendo um resíduo de leucina inserido. SEQ ID NO: 95 é a sequência de aminoácidos da variante C435-Leu- Y436 de WoodsCRW, compreendendo um resíduo de leucina inserido. SEQ ID NO: 96 é a sequência de aminoácidos da quimera Plu1415- Woods. SEQ ID NO: 97 é a sequência de aminoácidos da quimera Woods- Plu1415. SEQ ID NO: 98 é a sequência de aminoácidos da proteína Plu1415. SEQ ID NO: 99 é a sequência de nucleotídeos do domínio ß-prisma do C-terminal de WoodsCRW (aminoácidos 347-490). SEQ ID NO: 100 é a sequência de aminoácidos do domínio ß-prisma do C-terminal de WoodsCRW (aminoácidos 347-490). DEFINIÇÕES

[0015] Para clareza, certos termos usados no relatório descritivo são definidos e apresentados como se segue:

[0016] "Atividade" das proteínas inseticidas da invenção se pretende significar que as proteínas inseticidas funcionam como agentes de controle de insetos oralmente ativos, têm um efeito tóxico, e/ou são capazes de interromper ou deter a alimentação do inseto, que pode, ou não, ocasionar a morte do inseto. Quando uma proteína inseticida da invenção é administrada ao inseto, o resultado é tipicamente a morte do inseto, ou o inseto não se alimenta da fonte que torna a proteína inseticida disponível para o inseto. "Pesticida" é definido como uma atividade biológica tóxica capaz de controlar uma praga, tal como um inseto, nematódeo, fungo, bactéria, ou vírus, preferencialmente por sua morte ou destruição. "Inseticida" é definido como uma atividade biológica tóxica capaz de controlar insetos, preferencialmente por sua morte. Um "agente pesticida" é um agente que tem atividade pesticida. Um "agente inseticida" é um agente que tem atividade inseticida.

[0017] "Associada com/operacionalmente ligada" se refere a dois ácidos nucleicos que estão fisicamente ou funcionalmente relacionadas. Por exemplo, uma sequência de DNA promotora ou reguladora se diz estar "associada a" uma sequência de DNA que codifica RNA ou uma proteína no caso das duas sequências estarem ligadas operacionalmente, ou situadas de modo a que a sequência de DNA reguladora venha a afetar o nível de expressão da sequência de DNA estrutural ou codificante.

[0018] Uma "sequência codificante" é uma sequência de ácidos nucleicos que é transcrita em RNA tal como mRNA, rRNA, tRNA, snRNA, RNA senso ou RNA antissenso. Preferencialmente, o RNA é depois traduzido em um organismo para produzir uma proteína.

[0019] "Controlar" insetos significar inibir, através de um efeito tóxico, a capacidade de pragas de insetos sobreviverem, proliferarem, alimentarem e/ou reproduzirem, ou limitar o dano ou perda relacionado com insetos em plantas de cultura. "Controlar" insetos pode ou não significar a morte dos insetos, embora signifique preferencialmente a morte dos insetos.

[0020] "Administrar" uma proteína inseticida significa que a proteína inseticida entra em contato com um inseto, resultando em um efeito tóxico e controle do inseto. A proteína inseticida pode ser administrada em muitas formas reconhecidas, por exemplo, através de uma planta transgênica expressando a proteína inseticida, composição(ões) proteicas formuladas, composição(ões) proteicas pulverizáveis, uma matriz isca, ou qualquer outro sistema de administração de toxina reconhecido pela técnica.

[0021] "Quantidade eficaz para o controle de insetos" significa que a concentração de uma proteína inseticida que inibe, através de um efeito tóxico, a capacidade de insetos sobreviverem, crescerem, se alimentarem e/ou reproduzirem ou para limitar os danos relacionados com insetos ou perda em plantas de cultura. "Quantidade eficaz para o controle de insetos" pode ou não significar a morte dos insetos, embora signifique preferencialmente a morte dos insetos.

[0022] "Cassete de expressão" conforme usado no presente documento significa uma sequência de ácido nucleico capaz de dirigir a expressão de uma sequência de nucleotídeos específica em uma célula hospedeira adequada, compreendendo um promotor ligado de modo operacional a sequência de nucleotídeos de interesse que é ligado de modo operacional a sinais de terminação. Esse também compreende tipicamente sequências necessárias para tradução apropriada da sequência de nucleotídeos. O cassete de expressão compreendendo a sequência de nucleotídeos de interesse pode ter pelo menos um de seus componentes heterólogo em relação a pelo menos a um dos seus outros componentes. O cassete de expressão também pode ser um que ocorre naturalmente, mas que foi obtido em uma forma recombinante útil para expressão heteróloga. Tipicamente, no entanto, o cassete de expressão é heterólogo no que diz respeito ao hospedeiro, ou seja, a sequência de ácidos nucleicos particular do cassete de expressão não ocorre naturalmente na célula hospedeira e tem de ser introduzida na célula hospedeira ou em um antepassado da célula hospedeira por um evento de transformação. A expressão da sequência de nucleotídeos no cassete de expressão pode ser sob o controle de um promotor constitutivo ou de um promotor induzível que inicia a transcrição somente quando a célula hospedeira é exposta a algum estímulo externo particular. No caso de um organismo multicelular, tal como uma planta, o promotor pode ser também específico quanto a um tecido, ou órgão, particular, ou estágio de desenvolvimento.

[0023] Um cassete de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeos de interesse pode ser quimérico, significando que pelo menos um dos seus componentes é heterólogo no que diz respeito a pelo menos um dos seus outros componentes. Um cassete de expressão pode ser também um que compreende um promotor nativo dirigindo o seu gene nativo, no entanto foi obtido em uma forma recombinante útil para expressão heteróloga. Tal uso de um cassete de expressão faz com que não ocorra naturalmente na célula na qual foi introduzido.

[0024] Um cassete de expressão pode também incluir opcionalmente uma região de terminação transcricional e/ou traducional (ou seja, região de terminação) que é funcional em plantas. Uma variedade de terminadores transcricionais está disponível para uso em cassetes de expressão e é responsável pela terminação da transcrição para além da sequência de nucleotídeos heteróloga de interesse e poliadenilação correta de mRNA. A região de terminação pode ser nativa em relação à região de iniciação transcricional, pode ser nativa em relação à sequência de nucleotídeos de interesse operacionalmente ligada, pode ser nativa em relação à planta hospedeira, ou pode ser derivada de outra fonte (ou seja, estranha ou heteróloga em relação ao promotor, à sequência de nucleotídeos de interesse, à hospedeira de planta, ou qualquer sua combinação). Terminadores transcricionais apropriados incluem o, mas não estão limitados ao terminador de 35S do CAMV, o terminador de tml, o terminador da nopalina sintase e/ou o terminador de rbcs E9 da ervilha. Estes podem ser usados tanto em monocotiledôneas como em dicotiledôneas. Adicionalmente pode ser usado um terminador da transcrição nativo de uma sequência codificante. Qualquer terminador disponível conhecido por funcionar em plantas pode ser usado no contexto da presente invenção.

[0025] O termo "expressão" quando usado com referência a um polinucleotídeo, como um gene, ORF ou porção dos mesmos, ou um transgene em plantas, se refere ao processo de conversão de informações genéticas codificadas em um gene em RNA (por exemplo, mRNA, rRNA, tRNA ou snRNA) através de "transcrição" do gene (isto é, através da ação enzimática de uma RNA polimerase), e em proteína onde aplicável (por exemplo, se um gene codificar uma proteína), através de "tradução" de mRNA. A expressão de gene pode ser regulada em muitos estágios no processo. Por exemplo, no caso de construções antissenso ou de dsRNA, respectivamente, a expressão pode se referir à transcrição do RNA antissenso apenas ou do dsRNA apenas. Em modalidades, "expressão" se refere à transcrição e à acumulação estável de RNA senso (mRNA) ou funcional. "Expressão" pode também se referir à produção de proteína.

[0026] Um "gene" é uma região definida que está situada em um genoma e compreende uma sequência codificante de ácido nucleico e tipicamente também compreende outros ácidos nucleicos, primariamente reguladores, responsáveis pelo controle da expressão, isto é, a transcrição e tradução, da porção codificadora. Um gene pode também compreender outras sequências 5' e 3' não traduzidas e sequências de terminação. Outros elementos que podem estar presentes são, por exemplo, íntrons. A sequência de ácido nucleico reguladora do gene pode não estar normalmente ligada de modo operacional à sequência de ácido nucleico associada tal como encontrado na natureza e assim seria um gene quimérico.

[0027] "Gene de interesse" se refere a qualquer molécula de ácido nucleico que, quando transferido para uma planta, confere à planta uma característica desejada tal como resistência a antibióticos, resistência a vírus, resistência a insetos, resistência a doenças, ou resistência a outras pragas, tolerância a herbicida, tolerância ao estresse abiótico, esterilidade masculina, metabolismo modificado de ácidos graxos, metabolismo modificado de carboidratos, valor nutricional melhorado, desempenho melhorado em um processo industrial ou capacidade reprodutora alterada. O "gene de interesse" também pode ser um que é transferido para plantas para a produção de metabólitos ou enzimas comercialmente valiosas na planta.

[0028] Uma sequência de ácidos nucleicos ou molécula de ácidos nucleicos "heteróloga" é uma sequência de ácidos nucleicos ou molécula de ácidos nucleicos naturalmente não associada a uma célula hospedeira na qual é introduzida, incluindo múltiplas cópias não ocorrendo naturalmente de uma sequência de ácidos nucleicos ocorrendo naturalmente. Uma sequência de ácido nucleico ou molécula de ácido nucleico heteróloga pode compreender uma sequência quimérica tal como um cassete de expressão quimérica, em que o promotor e a região de codificação são derivados de múltiplos organismos de origem. A sequência do promotor pode ser uma sequência de promotor constitutivo, uma sequência de promotor específico de tecido, uma sequência de promotor quimicamente induzível, uma sequência de promotor induzível por ferida, uma sequência de promotor induzível por estresse e uma sequência de promotor específico do estágio de desenvolvimento.

[0029] Uma sequência de ácidos nucleicos "homóloga" é uma sequência de ácidos nucleicos naturalmente associada a uma célula hospedeira na qual é introduzida.

[0030] "Recombinação homóloga" é a troca recíproca de fragmentos de ácidos nucleicos entre moléculas de ácidos nucleicos homólogas.

[0031] "Identidade" ou "percentual de identidade" se refere ao grau de similaridade entre duas sequências de ácido nucleico ou proteína. Para comparação de sequências, tipicamente uma sequência atua como uma sequência de referência com a qual as sequências de teste são comparadas. Ao usar um algoritmo de comparação de sequências, as sequências de teste e de referência são inseridas em um computador, se necessário são designadas coordenadas de subsequências, e são designados parâmetros do programa de algoritmo de sequências. O algoritmo de comparação de sequências calcula depois a porcentagem de identidade de sequências para a(s) sequência(s) de teste em relação à sequência de referência, com base nos parâmetros do programa designados. A expressão "substancialmente idêntico(a)" no contexto de duas sequências de ácidos nucleicos ou duas sequências de aminoácidos, se refere a duas ou mais sequências ou subsequências que têm pelo menos cerca de 50% de identidade de resíduo de nucleotídeo ou aminoácido quanto comparadas e alinhadas para correspondência máxima conforme medido com o uso de um dos seguintes algoritmos de comparação de sequência ou por inspeção visual. Em certas modalidades, as sequências substancialmente idênticas têm pelo menos cerca de 60%, ou pelo menos cerca de 70%, ou pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 85%, ou até pelo menos cerca de 90% ou 95% de identidade de resíduos de nucleotídeos ou aminoácidos. Em certas modalidades existe identidade substancial ao longo de uma região das sequências que tem pelo menos cerca de 50 resíduos em comprimento ou ao longo de uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos ou as sequências são substancialmente idênticas ao longo de pelo menos cerca de 150 resíduos. Em modalidades adicionais, as sequências são substancialmente idênticas quando são idênticas ao longo do comprimento inteiro das regiões codificantes.

[0032] O alinhamento ótimo de sequências para comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), pelo método de pesquisa de similaridade de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), por implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou por inspeção visual (ver geralmente, Ausubel et al., infra).

[0033] Um exemplo de um algoritmo que é adequado para determinar a porcentagem de identidade de sequências e a similaridade de sequências é o algoritmo BLAST, que é descrito em Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). O software para realizar análises BLAST está publicamente disponível através do National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo envolve em primeiro lugar a identificação de pares de sequência de elevada pontuação (HSPs) por identificação de pequenas palavras de comprimento W na sequência de consulta, que igualam ou satisfazem alguma pontuação limiar de valor positivo T quando alinhadas com uma palavra do mesmo comprimento em uma sequência da base de dados. T é referido como uma pontuação limiar de palavra de proximidade (Altschul et al., 1990). Estas correspondências de palavra de proximidade iniciais atuam como sementes para iniciação de pesquisas para se encontrarem HSPs mais longos contendo os mesmos. As correspondências de palavras são depois prolongadas em ambas as direções ao longo de cada sequência tanto quanto a pontuação de alinhamento cumulativa possa ser aumentada. As pontuações cumulativas são calculadas usando, para sequências de nucleotídeos, os parâmetros M (pontuação de recompensa para um par de resíduos correspondentes; sempre > 0) e N (pontuação de penalidade para resíduos não correspondentes; sempre < 0). Para sequências de aminoácidos é usada uma matriz de pontuação para calcular a pontuação cumulativa. A extensão das correspondências de palavra em cada direção é interrompida quando a pontuação do alinhamento cumulativo cai na quantidade X a partir do seu valor máximo alcançado, a pontuação cumulativa tende para zero ou menos devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduos de pontuação negativa ou é alcançada a extremidade de qualquer uma das sequências. Os parâmetros W, T e X do algoritmo BLAST determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para sequências de nucleotídeos) usa como padrões um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, um corte de 100, M=5, N=-4 e uma comparação de ambas as fitas. Para sequências de aminoácidos, o programa BLASTP usa como padrões um comprimento de palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de 10 e a matriz de pontuação BLOSUM62 (ver Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)).

[0034] Adicionalmente a calcular a percentagem de identidade de sequências, o algoritmo BLAST realiza também uma análise estatística da similaridade entre duas sequências (ver, por exemplo, Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993)). Uma medida da similaridade proporcionada pelo algoritmo BLAST é a menor probabilidade de soma (P(N)), que proporciona uma indicação da probabilidade com a qual uma correspondência entre duas sequências de nucleotídeos ou de aminoácidos ocorreria por acaso. Por exemplo, uma sequência de ácidos nucleicos de teste é considerada similar a uma sequência de referência se a menor probabilidade de soma em uma comparação da sequência de ácidos nucleicos de teste com a sequência de ácidos nucleicos de referência for menor do que cerca de 0,1, mais preferencialmente menor do que cerca de 0,01 e mais preferencialmente menor do que cerca de 0,001.

[0035] Outro programa de computador amplamente usado e aceito para realizar alinhamento de sequência é CLUSTALW v1.6 (Thompson, et al. Nuc. Acids Res., 22: 4673-4680, 1994). O número de bases ou aminoácidos compatíveis é dividido pelo número total de bases ou aminoácidos, e multiplicado por 100 para obter um percentual de identidade. Por exemplo, se duas sequências de 580 pares de bases tivessem 145 bases correspondidas, seriam 25 por cento idênticas. Se as duas sequências comparadas tiverem comprimentos diferentes, o número de correspondências é dividido pelo mais curto dos dois comprimentos. Por exemplo, se existissem 100 aminoácidos correspondidos entre uma proteína de 200 aminoácidos e uma de 400, são 50 por cento idênticos no que diz respeito à sequência mais curta. Se a sequência mais curta é menor que 150 bases ou 50 aminoácidos de comprimento, o número de compatibilidades é dividido por 150 (para bases de ácido nucleico) ou 50 (para aminoácidos), e multiplicado por 100 para obter um percentual de identidade.

[0036] Outra indicação de que dois ácidos nucleicos são substancialmente idênticos é que as duas moléculas se hibridizam uma com a outra sob condições estringentes. A frase "hibridizar especificamente com" se refere a ligação, duplicação, ou hibridização de uma molécula somente a uma sequência de nucleotídeos específica sob condições estringentes quando essa sequência está presente em uma mistura complexa (por exemplo, celular total) DNA ou RNA. "Se liga(m) substancialmente" se refere à hibridização complementar entre um ácido nucleico sonda e um ácido nucleico alvo, e abrange incompatibilidades menores que podem ser acomodadas reduzindo a estringência dos meios de hibridização para se alcançar a detecção desejada da sequência de ácidos nucleicos alvo.

[0037] "Condições de hibridização estringentes" e "condições de lavagem de hibridização estringentes" no contexto dos experimentos de hibridização de ácidos nucleicos tais como hibridizações Southern e Northern são dependentes da sequência, e são diferentes sob diferentes parâmetros ambientais. As sequências maiores se hibridizam especificamente a temperaturas mais elevadas. Um guia extensivo para a hibridização de ácidos nucleicos é encontrado em Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes parte I, capítulo 2, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, Nova Iorque. Geralmente, condições de hibridização e lavagem altamente estringentes são selecionadas para serem cerca de 5 °C mais baixas do que o ponto térmico de fusão (Tm) para a sequência específica a uma força iônica e pH definidos. Tipicamente sob "condições estringentes" uma sonda irá hibridizar com sua subsequência alvo, mas não com outras sequências.

[0038] A Tm é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) à qual 50% da sequência-alvo se hibridiza com uma sonda perfeitamente correspondente. Condições muito estringentes são selecionadas de modo a serem iguais à Tm para uma sonda particular. Um exemplo de condições de hibridização estringentes para hibridização de ácidos nucleicos complementares os quais têm mais de 100 resíduos complementares em um filtro em uma transferência Southern ou Northern é formamida 50% com 1 mg de heparina a 42 °C, com a hibridização sendo realizada durante a noite. Um exemplo de condições de lavagem altamente estringentes é NaCl a 0,1 5 M a 72 °C durante cerca de 15 minutos. Um exemplo de condições de lavagem estringentes é uma lavagem com 0,2x SSC a 65 °C durante 15 minutos (ver, Sambrook, infra, para uma descrição de tampão SSC). Frequentemente, uma lavagem de estringência elevada é precedida de uma lavagem de baixa estringência para remover o sinal de fundo da sonda. Uma lavagem de média estringência exemplificativa para um duplex de, por ex., mais do que 100 nucleotídeos, é 1x SSC a 45 °C durante 15 minutos. Uma lavagem de baixa estringência exemplificativa para um duplex de, por ex., mais de 100 nucleotídeos, é 4-6x SSC a 40 °C durante 15 minutos. Para sondas curtas (p. ex., cerca de 10 a 50 nucleotídeos), as condições estringentes envolvem tipicamente concentrações de sais de menos do que cerca de 1,0 M de íon Na, tipicamente concentração de cerca de 0,01 a 1,0 M de íon Na (ou outros sais) a pH 7,0 a 8,3, e a temperatura é tipicamente pelo menos cerca de 30 °C. Condições estringentes podem ser também alcançadas com a adição de agentes desestabilizantes tais como formamida. Em geral, uma razão de sinal em relação a ruído de 2x (ou mais elevada) do que aquela observada para uma sonda não relacionada no ensaio de hibridização particular indica detecção de uma hibridização específica. Ácidos nucleicos que não se hibridizam um com o outro sob condições estringentes são ainda substancialmente idênticos se as proteínas que eles codificam forem substancialmente idênticas. Isto ocorre, p. ex., quando uma cópia de um ácido nucleico é criada usando a degenerescência máxima de códons permitida pelo código genético.

[0039] A seguir se encontra exemplos de conjuntos de condições de hibridização/lavagem que podem ser usadas para clonar sequências homólogas de nucleotídeos que são substancialmente idênticos à sequência de nucleotídeos de referência da presente invenção: uma sequência de nucleotídeos de referência se hibridiza preferencialmente com a sequência de nucleotídeos de referência em dodecil sulfato de sódio (SDS) a 7%, NaPO4 a 0,5 M, EDTA a 1 mM a 50 °C com lavagem em SSC 2X, SDS a 0,1% a 50 °C, mais desejavelmente em dodecil sulfato de sódio (SDS) a 7%, NaPO4 a 0,5 M, EDTA a 1 mM a 50°C com lavagem em SSC 1X, SDS a 0,1% a 50 °C, mais desejavelmente ainda em dodecil sulfato de sódio (SDS) a 7%, NaPO4 a 0,5 M, EDTA a 1 mM a 50 °C com lavagem em SSC 0,5X, SDS a 0,1% a 50 °C, preferencialmente em dodecil sulfato de sódio (SDS) a 7%, NaPO4 a 0,5 M, EDTA a 1 mM a 50 °C com lavagem em SSC 0,1X, SDS a 0,1% a 50 °C, mais preferencialmente em dodecil sulfato de sódio (SDS) a 7%, NaPO4 a 0,5 M, EDTA a 1 mM a 50 °C com lavagem em SSC 0,1X, SDS a 0,1% a 65 °C.

[0040] Uma indicação adicional de que dois ácidos nucleicos ou proteínas são substancialmente idênticas é o fato de a proteína codificada pelo primeiro ácido nucleico ser imunologicamente reativa de modo cruzado com, ou se ligar especificamente à proteína codificada pelo segundo ácido nucleico. Assim, uma proteína é tipicamente substancialmente idêntica a uma segunda proteína, por exemplo, onde as duas proteínas diferirem somente por substituições conservativas.

[0041] Uma sequência de ácidos nucleicos é "isocodificada com" uma sequência de ácidos nucleicos de referência quando a sequência de ácidos nucleicos codifica um polipeptídeo possuindo a mesma sequência de aminoácidos do polipeptídeo codificado pela sequência de ácidos nucleicos de referência.

[0042] Uma molécula de ácido nucleico "isolada" ou uma toxina isolada é uma molécula de ácido nucleico ou toxina que, pela mão do homem, existe separadamente de seu ambiente nativo e não é, por conseguinte, um produto da natureza. Uma molécula de ácido nucleico isolada ou toxina pode existir em uma forma purificada ou pode existir em um ambiente não nativo tal como, por exemplo sem limitação, uma célula microbiana recombinante, célula vegetal, tecido vegetal ou planta.

[0043] Uma "molécula de ácido nucleico" ou "sequência de ácidos nucleicos" é um segmento de RNA ou DNA de fita simples ou dupla fita que pode ser isolado de qualquer fonte. No contexto da presente invenção, a molécula de ácido nucleico é tipicamente um segmento de DNA. Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucleico da invenção são moléculas de ácido nucleico isoladas.

[0044] Os termos "proteína", "peptídeo" e "polipeptídeo" são usados alternadamente neste documento.

[0045] Como usado no presente documento, sequência "otimizada por códon" significa uma sequência de nucleotídeos de um polinucleotídeo recombinante, transgênico, ou sintético em que os códons são escolhidos de modo a refletir o desvio do códon particular que uma célula hospedeira pode ter. Isto é feito de modo a preservar a sequência de aminoácidos do polipeptídeo codificado pelo polinucleo- tídeo otimizado por códon. Em certas modalidades, a sequência de nucleotídeos da construção de DNA recombinante inclui uma sequência que foi otimizada por códon para a célula (p. ex., uma célula animal, vegetal ou fúngica), na qual a construção é para ser expressa. Por exemplo, uma construção para ser expressa em uma célula vegetal pode ter a totalidade ou parte da sua sequência (p. ex., o primeiro elemento de supressão genética ou o elemento de expressão genética) otimizada por códon para expressão em uma planta. Ver, por exemplo, e a Patente dos EUA N° 6,121,014, aqui incorporada como referência.

[0046] Uma "planta" é qualquer planta em qualquer estágio de desenvolvimento, particularmente uma planta de sementes.

[0047] Uma "célula vegetal" é uma unidade estrutural e fisiológica de uma planta, compreendendo um protoplasto e uma parede celular. A célula vegetal pode estar na forma de uma única célula isolada ou uma célula cultivada ou como parte de uma unidade de organização superior tal como, por exemplo, tecido vegetal, um órgão da planta ou uma planta inteira.

[0048] "Cultura de células vegetais" significa culturas de unidades vegetais tais como, por exemplo, protoplastos, células de cultura de células, células em tecidos vegetais, pólen, tubos de pólen, óvulos, sacos embrionários, zigotos e embriões em vários estágios de desenvolvimento.

[0049] "Material vegetal" se refere a folhas, caules, raízes, flores ou partes de flores, frutos, pólen, óvulos, zigotos, sementes, estacas, culturas de células ou tecidos ou qualquer outra parte ou produto de uma planta.

[0050] Um "órgão vegetal" é uma parte distinta e visivelmente estruturada e diferenciada de uma planta tal como uma raiz, caule, folha, broto de flor ou embrião.

[0051] "Tecido vegetal" como usado aqui significa um grupo de células vegetais organizadas em uma unidade estrutural e funcional. Qualquer tecido de uma planta in planta ou em cultura está incluído. Este termo inclui, mas não está limitado a plantas inteiras, órgãos de plantas, sementes de plantas, cultura de tecidos e quaisquer grupos de células de plantas organizados em unidades estruturais e/ou funcionais. O uso deste termo em conjunção com, ou na ausência de qualquer tipo específico de tecido de planta como listado acima ou de outro modo englobado por esta definição não se destina a ser exclusivo de qualquer outro tipo de tecido de planta.

[0052] Um "promotor" é uma sequência de DNA não traduzida a montante da região codificante que contém o sítio de ligação para RNA polimerase e inicia a transcrição do DNA. A região promotora pode também incluir outros elementos que atuam como reguladores da expressão de gene.

[0053] "Elementos reguladores" se referem a sequências envolvidas no controle da expressão de uma sequência de nucleotídeos. Elementos reguladores compreendem um promotor operacionalmente ligado à sequência de nucleotídeos de interesse e sinais de terminação. Tipicamente eles também englobam sequências requeridas para a tradução adequada da sequência de nucleotídeos.

[0054] "Transformação" é um processo de introdução de ácidos nucleicos heterólogos em uma célula ou organismo hospedeiro. Em modalidades particulares, "transformação" significa a integração estável de uma molécula de DNA no genoma (nuclear ou plastídeo) de um organismo de interesse.

[0055] "Transformado/transgênico/recombinante" se referem a um organismo hospedeiro tal como uma bactéria ou uma planta, no qual foi introduzida uma molécula de ácido nucleico heterólogo. A molécula de ácido nucleico pode ser estavelmente integrada no genoma do hospedeiro ou a molécula de ácido nucleico pode estar também presente como uma molécula extracromossômica. Uma tal molécula extracromossômica pode ser autorreplicante. Células, tecidos ou plantas transformadas são entendidas como englobando não só o produto final de um processo de transformação, mas também a sua progênie transgênica. Um hospedeiro "não transformado", "não transgênico" ou "não recombinante" se refere a um organismo de tipo selvagem, por exemplo, a uma bactéria ou planta, que não contém a molécula de ácido nucleico heterólogo.

[0056] Os nucleotídeos são indicados pelas suas bases por meio das seguintes abreviaturas padrão: adenina (A), citosina (C), timina (T) e guanina (G). Os aminoácidos são igualmente indicados pelas seguintes abreviaturas-padrão: alanina (Ala; A), arginina (Arg; R), asparagina (Asn; N), ácido aspártico (Asp; D), cisteína (Cys; C), glutamina (Gln; Q), ácido glutâmico (Glu; E), glicina (Gly; G), histidina (His; H), isoleucina (Ile; 1), leucina (Leu; L), lisina (Lys; K), metionina (Met; M), fenilalanina (Phe; F), prolina (Pro; P), serina (Ser; S), treonina (Thr; T), triptofano (Trp; W), tirosina (Tyr; Y), e valina (Val; V). DESCRIÇÃO DETALHADA

[0057] Esta invenção se refere a novas proteínas inseticidas com atividade contra coleópteros, por exemplo, Diabrotica virgifera virgifera (lagarta-da-raiz do milho do oeste; WCR), Diabrotica barberi (lagarta- da-raiz do milho do norte; NCR), e/ou Diabrotica undecimpunctata howardi (lagarta-da-raiz do milho do sul; SCR) e/ou outras espécies Diabrotica incluindo Diabrotica virgifera zeae (lagarta-da-raiz do milho mexicana), e/ou besouro-da-batata do Colorado. Em modalidades, uma nova proteína inseticida da presente invenção pode também ter atividade contra espécies de Lepidópteros. A presente invenção também se refere a ácidos nucleicos cuja expressão resulta em proteínas inseticidas da presente invenção, e ao fabrico e uso das proteínas inseticidas para controlar pragas de insetos. Em modalidades, a expressão dos ácidos nucleicos resulta em proteínas inseticidas que podem ser usadas para controlar os insetos coleópteros tal como a lagarta-da-raiz do milho do oeste, norte e/ou sul, especialmente quando expresso em uma planta transgênica, tal como uma planta de milho transgênico.

[0058] A presente invenção abrange adicionalmente uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína inseticida da invenção. A sequência de nucleotídeos pode ser otimizada para a expressão em bactéria, tal como Escherichia coli, ou para a expressão em uma planta, tal como Zea mays. Uma sequência de nucleotídeos otimizada para expressão em um organismo heterólogo, tal como uma espécie de bactéria diferente de onde se originou ou uma planta, não é de ocorrência natural. Em um aspecto desta modalidade, a molécula de ácido nucleico compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 a 36, SEQ ID NO: 73 a 83, e/ou SEQ ID NO: 99. Ensinamentos especificamente exemplificados de métodos para produzir moléculas de ácido nucleico que codificam as proteínas inseticidas da invenção podem ser encontrados nos exemplos do presente pedido. Os peritos na técnica reconhecerão que podem ser feitas modificações aos métodos exemplificados para produzir as proteínas inseticidas englobadas pela presente invenção.

[0059] Um especialista na técnica reconheceria que um transgene para uso comercial, tal como uma molécula de ácido nucleico compreendendo qualquer uma de SEQ ID NO: 2 a 36, SEQ ID NO: 73 a 83 ou SEQ ID NO: 99 pode ter modificações relativamente menores à sequência de ácido nucleico para atender a padrões reguladores governamentais. Tais modificações não afetariam a função da molécula resultante, que seria substancialmente idêntica à SEQ ID NO: 2 a 36, SEQ ID NO: 73 a 83, e/ou SEQ ID NO: 99. Um perito na técnica irá reconhecer que a molécula de ácido nucleico modificada seria essencialmente igual à mesma molécula de partida, e é incluída pela presente invenção.

[0060] A presente invenção também abrange uma molécula de ácido nucleico que compreende (a) uma sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID NO: 2 a 36, SEQ ID NO: 73 a 83 ou SEQ ID NO: 99; (b) uma sequência de nucleotídeos que é sequência pelo menos 45% idêntica, pelo menos 50% idêntica, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou é 100% idêntica a qualquer uma das sequências de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 a 36, SEQ ID NO: 73 a 83 ou SEQ ID NO: 99; (c) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo compreende SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 37 a 69 ou SEQ ID NO: 8696, e tem uma atividade de controle de insetos; (d) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo em que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo é pelo menos 45% idêntica, pelo menos 50% idêntica, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou é 100% idêntica a qualquer uma das sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 37 a 72, SEQ ID NO: 86 a 96 ou SEQ ID NO: 100; ou (e) uma sequência de nucleotídeos que é complementar à sequência de nucleotídeos de qualquer um de (a) a (d) acima.

[0061] A presente invenção abrange ainda um cassete de expressão compreendendo um promotor operacionalmente ligado a uma sequência heteróloga de nucleotídeos que compreende: (a) uma sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 2 a 36, SEQ ID NO: 73 a 83 ou SEQ ID NO: 99; (b) uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 45% idêntica, pelo menos 50% idêntica, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou é 100% idêntica à sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 2 a 36, SEQ ID NO: 73 a 83 ou SEQ ID NO: 99; (c) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo compreende SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 37 a 72, SEQ ID NO: 86 a 96 ou SEQ ID NO: 100, e tem uma atividade de controle de insetos; (d) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo em que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo é pelo menos 45% idêntica, pelo menos 50% idêntica, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou é 100% idêntica à sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 37 a 72, SEQ ID NO: 86 a 96 ou SEQ ID NO: 100; ou (e) uma sequência de nucleotídeos que é complementar à sequência de nucleotídeos de qualquer um de (a) a (d) acima. Em algumas modalidades, a presente invenção engloba um cassete de expressão compreendendo uma molécula de ácido nucleico heteróloga compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo é pelo menos 93% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 67 ou SEQ ID NO: 86 a 91. O cassete de expressão compreende um promotor operacionalmente ligado a uma sequência de nucleotídeos heteróloga e não é de ocorrência natural.

[0062] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico heteróloga do cassete de expressão compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo é a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 72 e em que o resíduo de aminoácido "X" pode ser qualquer resíduo de aminoácido. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico heteróloga do cassete de expressão compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo pelo menos 93% idêntico à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 100.

[0063] A presente invenção também engloba vetores ou construções recombinantes, que podem também ser referidos como vetores ou construções, compreendendo os cassetes de expressão e/ou as moléculas de ácido nucleico da presente invenção. Em esses vetores, os ácidos nucleicos estão preferencialmente em cassetes de expressão compreendendo elementos reguladores para expressão das moléculas de nucleotídeos em uma célula hospedeira capaz de expressar as moléculas de nucleotídeos. Esses elementos reguladores usualmente compreendem sinais de promotor e de terminação e preferencialmente também compreende elementos permitindo eficiente translação de polipeptídeos codificados pelos ácidos nucleicos da presente invenção. Vetores compreendendo os ácidos nucleicos podem ser capazes de replicação em células hospedeiras específicas, preferencialmente como moléculas extracromossômicas, e são, portanto, usadas para amplificar os ácidos nucleicos desta invenção nas células hospedeiras. A presente invenção também abrange uma célula hospedeira que contém um cassete de expressão ou uma molécula de ácido nucleico da invenção. Em uma modalidade, as células hospedeiras para esses vetores são microrganismos, tais como bactérias, em particular Bacillus thuringiensis ou E. coli, ou tais como fungos, tal como levedura. Em outra modalidade, as células hospedeiras para esses vetores recombinantes são endófitas ou epífitas. Em ainda outra modalidade, esses vetores são vetores virais e são usados para replicação da sequência de nucleotídeos em células hospedeiras específicas, por exemplo células de inseto ou células vegetais. Vetores recombinantes são também usadas para transformação das moléculas de nucleotídeos desta invenção nas células hospedeiras, em que as moléculas de nucleotídeos são integradas de forma estável no DNA de um hospedeiro transgênico. Em uma modalidade, o hospedeiro transgênico é vegetal, por exemplo, uma planta monocotiledônea, tal como uma planta de milho ou uma planta de trigo. Em modalidades, a planta hospedeira transgênica é uma planta dicotiledônea, tal como uma planta de soja ou planta de algodão.

[0064] Em outra modalidade, pelo menos um dos ácidos nucleicos da invenção é inserido em um cassete de expressão apropriado, que compreende um sinal de promotor e de terminação. A expressão do ácido nucleico pode ser constitutiva, ou um promotor induzível que responde a vários tipos de estímulos para iniciar a transcrição pode ser usado. Em outra modalidade, a célula na qual a proteína inseticida da invenção é expressa é um microrganismo, como um vírus, bactéria ou um fungo. Em ainda outra modalidade, um vírus, tal como a baculovírus, contém um ácido nucleico da invenção no seu genoma e expressa grande quantidade da correspondente proteína inseticida após infecção de células eucarióticas apropriadas que são adequadas para a replicação de vírus e expressão do ácido nucleico. A proteína inseticida assim produzida é usada como um agente inseticida. Em alternativa, baculovírus modificados para incluir o ácido nucleico são usados para infectar insetos in vivo e matá-los tanto através da expressão de uma toxina inseticida ou através da combinação de infecção viral e expressão de uma toxina inseticida. Em uma modalidade adicional, a presente invenção também engloba um método para a produção de um polipeptídeo com atividade inseticida, que compreende a cultura da célula hospedeira sob condições em que a molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo é expressa.

[0065] As células bacterianas também são hospedeiros para a expressão de ácido nucleico da invenção. Em uma modalidade são usadas bactérias simbióticas não patogênicas, que são capazes de viver e se replicar dentro de tecidos vegetais, assim chamadas endófitas, ou bactérias simbióticas não patogênicas, que são capazes de colonizar a filosfera ou a rizosfera, assim chamadas epífitas. Tais bactérias incluem bactérias dos gêneros Agrobacterium, Alcaligenes, Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Clavibacter, Enterobacter, Erwinia, Flavobacter, Klebsiella, Pseudomonas, Rhizobium, Serratia, Strepto- myces e Xanthomonas. Fungos simbióticos, tais como Trichoderma e Gliocladium, são também possíveis hospedeiros para expressão dos ácidos nucleicos inventivos para o mesmo propósito.

[0066] Técnicas para estas manipulações genéticas são específicas para os diferentes hospedeiros disponíveis e são conhecidas na arte. Por exemplo, os vetores de expressão pKK223-3 e pKK223-2 podem ser usados para expressar genes heterólogos em E. coli, tanto em fusão de transcrição ou tradução, atrás do promotor tac ou trc. Para a expressão de óperons que codificam múltiplas ORFs, o procedimento mais simples é inserir o óperon em um vetor como pKK223-3 em fusão de transcrição, permitindo que o sítio de ligação de ribossomo cognato dos genes heterólogos seja usado. As técnicas para a sobreexpressão em espécies gram-positivas como Bacillus também são conhecidas na técnica e podem ser usadas no contexto desta invenção (Quax et al. Em: Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics, Eds. Baltz et al., American Society for Microbiology, Washington (1993)). Sistemas alternativos para sobreexpressão dependem por exemplo, nos vetores de levedura e incluem o uso de Pichia, Saccharomyces e Kluyveromyces (Sreekrishna, Em: Industrial microorganisms: basic and applied molecular genetics, Baltz, Hegeman, e Skatrud eds., American Society for Microbiology, Washington (1993); Dequin & Barre, Biotechnology L2:173- 177 (1994); van den Berg et al., Biotechnology 8:135-139 (1990)).

[0067] Certas proteínas inseticidas têm sido expressas em plantas e as sementes dessas plantas são vendidas anualmente a agricultores para uso no controle de várias pragas de insetos. Tais produtos inseticidas com autoproteção estão sujeitos a revisão e registro por várias agências reguladoras, incluindo, por exemplo, a Agência de Proteção Ambiental dos EUA (EPA).

[0068] A exposição da dieta é a via principal pela qual os seres humanos podem ser expostos às proteínas inseticidas expressas nas plantas transgênicas. A toxicidade oral aguda de mamífero e a digestibilidade de proteína são os pontos finais para a avaliação de risco para a saúde humana da EPA. Outra evidência científica da segurança das proteínas inseticidas é que essas têm mostrado serem rapidamente degradadas in vitro usando fluidos gástricos simulados. Por exemplo, os resultados de sete ensaios in vitro realizados com proteínas Cry1, Cry2, e Cry3 representativas estabelecem que as proteínas são rapidamente degradadas, tipicamente dentro de 30 segundos. Esses resultados apoiam a conclusão mais ampla de que os membros desses grupos de proteínas Cry (que partilham de identidade de sequência de aminoácidos significativa) são suscetíveis de serem rapidamente degradados após a ingestão pelos seres humanos. Testes semelhantes são feitos para cada proteína transgênica expressa em plantas. Outra área de consideração é se as proteínas inseticidas podem induzir uma reação alérgica. A rápida degradação in vitro demonstrada pela proteína inseticida transgênica deve minimizar o potencial para essa ocorrência. Por comparação, os alérgenos alimentares geralmente persistiram no modelo gastrointestinal in vitro, enquanto as proteínas alimentares comuns sem história alérgica se degradaram rapidamente no fluido gástrico simulado (Metcalfe et al., 1996).

[0069] Um ensaio de fluido gástrico simulado (FGS), mede a digestibilidade in vitro de uma proteína de teste em condições rigorosamente controladas representativas do trato digestivo de mamífero superior. Por exemplo, o teste de proteína Cry produzido por bactérias (a uma concentração de 0,5-5 mg/mL) foi exposto para a enzima pepsina (a partir de mucosa gástrica de suíno, solubilizada em 2 mg/mL de NaCl, pH 1,2) em uma proporção de 10 Unidades de atividade de pepsina/µg de proteína teste durante um período de tempo de uma hora a 37 °C. As amostras são removidas nos pontos temporais 1, 2, 5, 10, 30 e 60 minutos e imediatamente extintas com a adição de tampão de paragem (Tampão de Carga 65% Bicarbonato de sódio a 0,5 M, pH 11, Tricina a 35%) pré-aquecido (95 °C - 2 minutos) para processar imediatamente a pepsina inativa, e voltado a aquecer durante 5 minutos adicionais. Uma vez que o ensaio estava completo, as amostras e controles de ponto de tempo (apenas proteína de teste, apenas pepsina) foram examinadas por SDS-PAGE em um gel de Tris-tricina a 10-20% (com peptídeos visíveis para baixo para 1 kDa) para acompanhar a cinética e o nível da digestão realizado pela pepsina. Se a proteína de teste ou um fragmento polipeptídico significativo da proteína do texto for visível, por exemplo, nos pontos temporais de 5 e/ou 10 minutos, então não é digerível ou não é completamente digestível pelo ensaio de FGS e pode ser classificado qualitativamente como "não" ou "não digerível". Se a proteína de teste e qualquer fragmento polipeptídico significativo não for visível, por exemplo, no ponto temporal de 5 minutos, então é digerível pelo ensaio de FGS e pode ser classificado qualitativamente como "sim" ou "digerível".

[0070] A presente invenção também engloba um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 45% idêntica, pelo menos 50% idêntica, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, em menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% idêntica, ou é 100% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 37 a 72, SEQ ID NO: 86 a 96 ou SEQ ID NO: 100, e compreendendo adicionalmente um sítio de clivagem de protease introduzido. O sítio de clivagem de protease introduzido não é de ocorrência natural, e é introduzido na sequência de polipeptídeo, tal como uma mutação de substituição ou uma mutação de deleção ou inserção. O sítio de clivagem de protease introduzido pode ser introduzido pela inserção de pelo menos um resíduo de leucina em uma sequência polipeptídica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 37 a 72, SEQ ID NO: 86 a 96 ou SEQ ID NO: 100. A mutação introduzida pode desestabilizar o polipeptídeo, de modo a que uma protease pode obter acesso a um sítio de clivagem que anteriormente não tinha acesso devido a enrolamento rígido e/ou estável da proteína, ou devido a impedimento estérico. O sítio de clivagem da protease introduzido pode ser uma mutação introduzida na sequência do polipeptídeo que é reconhecido por uma protease, tal como quimiotripsina, tripsina ou pepsina, como um sítio de clivagem proteolítica. Em algumas modalidades, o sítio de clivagem da protease introduzido pode alterar um sítio de clivagem de protease existente de modo a ser reconhecido por uma protease diferente. Os locais de clivagem da protease para a quimiotripsina, tripsina e pepsina são bem conhecidos na técnica. A quimiotripsina cliva preferencialmente ligações amida do peptídeo, onde o lado carboxila da ligação amida (a posição P1) é um grande aminoácido hidrofóbico (tirosina, triptofano e fenilalanina). A tripsina cliva as cadeias peptídicas principalmente no lado carboxila dos aminoácidos lisina ou arginina, exceto quando um deles é seguido por prolina. A pepsina é mais eficiente na clivagem de ligações peptídicas entre aminoácidos hidrofóbicos e preferencialmente aromáticos, tais como fenilalanina, triptofano e tirosina. Estes sítios de clivagem são os sítios de clivagem preferenciais e não incluem todos os sítios de clivagem reconhecidos pela quimiotripsina, tripsina ou pepsina, e além disso, não incluem todos os sítios de clivagem para todas as proteases.

[0071] Um exemplo de um polipeptídeo manipulado para conter um sítio de clivagem de protease introduzido é a variante C398L de WoodsCRW (SEQ ID NO: 55). Esta mutação de substituição muda um motivo de "NKDCVS" para "NKDLVS". Este sítio de clivagem de protease introduzido pode ser reconhecido pela pepsina e/ou quimiotripsina, e não está presente na sequência de proteína do tipo selvagem de WoodsCRW. Em algumas modalidades, o sítio de clivagem de protease introduzido pode estar no ou próximo do local da mutação, por exemplo, resíduos 388-408 do polipeptídeo. É bem conhecido na técnica que as cisteínas em proteínas são frequentemente ligadas covalentemente a outros resíduos de cisteína para formar ligações dissulfeto. As ligações dissulfeto desempenham um papel importante no enrolamento e estabilidade de algumas proteínas. Portanto, a variante C398L de WoodsCRW pode ter uma estrutura terciária alterada ou menos estável em comparação com a WoodsCRW de tipo selvagem. Em algumas modalidades, o sítio de clivagem de protease introduzido pode estar localizado distal a partir da mutação introduzida. Por exemplo, a mutação introduzida de C398L pode "soltar" o enrolamento tridimensional do polipeptídeo WoodsCRW, tornando assim um sítio de clivagem de protease que era previamente inacessível (e, portanto, não clivado) acessível para uma protease. Isto resulta na mutação introduzida introduzindo um sítio de clivagem de protease que não existia no polipeptídeo inalterado. Em algumas modalidades, a mutação introduzida e/ou o sítio de clivagem de protease introduzido está localizado entre os resíduos de aminoácidos 1 a 490 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, SEQ ID NO: 37 a 69, SEQ ID NO: 72 ou SEQ ID NO: 86 a 96. Em modalidades adicionais, a mutação introduzida e/ou o sítio de clivagem de protease introduzido está localizado entre os resíduos de aminoácidos 100 a 490 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, SEQ ID NO: 37 a 69, SEQ ID NO: 72 ou SEQ ID NO: 86 a 96. Em modalidades adicionais, a mutação introduzida e/ou o sítio de clivagem de protease introduzido está localizado entre os resíduos de aminoácidos 190 a 490 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, SEQ ID NO: 37 a 69, SEQ ID NO: 72 ou SEQ ID NO: 86 a 96. Em modalidades adicionais, a mutação introduzida e/ou o sítio de clivagem de protease introduzido está localizado entre os resíduos de aminoácidos 190 a 310 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, SEQ ID NO: 37 a 69, SEQ ID NO: 72 ou SEQ ID NO: 86 a 96. Em modalidades adicionais, a mutação introduzida e/ou o sítio de clivagem de protease introduzido está localizado entre os resíduos de aminoácidos 190 a 210 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, SEQ ID NO: 37 a 69, SEQ ID NO: 72 ou SEQ ID NO: 86 a 96. Em outras modalidades, a mutação introduzida está localizada entre os resíduos de aminoácidos 300 a 490 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, SEQ ID NO: 37 a 69, SEQ ID NO: 72 ou SEQ ID NO: 86 a 96. Em modalidades adicionais, a mutação introduzida e/ou o sítio de clivagem de protease introduzido está localizado entre os resíduos de aminoácidos 300 a 400 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, SEQ ID NO: 37 a 69, SEQ ID NO: 72 ou SEQ ID NO: 86 a 96.

[0072] O sítio de clivagem da protease introduzido pode alterar a especificidade da protease nesse sítio, por exemplo, pode alterar um sítio de clivagem proteolítica de tripsina para um sítio de clivagem proteolítica de quimiotripsina. Por exemplo, a variante K406L de WoodsCRW (SEQ ID NO: 45) pode alterar um sítio de clivagem de tripsina para um sítio de clivagem de quimiotripsina ou pepsina. Em algumas modalidades, o sítio de clivagem de protease introduzido está localizado entre os resíduos de aminoácidos 1 a 490 de qualquer uma das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NOs: 37 a 69, SEQ ID NO: 72 ou SEQ ID NOs: 86 a 96. Em modalidades adicionais, o sítio de clivagem de protease introduzido está localizado entre os resíduos de aminoácidos 100 a 490 de qualquer uma das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NOs: 37 a 69, SEQ ID NO: 72 ou SEQ ID NOs: 86 a 96. Em modalidades adicionais, o sítio de clivagem de protease introduzido está localizado entre os resíduos de aminoácidos 190 a 490 de qualquer uma das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NOs: 37 a 69, SEQ ID NO: 72 ou SEQ ID NOs: 86 a 96. Em modalidades adicionais, o sítio de clivagem de protease introduzido está localizado entre os resíduos de aminoácidos 190 a 400 de qualquer uma das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NOs: 37 a 69, SEQ ID NO: 72 ou SEQ ID NOs: 86 a 96. Em modalidades adicionais, o sítio de clivagem de protease introduzido está localizado entre os resíduos de aminoácidos 190 a 310 de qualquer uma das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NOs: 37 a 69, SEQ ID NO: 72 ou SEQ ID NOs: 86 a 96. Em modalidades adicionais, o sítio de clivagem de protease introduzido está localizado entre os resíduos de aminoácidos 190 a 210 de qualquer uma das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NOs: 37 a 69, SEQ ID NO: 72 ou SEQ ID NOs: 86 a 96. Em outras modalidades, o sítio de clivagem de protease introduzido está localizado entre os resíduos de aminoácidos 300 a 490 de qualquer uma das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NOs: 37 a 69, SEQ ID NO: 72 ou SEQ ID NOs: 86 a 96. Em modalidades adicionais, o sítio de clivagem de protease introduzido está localizado entre os resíduos de aminoácidos 300 a 400 de qualquer uma das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 37 a 69, SEQ ID NO: 72 ou SEQ ID NO: 86 a 96. Em uma modalidade adicional, o sítio de clivagem de protease introduzido que altera a especificidade da protease pode estar localizado entre os resíduos de aminoácidos correspondentes de 313 a 490 de qualquer uma das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NOs: 37 a 69 ou SEQ ID NOs: 86 a 96.

[0073] A presente invenção também engloba um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 45% idêntica, pelo menos 50% idêntica, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, em menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% idêntica, ou é 100% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NOs: 37 a 69 ou SEQ ID NOs: 86 a 96, e compreendendo adicionalmente uma mutação introduzida o que melhora a digestibilidade em um ensaio de FGS em comparação com um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. A mutação pode ser uma mutação de substituição, inserção ou deleção. A mutação pode ser a inserção de pelo menos um resíduo de leucina.

[0074] A presente invenção também inclui um método de melhoria da digestibilidade de um polipeptídeo pelo menos 45% idêntico, pelo menos 50% idêntico, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% idêntico, ou é 100% idêntico a qualquer uma das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NOs: 37 a 69 ou SEQ ID NOs: 86 a 96 compreendendo a introdução de pelo menos uma mutação na sequência de aminoácidos do polipeptídeo. Em modalidades, esta mutação introduzida melhora a digestibilidade do polipeptídeo em um ensaio de FGS. A mutação pode melhorar a digestibilidade introduzindo um sítio de clivagem de protease. Em outras modalidades, a mutação pode melhorar a digestibilidade por alterar a especificidade da protease naquele sítio. Por exemplo, para que o que pode ter sido um sítio de quimiotripsina ou tripsina seja mutado para um sítio de pepsina. Em outras modalidades, a mutação pode desestabilizar a proteína de modo a que um sítio é tornado acessível para uma protease para clivagem. O sítio tornado acessível a uma protease pode ser distal da mutação introduzida. Em modalidades preferidas, a mutação não altera ou não altera significativamente a atividade, ou a atividade inseticida, do polipeptídeo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo com a mutação introduzida possui pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% da atividade inseticida de WoodsCRW. Este método é exemplificado nos exemplos da presente descrição, onde, por exemplo, se verificou que as variantes C398L, C398Y e D397-Leu-Leu-C398 de WoodsCRW tinham digestibilidade melhorada no ensaio de FGS. Elas também mantiveram uma atividade inseticida muito alta.

[0075] Em algumas modalidades do método descrito acima, a(s) mutação(ões) introduzida(s) pode(m) estar localizada(s) entre os resíduos de aminoácidos 1 a 490 de qualquer uma das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NOs: 37 a 69, SEQ ID NO: 72 ou SEQ ID NOs: 86 a 96. Em modalidades adicionais, a(s) mutação(ões) introduzida(s) pode(m) estar localizada(s) entre os resíduos de aminoácidos 100 a 490 de qualquer uma das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NOs: 37 a 69, SEQ ID NO: 72 ou SEQ ID NOs: 86 a 96. Em modalidades adicionais, a(s) mutação(ões) introduzida(s) pode(m) estar localizada(s) entre os resíduos de aminoácidos 190 a 490 de qualquer uma das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NOs: 37 a 69, SEQ ID NO: 72 ou SEQ ID NOs: 86 a 96. Em modalidades adicionais, a(s) mutação(ões) introduzida(s) pode(m) estar localizada(s) entre os resíduos de aminoácidos 190 a 400 de qualquer uma das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NOs: 37 a 69, SEQ ID NO: 72 ou SEQ ID NOs: 86 a 96. Em modalidades adicionais, a(s) mutação(ões) introduzida(s) pode(m) estar localizada(s) entre os resíduos de aminoácidos 190 a 310 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, SEQ ID NOs: 37 a 69, SEQ ID NO: 72 ou SEQ ID NOs: 86 a 96. Em modalidades adicionais, a(s) mutação(ões) introduzida(s) pode(m) estar localizada(s) entre os resíduos de aminoácidos 190 a 210 de qualquer uma das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NOs: 37 a 69, SEQ ID NO: 72 ou SEQ ID NOs: 86 a 96. Em outras modalidades, a(s) mutação(ões) introduzida(s) pode(m) estar localizada(s) entre os resíduos de aminoácidos 300 a 490 de qualquer uma das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NOs: 37 a 69, SEQ ID NO: 72 ou SEQ ID NOs: 86 a 96. Em modalidades adicionais, mutação(ões) introduzida(s) pode(m) estar localizada(s) entre os resíduos de aminoácidos 300 a 400 de qualquer uma das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NOs: 37 a 69, SEQ ID NO: 72 ou SEQ ID NOs: 86 a 96. Em uma modalidade adicional, a(s) mutação(ões) introduzida(s) pode(m) estar localizada(s) entre os resíduos de aminoácidos correspondentes 313 a 490 de qualquer uma das SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NOs: 37 a 69. Em outras modalidades, a(s) mutação(ões) pode(m) ser introduzida(s) entre as sequências de aminoácidos 313 a 490 das SEQ ID NO: 1.

[0076] Em outras modalidades, uma mutação pode ser introduzida em ou próxima a C398 da SEQ ID NO: 1. De acordo com outras modalidades, a mutação pode ser C398L, C398I, C398V, C398G, C398A, C398F, C398M, C398S, C398W ou C398Y. Em outras modalidades, a mutação pode ser a inserção ou deleção de um resíduo de aminoácido, tal como, por exemplo, a inserção de pelo menos um resíduo de leucina. Este(s) resíduo(s) pode(m) ser adjacente(s) a, ou vizinho(s) de, C398 da SEQ ID NO: 1, tais como, por exemplo, as variantes D397-Leu-C398, D397-Leu-Leu-C398, C398-Leu-V399, C398- Leu-Leu-V399 ou D397-Leu-C398-L de WoodsCRW, que todas foram identificadas como tendo melhorado a digestibilidade no ensaio FGS. Elas também mantiveram uma atividade inseticida muito alta (ver Exemplos). Os resíduos de leucina podem igualmente ser inseridos próximos a C398, em que "próximos" pode ser pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 4, pelo menos 6, pelo menos 8, pelo menos 10 ou pelo menos 20 aminoácidos de distância de C398.

[0077] As proteínas inseticidas da presente invenção têm atividade de controle de insetos quando testadas contra pragas de insetos em bioensaios. Em uma modalidade, as proteínas inseticidas da invenção são ativas contra insetos coleópteros e/ou lepidópteros. Um perito na técnica apreciará que uma proteína da presente invenção pode ter uma gama diferente de atividade inseticida em comparação com outras proteínas da invenção. Em algumas modalidades, uma variante mutada de WoodsCRW pode ter atividade inseticida em uma ampla gama de pragas de insetos, como mais espécies de coleópteros ou lepidópteros, em comparação com outras variantes de WoodsCRW. Em outras modalidades, uma variante de WoodsCRW pode ter atividade inseticida sobre espécies de lepidópteros, mas não em espécies de coleópteros. Em algumas modalidades, uma variante de WoodsCRW pode ter atividade em uma gama mais ampla de atividade inseticida em espécies de coleópteros ou lepidópteros em comparação com WoodsCRW não modificada (SEQ ID NO: 1).

[0078] Insetos da ordem Lepidoptera incluem sem limitação qualquer inseto agora conhecido ou mais tarde identificado que está classificado como lepidóptero, incluindo aquelas espécies de insetos dentro das subordens Zeugloptera, Glossata e Heterobathmiina, e qualquer combinação desses. Insetos lepidópteros exemplificativos incluem, mas não estão limitados a Ostrinia spp. tal como O. nubilalis (broca europeia do milho); Plutella spp. tal como P. xylostella (traça- das-crucíferas); Spodoptera spp. tal como S. frugiperda (lagarta militar do milho), S. ornithogalli (lagarta militar de listras amarelas), S. praefica (lagarta militar de listras amarelas do oeste), S. eridania (lagarta militar do sul) e S. exigua (lagarta militar da beterraba); Agrotis spp. tal como A. ipsilon (lagarta-rosca negra), A. segetum (lagarta-rosca comum), A. gladiaria (lagarta-rosca argilosa), e A. orthogonia (lagarta-rosca pálida do oeste); Striacosta spp. tal como S. albicosta (lagarta-rosca do feijoeiro ocidental); Helicoverpa spp. tal como H. zea (lagarta da espiga do milho), H. punctigera (verme dos brotos nativo), S. littoralis (curuquerê do algodoeiro egípcio) e H. armigera (lagarta do capulho do algodoeiro); Heliothis spp. tal como H. virescens (lagarta-da-maçã); Diatraea spp. tal como D. grandiosella (broca do milho do sudoeste) e D. saccharalis (broca da cana-de-açúcar); Trichoplusia spp. tal como T. ni (lagarta medideira da couve); Sesamia spp. tal como S. nonagroides (broca do milho mediterrânica); Pectinophora spp. tal como P. gossypiella (lagarta rosada); Cochylis spp. tal como C. hospes (traça listrada do girassol); Manduca spp. tal como M. sexta (mandarová do tabaco) e M. quinquemaculata (mandarová do tomate); Elasmopalpus spp. tal como E. lignosellus (lagarta-Elasmo); Pseudoplusia spp. tal como P. includens (lagarta falsa medideira); Anticarsia spp. tal como A. gemmatalis (lagarta-da-soja); Plathypena spp. tal como P. scabra (larva verde do trevo); Pieris spp. tal como P. brassicae (verme do repolho), Papaipema spp. tal como P. nebris (broca do caule); Pseudaletia spp. tal como P. unipuncta (lagarta militar comum); Peridroma spp. tal como P. saucia (lagarta-rosca pintalgada); Keiferia spp. tal como K. lycopersicella (tomato pinworm); Artogeia spp. tal como A. rapae (verme do repolho importado); Phthorimaea spp. tal como P. operculella (traça da batatinha); Crymodes spp. tal como C. devastator (lagarta-rosca vítrea); Feltia spp. tal como F. ducens (lagarta-rosca suja); e qualquer combinação dos anteriores. Em um aspecto desta modalidade, as proteínas inseticidas da invenção são ativas contra lagarta-rosca negra, broca da cana-de-açúcar e/ou broca do milho do sudoeste.

[0079] Os insetos na ordem Coleoptera incluem, mas não estão limitados a qualquer inseto coleóptero agora conhecido ou mais tarde identificado incluindo aqueles nas subordens Archostemata, Myxophaga, Adephaga e Polyphaga e qualquer sua combinação.

[0080] Em um aspecto desta modalidade, as proteínas inseticidas da invenção são ativas contra Diabrotica spp. Diabrotica é um gênero de besouros da ordem Coleoptera comumente referidos como "lagartas- da-raiz do milho" ou "besouros das cucurbitáceas". Espécies de Diabrotica exemplificativas incluem sem limitações Diabrotica barberi (lagarta-da-raiz do milho do norte), D. virgifera virgifera (lagarta-da-raiz do milho do oeste), D. undecimpunctata howardii (lagarta-da-raiz do milho do sul), D. balteata (besouro de pepino listrado), D. undecimpunctata undecimpunctata (besouro de pepino manchado do oeste), D. significata (besouro da folha de 3 manchas), D. speciosa (vaquinha), D. virgifera zeae (lagarta-da-raiz do milho mexicana), D. beniensis, D. cristata, D. curviplustalata, D. dissimilis, D. elegantula, D. emorsitans, D. graminea, D. hispanloe, D. lemniscata, D. linsleyi, D. milleri, D. nummularis, D. occlusal, D. porrecea, D. scutellata, D. tibialis, D. trifasciata e D. viridula; e qualquer sua combinação.

[0081] Outros exemplos não limitantes de pragas de insetos Coleópteros de acordo com a presente invenção incluem Leptinotarsa spp. tais como L. decemlineata (besouro-da-batata do Colorado); Chrysomela spp. tais como C. scripta (escaravelho da folha do choupo); Hypothenemus spp. tais como H. hampei (broca dos grãos do café); Sitophilus spp. tais como S. zeamais (gorgulho do milho); Epitrix spp. tais como E. hirtipennis (besouro da folha do tabaco) e E. cucumeris besouro da folha da batata); Phyllotreta spp. tais como P. cruciferae (besouro da folha das crucíferas) e P. pusilla (besouro da folha preto ocidental); Anthonomus spp. tais como A. eugenii (gorgulho da pimenta); Hemicrepidus spp. tais como H. memnonius (vermes); Melanotus spp. tais como M. communis (verme); Ceutorhychus spp. tais como C. assimilis (gorgulho das vagens da couve); Phyllotreta spp. tais como P. cruciferae (besouro da folha das crucíferas); Aeolus spp. tais como A. mellillus (verme); Aeolus spp. tais como A. mancus (verme do trigo); Horistonotus spp. tais como H. uhlerii (verme da areia); Sphenophorus spp. tais como S. maidis (gorgulho do milho), S. zeae (gorgulho timothy), S. parvulus (gorgulho da poa), and S. callosus (gorgulho do milho do sul); Phyllophaga spp. (Larvas brancas); Chaetocnema spp. tais como C. pulicaria (besouro da folha do milho); Popillia spp. tais como P. japonica (besouro japonês); Epilachna spp. tais como E. varivestis (besouro do feijão mexicano); Cerotoma spp. tais como C. trifurcate (besouro da folha do feijão); Epicauta spp. tais como E. pestifera e E. lemniscata (besouros de bolha); e qualquer combinação dos anteriores.

[0082] As proteínas inseticidas da invenção podem também ser ativas contra Hemípteros, Dípteros, Lygus spp., e/ou outros insetos perfurantes e sugadores, por exemplo da ordem Orthoptera ou Thysanoptera. Insetos da ordem Diptera incluem mas não estão limitados a qualquer inseto díptero agora conhecido ou mais tarde identificado incluindo mas não limitado a Liriomyza spp. tal como L. trifolii (lagarta mineira) e L. sativae (lagarta mineira dos vegetais); Scrobipalpula spp. tal como S. absoluta (lagarta mineira do tomateiro); Delia spp. tal como D. platura (larva da semente do milho), D. brassicae (mosca da couve) e D. radicum (mosca da raiz da couve); Psilia spp. tal como P. rosae (mosca da cenoura); Tetanops spp. tal como T. myopaeformis (larva da beterraba); e qualquer combinação dos anteriores.

[0083] Insetos da ordem Orthoptera incluem mas não estão limitados a qualquer inseto ortóptero agora conhecido ou mais tarde identificado incluindo mas não limitado a Melanoplus spp. tal como M. differentialis (gafanhoto diferencial), M. femurrubrum (gafanhoto-de- patas-vermelhas), M. bivittatus (gafanhoto verde-escuro de duas listrado); e qualquer sua combinação.

[0084] Insetos da ordem Thysanoptera incluem mas não estão limitados a qualquer inseto tisanóptero agora conhecido ou mais tarde identificado incluindo mas não limitado a Frankliniella spp. tal como F. occidentalis (tripes-da-califórnia) e F. fusca (tripes do tabaco); e Thrips spp. tal como T. tabaci (tripes da cebola), T. palmi (tripes do melão); e qualquer combinação dos anteriores.

[0085] As proteínas inseticidas da invenção podem também ser ativas contra nematódeos. O termo "nematódeo" como aqui utilizado engloba qualquer organismo que é agora conhecido ou mais tarde identificado que é classificado no reino animal, filo Nematoda, incluindo sem limitação os nematódeos da classe Adenophorea (incluindo, por exemplo, ordens Enoplida, Isolaimida, Mononchida, Dorylaimida, Trichocephalida, Mermithida, Muspiceida, Araeolaimida, Chromadorida, Desmoscolecida, Desmodorida e Monhysterida) e/ou classe Secernentea (incluindo, por exemplo, Rhabdita, Strongylida, Ascaridida, Spirurida, Camallanida, Diplogasterida, Tylenchida e Aphelenchida).

[0086] Os nematódeos incluem, mas não se limitam a nematódeos parasitas, tais como nematódeos das galhas radiculares, nematódeos formadores de cistos e/ou nematódeos de lesão. De acordo com a presente invenção, gêneros de nematódeos exemplificativos incluem, mas não estão limitados a Meloidogyne (nematódeos das galhas radiculares), Heterodera (nematódeos formadores de cistos), Globodera (nematódeos formadores de cistos), Radopholus (nematódeos cavernícolas), Rotylenchulus (nematódeos reniformes), Pratylenchus (nematódeos de lesão), Aphelenchoides (nematódeos foliares), Helicotylenchus (nematódeos espiralados), Hoplolaimus (nematódeos adaga), Paratrichodorus (nematódeos de encurtamento e engrossamento da raiz), Longidorus, Nacobbus (nematódeos falsos das galhas radiculares), Subanguina, Belonlaimus (nematódeos de ferrão), Criconemella, Criconemoides (nematódeos anelados), Ditylenchus, Dolichodorus, Hemicriconemoides, Hemicycliophora, Hirschmaniella, Hypsoperine, Macroposthonia, Melinius, Punctodera, Quinisulcius, Scutellonema, Xiphinema (nematódeos adaga), Tylenchorhynchus (nematódeos do enfezamento), Tylenchulus, Bursaphelenchus (vermes redondos), e qualquer sua combinação.

[0087] De acordo com a presente invenção, nematódeos parasitas de plantas exemplificativos incluem, mas não estão limitados a, Belonolaimus gracilis, Belonolaimus longicaudatus, Bursaphelenchus xylophilus (nematódeo da madeira do pinheiro), Criconemoides ornata, Ditylenchus destructor (nematódeo da podridão da batata), Ditylenchus dipsaci (nematódeo do caule e bulbo), Globodera pallida (nematódeo do cisto da batata), Globodera rostochiensis (nematódeo dourado), Heterodera glycines (nematódeo do cisto da soja), Heterodera schachtii (nematódeo do cisto da beterraba); Heterodera zeae (nematódeo do cisto do milho), Heterodera avenae (nematódeo do cisto dos cereais), Heterodera carotae, Heterodera trifolii, Hoplolaimus columbus, Hoplolaimus galeatus, Hoplolaimus magnistylus, Longidorus breviannulatus, Meloidogyne arenaria, Meloidogyne chitwoodi, Meloidogyne hapla, Meloidogyne incognita, Meloidogyne javanica, Mesocriconema xenoplax, Nacobbus aberrans, Naccobus dorsalis, Paratrichodorus christiei, Paratrichodorus minor, Pratylenchus brachyurus, Pratylenchus crenatus, Pratylenchus hexincisus, Pratylenchus neglectus, Pratylenchus penetrans, Pratylenchus projectus, Pratylenchus scribneri, Pratylenchus tenuicaudatus, Pratylenchus thornei, Pratylenchus zeae, Punctodera chaccoensis, Quinisulcius acutus, Radopholus similis, Rotylenchulus reniformis, Tylenchorhynchus dubius, Tylenchulus semipenetrans (citrus nematode), Siphinema americanum, X. Mediterraneum, e qualquer combinação dos anteriores.

[0088] Em outra modalidade, a invenção abrange um método para produzir uma proteína inseticida que é ativa contra insetos, compreendendo: (a) obter uma célula hospedeira compreendendo um gene, que compreende ele próprio um cassete de expressão e/ou uma molécula de ácido nucleico da invenção; e (b) crescimento da célula hospedeira transgênica de modo a expressar uma proteína inseticida que é ativa contra insetos.

[0089] Em ainda uma modalidade adicional, a invenção abrange um método de controle de insetos, compreendendo administrar aos insetos uma quantidade eficaz para o controle de insetos de uma proteína inseticida da invenção.

[0090] Em uma modalidade, pelo menos uma proteína inseticida da invenção é expressa em um organismo superior tal como uma planta. Neste caso, as plantas transgênicas expressando quantidades eficazes controladoras de insetos da proteína inseticida protegem-se a si mesmas da praga de insetos. Quando os insetos começam a se alimentar em uma tal planta transgênica, também podem ingerir a proteína inseticida expressa. Isso irá impedir que o inseto morda adicionalmente o tecido da planta, e/ou pode até prejudicar ou matar o inseto. Um ácido nucleico da presente invenção é inserido em um cassete de expressão, que pode ser depois integrado de forma estável no genoma da planta. Em outra modalidade, o ácido nucleico é incluído em um vírus de autorreplicação não patogênico. As plantas transformadas de acordo com a presente invenção podem ser monocotiledôneas ou dicotiledôneas e incluem, mas não estão limitadas a, milho, trigo, aveia, grama de relva, grama de pastagem, linho, cevada, centeio, batata-doce, feijão, ervilha, chicória, alface, couve, couve-flor, brócolis, nabo, rabanete, espinafre, aspargo, cebola, alho, pimenta, aipo, abóbora, abóbora-moranga, cânhamo, abobrinha, maçã, pera, marmelo, melão, ameixa, cereja, pêssego, nectarina, damasco, morango, uva, framboesa, amora, abacaxi, abacate, papaia, manga, banana, soja, tomate, sorgo, cana-de-açúcar, beterraba-sacarina, girassol, colza, trevo, tabaco, cenoura, algodão, alfafa, arroz, batata, berinjela, pepino, Arabidopsis e plantas lenhosas tais como árvores coníferas e decíduas.

[0091] Em uma outra modalidade, a invenção abrange um método de produção de uma planta ou parte de planta possuindo resistência a insetos melhorada em comparação com uma planta de controle ou parte de planta, compreendendo: (a) introduzir uma molécula de ácido nucleico compreendendo um cassete de expressão da invenção; e (b) crescimento da parte da planta em uma planta que expressa a molécula de ácido nucleico heterólogo do cassete de expressão e que tem resistência a insetos melhorada em comparação com uma planta de controle ou parte de planta que não foi transformada com uma molécula de ácido nucleico compreendendo o cassete de expressão. Em uma modalidade preferida, o cassete de expressão pode codificar um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou é 100% idêntica ou similar a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NOs: 37 a 72, SEQ ID NOs: 86 a 96 ou SEQ ID NO: 100. Em uma modalidade preferida, o cassete de expressão pode codificar um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60% idêntica à SEQ ID NO: 4. Resistência a insetos "melhorada" pode ser medida como um aumento da atividade inseticida. Resistência a insetos melhorada pode ser maior que 0%, pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 4%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 100%, pelo menos 125%, pelo menos 150%, pelo menos 200%, pelo menos 300%, pelo menos 400%, pelo menos 500%, pelo menos 600%, pelo menos 700%, pelo menos 800%, pelo menos 900%, ou pelo menos 1000% maior atividade inseticida comparada a uma planta controle. Uma planta ou parte de planta tendo uma resistência a insetos melhorada em comparação com uma planta de controle ou parte de planta pode ser produzida por métodos de transformação vegetal, cultura de tecido vegetal, ou manipulação. A planta ou parte de planta pode ser produzida por métodos de propagação sexual ou assexuada. Qualquer planta de controle ou parte da planta adequada pode ser usada, por exemplo, uma planta do mesmo ou semelhante fundo genético crescida no mesmo ambiente. Em modalidades, a planta de controle ou parte de planta é do mesmo fundo genético e está a crescer no mesmo ambiente como a planta descrita, mas não compreende uma molécula da invenção, enquanto que a planta descrita compreende uma molécula da invenção.

[0092] Em outra modalidade, a invenção engloba um método para melhorar resistência a insetos em uma planta ou parte de planta em comparação com uma planta de controle ou parte de planta, compreendendo expressar na planta ou parte de planta uma molécula de ácido nucleico ou um cassete de expressão da invenção, em que a expressão do ácido nucleico heterólogo do cassete de expressão resulta em resistência a insetos melhorada em uma planta ou parte de planta em comparação com uma planta de controle ou parte de planta. Em modalidades, o cassete de expressão ou molécula de ácido nucleico compreende um promotor operacionalmente ligado a uma molécula de ácido nucleico heterólogo compreendendo uma sequência de nucleotídeos que compreende: (a) uma sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 2 a 36, SEQ ID NOs: 73 a 83 ou SEQ ID NO: 99; (b) uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou é 100% idêntica à sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 2 a 36, SEQ ID NOs: 73 a 83 ou SEQ ID NO: 99; (c) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo compreende SEQ ID NO: 1, SEQ ID NOs: 37 a 72, SEQ ID NOs: 86 a 96 ou SEQ ID NO: 100, e tem uma atividade de controle de insetos; (d) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo em que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo é pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou é 100% idêntica à sequência de aminoácidos das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NOs: 37 a 72, SEQ ID NOs: 86 a 96 ou SEQ ID NO: 100; ou (e) uma sequência de nucleotídeos que é complementar à sequência de nucleotídeos de qualquer um de (a) a (d) acima. A molécula de ácido nucleico ou cassete de expressão pode ser introduzida na planta. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico ou cassete de expressão pode ser introduzida em uma parte de planta e uma planta compreendendo a molécula de ácido nucleico ou cassete de expressão pode ser produzida da parte da planta.

[0093] Em outra modalidade, a invenção abrange um método de produção de uma planta tendo resistência a insetos melhorada em comparação com uma planta controle, compreendendo detectar, em uma parte de planta, um ácido nucleico heterólogo compreendendo uma molécula de ácido nucleico ou um cassete de expressão da invenção e produzir uma planta a partir de parte da planta, produzindo assim uma planta que tem resistência a insetos melhorada em comparação com uma planta de controle. Em uma modalidade adicional, a invenção abrange um método de identificação de uma planta ou parte de planta tendo resistência a insetos melhorada em comparação com uma planta ou parte de planta de controle, compreendendo detectar, na planta ou parte de planta, uma molécula de ácido nucleico ou um cassete de expressão da invenção, identificando assim uma planta ou parte de planta tendo resistência a insetos melhorada. Em uma modalidade adicional, o cassete de expressão ou um seu fragmento de diagnóstico é detectado em um produto de amplificação de uma amostra de ácido nucleico da planta ou parte da planta. O fragmento de diagnóstico pode ser uma molécula de ácido nucleico de pelo menos 10 nucleotídeos contíguos de comprimento que é única para o cassete de expressão da invenção.

[0094] Em ainda outra modalidade, a invenção abrange um método de produção de uma planta que possui resistência a insetos melhorada em comparação com uma planta de controle ou parte de planta, compreendendo o cruzamento de uma primeira planta genitora com uma segunda planta genitora, em que, pelo menos, a primeira planta genitora compreende dentro do seu do genoma um ácido nucleico heterólogo que compreende uma molécula de ácido nucleico ou um cassete de expressão da presente invenção e a produção de uma geração de progênie, em que a geração de progênie compreende pelo menos uma planta que possui o ácido nucleico heterólogo no seu genoma e que apresenta resistência a insetos melhorada em comparação com uma planta de controle.

[0095] Em modalidades preferidas, os métodos da invenção conferem resistência a insetos melhorada em uma planta ou parte de planta contra uma praga de insetos coleópteros e/ou lepidópteros. O controle de insetos de ambas as pragas de insetos lepidópteros e coleópteros é demonstrado nos Exemplos. Em outras modalidades, os métodos da invenção conferem resistência a insetos melhorada em uma planta ou parte da planta contra espécies de Diabrotica, incluindo Diabrotica virgifera virgifera, Diabrotica barberi, Diabrotica undecimpunctata howardi, Diabrotica virgifera zeae, e/ou Diabrotica speciosa, e/ou espécies relacionada.

[0096] Em modalidades preferidas, os métodos da invenção conferem resistência a insetos melhorada em uma planta monocotiledônea.

[0097] A presente invenção abrange ainda uma planta transgênica compreendendo uma molécula de ácido nucleico heteróloga ou um cassete de expressão da invenção, que quando transcrita e traduzida confere resistência a insetos melhorada. Em modalidades preferidas, a molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% pelo menos 99%, ou 100% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOs: 2 a 36, SEQ ID NOs: 73 a 83 ou SEQ ID NO: 99. Em modalidades preferidas, a planta transgênica compreende uma molécula de ácido nucleico heteróloga compreendendo uma sequência pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% pelo menos 99%, ou 100% idêntica à SEQ ID NOs: 2 a 36, SEQ ID NOs: 73 a 83 ou SEQ ID NO: 99. Em modalidades, a planta transgênica é uma planta dicotiledônea. Em modalidades preferidas, a planta transgênica é uma planta monocotiledônea. Em modalidades adicionais, a planta transgênica é alfafa, endro, maçã, damasco, alcachofra, rúcula, espargos, abacate, banana, feijão, beterraba, amora, mirtilo, brócolis, couve-de-bruxelas, repolho, canola, meloa, cenoura, mandioca, couve- flor, salsão, cereja, coentro, cítrico, clementina, café, milho, algodão, pepino, abeto-de-douglas, berinjela, endívia, escarola, eucalipto, erva- doce, figos, cabaça, uva, toranja, baba de mel, jicama, quiuí, alface, alho-poró, limão, lima, pinheiro amarelo, manga, melão, cogumelo, noz, quiabo, cebola, laranja, uma planta ornamental, mamão, salsa, ervilha, pêssego, amendoim, pera, pimenta, caqui, pinheiro, abacaxi, banana- da-terra, ameixa, romã, álamo, batata, abóbora-moranga, marmeleiro, pinheiro-de-monterey, chicória, rabanete, framboesa, arroz, centeio, sorgo, pinheiro do sul, soja, espinafre, abóbora, morango, beterraba sacarina, girassol, batata doce, liquidâmbar, tangerina, chá, tabaco, tomate, relva, uma videira, melancia, inhame ou abobrinha italiana. Em modalidades preferenciais, a planta transgênica é milho-painço, painço amarelo, milho, sorgo, trigo, aveia, grama de relva, grama de pastagem, linho, arroz, cana-de-açúcar, colza ou cevada.

[0098] Ainda em outra modalidade, uma planta transgênica da invenção compreende uma molécula de ácido nucleico heterólogo compreendendo uma sequência promotora. Ainda em outra modalidade, uma planta transgênica da invenção pode compreender uma molécula de ácido nucleico heterólogo que codifica pelo menos uma característica adicional desejada. A característica adicional pode ser codificada na mesma molécula de ácido nucleico heteróloga que uma molécula da invenção, ou pode ser codificada em uma segunda molécula de ácido nucleico heteróloga. A característica adicional desejada pode conferir resistência a insetos a uma segunda praga, resistência a insetos à mesma praga, tolerância ao estresse abiótico, esterilidade masculina, resistência a herbicidas, resistência a doenças bacterianas, resistência a doenças fúngicas, resistência a doenças virais, resistência a nematódeos, metabolismo de ácidos graxos modificado, metabolismo de carboidratos modificado, valor nutricional melhorado, desempenho em um processo industrial melhorado ou capacidade reprodutiva alterada. A característica adicional desejada pode também induzir a produção dentro da planta de uma enzima ou metabolito comercialmente valiosa.

[0099] Em modalidades, a característica desejada adicionada é um segundo agente pesticida. O segundo agente pesticida pode ser ativo em qualquer praga de plantas, incluindo insetos, nematódeos, fungos, vírus ou bactérias. Exemplos de pragas de plantas de insetos incluem e não se limitam a Nilaparvata spp. (p. ex. N. lugens (cigarrinha marrom)); Laodelphax spp. (p. ex. L. striatellus (cigarrinha marrom pequena)); Nephotettix spp. (p. ex. N. virescens ou N. cincticeps (cigarrinha verde), ou N.nigropictus (cigarrinha do arroz)); Sogatella spp. (p. ex. S. furcifera (cigarrinha de costas brancas)); Blissus spp. (p. ex. B. leucopterus leucopterus (percevejo das gramíneas)); Scotinophora spp. (p. ex. S. vermidulate (gorgulho do arroz)); Acrosternum spp. (p. ex. A. hilare (percevejo verde)); Parnara spp. (p. ex. P. guttata (larva da borboleta do arroz)); Chilo spp. (p. ex. C. suppressalis (broca riscada do tronco do arroz), C. auricilius (broca do tronco de bordas douradas), ou C. polychrysus (broca do tronco de cabeça escura)); Chilotraea spp. (p. ex. C. polychrysa (broca do caule do arroz)); Sesamia spp. (p. ex. S. inferens (broca rosa do arroz)); Tryporyza spp. (p. ex. T. innotata (broca branca do arroz), ou T. incertulas (broca amarela do arroz)); Cnaphalocrocis spp. (p. ex. C. medinalis (lagarta-enroladeira do arroz)); Agromyza spp. (p. ex. A. oryzae (lagarta mineira), ou A. parvicornis lagarta mineira do milho)); Diatraea spp. (p. ex. D. saccharalis (broca da cana-de-açúcar), ou D. grandiosella (broca do milho do sudoeste)); Narnaga spp. (p. ex. N. aenescens (lagarta verde do arroz)); Xanthodes spp. (p. ex. X. transversa (lagarta verde)); Spodoptera spp. (p. ex. S. frugiperda (lagarta militar do milho), S. exigua (lagarta militar da beterraba), S. littoralis (lagarta-rosca) ou S. praefica (lagarta militar de listras amarelas do oeste)); Mythimna spp. (p. ex. Mythmna (Pseudaletia) seperata (lagarta militar)); Helicoverpa spp. (p. ex. H. zea (lagarta da espiga do milho)); Colaspis spp. (p. ex. C. brunnea (besouro de Colaspis da uva)); Lissorhoptrus spp. (p. ex. L. oryzophilus (gorgulho de água de arroz)); Echinocnemus spp. (p. ex. E. squamos (gorgulho do arroz)); Diclodispa spp. (p. ex. D. armigera (hispa do arroz)); Oulema spp. (p. ex. O. oryzae (besouro de folha); Sitophilus spp. (p. ex. S. oryzae (gorgulho do arroz)); Pachydiplosis spp. (p. ex. P. oryzae (mosca-de-galha do arroz)); Hydrellia spp. (p. ex. H. griseola (lagarta mineira pequena), ou H. sasakii (larvas da haste do arroz)); Chlorops spp. (p. ex. C. oryzae (larvas da haste)); Diabrotica spp. (p. ex. D. virgifera virgifera (lagarta-da-raiz do milho do oeste), D. barberi (lagarta- da-raiz do milho do norte), D. undecimpunctata howardi (lagarta-da-raiz do milho do sul), D. virgifera zeae (lagarta-da-raiz do milho mexicana); D. balteata (besouro de pepino listrado)); Ostrinia spp. (p. ex. O. nubilalis (broca europeia do milho)); Agrotis spp. (p. ex. A.ipsilon (lagarta-rosca negra)); Elasmopalpus spp. (p. ex. E. lignosellus (lagarta- Elasmo)); Melanotus spp. (vermes); Cyclocephala spp. (p. ex. C. borealis (besouro mascarado do norte), ou C. immaculata (besouro mascarado do sul)); Popillia spp. (p. ex. P. japonica (besouro japonês)); Chaetocnema spp. (p. ex. C. pulicaria (besouro da folha do milho)); Sphenophorus spp. (p. ex. S. maidis (gorgulho do milho)); Rhopalosiphum spp. (p. ex. R. maidis (pulgão da folha do milho)); Anuraphis spp. (p. ex. A. maidiradicis (pulgão da raiz do milho)); Melanoplus spp. (p. ex. M. femurrubrum (gafanhoto-de-patas- vermelhas) M. differentialis (gafanhoto diferencial)) ou M. sanguinipes (gafanhoto migratório)); Hylemya spp. (p. ex. H. platura (larva da semente do milho)); Anaphothrips spp. (p. ex. A. obscrurus (tripes da grama)); Solenopsis spp. (p. ex. S. milesta (formiga ladra)); ou spp. (p. ex. T. urticae (ácaros-aranha de duas manchas), T. cinnabarinus (ácaros-aranha vermelho comum); Helicoverpa spp. (p. ex. H. zea (lagarta das espigas do algodoeiro), ou H. armigera (lagarta roscada americana)); Pectinophora spp. (p. ex. P. gossypiella (lagarta rosada)); Earias spp. (p. ex. E. vittella (lagarta roscada manchada)); Heliothis spp. (p. ex. H. virescens (lagarta-da-maçã)); Anthonomus spp. (p. ex. A. grandis (bicudo do algodoeiro)); Pseudatomoscelis spp. (p. ex. P. seriatus (pulga do algodão)); Trialeurodes spp. (p. ex. T. abutiloneus (mosca branca de asas listradas) T. vaporariorum (mosca branca de estufa)); Bemisia spp. (p. ex. B. argentifolii (mosca branca da folha prateada)); Aphis spp. (p. ex. A. gossypii (pulgão do algodão)); Lygus spp. (p. ex. L. lineolaris (percevejo manchado) ou L. hesperus (percevejo manchado do oest)); Euschistus spp. (p. ex. E. conspersus (percevejo marrom)); Chlorochroa spp. (p. ex. C. sayi (percevejo Say)); Nezara spp. (p. ex. N. viridula (percevejo verde do sul)); Thrips spp. (p. ex. T. tabaci (tripes da cebola)); Frankliniella spp. (p. ex. F. fusca (tripes do tabaco), ou F. occidentalis (tripes-da-califórnia)); Leptinotarsa spp. (p. ex. L. decemlineata (besouro da batata do Colorado), L. juncta (besouro falso da batata), ou L. texana (besouro falso da batata do Texas)); Lema spp. (p. ex. L. trilineata (besouro de batata de três linhas)); Epitrix spp. (p. ex. E. cucumeris (besouro da folha da batata), E. hirtipennis (besouro da folha do tabaco), ou E. tuberis (besouro saltador do tubérculo)); Epicauta spp. (p. ex. E. vittata burrinho listrado)); Phaedon spp. (p. ex. P. cochleariae (besouro da folha da mostarda)); Epilachna spp. (p. ex. E. varivetis (besouro do feijão mexicano)); Acheta spp. (p. ex. A. domesticus (grilo doméstico)); Empoasca spp. (p. ex. E. fabae (cigarrinha verde da batata)); Myzus spp. (p. ex. M. persicae (pulgão verde do pessegueiro)); Paratrioza spp. (p. ex. P. cockerelli (psilídeo)); Conoderus spp. (p. ex. C. falli (verme da batata), ou C. vespertinus (verme do tabaco)); Phthorimaea spp. (p. ex. P. operculella (traça da batatinha)); Macrosiphum spp. (p. ex. M. euphorbiae (pulgão da batata)); Thyanta spp. (p. ex. T. pallidovirens (percevejo da costa castanha)); Phthorimaea spp. (p. ex. P. operculella (traça da batata)); Helicoverpa spp. (p. ex. H. zea (broca grande do fruto); Keiferia spp. (p. ex. K. lycopersicella (verme do tomate)); Limonius spp. (vermes); Manduca spp. (p. ex. M. sexta (mandarová do tabaco), ou M. quinquemaculata (mandarová do tomate)); Liriomyza spp. (p. ex. L. sativae, L. trifolli ou L. huidobrensis (lagarta mineira)); Drosophilla spp. (p. ex. D. melanogaster, D. yakuba, D. pseudoobscura ou D. simulans); Carabus spp. (p. ex. C. granulatus); Chironomus spp. (p. ex. C. tentanus); Ctenocephalides spp. (p. ex. C. felis (pulga do gato)); Diaprepes spp. (p. ex. D. abbreviatus (gorgulho da raiz)); Ips spp. (p. ex. I. pini (besouros-da-casca do pinheiro)); Tribolium spp. (p. ex. T. castaneum (besouro castanho)); Glossina spp. (p. ex. G. morsitans (mosca tsé-tsé)); Anopheles spp. (p. ex. A. gambiae (mosquito da malária)); Helicoverpa spp. (p. ex. H. armigera (lagarta Helicoverpa armigera)); Acyrthosiphon spp. (p. ex. A. pisum (afídeo da ervilha)); Apis spp. (p. ex. A. melifera (abelha do mel)); Homalodisca spp. (p. ex. H. coagulate (atirador vítreo-de-asa)); Aedes spp. (p. ex. Ae. aegypti (mosquito da febre-amarela)); Bombyx spp. (p. ex. B. mori (mariposa-de-seda)); Locusta spp. (p. ex. L. migratoria (gafalhoto- migratório)); Boophilus spp. (p. ex. B. microplus (carrapato de boi)); Acanthoscurria spp. (p. ex. A. gomesiana (aranha-caranguejeira)); Diploptera spp. (p. ex. D. punctata (baratas-besouro do Pacífico)); Heliconius spp. (p. ex. H. erato (borboleta vermelha da flor da paixão) ou H. melpomene (borboleta de carteiro)); Curculio spp. (p. ex. C. glandium (escaravelho da bolota)); Plutella spp. (p. ex. P. xylostella (traça-das-crucíferas)); Amblyomma spp. (p. ex. A. variegatum (carrapato tropical)); Anteraea spp. (p. ex. A. yamamai (mariposa de seda japonesa)); e Armigeres spp. (p. ex. A. subalbatus).

[00100] As proteínas inseticidas da invenção podem ser usadas em combinação com outros agentes pesticidas (por exemplo, proteínas Bt Cry) para aumentar a gama de pragas alvo. Além disso, o uso das proteínas inseticidas da presente invenção em combinação com um agente inseticida que tem um modo de ação diferente ou tem como alvo um receptor diferente no intestino de insetos, tem particular utilidade para a prevenção e/ou gestão da resistência dos insetos.

[00101] O segundo agente pesticida pode ser uma proteína inseticida derivada de Bacillus thuringiensis. Uma proteína inseticida de B. thuringiensis pode ser qualquer uma de um número de proteínas inseticidas incluindo, mas não se limitando a uma proteína Cry1, uma proteína Cry3, uma proteína Cry7, uma proteína Cry8, uma proteína Cry11, uma proteína Cry22, uma proteína Cry 23, uma proteína Cry 36, uma proteína Cry37, uma proteína Cry34 em conjunto com uma proteína Cry35, uma proteína inseticida binária CryET33 e CryET34, uma proteína inseticida binária TIC100 e TIC101, uma proteína inseticida binária PS149B1, uma VIP (Proteína Inseticida Vegetativa, divulgada nas Patentes dos EUA 5,849,870 e 5,877,012, aqui incorporadas a título de referência), uma TIC900 ou proteína relacionada, uma TIC901, TIC1201, TIC407, TIC417, uma proteína Cry3A modificada ou proteínas híbridas ou quimeras preparadas a partir de qualquer uma das proteínas inseticidas precedentes. Em outras modalidades, a proteína inseticida B. thuringiensis é selecionada do grupo que consiste em proteínas Cry3Bb1, Cry34Ab1 em conjunto com Cry35Ab1, mCry3A (Patente dos EUA No. 7,276,583, aqui incorporada a título de referência), eCry3.1Ab (Patente dos EUA No. 8,309,516, aqui incorporada a título de referência) e Vip3A, incluindo Vip3Aa (Patente dos EUA No. 6,137,033, aqui incorporada a título de referência).

[00102] Em outras modalidades, a planta transgênica da invenção pode compreender um segundo agente pesticida que pode ser derivado de outras fontes sem ser B. thuringiensis. O segundo agente inseticida pode ser um agente selecionado do grupo compreendendo uma a amilase, uma peroxidase, uma colesterol oxidase, uma patatina, uma protease, um inibidor de protease, uma urease, um inibidor de alfa- amilase, uma proteína formadora de poros, uma quitinase, uma lectina, um anticorpo ou fragmento de anticorpo manipulado, uma proteína inseticida de Bacillus cereus, uma proteína inseticida de Xenorhabdus spp. (tal como de X. nematophila ou X. bovienii), uma proteína inseticida de Photorhabdus spp. (tal como de P. luminescens ou P. asymobiotica), uma proteína inseticida de Brevibacillus spp. (tal como de B. laterosporous), uma proteína inseticida de Lysinibacillus spp. (tal como de L. sphearicus), uma proteína inseticida de Chromobacterium spp. (tal como de C. subtsugae ou uma proteína inseticida de C. piscinae) , uma proteína inseticida de Yersinia spp. (tal como de Y. entomophaga), uma proteína inseticida de Paenibacillus spp. (tal como de P. propylaea), uma proteína inseticida de Clostridium spp. (tal como de C. bifermentans), uma Pseudomonas spp. (tal como P. fluorescens)e uma lignina. Em outras modalidades, o segundo agente pode ser pelo menos uma proteína inseticida derivada de um complexo de toxina (Tc) inseticida de Photorhabdus, Xenorhabus, Serratia ou Yersinia. Em outras modalidades. A proteína inseticida pode ser uma ADP- ribosiltransferase derivada de uma bactéria inseticida, tal como Photorhabdus ssp. Ainda em outras modalidades, a proteína inseticida pode Axmi205 ou derivada de Axmi205 (Patente dos EUA No. 8,575,425 e No. 9,394,345, cada uma aqui incorporada por referência). Em outras modalidades, a proteína inseticida pode ser uma proteína VIP, tal como VIP1 e/ou VIP2 de B. cereus. Em ainda outras modalidades, a proteína inseticida pode ser uma toxina binária derivada de uma bactéria inseticida, tal como ISP1A e ISP2A de B. laterosporous ou BinA e BinB de L. sphaericus. Em ainda outras modalidades, a proteína inseticida pode ser manipulada ou pode ser um híbrido ou quimera de qualquer uma das proteínas inseticidas precedentes.

[00103] Em algumas modalidades, a planta transgênica da invenção pode compreender e/ou expressar pelo menos um segundo agente pesticida que é não proteico. Em algumas modalidades, o segundo agente pesticida pode estar presente na superfície da planta, por exemplo, como uma aplicação tópica. Em modalidades preferidas, o segundo agente pesticida é uma molécula de RNA de interferência. Um RNA de interferência compreende tipicamente pelo menos um fragmento de RNA contra um gene alvo, uma sequência espaçadora e um segundo fragmento de RNA que é complementar ao primeiro, de forma que possa ser formada uma estrutura de RNA de fita dupla. Ocorre interferência de RNA (RNAi) quando um organismo reconhece moléculas de RNA de fita dupla (dsRNA) e as hidrolisa. Os produtos de hidrólise resultantes são pequenos fragmentos de RNA com cerca de 19-24 nucleotídeos em comprimento, chamados pequenos RNAs de interferência (siRNAs). Os siRNAs se difundem depois ou são transportados ao longo do organismo, incluindo através de membranas celulares, onde hibridizam com mRNAs (ou outros RNAs) e causam hidrólise do RNA. Os RNAs de interferência são reconhecidos pelo complexo silenciador de interferência de RNA (RISC) no qual é carregada uma fita efetora (ou "fita guia") do RNA. Esta fita guia atua como um molde para o reconhecimento e destruição das sequências do dúplex. Este processo é repetido de cada vez que o siRNA hibridiza com o seu alvo de RNA complementar, prevenindo efetivamente que esses mRNAs sejam traduzidos e, assim, "silenciando" a expressão de genes específicos a partir dos quais os mRNAs foram transcritos. Os RNAs de interferência são conhecidos na técnica como sendo úteis para controle de insetos (ver, por exemplo, publicação WO2013/192256, aqui incorporada a título de referência). Um RNA de interferência projetado para controle de insetos produz um RNA de fita dupla de ocorrência não natural, que tira vantagem das vias nativas de RNAi no inseto para desencadear regulação negativa de genes alvo que possa levar à cessação da alimentação e/ou crescimento e possa resultar na morte da praga de insetos. A molécula de RNA de interferência pode conferir resistência a insetos contra a mesma praga alvo que a proteína da invenção, ou pode ter como alvo uma praga diferente. A praga de plantas de insetos alvo pode se alimentar mastigando, sugando ou perfurando. Os RNAs de interferência são conhecidos na técnica como sendo úteis para o controle de insetos. Em modalidades, o dsRNA útil para controle de insetos é descrito nos Pedidos de Patente PCT Nos. PCT/US17/044825; PCT/US17/044831; PCT/US17/044832, incorporados no presente documento por referência. Em modalidades, o dsRNA útil para controle de insetos é descrito nas Patentes EUA Nos. 9,238,8223, 9,340,797 ou 8,946,510, incorporadas no presente documento por referência. Em modalidades, o dsRNA útil para controle de insetos é descrito nos Pedidos de Patentes EUA Nos. 12/868,994, 13/831,230, 14/207,313 ou 14/207318, incorporados no presente documento por referência. Em outras modalidades, o RNA de interferência pode conferir resistência contra uma praga de plantas que não insetos, tais como pragas de nematódeos ou uma praga vírus.

[00104] A coexpressão de mais do que um agente pesticida na mesma planta transgênica pode ser alcançada por meio de um único vetor recombinante compreendendo sequências codificantes de mais do que um agente pesticida na chamada pilha molecular e manipulação genética de uma planta para conter e expressar todas os agentes pesticidas na planta transgênica. Tais pilhas moleculares podem também ser feitas usando mini-cromossomas tal como descrito, por exemplo na Patente dos EUA 7,235,716. Alternativamente, uma planta transgênica compreendendo um ácido nucleico que codifica um primeiro agente pesticida pode ser novamente transformada com um ácido nucleico diferente que codifica um segundo agente pesticida e assim por diante. Alternativamente, uma planta, Genitor 1, pode ser geneticamente manipulada para a expressão de genes da presente invenção. Uma segunda planta, Genitor 2, pode ser geneticamente manipulada para expressão de um segundo agente pesticida. Por cruzamento do Genitor 1 com o Genitor 2 são obtidas plantas de progênie que expressam todos os genes introduzidos nos Genitores 1 e 2.

[00105] Plantas ou semente transgênicas compreendendo e/ou expressando uma proteína inseticida da invenção podem ser também tratadas com um inseticida ou revestimento de semente inseticida como descrito nas Patentes dos EUA Nos. 5,849,320 e 5,876,739, aqui incorporadas por referência. Em modalidades, onde tanto o inseticida ou revestimento de semente inseticida como a planta ou semente transgênica da invenção são ativos contra o mesmo inseto alvo, por exemplo uma praga de Coleópteros ou praga alvo de Diabrotica, a combinação é útil (i) em um método para intensificação adicional da atividade da composição da invenção contra o inseto alvo e/ou (ii) em um método para prevenção do desenvolvimento de resistência à composição da invenção pelo proporcionar de ainda outro mecanismo de ação contra o inseto alvo. Assim, em modalidades, a invenção proporciona um método de intensificação do controle de uma população de insetos de Diabrotica compreendendo proporcionar uma planta ou semente transgênica da invenção e aplicar à planta ou à semente de um inseticida ou revestimento de semente inseticida na planta ou semente transgênica da invenção.

[00106] Mesmo quando o inseticida ou revestimento de semente inseticida é ativo contra um inseto diferente, o inseticida ou revestimento de semente inseticida é útil para expandir a faixa de controle de insetos, por exemplo, quando é adicionado um inseticida ou um revestimento de semente inseticida que tem atividade contra insetos lepidópteros para uma semente transgênica da invenção, que, em certas modalidades, tem atividade contra insetos coleópteros e alguns lepidópteros, a semente transgênica revestida produzida controla pragas de insetos lepidópteros e coleópteros.

[00107] Exemplos de tais inseticidas e/ou revestimentos de semente inseticidas incluem, sem limitação, um carbamato, um piretroide, um organofosfato, um fiprol, um neonicotinoide, um organocloreto, uma nereistoxina ou uma sua combinação. Em outra modalidade, o inseticida ou revestimento de semente inseticida é selecionado do grupo consistindo em carbofurano, carbaril, metomil, bifentrina, teflutrina, permetrina, ciflutrina, lambda-cialotrina, cipermetrina, deltametrina, clorpirifos, cloretoxifos, dimetoato, etoprofos, malation, metil-paration, forato, terbufos, tebupirimifos, fipronil, acetamiprida, imidacloprida, tiacloprida, tiametoxam, endossulfano, bensultap e uma sua combinação. Produtos comerciais contendo tais inseticidas e revestimentos de semente inseticidas incluem, sem limitação, Furadan® (carbofurano), Lanate® (metomil, metomil, mesomila), Sevin® (carbaril), Talstar® (bifentrina), Force® (teflutrina), Ammo® (cipermetrina), Cymbush® (cipermetrina), Delta Gold® (deltametrina), Karate® (lambda-cialotrina), Ambush® (permetrina), Pounce® (permetrina), Brigade® (bifentrina), Capture® (bifentrina), ProShield® (teflutrina), Warrior® (lambda-cialotrina), Dursban® (clorfirifos), Fortress® (cloretoxifos), Mocap® (etoprop), Thimet® (forato), AAstar® (forato, flucitinato), Rampart® (forato), Counter® (terbufos), Cygon® (dimetoato), Dicapton, Regent® (fipronil), Cruiser® (tiametoxam), Gaucho® (imidacloprida), Prescribe® (imidacloprida), Poncho® (clotianidina) e Aztec® (ciflutrina, tebupirimfos).

[00108] A presente invenção também abrange uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de controle de insetos de uma proteína inseticida de acordo com a invenção. Em outras modalidades, a composição compreende um transportador agricolamente adequado e um polipeptídeo da invenção com atividade inseticida. O transportador agrícola pode incluir adjuvantes, misturadores, intensificadores, etc. benéficos para aplicação de um ingrediente ativo, tal como um polipeptídeo da invenção, incluindo um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou 100% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 37 a 72, SEQ ID NO: 86 a 96 ou SEQ ID NO: 100. Os transportadores adequados não devem ser fitotóxicos para culturas valiosas, particularmente às concentrações empregues na aplicação das composições na presença de culturas, e não devem reagir quimicamente com os compostos do ingrediente ativo aqui descrito, nomeadamente um polipeptídeo da invenção, ou outros ingredientes da composição. Tais misturas podem ser desenhadas para aplicação diretamente às culturas ou podem ser concentrados ou formulações que são normalmente diluídos com transportadores e adjuvantes adicionais antes da aplicação. Podem incluir componentes inertes ou ativos e podem ser sólidos, tais como, por exemplo, poeiras, pós, grânulos, grânulos dispersíveis em água ou pós molháveis, ou líquidos, tais como, por exemplo, concentrados emulsificáveis, soluções, emulsões ou suspensões. Transportadores agrícolas adequados podem incluir transportadores líquidos, por exemplo água, tolueno, xileno, nafta de petróleo, óleo de cultura, acetona, cetona de metiletila, cicloexanona, tricloroetileno, percloroetileno, acetato de etila, acetato de amila, acetato de butila, éter de monometila de propilenoglicol e éter de monometila de dietilenoglicol, metanol, etanol, isopropanol, álcool de amila, etilenoglicol, propilenoglicol, glicerina e similares. A água é geralmente o transportador de escolha para a diluição de concentrados. Transportadores sólidos adequados incluem talco, argila de pirofilita, sílica, argila de atapulgita, kieselguhr, giz, terra diatomácea, cal, carbonato de cálcio, argila de bentonita, terra de Fuller, cascas de sementes de algodão, farinha de trigo, farinha de soja, pedra- pomes, farinha de madeira, farinha de cascas de nozes, lignina e similares. Em outra modalidade, um polipeptídeo da invenção pode ser encapsulado em uma matriz sintética tal como um polímero e aplicado à superfície de um hospedeiro tal como uma planta. A ingestão das células hospedeiras por um inseto permite administração dos agentes de controle de insetos ao inseto e resulta em um efeito tóxico na praga de inseto.

[00109] Em modalidades adicionais, uma composição da invenção pode ser um pó, poeira, pélete, grânulo, aspersão, emulsão, coloide ou solução. Uma composição da invenção pode ser preparada por dessecação, liofilização, homogeneização, extração, filtração, centrifugação, sedimentação ou concentração de uma cultura de células bacterianas. Uma composição da invenção pode compreender pelo menos 1%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, ou pelo menos 99% em peso de um polipeptídeo da invenção.

[00110] Em modalidades, uma composição da invenção pode compreender, pelo menos, um segundo agente pesticida (por exemplo, que pode ser expresso transgenicamente a partir da planta e/ou ser incorporado na composição), o qual pode ser inseticida, nematicida, fungicida ou bactericida. Pelo menos um segundo agente pesticida pode ser inseticida para o mesmo inseto que um polipeptídeo da invenção ou para um inseto diferente. O segundo agente pesticida pode ser um polipeptídeo. O agente pesticida pode ser um RNA de interferência (por exemplo, um dsRNA). O segundo agente pesticida pode ser um microrganismo, tal como uma bactéria, que compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica um agente pesticida e/ou contém um agente pesticida, tal como um polipeptídeo ou RNA de interferência. O microrganismo pode ser atenuado, inativado pelo calor ou liofilizado. O microrganismo pode estar morto ou incapaz de se reproduzir. O segundo agente pesticida pode ser um inseticida, por exemplo carbofurano, carbaril, metomil, bifentrina, teflutrina, permetrina, ciflutrina, lambda-cialotrina, cipermetrina, deltametrina, clorpirifos, cloretoxifos, clotianidina, dimetoato, etoprofos, malation, metil-paration, forato, terbufos, tebupirimifos, fipronil, acetamiprida, imidacloprida, tiacloprida, tiametoxam, endossulfano, bensultap, ou uma sua combinação, ou um produto comercial contendo tais inseticidas e revestimentos de sementes inseticidas como descrito acima.

[00111] Uma composição da invenção, por exemplo uma composição compreendendo um polipeptídeo da invenção e um transportador agricolamente aceitável, pode ser usada em métodos agrícolas convencionais. Um transportador agricolamente aceitável é uma formulação útil para aplicar uma composição compreendendo um polipeptídeo da invenção a uma planta ou semente. Por exemplo, as composições da invenção podem ser misturadas com água e/ou fertilizantes e podem ser aplicadas pré-emergência e/ou pós- emergência a um lócus desejado por quaisquer meios, tal como tanques de pulverização em aviões, equipamento de irrigação, equipamento de pulverização com injeção direta, tanques de pulverização de costas, tanques de imersão para gado, equipamento agrícola usado na pulverização do solo (p. ex., pulverizadores de barras, pulverizadores manuais) e similares. O lócus desejado pode ser solo, plantas e similares.

[00112] Uma composição da invenção pode ser aplicada a uma semente ou propágulo de planta em qualquer estado fisiológico, em qualquer momento entre a coleta da semente e a semeadura da semente; durante ou após a semeadura; e/ou após a germinação. É preferencial que a semente ou propágulo de planta esteja em um estado suficientemente durável tal que incorra em danos nulos ou mínimos, incluindo danos físicos ou danos biológicos, durante o processo de tratamento. Uma formulação pode ser aplicada às sementes ou propágulos de plantas usando técnicas e máquinas revestimento convencionais, tais como técnicas de leito fluidizado, o método do moinho de cilindros, depuradores de sementes rotoestáticos e revestidores de tambor.

[00113] A presente invenção também compreende um método para controlar uma população de pragas de Lepidópteros e/ou Coleópteros compreendendo o contato da dita população com uma quantidade eficaz de controle de insetos de um polipeptídeo da invenção com atividade inseticida, onde o polipeptídeo é pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou é 100% idêntico a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 37 a 72, SEQ ID NO: 86 a 96 ou SEQ ID NO: 100. O contato inclui membros da população de pragas que se alimentam ou ingerem o polipeptídeo. O polipeptídeo pode ser incorporado em alimentos da dieta de insetos ou pode ser expresso em ou presente no tecido da planta que o inseto ingere depois. Em outras modalidades, o controle das populações de pragas de Lepidópteros e/ou Coleópteros inclui matar os insetos por contato dos insetos com uma quantidade eficaz de controle de insetos de um polipeptídeo da invenção.

[00114] A presente invenção também compreende um método para proteger uma planta de uma praga de inseto, compreendendo expressar em uma planta ou célula da planta uma sequência de nucleotídeos ou cassete de expressão que codifica um polipeptídeo inseticida da invenção. Em modalidades, a sequência de nucleotídeos é pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou é 100% idêntica à sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 a 36, ou codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou é 100% idêntica a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 37 a 72, SEQ ID NO: 86 a 96 ou SEQ ID NO: 100. Em modalidades adicionais, a planta ou célula da planta produz um polipeptídeo inseticida tendo atividade inseticida contra uma praga de Lepidópteros e/ou Coleópteros.

[00115] A presente invenção também compreende um método para aumentar o rendimento de uma planta compreendendo crescer em um campo uma planta, ou uma sua semente, tendo estavelmente incorporado no seu genoma uma molécula de ácido nucleico de um cassete de expressão da presente invenção, e em que o referido campo é infestado com uma praga contra a qual o referido polipeptídeo tem atividade inseticida.

[00116] Uma vez que um ácido nucleico desejado tenha sido transformado em uma espécie de planta particular, ele pode ser propagado nessa espécie ou movido para outras variedades da mesma espécie, que incluem em particular variedades comerciais, usando técnicas de melhoramento tradicionais.

[00117] Em modalidades, um ácido nucleico da presente invenção é expresso em plantas transgênicas, causando assim a biossíntese da correspondente proteína inseticida nas plantas transgênicas. Deste modo, as plantas transgênicas com resistência a insetos melhorada, particularmente lagarta-da-raiz do milho, são geradas. Para sua a expressão em plantas transgênicas, os ácidos nucleicos da invenção podem ser opcionalmente modificados e otimizados. Apesar de, em muitos casos, os genes dos organismos microbianos poderem ser expressos em plantas a níveis elevados sem modificação, a baixa expressão nas plantas transgênicas pode resultar dos ácidos nucleicos microbianos com códons que não são preferidos nas plantas. É conhecido na técnica que todos os organismos têm preferência específicas para o uso de códon, e os códons dos ácidos nucleicos descritos nesta invenção podem ser alterados para se adequar às preferências das plantas, enquanto mantêm os aminoácidos codificados desse modo. Além do mais, a elevada expressão em plantas é mais bem alcançada a partir de sequências codificantes que têm pelo menos cerca 35% de conteúdo de GC, preferencialmente mais do que cerca de 45%, mais preferencialmente mais do que cerca de 50%, e o mais preferencialmente mais do que cerca de 60%. Ácidos nucleicos microbianos que têm baixo conteúdo de GC podem expressar-se pobremente em plantas devido à existência de motivos ATTTA que podem desestabilizar mensagens, e motivos AATAAA que podem causar poliadenilação inapropriada. Em modalidades, sequências podem ser modificadas para considerar as preferências de códon específicas e preferências de conteúdo GC de monocotiledôneas ou dicotiledôneas, já que essas preferências mostraram diferir (Murray et al. Nucl. Acids Res. 17:477-498 (1989)). Em adição, os ácidos nucleicos são analisados para a existência de sítios de splice ilegítimos que podem ocasionar truncação de mensagem. Todas as alterações que é necessário fazer nos ácidos nucleicos, como as descritas acima, podem ser efetuadas usando técnicas bem conhecidas de mutagênese sítio- dirigida, PCR, e construção de genes sintéticos, por exemplo usando os métodos descritos nos pedidos de patente publicados EP 0 385 962, EP 0 359 472 e WO 93/07278.

[00118] Em uma modalidade da invenção, uma sequência codificante para uma proteína inseticida da presente invenção é feita de acordo com o procedimento divulgado na Patente dos EUA 5,625,136, aqui incorporada por referência. Neste procedimento, são usados os códons preferidos do milho, isto é, é usado o único códon que codifica mais frequentemente aquele aminoácido em milho. O códon preferencial de milho para um aminoácido particular pode ser derivado, por exemplo, de sequências de gene conhecidas de milho. O uso de códons de milho por 28 genes de plantas de milho encontra-se em Murray et al., Nucleic Acids Research 17:477-498 (1989), a divulgação da qual é aqui incorporada como referência.

[00119] Desta maneira, a sequência de nucleotídeos pode ser otimizada para a expressão em qualquer planta. É reconhecido que toda ou qualquer parte da sequência de gene pode ser otimizada ou sintética. Ou seja, também podem ser usadas sequências sintéticas ou parcialmente otimizadas.

[00120] Para iniciação mais eficiente da tradução, sequências adjacentes à metionina iniciadora podem ser modificadas. Por exemplo, podem ser modificadas pela inclusão de sequências conhecidas por serem eficazes em plantas. Joshi sugeriu um consenso apropriado para plantas (NAR 15:6643-6653 (1987)) e Clontech sugere um iniciador de tradução de consenso adicional (catálogo 1993/1994, página 210). Essas sequências de consenso são adequadas para uso com os ácidos nucleicos da presente invenção. Em modalidades, as sequências são incorporadas em construções compreendendo os ácidos nucleicos, até e incluindo o ATG (deixando o segundo aminoácido não modificado), ou alternativamente até e incluindo o GTC subsequente o ATG (com a possibilidade de modificar o segundo aminoácido do transgene).

[00121] A expressão dos ácidos nucleicos em plantas transgênicas é dirigida por promotores que funcionam em plantas. A escolha do promotor irá variar dependendo dos requisitos temporais e espaciais para expressão, e dependendo também das espécies-alvo. Deste modo, a expressão dos ácidos nucleicos desta invenção em folhas, em galhos ou troncos, em espigas, em inflorescências (por exemplo, espinhos, panículas, sabugos, etc.), em raízes, e/ou plântulas é preferencial. Em muitos casos, no entanto, é pretendida proteção contra mais do que um tipo de praga de insetos e, logo, é desejável a expressão em múltiplos tecidos. Embora tenha sido mostrado que muitos promotores de dicotiledôneas são operacionais em monocotiledôneas e vice-versa, idealmente são selecionados promotores de dicotiledôneas para expressão em dicotiledôneas, e promotores de monocotiledôneas para expressão em monocotiledôneas. No entanto, não há restrição quanto à proveniência de promotores selecionados; é suficiente que os mesmos sejam operacionais no direcionamento da expressão os ácidos nucleicos na célula desejada.

[00122] Em uma modalidade são utilizados promotores que são expressos constitutivamente incluindo os promotores de actina ou ubiquitina ou CMP ou os promotores CaMV 35S e 19S. Os ácidos nucleicos dessa invenção também podem ser expressos sob a regulação de promotores que são quimicamente regulados. A tecnologia preferida para indução química da expressão de genes está detalhada no pedido publicado EP 0 332 104 (em nome de Ciba-Geigy) e Patente dos EUA 5,614,395. Um promotor preferido para indução química é o promotor PR-1a do tabaco.

[00123] Em outra modalidade pode ser usada uma categoria de promotores que que é induzível por ferida. Foram descritos inúmeros promotores que são expressos em sítios de ferida e também nos sítios de infecção fitopatogênica. Idealmente, um tal promotor só deve ser ativo localmente nos locais de infecção, e deste modo as proteínas inseticidas da invenção só se acumulam nas células que precisam de sintetizar as proteínas para matar a praga de insetos invasora. Os promotores preferidos deste tipo incluem aqueles descritos por Stanford et al. Mol. Gen. Genet. 215:200-208 (1989), Xu et al. Plant Molec. Biol. 22:573-588 (1993), Logemann et al. Plant Cell 1:151-158 (1989), Rohrmeier & Lehle, Plant Molec. Biol. 22:783-792 (1993), Firek et al. Plant Molec. Biol. 22:129-142 (1993), e Warner et al. Plant J. 3:191-201 (1993).

[00124] Os promotores específicos de tecido ou preferenciais de tecido úteis para a expressão dos genes codificando proteínas inseticidas da invenção em plantas, particularmente, milho, são aqueles que direcionam a expressão em raiz, seiva, folha ou pólen, particularmente raiz. Tais promotores, por exemplo aqueles isolados de PEPC ou trpA, são divulgados na Pat. dos EUA No. 5,625,136, ou MTL, divulgados na Pat. Dos EUA No. 5,466,785. Ambas as patentes dos EUA estão aqui incorporadas a título de referência em sua totalidade.

[00125] Adicionalmente podem ser usados promotores funcionais em plastídeos. Exemplos não limitantes de tais promotores incluem a 5' UTR do gene 9 do bacteriófago T3 e outros promotores divulgados na Patente dos E.U.A. No. 7,579,516. Outros promotores úteis com a invenção incluem o, mas não estão limitados ao promotor da carboxilase de RuBP de pequena subunidade S-E9 e o promotor do gene do inibidor de tripsina Kunitz (Kti3).

[00126] Em aspectos adicionais, as sequências de nucleotídeos da invenção podem estar operacionalmente associadas a um promotor que é induzível por feridas ou induzível por infecção por pragas ou patógenos (p. ex., uma praga de insetos ou nematódeos de planta). Foram descritos numerosos promotores que são expressos em locais de ferida e/ou em locais de ataque de pragas (p. ex., alimentação de insetos/nematódeos) ou infecção por fitopatógenos. Idealmente, um tal promotor deve ser somente ativo localmente nos ou adjacente aos locais de ataque, e deste modo a expressão das sequências de nucleotídeos da invenção estará focada nas células que estão sendo invadidas ou das quais se estão alimentando. Tais promotores incluem, mas não estão limitados aos descritos por Stanford et al., Mol. Gen. Genet. 215:200-208 (1989), Xu et al. Plant Molec. Biol. 22:573-588 (1993), Logemann et al. Plant Cell 1:151-158 (1989), Rohrmeier e Lehle, Plant Molec. Biol. 22:783-792 (1993), Firek et al. Plant Molec. Biol. 22:129-142 (1993), Warner et al. Plant J. 3:191-201 (1993), Patente dos EUA No. 5,750,386, Patente dos EUA No. 5,955, 646, Patente dos EUA No. 6,262,344, Patente dos EUA No. 6,395,963, Patente dos EUA No. 6,703,541, Patente dos EUA No. 7,078,589, Patente dos EUA No. 7,196,247, Patente dos EUA No. 7,223,901 e Publicação de Pedido de Patente dos EUA 2010043102.

[00127] Em algumas modalidades da presente invenção é usado um "promotor mínimo" ou "promotor basal". Um promotor mínimo é capaz de recrutar o e se ligar ao complexo de RNA polimerase II e suas proteínas acessórias para permitir a iniciação transcricional e alongamento. Em algumas modalidades, um promotor mínimo é construído para compreender somente os nucleotídeos/sequências de nucleotídeos de um promotor selecionado que são requeridos para a ligação dos fatores de transcrição e transcrição de uma sequência de nucleotídeos de interesse que está operacionalmente associada ao promotor mínimo incluindo, mas não se limitando a sequências de caixas TATA. Em outras modalidades, o promotor mínimo não tem sequências cis que recrutam e se ligam a fatores de transcrição que modulam (por exemplo, intensificam, reprimem, conferem especificidade quanto aos tecidos, conferem induzibilidade ou repressibilidade) a transcrição. Um promotor mínimo está geralmente localizado a montante (ou seja, 5') de uma sequência de nucleotídeos a ser expressa. Assim, nucleotídeos/sequências de nucleotídeos de qualquer promotor usáveis com a presente invenção podem ser selecionados para uso como um promotor mínimo.

[00128] Inúmeras outras sequências podem ser incorporadas em cassetes de expressão descritos na presente invenção. Estas incluem sequências que mostraram intensificar a expressão como sequências de íntrons (p. ex., de Adhl e bronzel) e sequências-líder virais (p. ex., de TMV, MCMV e AMV).

[00129] Pode ser preferível direcionar a expressão dos ácidos nucleicos da presente invenção para diferentes localizações celulares na planta. Em alguns casos, a localização no citosol pode ser desejável, enquanto, em outros casos, a localização em alguma organela subcelular, pode ser preferida. A localização subcelular de enzimas codificadas por transgene é feita usando técnicas bem conhecidas na arte. Tipicamente, o DNA que codifica o peptídeo alvo de um produto genético conhecido dirigido para a organela é manipulado e fundido a montante do ácido nucleico. Muitas dessas sequências alvo são conhecidas pelo cloroplasto e foi mostrado o seu funcionamento em construções heterólogas. A expressão dos ácidos nucleicos da presente invenção é também direcionada para o retículo endoplasmático ou para os vacúolos das células hospedeiras. As técnicas para alcançar isso são bem conhecidas na técnica.

[00130] Vetores adequados para transformação de plantas são bem conhecidos na técnica. Para transformação mediada por Agrobacterium, os vetores binários ou vetores que portam pelo menos uma sequência limite de T-DNA são adequados, enquanto que para transferência de gene direta qualquer vetor é adequado e DNA linear contendo apenas a construção de interesse pode ser preferencial. No caso de transferência genética direta pode ser usada transformação com uma única espécie de DNA ou cotransformação (Schocher et al. Biotechnology 4:10931096 (1986)). Para transferência de genes direta e transferência mediada por Agrobacterium, a transformação é usualmente (mas não necessariamente) realizada com um marcador selecionável que pode proporcionar resistência a um antibiótico (canamicina, higromicina ou metotrexato) ou um herbicida (basta). Os vetores de transformação de plantas compreendendo as moléculas de ácido nucleico da presente invenção também podem compreender genes (por exemplo fosfomanose isomerase; PMI) que proporcionam para a seleção positiva das plantas transgênicas, tal como divulgado nas Patentes dos EUA 5,767,378 e 5,994,629, aqui incorporadas por referência. A escolha de marcador selecionável não é, no entanto, crítica para a invenção.

[00131] Em modalidades, o ácido nucleico pode ser transformado no genoma nuclear. Em outra modalidade, um ácido nucleico da presente invenção é transformado diretamente no genoma do plastídeo. Uma vantagem principal da transformação de plastídeo é que os plastídeos são em geral capazes de expressar genes bactericidas com substancial otimização de códon, e os plastídeos são capazes de expressar múltiplos quadros de leitura abertos sob controle de um único promotor. A tecnologia de transformação com plastídeos é extensamente descrita nas Patentes dos EUA Nos. 5,451,513, 5,545,817 e 5,545,818, no Pedido PCT No. WO 95/16783 e em McBride et al. (1994) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91, 7301-7305. A técnica básica para a transformação de cloroplastos envolve a introdução de regiões de DNA de plastídeo clonado flanqueando um marcador selecionável em conjunto com o gene de interesse em um tecido-alvo adequado, por exemplo, usando transformação biolística ou de protoplastos (por exemplo, transformação mediada por cloreto de cálcio ou PEG). As regiões de flanqueamento de 1 a 1,5 kb, denominadas sequências de direcionamento, facilitam a recombinação homóloga com o genoma de plastídeo e assim permitem a substituição ou modificação de regiões específicas do plastoma. Inicialmente, as mutações pontuais no rRNA 16S de cloroplasto e genes rps12 que conferem resistência à espectinomicina e/ou estreptomicina são utilizados como marcadores selecionáveis para transformação (Svab, Z., Hajdukiewicz, P., e Maliga, P. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87, 8526-8530; Staub, J. M., e Maliga, P. (1992) Plant Cell 4, 39-45). Isto resultou em transformantes homoplasmáticos estáveis a uma frequência de aproximadamente um por 100 bombardeamentos de folhas alvo. A presença de locais de clonagem entre estes marcadores permitiu a criação de um vetor de direcionamento de plastídeo para introdução de genes estranhos (Staub, J.M., e Maliga, P. (1993) EMBO J. 12, 601-606). Aumentos substanciais na frequência de transformação são obtidos através da substituição dos genes de resistência a antibiótico de proteína r ou rRNA recessivos com um marcador selecionável dominante, o gene aadA bacteriano que codifica a enzima de cletoxificação de espectinomicina aminoglicosídeo- 3'-adeniltransferase (Svab, Z., e Maliga, P. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 913-917). Anteriormente, este marcador havia sido usado com sucesso para transformação de elevada frequência do genoma de plastídeo da alga verde Chlamydomonas reinhardtii (Goldschmidt- Clermont, M. (1991) Nucl. Acids Res. 19: 4083-4089). Outros marcadores selecionáveis úteis para transformação de plastídeos são conhecidos na técnica e englobados dentro do escopo da invenção. Tipicamente são requeridos aproximadamente 15-20 ciclos de divisão celular após transformação para se alcançar um estado homoplastídico. A expressão em plastídeos, na qual os genes são inseridos por recombinação homóloga em todos os vários milhares de cópias do genoma de plastídeo circular presente em cada célula de planta, tira partido da vantagem do enorme número de cópias em relação a genes expressos no núcleo para permitir níveis de expressão que podem prontamente exceder 10% da proteína de planta solúvel total. Em uma modalidade preferencial, um ácido nucleico da presente invenção é inserido em um vetor direcionando plastídeos e é transformado no genoma de plastídeo de uma planta hospedeira desejada. As plantas homoplásticas para genomas de plastídeo que contêm um ácido nucleico da presente invenção são obtidas, e são preferencialmente capazes de elevada expressão do ácido nucleico. EXEMPLOS

[00132] A invenção será adicionalmente descrita por referência aos seguintes exemplos detalhados. Estes exemplos são proporcionados somente para os propósitos de ilustração e não se destinam a ser limitantes a não ser que de outro modo especificado. As técnicas de DNA recombinante e clonagem molecular padrão usadas aqui são bem conhecidas na técnica e são descritas por J. Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a Ed., Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001); por T.J. Silhavy, M.L. Berman e L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NI (1984) e por Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Nova Iorque, John Wiley and Sons Inc., (1988), Reiter, et al., Methods in Arabidopsis Research, World Scientific Press (1992), e Schultz et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers (1998). Exemplo 1: Identificação de uma Proteína com atividade Inseticida contra a Lagarta-da-raiz do Milho do Oeste

[00133] Uma proteína inseticida (SEQ ID NO: 1) foi identificada de Woodsholea maritima. Uma versão otimizada de E. coli deste gene foi sintetizada (SEQ ID NO: 2) e o gene foi clonado em um vetor pET29a, criando a construção pET29a(Woods). A construção pET29a(Woods) foi transformada em E. coli BL21* (DE3) e a expressão de proteínas foi realizada em caldo de Luria-Bertani com indução por IPTG a 18 °C durante a noite. A fração solúvel dos lisados foi preparada a partir destas culturas usando uma célula de pressão francesa seguida de centrifugação de lisados completos a 20,000 x g durante trinta minutos. O sobrenadante (fração solúvel) foi então testado para bioatividade para a lagarta-da-raiz do milho do oeste (WCR).

[00134] Os ensaios de bioatividade foram realizados usando um método de incorporação de dieta. Resumidamente, lisados de E. coli BL21*(DE3) foram misturados com um volume igual de dieta artificial de inseto aquecida (Bioserv, Inc., Frenchtown, NJ) em tubos de centrífuga de 1,5 mL e depois aplicados a placas de Petri pequenas. Depois que a mistura da amostra de dieta foi arrefecida e solidificada, 12 larvas WCR foram adicionadas a cada placa. As placas foram seladas e mantidas às condições ambiente do laboratório no que se refere à temperatura, iluminação e umidade relativa. Os lisados de culturas de E. coli BL21* (DE3) contendo o vetor pET29a vazio foram usados como controles negativos. A mortalidade foi avaliada no dia 4 e dia 7. Para esta e todas as tabelas subsequentes que mostram atividade inseticida sobre CRW, as abreviações para a coluna "Observações" são as seguintes: s = larvas pequenas, sm = larvas pequenas/médias, m= larvas médias, mb = larvas médias/grandes, b= larvas grandes, vb = larvas muito grandes Como mostrado na Tabela 1, o lisado da cultura expressando pET29a(Woods) mostrou forte bioatividade contra WCR. A proteína de W. maritima foi redenominada WoodsCRW. Tabela 1: Atividade Inseticida contra a Lagarta-da-raiz do Milho do Oeste

[00135] A proteína WoodsCRW na preparação do lisado foi quantificada por Bio-Rad Experion e ensaio de proteína BCA e testada novamente contra 12 larvas de WCR ao longo de uma gama de concentrações em um bioensaio de incorporação de dieta (Tabela 2). WoodsCRW mostrou forte bioatividade para WCR ao longo da gama de concentrações testadas. Tabela 2: Atividade inseticida do lisado de WoodsCRW contra WCR Exemplo 2: WoodsCRW Purificada Possui Atividade Inseticida contra a Lagarta-da-raiz do Milho do Oeste

[00136] Uma construção pET-6His-SUMO compreendendo a SEQ ID NO: 2 foi produzido para a WoodsCRW. A construção pET-6His- SUMO-WoodsCRW foi transformada em E. coli BL21*(DE3) para produção de proteína. A proteína SUMO marcada foi purificada usando técnicas convencionais para uma proteína marcada com His e subsequentemente clivada com SUMO protease para libertar a proteína livre de marcador WoodsCRW. A proteína clivada foi então aplicada a uma coluna HisTrapFF FPLC e o fluxo contínuo da coluna foi recolhido. As frações de fluxo contínuo foram analisadas quanto à pureza por SDS-PAGE (O PM esperado de WoodsCRW é 54,1 kDa.). A WoodsCRW purificada foi então dialisada em 1X PBS durante a noite a 4 °C e depois concentrada para 13 mg/mL. A proteína pura foi então testada contra 12 larvas de WCR ao longo de uma gama de concentrações no método de incorporação de dieta descrito no Exemplo 1. Como mostrado na Tabela 3, WoodsCRW é muito eficaz contra a WCR; WoodsCRW a 6 µg/mL produziu 83% de mortalidade no dia 6. Tabela 3: Atividade inseticida de WoodsCRW Purificada contra WCR Exemplo 3: WoodsCRW possui atividade inseticida contra a Lagarta-da-raiz do Milho do Norte

[00137] WoodsCRW foi purificada como no Exemplo 2 e foi testada quanto à eficácia contra 12 larvas da Lagarta-da-raiz do Milho do Norte (NCR) em um ensaio de incorporação de dieta, realizado essencialmente como descrito no Exemplo 1, exceto que a mortalidade foi avaliada no dia 3 e dia 7. WoodsCRW foi testada em concentrações de 0,2 mg/mL e 0,1 mg/mL. O controle negativo tinha apenas 1xPBS. Como mostrado na Tabela 4, WoodsCRW demonstra atividade inseticida contra NCR. Tabela 4: Atividade inseticida de WoodsCRW contra NCR Exemplo 4: WoodsCRW possui atividade inseticida contra a Lagarta-da-raiz do Milho do Oeste resistente a Cry

[00138] Para determinar se a toxicidade de WoodsCRW é através de um modo de ação separado das proteínas relacionadas a Cry3, WoodsCRW foi purificada como no Exemplo 2 e foi testada quanto à eficácia contra uma estirpe de WCR que é resistente à toxina mCry3A (mCry3A-R) e contra uma estirpe de WCR que é resistente à toxina eCry3.1Ab (eCry3.1Ab-R). Os ensaios de incorporação de dieta foram realizados essencialmente como descrito no Exemplo 1, exceto que a mortalidade foi avaliada no dia 4 e dia 6. WoodsCRW purificada foi testada em duas concentrações diferentes, 0,2 mg/mL e 0,075 mg/mL. O controle negativo tinha apenas 1xPBS. WCR que não é resistente a mCry3A ou eCry3.1Ab (sus = suscetível) também foi testada. Cada ensaio foi realizado com 12 larvas WCR. Como mostrado na Tabela 5, WoodsCRW demonstra atividade inseticida contra estirpes de WCR resistentes a Cry. Tabela 5: Atividade inseticida de WoodsCRW contra Cry-R de WCR

Exemplo 5: WoodsCRW não possui atividade inseticida contra Lepidópteros

[00139] Os lisados de culturas de bactéria que expressam WoodsCRW (SEQ ID NO: 2) foram testados quanto à bioatividade em um painel de pragas de insetos Lepidópteros usando bioensaios de sobreposição de dieta. A broca europeia do milho (ECB), a lagarta- rosca negra (BCW), a lagarta da espiga do milho (CEW) e a lagarta militar do milho (FAW) foram testadas quanto à atividade inseticida de WoodsCRW por um ensaio de incorporação de dieta semelhante ao do Exemplo 1. 12 larvas L1 foram testadas para cada experiência, usando lisados de culturas de bactérias Bl21* (DE3) contendo um gene que codifica para WoodsCRW (SEQ ID NO: 2). Uma amostra controle positivo para BCW, CEW e FAW consistiu em larvas expostas a lisados de E. coli Bl21* (DE3) expressando Vip3A (Patente EUA No. 5,877,012, incorporada aqui por referência). 1X PBS isoladamente e lisados de culturas de bactérias Bl21* (DE3) contendo o vetor pET29 vazio foram usados como controles negativos. A mortalidade foi avaliada no dia 7. As larvas que atingem o estágio L3 não foram significativamente afetadas pelo tratamento. Se as larvas atingem apenas o estágio L2, então é possível que o tratamento tenha causado inibição do crescimento. Se as larvas permanecerem no estágio L1 durante todo o tratamento então ocorreu inibição do crescimento. Isto também pode ser considerado "mortalidade efetiva", pois as larvas não se desenvolverão além do estágio L1, mesmo que permaneçam vivas. WoodsCRW não foi ativa contra as pragas de insetos Lepidópteros testadas nestas condições experimentais (Tabela 6). Tabela 6: Atividade inseticida de WoodsCRW contra Lepidópteros L1 = 1° instar, L2 = 2° instar, L3 = 3° instar Exemplo 6: Variantes de Woods CRW possui atividade inseticida contra WCR

[00140] As mutações foram introduzidas em WoodsCRW e a estabilidade da proteína e a atividade inseticida de lisados de bactérias compreendendo a variante mutada de WoodsCRW e/ou proteína variante mutada de WoodsCRW purificada foram testadas. As mutações incluem as alterações de aminoácidos em resíduos de cisteína e também a inserção de resíduos de leucina adjacentes aos resíduos de cisteína. Estas mutações foram introduzidas para determinar se uma variante mutada de WoodsCRW poderia ser concebida para manter a atividade inseticida, mas seria digerível em um ensaio de Fluido Gástrico Simulado (FGS). Uma tal variante WoodsCRW pode ter valor comercial, por exemplo através da expressão transgênica em uma planta para conferir propriedades inseticidas à planta.

[00141] A atividade inseticida foi determinada usando ensaios de incorporação de dieta realizados essencialmente como descrito no Exemplo 1, usando 12 larvas de WCR por ensaio experimental. Os resultados são mostrados nas Tabelas 7-19. SEQ ID NOs corresponde à sequência de aminoácidos da variante. Os mutantes mostrados nas Tabelas 14-16 e 19 contêm inserções de leucina nas posições indicadas, como indicado por "-Leu-" ou "-L-". Para a Tabela 14, foram testadas diluições de 1:20 de cada lisado bacteriano. Para as Tabelas 15 e 16, as diluições do lisado são mostradas como parte do tratamento. Para as Tabelas 17-19, as quantidades de proteína purificada usadas são mostradas como parte do tratamento. A maioria das variantes mutadas de WoodsCRW apresenta atividade inseticida. No entanto, poucas mostram digestibilidade de FGS.

Exemplo 7: Ensaio de fluido gástrico simulado em preparações de lisado de E. coli'

[00142] Este exemplo descreve o ensaio realizado para determinar a digestibilidade de FGS. Lisados de bactérias em fosfato de potássio a 50 mM pH 7,0, cloreto de sódio a 50 mM foram diluídos para 3 mg/mL (concentração de proteína total) para a análise de digestibilidade. A reação de digestão foi iniciada adicionando 15 µL de lisado a 285 µL de fluido gástrico simulado [10 Unidades de pepsina/µg de proteína, ou aproximadamente 1579 Unidades pepsina/mL, em solução G-Con (cloreto de sódio a 2 mg/mL, pH 1,2)] em 37 °C. Ao fim de 5 ou 10 minutos, 100 µL da reação Lisado-FGS foi removido e a reação foi terminada pela adição de 100 µL de solução de paragem pré-aquecida (95 °C) composta de Tampão de Carga de Tricina a 65% (Bio-Rad Tampão de Carga de Tricina 2x com 10% de ß-mercaptoetanol) e 35% de bicarbonato de sódio a 500 mM, pH 11,0. Foi produzido um ponto temporal zero (T0) adicionando 5 µL de lisado de teste a 100 µL de Solução de Paragem pré-aquecida (95 °C) e 95 µL de fluido gástrico simulado. Todas as amostras foram aquecidas a 95 °C durante 5 minutos e depois armazenadas em gelo até análise por SDS-PAGE. Trinta microlitros de cada reação foram carregados em um gel de peptídeos de Tris-tricina a 10-20% antes da eletroforese padrão em gel de proteína. O gel de Tris-tricina foi fixado durante 20 minutos com uma mistura de 40% de metanol:10% de ácido acético imediatamente após a eletroforese. O gel foi então corado com um corante de proteína GelCode Blue durante 1 hora à temperatura ambiente. Após 1 hora, o gel de poliacrilamida foi descorado com água destilada durante pelo menos 12 horas. Os resultados são apresentados qualitativamente nas Tabelas 7-19, na coluna "FGS". As variantes mutadas de WoodsCRW na Tabela 20 foram também testadas quanto à digestibilidade. Um "não" (N) significa que a variante intata de proteína WoodsCRW foi detectável por coloração de proteína GelCode Blue após eletroforese em gel, indicando que a proteína não era totalmente digerível no ensaio de FGS. Um "sim" (Y) significa que variante intata da proteína WoodsCRW não foi detectável, indicando que a variante da proteína WoodsCRW foi digerível no ensaio FGS. Para as Tabelas 7-19, se a coluna FGS não contiver "N" ou "Y", isso indica que a proteína não foi testada quanto à digestibilidade. Tabela 7: Atividade inseticida das variantes mutadas de WoodsCRW contra WCR

[00143] Como mostrado na Tabela 9, a variante mutada C313S/C383S/C398S/C435S/C485S de WoodsCRW (SEQ ID NO: 42) tem atividade inseticida muito baixa, com uma taxa de mortalidade de 33% no dia 6, quando usando 580 µg/mL de proteína. A Tabela 10 mostra que a variante C383S/C435S/C485S de WoodsCRW (SEQ ID NO: 41) também tem atividade inseticida baixa, com uma taxa de mortalidade de 42% no dia 6, quando usando 50 µg/mL de proteína. Adicionalmente, a Tabela 8 mostra que as variantes C398S/C435S de WoodsCRW (SEQ ID NO: 39) e C398S-C485S (SEQ ID NO: 40) têm atividade inseticida reduzida. A Tabela 7 também mostra que as variantes C435S (SEQ ID NO: 29) e C383S (SEQ ID NO: 31) de WoodsCRW tinham algum nível de atividade inseticida reduzida. Estes resultados indicam que pelo menos uma das cisteínas modificadas e/ou uma combinação de pelo menos duas das cisteínas modificados desempenham um papel importante na atividade inseticida de WoodsCRW. Estes resultados também indicam que um domínio de proteína de cerca do aminoácido 313 a cerca do aminoácido 485 é essencial para a atividade inseticida de WoodsCRW.

[00144] Como mostrado nas Tabelas 14-16 e 19, as inserções de leucina em torno da posição C398 retêm atividade inseticida relativamente alta e são digeríveis por FGS. Além disso, a mutação de C398 para L ou Y também resulta em uma variante mutada de WoodsCRW com atividade inseticida relativamente alta contra a WCR e digestibilidade de FGS (Tabelas 17 e 18). Exemplo 8: Variantes C398L e C398Y de WoodsCRW inseticidas contra WCR resistente a Cry3

[00145] Para determinar se as variantes mutadas C398L e C398Y de WoodsCRW mantiveram a atividade inseticida na WCR resistente a proteínas relacionadas com Cry3, estas duas variantes foram analisadas quanto à atividade em WCR resistente a eCry3.1Ab. Os ensaios de incorporação de dieta usando proteínas WoodsCRW C398L ou C398Y purificadas foram realizados de modo semelhante aos métodos descritos no Exemplo 4. Os resultados são mostrados na Tabela 21. Concentrações de proteína purificada são incluídas no tratamento. Os resultados indicam que as variantes mutadas C398L e C398Y de WoodsCRW possuem atividade inseticida contra uma estirpe de WCR resistente a Cry3. Tabela 21: Atividade inseticida das variantes mutadas de WoodsCRW purificadas contra WCR resistente a eCry3.1Ab

Exemplo 9: WoodsCRW tem um domínio essencial para a atividade inseticida

[00146] A estrutura de cristal de WoodsCRW foi resolvida e observou- se que possui semelhanças estruturais significativas com Plu1415, uma proteína da bactéria Photorhabdus luminescens cuja estrutura cristalina é descrita por Rosado et al., 2007 (Science 317: 1548-1551). Como a Plu1415, a WoodsCRW é composta por um domínio MACPF no N- terminal e um domínio ß-prisma no C-terminal. Os lisados bacterianos de Plu1415 foram analisados quanto à atividade inseticida após o método de bioensaio de incorporação de dieta descrito no Exemplo 1, usando 12 larvas de WCR. Os resultados são mostrados na Tabela 22. Curiosamente, a Plu1415 não possui atividade inseticida contra WCR. Tabela 22: Atividade Inseticida de lisados de bactérias de Plu1415 contra WCR

[00147] As duas estruturas de cristal foram usadas para produzir proteína quimérica para determinar que domínio(s) era(m) responsável(eis) pela atividade inseticida de WoodsCRW em WCR. Com base nas comparações estruturais das duas proteínas, duas proteínas de fusão complementares foram produzidas. A quimera Plu1415-WoodsCRW compreende o domínio MACPF no N-terminal de Plu1415 (aminoácidos 1-362) e o domínio ß-prisma no C-terminal de WoodsCRW (aminoácidos 363-506). De um modo semelhante, a quimera WoodsCRW-Plu1415 compreende o domínio MACPF no N- terminal de WoodsCRW (aminoácidos 1-346) e o domínio ß-prisma no C-terminal de Plu1415 (aminoácidos 347-494). As quimeras foram testadas quanto à atividade inseticida para WCR usando 12 larvas e seguindo o método de bioensaio de incorporação de dieta descrito no Exemplo 1. Os resultados estão apresentados nas Tabelas 23 e 24. Curiosamente, a quimera Plu1415-Woods possui atividade inseticida contra a WCR, no entanto, a quimera Woods-Plu1415 não. Estes dados indicam que o domínio ß-prisma no C-terminal de WoodsCRW é necessário e requerido para a atividade inseticida e pode conferir atividade inseticida contra WCR quando fundido a um domínio MACPF em uma construção quimérica. Tabela 23: Atividade inseticida da quimera Plu1415-Woods contra WCR

Exemplo 10: Transformação de Milho com as variantes C398L e C398Y de WoodsCRW

[00148] Foram produzidas construções de vetor binário adequados para a transformação mediada por Agrobacterium das variantes C398L e C398Y de WoodsCRW. Cada um dos vetores binários compreende uma variante C398L de WoodsCRW otimizada para milho ou uma sequência codificante da variante C398Y de WoodsCRW otimizada para milho, operacionalmente ligada na extremidade 5' a um promotor adequado para dirigir a expressão em plantas e operacionalmente ligada na extremidade 3' a uma sequência terminadora. A otimização de códon para milho foi efetuada, por exemplo, usando os métodos descritos na Patente dos EUA No. 6,320,100 (incorporada por referência no presente documento). As construções foram transformadas em Agrobacterium tumefaciens usando técnicas comuns de biologia molecular conhecidas dos peritos na técnica. Para preparar as Agrobactérias para a transformação, as células foram cultivadas em meio YPC líquido a 28 °C e 220 rpm durante a noite. A transformação por Agrobactéria de embriões imaturos de milho foi realizada essencialmente como descrito em Negrotto et al., 2000, (Plant Cell Reports 19: 798-803). Para este exemplo, todos os constituintes dos meios são essencialmente como descrito em Negrotto et al., supra. No entanto, vários constituintes de meios conhecidos na técnica podem ser substituídos.

[00149] Após transformação, seleção e regeneração, as plantas foram testadas quanto à presença do gene PMI e da sequência codificante otimizada por códon para milho de WoodsCRW para as variantes C398L ou C398Y usando análise TaqMan®. As plantas também foram testadas quanto à presença da estrutura do vetor. As plantas negativas para a estrutura do vetor e compreendendo uma cópia do transgene foram transferidas para a estufa e avaliadas quanto à resistência aos danos da WCR.

Exemplo 11: Plantas de milho que expressam as variantes WoodsCRW apresentam atividade inseticida contra a WCR

[00150] A presença de uma variante de WoodsCRW detectada por ELISA em ng/mg de proteína solúvel total (TSP) em tecido foliar ou radicular de cada evento. A atividade inseticida foi determinada usando o Bioensaio de Segmento da Raiz. Resumidamente, amostras de tecido radicular de milho de cada evento foram recolhidas quando os eventos de milho expressando variante de WoodsCRW atingiram o estágio V3V4. O tecido radicular do milho foi colocado em uma placa de Petri e então infetado com 12 larvas de WCR em um bioensaio de segmento da raiz. Duas amostras de tecido radicular (Rep1 e Rep2) foram avaliadas quanto a orifícios de alimentação (FH) e danos por formação de cicatriz no dia 3. O tecido radicular do milho não transformado (nulo) serviu como controle negativo. Os dados das Tabelas 25 e 26 mostram que a expressão transgênica de uma variante de WoodsCRW conhecida por ter atividade inseticida na CRW forneceu proteção contra CRW no tecido radicular transgênico de WoodsCRW quando comparado com o tecido radicular da amostra nula (Tabelas 25 e 26). Tabela 25: Atividade inseticida de Milho WoodsCRW variante C398L Transgênico contra WCR

Exemplo 12: WoodsCRW em combinação com um RNA de interferência tem atividade inseticida contra a WCR

[00151] WoodsCRW e/ou uma variante de WoodsCRW são purificadas como no Exemplo 2. O dsRNA contra um alvo essencial e conhecido por ter atividade inseticida foi preparado. Em exemplos não limitantes, o dsRNA pode ter como alvo um gene que codifica a ATP sintase vacuolar, beta-tubulina, proteína p28 da subunidade do proteossomo p26S, EF1a 48D, troponina I, tetraspanina, gama- coatômero, beta-coatômero e/ou epóxido hidrolase do hormônio juvenil. (Pedidos Provisórios EUA Nos. 62/371,259, 62/371,261 e 62/371,262; Patente EUA No. 7,812,219; cada um aqui incorporado por referência). O dsRNA e a proteína purificada são testados para eficácia contra WCR em um ensaio de incorporação de dieta, realizado essencialmente como descrito no Exemplo 1.

[00152] Deve ser entendido que os exemplos e modalidades descritos aqui são somente para propósitos ilustrativos e que várias modificações ou mudanças à luz dos mesmos da descrição serão sugeridas a pessoas peritas na técnica e são para ser incluídas dentro do espírito e alcance deste pedido e do escopo das reivindicações anexas.

[00153] Todas as publicações e pedidos de patentes mencionados em este relatório descritivo são indicativos do nível de perícia dos peritos na técnica à qual esta invenção pertence. Todas as publicações e pedidos de patentes são aqui incorporados por referência na mesma medida como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado como estando incorporado por referência.

Claims (6)

1. Cassete de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende um promotor operacionalmente ligado a uma molécula de ácido nucleico heteróloga compreendendo: (a) uma sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 22 ou 34, SEQ ID NOs: 73, 74 ou 75; (b) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo, sendo que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo compreende SEQ ID NOs: 55 ou 67, SEQ ID NOs: 86, 87 ou 88; (c) uma sequência de nucleotídeos que é complementar à sequência de nucleotídeos de qualquer um de (a) ou (b) acima.

2. Polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 55 ou 67 ou SEQ ID NOs: 86, 87, ou 88.

3. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o cassete de expressão, como definido na reivindicação 1.

4. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende o cassete de expressão, como definido na reivindicação 1.

5. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que é uma célula hospedeira bacteriana.

6. Método para controlar uma população de pragas de coleópteros, caracterizado pelo fato de que compreende o contato da referida população com uma quantidade eficaz de controle de insetos de um polipeptídeo com atividade inseticida, sendo que o polipeptídeo compreende as SEQ ID NOs: 55, 67, 86, 87, ou 88.