BR112020018666A2

BR112020018666A2 - Proteínas inseticidas

Info

Publication number: BR112020018666A2
Application number: BR112020018666-0A
Authority: BR
Inventors: Clarence Michael REYNOLDS; Christopher Fleming
Original assignee: Syngenta Participations Ag
Priority date: 2018-03-15
Filing date: 2019-03-07
Publication date: 2021-01-05
Also published as: CA3093297A1; WO2019177855A1; AR114668A1; CN111868248A; MX2020009558A; RU2020132969A; EP3765623A1; US20210251240A1; EP3765623A4

Abstract

são divulgadas composições e métodos para controlar pragas de plantas. em particular, são proporcionadas novas proteínas inseticidas que têm toxicidade contra pragas de insetos coleópteros e/ou lepidópteros. são também proporcionadas moléculas de ácido nucleico que codificam as novas proteínas inseticidas. métodos de produção das proteínas inseticidas e métodos de uso das proteínas inseticidas e ácidos nucleicos que codificam as proteínas inseticidas da presente invenção, por exemplo, em plantas transgênicas para conferir proteção contra danos causados por insetos, são também divulgados.

Description

“PROTEÍNAS INSETICIDAS” LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0001] Uma Listagem de Sequência em formato de texto ASCII, submetida sob 37 CFR § 1.821, intitulada "81547_ST25.txt", com 305 kilobytes de tamanho, gerada em 14 de março de 2018 e arquivada por meio de EFS-Web é fornecida no lugar de uma cópia em papel. Esta Listagem de Sequência é aqui incorporada a título de referência no relatório descritivo pelas suas revelações.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] A presente invenção se relaciona com os campos de engenharia de proteínas, biologia molecular vegetal e controle de pragas. Mais particularmente, a invenção se relaciona com uma nova proteína e suas variantes tendo atividade inseticida, ácidos nucleicos cuja expressão resultada nas proteínas inseticidas, e métodos de fabricação e métodos de uso das proteínas inseticidas e ácidos nucleicos correspondentes para controlar insetos.

ANTECEDENTES

[0003] As pragas de insetos são uma causa importante na perda de culturas. Somente nos EUA, bilhões de dólares são perdidos anualmente devido a infestações por vários gêneros de insetos. Adicionalmente às perdas nas culturas agrícolas, as pragas de insetos são também um peso para os horticultores e fruticultores, para os produtores de flores ornamentais, e elas são um incômodo para jardineiros e proprietários.

[0004] Espécies de lagarta-da-raiz do milho são consideradas como sendo as mais destrutivas das pragas de milho. Nos Estados Unidos, as três espécies importantes são Diabrotica virgifera virgifera, a lagarta-da-raiz do milho ocidental, D. longicornis barberi, a lagarta-da-raiz do milho do norte e D. undecimpunctata howardi, a lagarta-da-raiz do milho do sul. Apenas as lagarta-da-raiz do milho do oeste e norte são consideradas pragas primárias de milho no Cinturão do Milho dos EUA. Além disso, uma importante praga da lagarta-da-raiz do milho no sul dos EUA é a lagarta-da-raiz do milho mexicana, Diabrotica virgifera zeae. Larvas de lagarta-da- raiz do milho causam o dano mais substancial da planta, uma vez que se alimentam quase exclusivamente de raízes do milho. Este dano tem demonstrado aumentar o acamamento de planta, reduzir o rendimento de grãos e o rendimento vegetativo, bem como alterar o teor de nutrientes do grão. A alimentação larval também causa efeitos indiretos no milho, abrindo avenidas através das raízes para infecções bacterianas e fúngicas que levam a doenças de podridão da raiz e do caule. Lagartas-da-raiz do milho adultas são ativas em searas no final do verão, onde se alimentam de espigas, sedas e pólen, interferindo assim com a polinização normal.

[0005] As lagartas-da-raiz do milho são principalmente controladas por aplicações intensivas de pesticidas químicos, que são ativos por inibição do crescimento de insetos, prevenção da alimentação ou reprodução de insetos ou por causarem a morte. Um bom controle da lagarta-da-raiz do milho pode assim ser alcançado, mas estes químicos podem por vezes afetar também outros organismos benéficos. Outro problema que resulta do uso amplo de pesticidas químicos é o aparecimento de variedades de insetos resistentes. Ainda outro problema é devido ao fato de que as larvas da lagarta- da-raiz do milho se alimentarem no subsolo, dificultando assim a aplicação de tratamentos de inseticidas de resgate. Portanto, a maioria das aplicações de inseticidas é feita profilaticamente no momento do plantio. Essa prática resulta em um grande impacto ambiental. Isto tem sido parcialmente minimizado por várias práticas de gestão agrícola, mas existe uma necessidade crescente de mecanismos alternativos de controle de pragas.

[0006] Os agentes biológicos de controle de pragas, tais como cepas de Bacillus thuringiensis (Bt) expressando toxinas pesticidas do tipo δ-endotoxinas (delta-endotoxinas; também chamadas toxinas cristalinas ou proteínas Cry), têm sido aplicadas a plantas de culturas com resultados satisfatórios contra pragas de insetos. As δ-endotoxinas são proteínas contidas em uma matriz cristalina que são conhecidas por possuírem atividade inseticida quando ingeridas por certos insetos. Várias proteínas Cry nativas de Bacillus thuringiensis, ou proteínas Cry manipuladas, foram expressas em plantas de cultivo transgênicas e exploradas comercialmente para controlar certas pragas de insetos lepidópteros e coleópteros. Por exemplo, começando em 2003, híbridos transgênicos de milho que controlam a lagarta-da-raiz do milho por expressão de uma proteína Cry3Bb1, Cry34Ab1/Cry35Ab1 ou Cry3A modificada (mCry3A) ou Cry3Ab (eCry3.1Ab) têm estado disponíveis comercialmente nos EUA.

[0007] Embora o uso de plantas transgênicas expressando proteínas Cry tenha se mostrado extremamente eficaz, são conhecidas pragas de insetos que agora têm resistência contra as proteínas Cry expressas em certas plantas transgênicas. Em conformidade, permanece a necessidade de identificar agentes de controle de pragas novos e eficazes que forneçam um benefício econômico aos fazendeiros e que sejam aceitáveis em relação ao ambiente. Particularmente necessárias são proteínas que são tóxicas para as espécies de Diabrotica, uma das principais pragas do milho, que tenham um modo de ação diferente dos produtos de controle de insetos existentes como forma de mitigar o desenvolvimento de resistência. Além disso, administração de agentes de controle de insetos através de produtos que minimiza a carga sobre o meio ambiente, como através de plantas transgênicas, são desejáveis.

SUMÁRIO

[0008] Tendo em vista estas necessidades, a presente invenção fornece proteínas inseticidas inovadoras, a saber, NitromobCRW e proteínas que são substancialmente idênticas a NitromobCRW e suas variantes. As proteínas da invenção têm toxicidade para a lagarta da raiz do milho (Diabrotica spp). As proteínas a invenção podem também ter toxicidade para outros Coleópteros e/ou para Lepidópteros. A invenção é adicionalmente elaborada para moléculas de ácido nucleico que codificam NitromobCRW ou suas variantes, seus complementos, ou que são substancialmente idênticas a NitromobCRW e suas variantes.

[0009] Também incluídos na invenção estão os vetores que contenham tais ácidos nucleicos recombinantes (ou complementares aos mesmos); uma planta ou microrganismo que inclui e permite a expressão de tais ácidos nucleicos; plantas transformadas com tais ácidos nucleicos, por exemplo, plantas de milho transgênicas; a progênie de tais plantas que contêm os ácidos nucleicos estavelmente incorporados e hereditários de uma forma Mendeliana e/ou as sementes de tais plantas e tal progênie. A invenção também inclui métodos de manipulação para introduzir um transgene compreendendo uma molécula de ácido nucleico da invenção em uma planta de progênie e em vários germoplasmas.

[0010] A invenção também inclui composições e formulações contendo NitromobCRW ou suas variantes, que sejam capazes de inibir a capacidade de pragas de insetos de sobreviver, crescer e/ou se reproduzir, ou de limitar danos relacionados a insetos ou perda de plantas de cultivo, por exemplo, aplicando NitromobCRW ou suas variantes como parte de composições ou formulações a áreas ou plantas infestadas por insetos, ou para tratar profilaticamente áreas ou plantas suscetíveis a insetos para conferir proteção contra as pragas de insetos.

[0011] A invenção é adicionalmente elaborada para um método de produção de NitromobCRW ou suas variantes e para métodos de uso de ácidos nucleicos, por exemplo em microrganismos para controlar insetos ou em plantas transgênicas para conferir proteção contra danos por insetos.

[0012] As novas proteínas descritas aqui são ativas contra insetos. Por exemplo, em modalidades, as proteínas da presente invenção podem ser usadas para controlar pragas de insetos economicamente importantes, incluindo insetos Coleópteros, como lagarta-da-raiz do milho do oeste (WCR),

lagarta-da-raiz do milho do norte (NCR), lagarta-da-raiz do milho do sul (SCR) e/o lagarta-da-raiz do milho mexicana (D. virgifera zeae). As proteínas inseticidas da invenção podem ser usadas isoladamente ou em combinação com outras estratégias de controle de insetos para conferir eficácia melhorada de controle de pragas contra a mesma praga de insetos e/ou para aumentar o espectro de insetos alvo com impacto ambiental mínimo.

[0013] Outros aspectos e vantagens da presente invenção se tornarão evidentes para o perito na técnica a partir de um estudo da seguinte descrição da invenção e dos exemplos não limitadores.

BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS NA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0014] As sequências de ácidos nucleicos listadas na listagem de sequências anexas são mostradas usando abreviações de letras padrão para bases de nucleotídeos, conforme definido em 37 C.F.R.§1.822. As sequências de ácidos nucleicos e aminoácidos listadas definem moléculas (isto é, polinucleotídeos e polipeptídeos, respectivamente) tendo os monômeros de nucleotídeos e aminoácidos dispostos da maneira descrita. As sequências de ácidos nucleicos e aminoácidos listadas também definem, cada uma, um gênero de polinucleotídeos ou polipeptídeos que compreendem os monômeros de nucleotídeos e aminoácidos dispostos da maneira descrita. Tendo em vista a redundância do código genético, será entendido que uma sequência de nucleotídeos incluindo uma sequência de codificação também descreve o gênero de polinucleotídeos codificando o mesmo polipeptídeo que um polinucleotídeo que consiste na sequência de referência. Será ainda entendido que uma sequência de aminoácidos descreve o gênero de ORF de polinucleotídeos codificando esse polipeptídeo.

[0015] Apenas uma fita de cada sequência de ácido nucleico é mostrada, mas a fita complementar é entendida como incluindo qualquer referência à fita apresentada. Como o complemento e o complemento reverso de uma sequência primária de ácido nucleico são necessariamente divulgados pela sequência primária, a sequência complementar e a sequência complementar reversa fazem referência à sequência de ácido nucleico, a menos que seja declarado explicitamente o contrário (ou o contrário seja claro no contexto em que a sequência aparece). Além disso, como é entendido na técnica que a sequência nucleotídica de uma fita de RNA é determinada pela sequência de DNA a partir da qual foi transcrita (exceto pela substituição das nucleobases de uracila (U) por timina (Τ)), uma sequência de RNA sequência é incluída por qualquer referência à sequência de DNA que a codifica. Na lista de sequências anexa: SEQ ID NO: 1 é a sequência de nucleotídeos otimizada de NitromobCRW E. coli. SEQ ID NO: 2 é a sequência de nucleotídeos de NitromobCRW variante I98L. SEQ ID NO: 3 é a sequência de nucleotídeos de NitromobCRW variante V99L. SEQ ID NO: 4 é a sequência de nucleotídeos de NitromobCRW variante I175L.

SEQ ID NO: 5 é a sequência de nucleotídeos de NitromobCRW variante I208L.

SEQ ID NO: 6 é a sequência de nucleotídeos de NitromobCRW variante I215L.

SEQ ID NO: 7 é a sequência de nucleotídeos de NitromobCRW variante I215F.

SEQ ID NO: 8 é a sequência de nucleotídeos de NitromobCRW variante I215Y.

SEQ ID NO: 9 é a sequência de nucleotídeos de NitromobCRW variante Y213L/I215L.

SEQ ID NO: 10 é a sequência de nucleotídeos de NitromobCRW variante I245L.

SEQ ID NO: 11 é a sequência de nucleotídeos de NitromobCRW variante I255L.

SEQ ID NO: 12 é a sequência de nucleotídeos de NitromobCRW variante I265L.

SEQ ID NO: 13 é a sequência de nucleotídeos de NitromobCRW variante I257L.

SEQ ID NO: 14 é a sequência de nucleotídeos de NitromobCRW variante G216A.

SEQ ID NO: 15 é a sequência de nucleotídeos de NitromobCRW variante G216L.

SEQ ID NO: 16 é a sequência de nucleotídeos de NitromobCRW variante V122L.

SEQ ID NO: 17 é a sequência de nucleotídeos de NitromobCRW variante V167L.

SEQ ID NO: 18 é a sequência de nucleotídeos de NitromobCRW variante V220L.

SEQ ID NO: 19 é a sequência de nucleotídeos de NitromobCRW variante de inserção L214-Leu-I215.

SEQ ID NO: 20 é a sequência de nucleotídeos de NitromobCRW variante de inserção I215-Leu-G216. SEQ ID NO: 21 é a sequência de nucleotídeos de NitromobCRW variante Y213F/I215L.

SEQ ID NO: 22 é a sequência de nucleotídeos de NitromobCRW variante I175L/I215L.

SEQ ID NO: 23 é a sequência de nucleotídeos de NitromobCRW variante I208L/I215L.

SEQ ID NO: 24 é a sequência de nucleotídeos de NitromobCRW variante I215L/I255L.

SEQ ID NO: 25 é a sequência de nucleotídeos de NitromobCRW variante I255L/I257L.

SEQ ID NO: 26 é a sequência de nucleotídeos de NitromobCRW variante L214S/I215L.

SEQ ID NO: 27 é a sequência de nucleotídeos de NitromobCRW variante V203S/M204L.

SEQ ID NO: 28 é a sequência de nucleotídeos de NitromobCRW variante T218L.

SEQ ID NO: 29 é a sequência de nucleotídeos de NitromobCRW variante T218F.

SEQ ID NO: 30 é a sequência de nucleotídeos de NitromobCRW variante V185L.

SEQ ID NO: 31 é a sequência de nucleotídeos de NitromobCRW variante V193L/I215L.

SEQ ID NO: 32 é a sequência de nucleotídeos de NitromobCRW variante E196L/I215L.

SEQ ID NO: 33 é a sequência de nucleotídeos de NitromobCRW variante E186L/I215L.

SEQ ID NO: 34 é a sequência de nucleotídeos de NitromobCRW variante V177L/I215L.

SEQ ID NO: 35 é a sequência de nucleotídeos de NitromobCRW variante Y213L.

SEQ ID NO: 36 é a sequência de nucleotídeos de NitromobCRW variante V203S/M204L/I215L.

SEQ ID NO: 37 é a sequência de nucleotídeos de NitromobCRW nativo.

SEQ ID NO: 38 é a sequência de nucleotídeos otimizada por códons de maís NitromobCRW variante Y213L/I215L.

SEQ ID NO: 39 é a sequência de aminoácidos de NitromobCRW nativo.

SEQ ID NO: 40 é a sequência de aminoácidos de NitromobCRW variante I98L.

SEQ ID NO: 41 é a sequência de aminoácidos de NitromobCRW variante V99L.

SEQ ID NO: 42 é a sequência de aminoácidos de NitromobCRW variante I175L.

SEQ ID NO: 43 é a sequência de aminoácidos de NitromobCRW variante I208L.

SEQ ID NO: 44 é a sequência de aminoácidos de NitromobCRW variante I215L.

SEQ ID NO: 45 é a sequência de aminoácidos de NitromobCRW variante I215F.

SEQ ID NO: 46 é a sequência de aminoácidos de NitromobCRW variante I215Y.

SEQ ID NO: 47 é a sequência de aminoácidos de NitromobCRW variante Y213L/I215L.

SEQ ID NO: 48 é a sequência de aminoácidos de NitromobCRW variante I245L.

SEQ ID NO: 49 é a sequência de aminoácidos de NitromobCRW variante I255L.

SEQ ID NO: 50 é a sequência de aminoácidos de NitromobCRW variante I265L.

SEQ ID NO: 51 é a sequência de aminoácidos de NitromobCRW variante I257L.

SEQ ID NO: 52 é a sequência de aminoácidos de NitromobCRW variante G216A.

SEQ ID NO: 53 é a sequência de aminoácidos de NitromobCRW variante G216L.

SEQ ID NO: 54 é a sequência de aminoácidos de NitromobCRW variante V122L.

SEQ ID NO: 55 é a sequência de aminoácidos de NitromobCRW variante V167L.

SEQ ID NO: 56 é a sequência de aminoácidos de NitromobCRW variante V220L.

SEQ ID NO: 57 é a sequência de aminoácidos de NitromobCRW variante de inserção L214-Leu-I215. SEQ ID NO: 58 é a sequência de aminoácidos de NitromobCRW variante de inserção I215-Leu-G216. SEQ ID NO: 59 é a sequência de aminoácidos de NitromobCRW variante Y213F/I215L.

SEQ ID NO: 60 é a sequência de aminoácidos de NitromobCRW variante I175L/I215L.

SEQ ID NO: 61 é a sequência de aminoácidos de NitromobCRW variante I208L/I215L.

SEQ ID NO: 62 é a sequência de aminoácidos de NitromobCRW variante I215L/I255L.

SEQ ID NO: 63 é a sequência de aminoácidos de NitromobCRW variante I255L/I257L.

SEQ ID NO: 64 é a sequência de aminoácidos de NitromobCRW variante L214S/I215L.

SEQ ID NO: 65 é a sequência de aminoácidos de NitromobCRW variante V203S/M204L. SEQ ID NO: 66 é a sequência de aminoácidos de NitromobCRW variante T218L. SEQ ID NO: 67 é a sequência de aminoácidos de NitromobCRW variante T218F. SEQ ID NO: 68 é a sequência de aminoácidos de NitromobCRW variante V185L. SEQ ID NO: 69 é a sequência de aminoácidos de NitromobCRW variante V193L/I215L. SEQ ID NO: 70 é a sequência de aminoácidos de NitromobCRW variante E196L/I215L. SEQ ID NO: 71 é a sequência de aminoácidos de NitromobCRW variante E186L/I215L. SEQ ID NO: 72 é a sequência de aminoácidos de NitromobCRW variante V177L/I215L. SEQ ID NO: 73 é a sequência de aminoácidos de NitromobCRW variante Y213L. SEQ ID NO: 74 é a sequência de aminoácidos de NitromobCRW variante V203S/M204L/I215L. SEQ ID NO: 75 é uma sequência de nucleotídeos de NitromobCRW- Cterm-SUMO. SEQ ID NO: 76 é uma sequência de aminoácidos de um peptídeo de extensão de NitromobCRW-Cterm-SUMO. SEQ ID NO: 77 é uma sequência de aminoácidos NitromobCRW Y213L/I215L-Cterm-SUMO.

DEFINIÇÕES

[0016] Para clareza, certos termos usados no relatório descritivo são definidos e apresentados como se segue:

[0017] "Atividade" das proteínas inseticidas da invenção se pretende significar que as proteínas inseticidas funcionam como agentes de controle de insetos oralmente ativos, têm um efeito tóxico, e/ou são capazes de interromper ou deter a alimentação do inseto, que pode, ou não, ocasionar a morte do inseto. Quando uma proteína inseticida da invenção é administrada ao inseto, o resultado é tipicamente a morte do inseto, ou o inseto não se alimenta da fonte que torna a proteína inseticida disponível para o inseto. "Pesticida" é definido como uma atividade biológica tóxica capaz de controlar uma praga, tal como um inseto, nematódeo, fungo, bactéria ou vírus, preferencialmente por exterminação morte ou destruição. “Inseticida” é definido como uma atividade biológica tóxica capaz de controlar insetos, preferencialmente pela sua exterminação. Um "agente pesticida" é um agente que tem atividade pesticida. Um "agente inseticida" é um agente que tem atividade inseticida.

[0018] "Associado com/ligado operacionalmente" refere-se a dois ácidos nucleicos que são relacionados física ou funcionalmente. Por exemplo, uma sequência de DNA promotora ou reguladora se diz estar "associada a" uma sequência de DNA que codifica RNA ou uma proteína no caso das duas sequências estarem ligadas operacionalmente, ou situadas de modo a que a sequência de DNA reguladora venha a afetar o nível de expressão da sequência de DNA estrutural ou codificante.

[0019] Uma “sequência codificante” é uma sequência de ácidos nucleicos que é transcrita em RNA, tal como mRNA, rRNA, tRNA,

snRNA, RNA senso ou RNA antissenso. Preferencialmente, o RNA é depois traduzido em um organismo para produzir uma proteína.

[0020] "Controlar" insetos significar inibir, através de um efeito tóxico, a capacidade de pragas de insetos sobreviverem, proliferarem, alimentarem e/ou reproduzirem, ou limitar o dano ou perda relacionado com insetos em plantas de cultura. "Controlar" insetos pode ou não significar a exterminação dos insetos, embora signifique preferencialmente a exterminação dos insetos.

[0021] "Administrar" uma proteína inseticida significa que a proteína inseticida entra em contato com um inseto, resultando em um efeito tóxico e controle do inseto. A proteína inseticida pode ser administrada em muitas formas reconhecidas, por exemplo, através de uma planta transgênica expressando a proteína inseticida, composição(ões) proteicas formuladas, composição(ões) proteicas pulverizáveis, uma matriz isca, ou qualquer outro sistema de administração de toxina reconhecido pela técnica.

[0022] "Quantidade eficaz para o controle de insetos" significa a concentração de uma proteína inseticida que inibe, através de um efeito tóxico, a capacidade dos insetos de sobreviver, crescer, se alimentar e/ou se reproduzir, ou para limitar os danos relacionados aos insetos ou perda nas plantas cultivadas. "Quantidade eficaz para o controle de insetos" pode ou não significar a exterminação dos insetos, embora signifique preferencialmente a exterminação dos insetos.

[0023] "Cassete de expressão" conforme usado no presente documento significa uma sequência de ácido nucleico capaz de dirigir a expressão de uma sequência de nucleotídeos específica em uma célula hospedeira adequada, compreendendo um promotor ligado de modo operacional a sequência de nucleotídeos de interesse que é ligado de modo operacional a sinais de terminação. Compreende também tipicamente sequências requeridas para tradução apropriada da sequência de nucleotídeos. O cassete de expressão compreendendo a sequência de nucleotídeos de interesse pode ter pelo menos um de seus componentes heterólogo em relação a pelo menos a um dos seus outros componentes. O cassete de expressão também pode ser um que ocorre naturalmente, mas que foi obtido em uma forma recombinante útil para expressão heteróloga. Tipicamente, no entanto, o cassete de expressão é heterólogo no que diz respeito ao hospedeiro, ou seja, a sequência de ácidos nucleicos particular do cassete de expressão não ocorre naturalmente na célula hospedeira e tem de ser introduzida na célula hospedeira ou em um antepassado da célula hospedeira por um evento de transformação. A expressão da sequência de nucleotídeos no cassete de expressão pode estar sob o controle de um promotor constitutivo ou de um promotor induzível que inicia a transcrição apenas quando a célula hospedeira é exposta a algum estímulo externo particular. No caso de um organismo multicelular, tal como uma planta, o promotor pode ser também específico quanto a um tecido, ou órgão, particular, ou estágio de desenvolvimento.

[0024] Um cassete de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeos de interesse pode ser quimérico, significando que pelo menos um dos seus componentes é heterólogo no que diz respeito a pelo menos um dos seus outros componentes. Um cassete de expressão pode ser também um que compreende um promotor nativo dirigindo o seu gene nativo, no entanto foi obtido em uma forma recombinante útil para expressão heteróloga. Tal uso de um cassete de expressão faz com que não ocorra naturalmente na célula na qual foi introduzido.

[0025] Um cassete de expressão pode também incluir opcionalmente uma região de terminação transcricional e/ou translacional (ou seja, região de terminação) que é funcional em plantas. Uma variedade de terminadores transcricionais está disponível para uso em cassetes de expressão e é responsável pela terminação da transcrição para além da sequência de nucleotídeos heteróloga de interesse e poliadenilação correta de mRNA. A região de terminação pode ser nativa em relação à região de iniciação transcricional, pode ser nativa em relação à sequência de nucleotídeos de interesse operacionalmente ligada, pode ser nativa em relação à planta hospedeira, ou pode ser derivada de outra fonte (ou seja, estranha ou heteróloga em relação ao promotor, à sequência de nucleotídeos de interesse, à hospedeira de planta, ou qualquer sua combinação). Os terminadores transcricionais apropriados incluem, porém, sem limitação, o terminador CAMV 35S, o terminador tml, o terminador nopalina sintase e/ou o terminador rbcs E9 de ervilha. Estes podem ser usados tanto em monocotiledôneas como em dicotiledôneas. Adicionalmente pode ser usado um terminador da transcrição nativo de uma sequência codificante. Qualquer terminador disponível conhecido por funcionar em plantas pode ser usado no contexto da presente invenção.

[0026] O termo "expressão" quando usado com referência a um polinucleotídeo, tal como um gene, ORF ou porção dos mesmos, ou um transgene em plantas, se refere ao processo de conversão de informação genética codificada em um gene em RNA (por exemplo, mRNA, rRNA, tRNA ou snRNA) através da "transcrição" do gene (isto é, através da ação enzimática de uma RNA polimerase), e em proteína onde aplicável (por exemplo, se um gene codificar uma proteína), através de "tradução" de mRNA. A expressão de gene pode ser regulada em muitos estágios no processo. Por exemplo, no caso de construtos antissenso ou de dsRNA, respectivamente, a expressão pode se referir à transcrição apenas do RNA antissenso ou apenas do dsRNA. Em modalidades, "expressão" se refere à transcrição e à acumulação estável de RNA senso (mRNA) ou funcional. "Expressão" também se pode referir à produção de proteína.

[0027] Um "gene" é uma região definida que está localizada dentro de um genoma e compreende uma sequência de ácido nucleico codificante e, tipicamente, também compreende outros ácidos nucleicos, prioritariamente reguladores, responsáveis pelo controle da expressão, ou seja, a transcrição e tradução, da porção de codificação. Um gene pode também compreender outras sequências 5´ e 3´ não traduzidas e sequências de terminação. Outros elementos que podem estar presentes são, por exemplo, íntrons. A sequência de ácido nucleico reguladora do gene pode não estar normalmente ligada de modo operacional à sequência de ácido nucleico associada tal como encontrado na natureza e assim seria um gene quimérico.

[0028] "Gene de interesse" se refere a qualquer molécula de ácido nucleico que, quando transferido para uma planta, confere à planta uma característica desejada tal como resistência a antibióticos, resistência a vírus, resistência a insetos, resistência a doenças, ou resistência a outras pragas, tolerância a herbicida, tolerância ao estresse abiótico, esterilidade masculina, metabolismo modificado de ácidos graxos, metabolismo modificado de carboidratos, valor nutricional melhorado, desempenho melhorado em um processo industrial ou capacidade reprodutora alterada. O "gene de interesse" também pode ser um que é transferido para plantas para a produção de metabólitos ou enzimas comercialmente valiosas na planta.

[0029] Uma sequência de ácidos nucleicos ou molécula de ácidos nucleicos "heteróloga" é uma sequência de ácidos nucleicos ou molécula de ácidos nucleicos naturalmente não associada a uma célula hospedeira na qual é introduzida, incluindo múltiplas cópias não ocorrendo naturalmente de uma sequência de ácidos nucleicos ocorrendo naturalmente. Uma sequência de ácido nucleico ou molécula de ácido nucleico heteróloga pode compreender uma sequência quimérica tal como um cassete de expressão quimérica, em que o promotor e a região de codificação são derivados de múltiplos organismos de origem. A sequência do promotor pode ser uma sequência de promotor constitutivo, uma sequência de promotor específico de tecido, uma sequência de promotor quimicamente induzível, uma sequência de promotor induzível por ferida, uma sequência de promotor induzível por estresse e uma sequência de promotor específico do estágio de desenvolvimento.

[0030] Uma sequência de ácidos nucleicos “homóloga” é uma sequência de ácidos nucleicos naturalmente associada a uma célula hospedeira na qual é introduzida.

[0031] "Recombinação homóloga" é a troca recíproca de fragmentos de ácidos nucleicos entre moléculas de ácidos nucleicos homólogas.

[0032] "Identidade" ou "percentual de identidade" se refere ao grau de similaridade entre duas sequências de ácido nucleico ou proteína. Para comparação de sequências, tipicamente uma sequência atua como uma sequência de referência com a qual as sequências de teste são comparadas. Quando se usa um algoritmo de comparação de sequência, as sequências de teste e referência são inseridas em um computador, as coordenadas da subsequência são designadas, se necessário, e os parâmetros do programa do algoritmo da sequência são designados. O algoritmo de comparação de sequências calcula depois a porcentagem de identidade de sequências para a(s) sequência(s) de teste em relação à sequência de referência, com base nos parâmetros do programa designados. A expressão “substancialmente idêntico(a)” no contexto de duas sequências de ácidos nucleicos ou duas sequências de aminoácidos, se refere a duas ou mais sequências ou subsequências que têm pelo menos cerca de 50% de identidade de resíduo de nucleotídeo ou aminoácido quanto comparadas e alinhadas para correspondência máxima conforme medido com o uso de um dos seguintes algoritmos de comparação de sequência ou por inspeção visual. Em certas modalidades, as sequências substancialmente idênticas têm pelo menos cerca de 60%, ou pelo menos cerca de 70%, ou pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 85%, ou até pelo menos cerca de 90% ou 95% de identidade de resíduos de nucleotídeos ou aminoácidos. Em certas modalidades existe identidade substancial ao longo de uma região das sequências que tem pelo menos cerca de 50 resíduos em comprimento ou ao longo de uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos ou as sequências são substancialmente idênticas ao longo de pelo menos cerca de 150 resíduos. Em modalidades adicionais, as sequências são substancialmente idênticas quando as mesmas são idênticas em todo o comprimento das regiões de codificação.

[0033] O alinhamento ótimo de sequências para comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), pelo método de pesquisa de similaridade de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. EUA 85: 2444 (1988), por implantações computadorizadas desses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou por inspeção visual (consultar geralmente, Ausubel et al., infra).

[0034] Um exemplo de um algoritmo que é adequado para determinar a percentagem de identidade de sequência e similaridade de sequência é o algoritmo BLAST, que é descrito em Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). O software para realizar análises BLAST está disponível publicamente através do National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo envolve em primeiro lugar a identificação de pares de sequência de elevada pontuação (HSP) por identificação de pequenas palavras de comprimento W na sequência de consulta, que igualam ou satisfazem alguma pontuação limiar de valor positivo T quando alinhadas com uma palavra do mesmo comprimento em uma sequência da base de dados.

T é referido como uma pontuação limiar de palavra de proximidade (Altschul et al., 1990). Esses acertos de palavras de vizinhança iniciais atuam como sementes para iniciar pesquisas para encontrar HSP mais longos que contenham os mesmos.

As correspondências de palavras são depois prolongadas em ambas as direções ao longo de cada sequência tanto quanto a pontuação de alinhamento cumulativa possa ser aumentada.

As pontuações cumulativas são calculadas usando, para sequências de nucleotídeos, os parâmetros M (pontuação de recompensa para um par de resíduos correspondentes; sempre > 0) e N (pontuação de penalidade para resíduos não correspondentes; sempre < 0). Para sequências de aminoácidos é usada uma matriz de pontuação para calcular a pontuação cumulativa.

A extensão dos acertos de palavra em cada direção é interrompida quando a pontuação de alinhamento cumulativo cai pela quantidade X de seu valor máximo alcançado, a pontuação cumulativa vai para zero ou abaixo devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduos de pontuação negativa, ou o final de qualquer sequência é alcançado.

Os parâmetros W, T e X do algoritmo BLAST determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamento.

O programa BLASTN (para sequências de nucleotídeos) usa como padrão um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, um corte de 100, M = 5, N = -4 e uma comparação de ambas as fitas.

Para sequências de aminoácidos, o programa BLASTP usa como padrão um comprimento de palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de 10 e a matriz de pontuação BLOSUM62 (consultar Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)).

[0035] Além de calcular a identidade de sequência percentual, o algoritmo BLAST também realiza uma análise estatística da similaridade entre duas sequências (consultar, por exemplo, Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. EUA 90: 5873-5787 (1993)). Uma medida de similaridade fornecida pelo algoritmo BLAST é a menor probabilidade de soma (P(N)), que fornece uma indicação da probabilidade pela qual uma correspondência entre duas sequências de nucleotídeos ou aminoácidos ocorreria por acaso. Por exemplo, uma sequência de ácidos nucleicos de teste é considerada similar a uma sequência de referência se a menor probabilidade de soma em uma comparação da sequência de ácidos nucleicos de teste com a sequência de ácidos nucleicos de referência for menor do que cerca de 0,1, mais preferencialmente menor do que cerca de 0,01 e mais preferencialmente menor do que cerca de 0,001.

[0036] Outro programa de computador amplamente usado e aceito para realizar alinhamento de sequência é CLUSTALW v1.6 (Thompson, et al. Nuc. Acids Res., 22: 4673 a 4680, 1994). O número de bases ou aminoácidos correspondentes é dividido pelo número total de bases ou aminoácidos e multiplicado por 100 para obter uma identidade percentual. Por exemplo, se duas sequências de 580 pares de bases têm 145 bases compatíveis, as mesmas seriam 25 por cento idênticas. Se as duas sequências comparadas têm comprimentos diferentes, o número de correspondências é dividido pelo mais curto dos dois comprimentos. Por exemplo, se existissem

100 aminoácidos correspondidos entre uma proteína de 200 aminoácidos e uma de 400, são 50 por cento idênticos no que diz respeito à sequência mais curta. Se a sequência mais curta é menor que 150 bases ou 50 aminoácidos de comprimento, o número de compatibilidades é dividido por 150 (para bases de ácido nucleico) ou 50 (para aminoácidos), e multiplicado por 100 para obter um percentual de identidade.

[0037] Outra indicação de que dois ácidos nucleicos são substancialmente idênticos é que as duas moléculas se hibridizam uma com a outra sob condições estringentes. A frase "hibridizar especificamente com" se refere a ligação, duplicação, ou hibridização de uma molécula somente a uma sequência de nucleotídeos específica sob condições rigorosas quando essa sequência está presente em uma mistura complexa (por exemplo, celular total) DNA ou RNA. “Se liga(m) substancialmente” se refere à hibridação complementar entre um ácido nucleico sonda e um ácido nucleico alvo e abrange não correspondências menores que podem ser acomodadas por redução da estringência dos meios de hibridação para se alcançar a detecção desejada da sequência de ácidos nucleicos alvo.

[0038] “Condições de hibridação estringentes” e “condições de lavagem de hibridação estringentes” no contexto de experiências de hibridação de ácidos nucleicos tais como hibridações de Southern e Northern são dependentes da sequência e são diferentes sob diferentes parâmetros ambientais. As sequências mais longas hibridam especificamente a temperaturas mais elevadas. Um guia extensivo para a hibridização de ácidos nucleicos é encontrado em Tijssen (1993) Laboratory Techniques in

Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes parte I, capítulo 2, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, Nova Iorque. Geralmente, condições de hibridação e lavagem altamente estringentes são selecionadas para serem cerca de 5 °C mais baixas do que o ponto térmico de fusão (Tm) para a sequência específica a uma força iônica e pH definidos. Tipicamente, sob “condições estringentes” uma sonda hibridará com sua subsequência alvo, mas não com outras sequências.

[0039] A Tm é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) à qual 50% da sequência alvo hibrida com uma sonda perfeitamente correspondente. Condições muito estringentes são selecionadas para serem iguais à Tm para uma sonda particular. Um exemplo de condições de hibridização rigorosas para hibridização de ácidos nucleicos complementares os quais têm mais de 100 resíduos complementares em um filtro em uma transferência Southern ou northern é formamida 50% com 1 mg de heparina a 42 ºC, com a hibridização sendo realizada durante a noite. Um exemplo de condições de lavagem altamente estringentes é NaCl a 0,1 5 M a 72 ºC durante cerca de 15 minutos. Um exemplo de condições de lavagem rigorosas é uma lavagem 0,2x SSC a 65 ºC por 15 minutos (consultar Sambrook, infra, para uma descrição do tampão SSC). Frequentemente, uma lavagem de estringência elevada é precedida de uma lavagem de baixa estringência para remover o sinal de fundo da sonda. Uma lavagem de médio rigor exemplificativa para um duplex de, por exemplo, mais de 100 nucleotídeos, é 1x SSC a 45 ºC durante 15 minutos. Uma lavagem de baixo rigor exemplificativa para um duplex de, por exemplo, mais de 100 nucleotídeos, é 4-6x SSC a 40 ºC durante 15 minutos. Para sondas curtas (por exemplo, cerca de 10 a 50 nucleotídeos), as condições estringentes envolvem tipicamente concentrações de sais de menos do que cerca de 1,0 M de íon Na, tipicamente concentração de cerca de 0,01 a 1,0 M de íon Na (ou outros sais) a pH 7,0 a 8,3, e a temperatura é tipicamente pelo menos cerca de 30 °C. Condições estringentes podem ser também alcançadas com a adição de agentes desestabilizantes tais como formamida. Em geral, uma razão entre sinal e ruído de 2x (ou mais elevada) do que aquela observada para uma sonda não relacionada no ensaio de hibridação particular indica detecção de uma hibridação específica. Ácidos nucleicos que não hibridam entre si sob condições estringentes são ainda substancialmente idênticos se as proteínas que eles codificam forem substancialmente idênticas. Isto ocorre, por exemplo, quando uma cópia de um ácido nucleico é criada usando a degenerescência máxima de códons permitida pelo código genético.

[0040] A seguir estão apresentados exemplos de conjuntos de condições de hibridização/lavagem que podem ser usados para clonar sequências de nucleotídeos homólogas que são substancialmente idênticas às sequências de nucleotídeos de referência da presente invenção: uma sequência de nucleotídeos de referência hibridiza preferencialmente com a sequência de nucleotídeos de referência em 7% de dodecil sulfato de sódio (SDS), NaPO4 0,5 M, EDTA 1 mM a 50 °C com lavagem em 2X SSC, 0,1% SDS a 50 °C, mais desejavelmente em 7% de dodecil sulfato de sódio (SDS), NaPO4 0,5 M, EDTA 1 mM a 50 °C com lavagem em 1X SSC, 0,1% SDS a 50 °C, mais desejavelmente ainda em 7% de dodecil sulfato de sódio (SDS), NaPO4 0,5 M, EDTA 1 mM a 50 °C com lavagem em 0,5X SSC, 0,1% SDS a 50 °C, de preferência em 7% de dodecil sulfato de sódio (SDS), NaPO4 0,5 M, EDTA 1 mM a 50 °C com lavagem em 0,1X SSC, 0,1% de SDS a 50 °C, mais preferencialmente em 7% de dodecil sulfato de sódio (SDS), NaPO4 0,5 M, EDTA 1 mM a 50 °C com lavagem em 0,1X SSC, SDS 0,1% a 65 °C.

[0041] Uma indicação adicional de que dois ácidos nucleicos ou proteínas são substancialmente idênticas é o fato de a proteína codificada pelo primeiro ácido nucleico ser imunologicamente reativa de modo cruzado com, ou se ligar especificamente à proteína codificada pelo segundo ácido nucleico. Assim, uma proteína é tipicamente substancialmente idêntica a uma segunda proteína, por exemplo, onde as duas proteínas diferirem somente por substituições conservativas.

[0042] Uma sequência de ácidos nucleicos é "isocodificada com" uma sequência de ácidos nucleicos de referência quando a sequência de ácidos nucleicos codifica um polipeptídeo possuindo a mesma sequência de aminoácidos do polipeptídeo codificado pela sequência de ácidos nucleicos de referência.

[0043] Uma molécula de ácido nucleico "isolada" ou uma toxina isolada é uma molécula de ácido nucleico ou toxina que, pela mão do homem, existe separadamente de seu ambiente nativo e não é, por conseguinte, um produto da natureza. Uma molécula de ácido nucleico isolada ou toxina pode existir em uma forma purificada ou pode existir em um ambiente não nativo tal como, por exemplo sem limitação, uma célula microbiana recombinante, célula vegetal, tecido vegetal ou planta.

[0044] Uma "molécula de ácido nucleico" ou "sequência de ácidos nucleicos" é um segmento de RNA ou DNA de fita simples ou dupla fita que pode ser isolado de qualquer fonte. No contexto da presente invenção, a molécula de ácido nucleico é tipicamente um segmento de DNA. Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucleico da invenção são moléculas de ácido nucleico isoladas.

[0045] Os termos "proteína", "peptídeo" e "polipeptídeo" são usados indistintamente no presente documento.

[0046] Como usado no presente documento, sequência "otimizada por códon" significa uma sequência de nucleotídeos de um polinucleotídeo recombinante, transgênico, ou sintético em que os códons são escolhidos de modo a refletir o desvio do códon particular que uma célula hospedeira pode ter. Isto é feito de modo a preservar a sequência de aminoácidos do polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo otimizado por códon. Em certas modalidades, a sequência de nucleotídeos do construto de DNA recombinante inclui uma sequência que foi otimizada por códon para a célula (por exemplo, uma célula animal, vegetal ou fúngica), na qual o construto é para ser expresso. Por exemplo, um construto para ser expresso em uma célula vegetal pode ter a totalidade ou parte da sua sequência (por exemplo, o primeiro elemento de supressão genética ou o elemento de expressão genética) otimizada por códon para expressão em uma planta. Ver, por exemplo, e a Patente dos EUA N.º 6,121,014, aqui incorporada como referência.

[0047] Uma “planta” é qualquer planta em qualquer estágio de desenvolvimento, particularmente uma planta de sementes.

[0048] Uma “célula de planta” é uma unidade estrutural e fisiológica de uma planta, compreendendo um protoplasto e uma parede celular. A célula de planta pode estar na forma de uma única célula isolada ou uma célula cultivada ou como parte de uma unidade de organização superior tal como, por exemplo, tecido vegetal, um órgão da planta ou uma planta inteira.

[0049] "Cultura de células vegetais" significa culturas de unidades vegetais, tais como, por exemplo, protoplastos, células de cultura de células, células em tecidos vegetais, pólen, tubos polínicos, óvulos, sacos embrionários, zigotos e embriões em vários estágios de desenvolvimento.

[0050] "Material vegetal" se refere a folhas, caules, raízes, flores ou partes de flores, frutas, pólen, óvulos, zigotos, sementes, estacas, culturas de células ou tecidos ou qualquer outra parte ou produto de uma planta.

[0051] Um “órgão de planta” é uma parte distinta e visivelmente estruturada e diferenciada de uma planta tal como uma raiz, caule, folha, broto de flor ou embrião.

[0052] “Tecido de planta” como usado aqui significa um grupo de células vegetais organizadas em uma unidade estrutural e funcional. Qualquer tecido de uma planta in planta ou em cultura está incluído. Este termo inclui, mas não está limitado a, plantas inteiras, órgãos vegetais, sementes de plantas, cultura de tecidos e quaisquer grupos de células vegetais organizados em unidades estruturais e/ou funcionais. O uso deste termo em conjunção com, ou na ausência de, qualquer tipo específico de tecido vegetal como listado acima, ou de outro modo englobado por esta definição,

não se destina a ser exclusivo de qualquer outro tipo de tecido vegetal.

[0053] Um "promotor" é uma sequência de DNA não traduzida a montante da região codificante que contém o sítio de ligação para RNA polimerase e inicia a transcrição do DNA. A região promotora pode também incluir outros elementos que atuam como reguladores da expressão de gene.

[0054] “Elementos reguladores" se referem a sequências envolvidas no controle da expressão de uma sequência de nucleotídeos. Elementos reguladores compreendem um promotor ligado operacionalmente à sequência de nucleotídeos de interesse e sinais de terminação. Tipicamente eles também englobam sequências requeridas para a tradução adequada da sequência de nucleotídeos.

[0055] “Transformação” é um processo de introdução de ácidos nucleicos heterólogos em uma célula ou organismo hospedeiro. Em modalidades particulares, “transformação” significa a integração estável de uma molécula de DNA no genoma (nuclear ou plastídeo) de um organismo de interesse.

[0056] “Transformado/transgênico/recombinante” se referem a um organismo hospedeiro tal como uma bactéria ou uma planta, no qual foi introduzida uma molécula de ácido nucleico heteróloga. A molécula de ácido nucleico pode ser estavelmente integrada no genoma do hospedeiro ou a molécula de ácido nucleico pode estar também presente como uma molécula extracromossômica. Uma tal molécula extracromossômica pode ser autorreplicante. Células, tecidos ou plantas transformadas são entendidas como englobando não só o produto final de um processo de transformação, mas também a sua progênie transgênica. Um hospedeiro “não transformado”, “não transgênico” ou “não recombinante” se refere a um organismo de tipo selvagem, por exemplo, a uma bactéria ou planta, que não contém a molécula de ácido nucleico heteróloga.

[0057] Os nucleotídeos são indicados pelas suas bases por meio das seguintes abreviaturas padrão: adenina (A), citosina (C), timina (T) e guanina (G). Os aminoácidos são igualmente indicados pelas seguintes abreviaturas-padrão: alanina (Ala; A), arginina (Arg; R), asparagina (Asn; N), ácido aspártico (Asp; D), cisteína (Cys; C), glutamina (Gln; Q), ácido glutâmico (Glu; E), glicina (Gly; G), histidina (His; H), isoleucina (Ile; 1), leucina (Leu; L), lisina (Lys; K), metionina (Met; M), fenilalanina (Phe; F), prolina (Pro; P), serina (Ser; S), treonina (Thr; T), triptofano (Trp; W), tirosina (Tyr; Y) e valina (Val; V).

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0058] Esta invenção se refere a proteínas inseticidas inovadoras que têm atividade contra Coleopterans, por exemplo, Diabrotica virgifera virgifera (lagarta da raiz do milho ocidental; WCR), Diabrotica barberi (lagarta da raiz do milho do norte; NCR) e/ou Diabrotica undecimpunctata howardi (lagarta da raiz do milho do sul; SCR) e/ou outras espécies de Diabrotica incluindo Diabrotica virgifera zeae (lagarta da raiz do milho mexicano) e/ou outras pragas de insetos Coleópteros, como o besouro da batata do Colorado. Em modalidades, uma nova proteína inseticida da presente invenção pode também ter atividade contra espécies de Lepidópteros. A presente invenção também se refere a ácidos nucleicos cuja expressão resulta em proteínas inseticidas da presente invenção, e à fabricação e uso das proteínas inseticidas para controlar pragas de insetos. Em modalidades, a expressão dos ácidos nucleicos resulta em proteínas inseticidas que podem ser usadas para controlar insetos Coleópteros, como a lagarta da raiz do milho ocidental, norte e/ou sul, particularmente quando expressa em uma planta transgênica, como uma planta de milho transgênica.

[0059] A presente invenção abrange adicionalmente uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína inseticida da invenção. A sequência de nucleotídeos pode ser otimizada para expressão em bactérias, tais como Escherichia coli, ou para expressão em uma planta, tal como Zea mays. Uma sequência de nucleotídeos otimizada para expressão em um organismo heterólogo, tal como uma espécie de bactéria diferente de onde se originou ou uma planta, não é de ocorrência natural. Em um aspecto desta modalidade, a molécula de ácido nucleico compreende a sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 38, ou um complemento das mesmas. Ensinamentos especificamente exemplificados de métodos para produzir moléculas de ácido nucleico que codificam as proteínas inseticidas da invenção podem ser encontrados nos exemplos do presente pedido. Os peritos na técnica reconhecerão que podem ser feitas modificações aos métodos exemplificados para produzir as proteínas inseticidas englobadas pela presente invenção.

[0060] Um especialista na técnica reconheceria que um transgene para uso comercial, tal como uma molécula de ácido nucleico compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 38, ou um complemento das mesmas, pode ter modificações relativamente pequenas na sequência de ácido nucleico para atender aos padrões regulatórios governamentais. Tais modificações não afetariam a função da molécula resultante, que seria substancialmente idêntica à SEQ ID NO: 1 a 38. Um perito na técnica irá reconhecer que a molécula de ácido nucleico modificada seria essencialmente igual à mesma molécula de partida, e é incluída pela presente invenção.

[0061] A presente invenção também abrange uma molécula de ácido nucleico que compreende (a) uma sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 38; (b) uma sequência de nucleotídeos que é sequência pelo menos 45% idêntica, pelo menos 50% idêntica, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou é 100% idêntico a qualquer uma das sequências de nucleotídeos das SEQ ID NOs: 1 a 38; (c) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo compreende as SEQ ID NOs: 39 a 74, e tem atividade de controle de insetos; (d) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo é pelo menos 45% idêntica, pelo menos 50% idêntica, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70 %, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96 %,

pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou é 100% idêntica a qualquer uma das sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 39 a 74; ou (e) uma sequência de nucleotídeos que é complementar à sequência de nucleotídeos de qualquer um de (a) a (d) acima.

[0062] A presente invenção abrange ainda um cassete de expressão compreendendo um promotor operacionalmente ligado a uma sequência heteróloga de nucleotídeos que compreende: (a) uma sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 38; (b) uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 45% idêntica, pelo menos 50% idêntica, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou é 100% idêntica à sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 38; (c) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo compreende as SEQ ID NOs: 39 a 74, e tem atividade de controle de insetos; (d) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo é pelo menos 45% idêntica, pelo menos 50% idêntica, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70 %, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96 %, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou é 100% idêntica à sequência de aminoácidos de qualquer um das SEQ ID NOs: 39 a 74; ou (e) uma sequência de nucleotídeos que é complementar à sequência de nucleotídeos de qualquer um de (a) a (d) acima. Em algumas modalidades, a presente invenção engloba um cassete de expressão compreendendo uma molécula de ácido nucleico heteróloga compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo é pelo menos 93% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 39 a 74. O cassete de expressão compreende um promotor operacionalmente ligado a uma sequência de nucleotídeos heteróloga e não é de ocorrência natural.

[0063] A presente invenção também engloba vetores ou construtos recombinantes, que podem também ser referidos como vetores ou construtos, compreendendo os cassetes de expressão e/ou as moléculas de ácido nucleico da presente invenção. Em esses vetores, os ácidos nucleicos estão preferencialmente em cassetes de expressão compreendendo elementos reguladores para expressão das moléculas de nucleotídeos em uma célula hospedeira capaz de expressar as moléculas de nucleotídeos. Esses elementos reguladores usualmente compreendem sinais de promotor e de terminação e preferencialmente também compreende elementos permitindo eficiente translação de polipeptídeos codificados pelos ácidos nucleicos da presente invenção. Vetores compreendendo os ácidos nucleicos podem ser capazes de replicação em células hospedeiras específicas, preferencialmente como moléculas extracromossômicas, e são, portanto, usadas para amplificar os ácidos nucleicos desta invenção nas células hospedeiras. A presente invenção também abrange uma célula hospedeira que contém um cassete de expressão ou uma molécula de ácido nucleico da invenção. Em uma modalidade, as células hospedeiras de tais vetores são micro-organismos, tais como bactérias, em particular Bacillus thuringiensis ou E. coli, ou tais como fungos, tais como levedura. Em outra modalidade, as células hospedeiras para esses vetores recombinantes são endófitas ou epífitas. Em ainda outra modalidade, esses vetores são vetores virais e são usados para replicação da sequência de nucleotídeos em células hospedeiras específicas, por exemplo células de inseto ou células vegetais. Vetores recombinantes são também usadas para transformação das moléculas de nucleotídeos desta invenção nas células hospedeiras, em que as moléculas de nucleotídeos são integradas de forma estável no DNA de um hospedeiro transgênico. Em uma modalidade, o hospedeiro transgênico é vegetal, por exemplo, uma planta monocotiledônea, tal como uma planta de milho ou uma planta de trigo. Em modalidades, a planta hospedeira transgênica é uma planta dicotiledônea, tal como uma planta de soja ou planta de algodão.

[0064] Em outra modalidade, pelo menos um dos ácidos nucleicos da invenção é inserido em um cassete de expressão apropriado, que compreende um sinal de promotor e de terminação. A expressão do ácido nucleico pode ser constitutiva, ou um promotor induzível que responde a vários tipos de estímulos para iniciar a transcrição pode ser usado. Em outra modalidade, a célula na qual a proteína inseticida da invenção é expressa é um microrganismo, como um vírus, bactéria ou um fungo. Em ainda outra modalidade, um vírus, tal como a baculovírus, contém um ácido nucleico da invenção no seu genoma e expressa grande quantidade da correspondente proteína inseticida após infecção de células eucarióticas apropriadas que são adequadas para a replicação de vírus e expressão do ácido nucleico. A proteína inseticida assim produzida é usada como um agente inseticida. Em alternativa, baculovírus modificados para incluir o ácido nucleico são usados para infectar insetos in vivo e matá-los tanto através da expressão de uma toxina inseticida ou através da combinação de infecção viral e expressão de uma toxina inseticida. Em uma modalidade adicional, a presente invenção também engloba um método para a produção de um polipeptídeo com atividade inseticida, que compreende a cultura da célula hospedeira sob condições em que a molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo é expressa.

[0065] As células bacterianas também são hospedeiros para a expressão de ácido nucleico da invenção. Em uma modalidade são usadas bactérias simbióticas não patogênicas, que são capazes de viver e se replicar dentro de tecidos vegetais, assim chamadas endófitos, ou bactérias simbióticas não patogênicas, que são capazes de colonizar a filosfera ou a rizosfera, assim chamadas epífitos. Tais bactérias incluem bactérias dos gêneros Agrobacterium, Alcaligenes, Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Clavibacter, Enterobacter, Erwinia, Flavobacter, Klebsiella, Pseudomonas, Rhizobium, Serratia, Streptomyces e Xanthomonas. Fungos simbióticos, tais como Trichoderma e Gliocladium também são hospedeiros possíveis para a expressão dos ácidos nucléicos inventivos para o mesmo propósito.

[0066] Técnicas para estas manipulações genéticas são específicas para os diferentes hospedeiros disponíveis e são conhecidas na arte. Por exemplo, os vetores de expressão pKK223-3 e pKK223-2 podem ser usados para expressar genes heterólogos em E. coli, tanto em fusão de transcrição ou tradução, atrás do promotor tac ou trc. Para a expressão de óperons que codificam múltiplas ORF, o procedimento mais simples é inserir o óperon em um vetor como pKK223-3 em fusão de transcrição, permitindo que o sítio de ligação de ribossomo cognato dos genes heterólogos seja usado. Técnicas para superexpressão em espécies gram-positivas, tais como Bacillus, também são conhecidas na técnica e podem ser usadas no contexto desta invenção (Quax et al. In: Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics, Eds. Baltz et al., American Society for Microbiology, Washington (1993)). Sistemas alternativos para sobre-expressão dependem, por exemplo, nos vetores de levedura e incluem o uso de Pichia, Saccharomyces e Kluyveromyces (Sreekrishna, Em:Industrial microorganisms:basic and applied molecular genetics, Baltz, Hegeman, e Skatrud eds., American Society for Microbiology, Washington (1993); Dequin & Barre, Biotechnology L2:173- 177 (1994); van den Berg et al., Biotechnology 8:135-139 (1990)).

[0067] Certas proteínas inseticidas têm sido expressas em plantas e as sementes dessas plantas são vendidas anualmente a agricultores para uso no controle de várias pragas de insetos. Tais produtos inseticidas com autoproteção estão sujeitos a revisão e registro por várias agências reguladoras, incluindo, por exemplo, a Agência de Proteção Ambiental dos EUA (EPA).

[0068] A exposição da dieta é a via principal pela qual os seres humanos podem ser expostos às proteínas inseticidas expressas nas plantas transgênicas. A toxicidade oral aguda de mamífero e a digestibilidade de proteína são os pontos finais para a avaliação de risco para a saúde humana da EPA.

Outra evidência científica da segurança das proteínas inseticidas é que essas têm mostrado serem rapidamente degradadas in vitro usando fluidos gástricos simulados. Por exemplo, os resultados de sete ensaios in vitro realizados com proteínas Cry1, Cry2, e Cry3 representativas estabelecem que as proteínas são rapidamente degradadas, tipicamente dentro de 30 segundos. Esses resultados apoiam a conclusão mais ampla de que os membros desses grupos de proteínas Cry (que partilham de identidade de sequência de aminoácidos significativa) são suscetíveis de serem rapidamente degradados após a ingestão pelos seres humanos. Testes semelhantes são feitos para cada proteína transgênica expressa em plantas. Outra área de consideração é se as proteínas inseticidas podem induzir uma reação alérgica. A rápida degradação in vitro demonstrada pela proteína inseticida transgênica deve minimizar o potencial para essa ocorrência. Por comparação, os alergênios alimentares geralmente persistiram no modelo gastrointestinal in vitro, enquanto as proteínas alimentares comuns sem história alérgica se degradaram rapidamente no fluido gástrico simulado (Metcalfe et al., 1996).

[0069] Um ensaio de fluido gástrico simulado (SGF), mede a digestibilidade in vitro de uma proteína de teste em condições rigorosamente controladas representativas do trato digestivo de mamífero superior. Por exemplo, a proteína Cry de teste produzida bacterianamente (a uma concentração de 0,5 a 5 mg/ml) foi exposta à enzima pepsina (de mucosa gástrica suína, solubilizada em 2 mg/ml de NaCl, pH 1,2) a uma razão de 10 Unidades de atividade de pepsina/µg de proteína de teste durante um período de tempo de uma hora a

37 °C. As amostras foram removidas em pontos no tempo de 1, 2, 5, 10, 30 e 60 minutos e imediatamente arrefecidas bruscamente com a adição de tampão de parada (Bicarbonato de Sódio 0,5 M 65%, pH 11, 35% Tampão de Carregamento de Tricina) pré-aquecido (95 °C - 2 minutos) para tornar imediatamente a pepsina inativa e retornar ao calor por mais 5 minutos. Uma vez que o ensaio estava completo, as amostras e controles de ponto de tempo (apenas proteína de teste, apenas pepsina) foram examinadas por SDS-PAGE em um gel de Tris-tricina a 10-20% (com peptídeos visíveis para baixo para 1 kDa) para acompanhar a cinética e o nível da digestão realizado pela pepsina. Se a proteína de teste ou um fragmento polipeptídico significativo da proteína do texto for visível, por exemplo, nos pontos temporais de 5 e/ou 10 minutos, então não é digerível ou não é completamente digestível pelo ensaio de SGF e pode ser classificado qualitativamente como "não" ou "não digerível". Se a proteína de teste e qualquer fragmento polipeptídico significativo não for visível, por exemplo, no ponto temporal de 5 minutos, então é digerível pelo ensaio de SGF e pode ser classificado qualitativamente como "sim" ou "digerível".

[0070] A presente invenção também engloba um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 45% idêntica, pelo menos 50% idêntica, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, em menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% idêntica, ou é 100% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOs: 39 a 74, e que compreende adicionalmente um sítio de clivagem de protease introduzido. O sítio de clivagem de protease introduzido não é de ocorrência natural, e é introduzido na sequência de polipeptídeo, tal como uma mutação de substituição ou uma mutação de deleção ou inserção.

O sítio de clivagem de protease introduzido pode ser introduzido pela inserção de pelo menos um resíduo de leucina em uma sequência polipeptídica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs: 39 a 74. A mutação introduzida pode desestabilizar o polipeptídeo, de modo a que uma protease pode obter acesso a um sítio de clivagem que anteriormente não tinha acesso devido a enrolamento rígido e/ou estável da proteína, ou devido a impedimento estérico.

O sítio de clivagem da protease introduzido pode ser uma mutação introduzida na sequência do polipeptídeo que é reconhecido por uma protease, tal como quimotripsina, tripsina ou pepsina, como um sítio de clivagem proteolítica.

Em algumas modalidades, o sítio de clivagem da protease introduzido pode alterar um sítio de clivagem de protease existente de modo a ser reconhecido por uma protease diferente.

Os locais de clivagem da protease para a quimotripsina, tripsina e pepsina são bem conhecidos na técnica.

A quimotripsina cliva preferencialmente ligações amida do peptídeo, onde o lado carboxila da ligação amida (a posição P1) é um grande aminoácido hidrofóbico (tirosina, triptofano e fenilalanina). A tripsina cliva as cadeias peptídicas principalmente no lado carboxila dos aminoácidos lisina ou arginina, exceto quando um deles é seguido por prolina.

A pepsina é mais eficiente na clivagem de ligações peptídicas entre aminoácidos hidrofóbicos e preferencialmente aromáticos, tais como fenilalanina, triptofano, tirosina e leucina.

Estes sítios de clivagem são os sítios de clivagem preferenciais e não incluem todos os sítios de clivagem reconhecidos pela quimotripsina, tripsina ou pepsina, e além disso não incluem todos os sítios de clivagem para todas as proteases.

[0071] Um exemplo de um polipeptídeo manipulado para conter um local de clivagem de protease introduzido é o NitromobCRW variante Y213L/I215L (SEQ ID NO: 47). Esta mutação de substituição muda um motivo de "YNAYLIG" para "YNALLL". Este local de clivagem de protease introduzido pode ser reconhecido por pepsina e/ou quimotripsina e não está presente na sequência da proteína NitromobCRW de tipo selvagem. Em algumas modalidades, o sítio de clivagem de protease introduzido pode estar no ou próximo do local da mutação, por exemplo, resíduos 190-230 do polipeptídeo. A variante Y213L/I215L de NitromobCRW pode ter uma estrutura terciária alterada ou menos estável em comparação com NitromobCRW de tipo selvagem. Em algumas modalidades, o sítio de clivagem de protease introduzido pode estar localizado distal a partir da mutação introduzida. Por exemplo, a mutação introduzida de Y213 e/ou I215 pode "afrouxar" o dobramento tridimensional do polipeptídeo NitromobCRW, tornando, assim, um local de clivagem de protease que era anteriormente inacessível (e, portanto, não clivado) acessível a uma protease. Isto resulta na mutação introduzida introduzindo um sítio de clivagem de protease que não existia no polipeptídeo inalterado. Em algumas modalidades, a mutação introduzida e/ou o sítio de clivagem de protease introduzido está localizado entre os resíduos de aminoácidos 1 a 300 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 39 a 74. Em algumas modalidades, a mutação introduzida e/ou o sítio de clivagem de protease introduzido está localizado entre os resíduos de aminoácidos 97 a 300 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 39 a

74. Em modalidades adicionais, a mutação introduzida e/ou o sítio de clivagem de protease introduzido está localizado entre os resíduos de aminoácidos 97 a 266 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 39 a 74. Em modalidades adicionais, a mutação introduzida e/ou o sítio de clivagem de protease introduzido está localizado entre os resíduos de aminoácidos 175 a 266 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 39 a 74. Em modalidades adicionais, a mutação introduzida e/ou o sítio de clivagem de protease introduzido está localizado entre os resíduos de aminoácidos 185 a 250 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 74. Em modalidades adicionais, a mutação introduzida e/ou o sítio de clivagem de protease introduzido está localizado entre os resíduos de aminoácidos 200 a 230 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 74.

[0072] A presente invenção também engloba um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 45% idêntica, pelo menos 50% idêntica, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, em menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% idêntica, ou é 100% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOs: 39 a 74, e compreendendo adicionalmente uma mutação introduzida o que melhora a digestibilidade em um ensaio de SGF em comparação com um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 39. A mutação pode ser uma mutação de substituição, inserção ou deleção. A mutação pode ser a inserção de pelo menos um resíduo de leucina.

[0073] A presente invenção também inclui um método de melhoria da digestibilidade de um polipeptídeo pelo menos

45% idêntico, pelo menos 50% idêntico, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% idêntico, ou é 100% idêntico a qualquer uma das SEQ ID NOs: 39 a 74 compreendendo a introdução de pelo menos uma mutação na sequência de aminoácidos do polipeptídeo.

Em modalidades, esta mutação introduzida melhora a digestibilidade do polipeptídeo em um ensaio de SGF.

A mutação pode melhorar a digestibilidade introduzindo um sítio de clivagem de protease.

Em outras modalidades, a mutação pode melhorar a digestibilidade por alterar a especificidade da protease naquele sítio.

Por exemplo, para que o que pode ter sido um sítio de quimotripsina ou tripsina seja mutado para um sítio de pepsina.

Em outras modalidades, a mutação pode desestabilizar a proteína de modo a que um sítio é tornado acessível para uma protease para clivagem.

O sítio tornado acessível a uma protease pode ser distal da mutação introduzida.

Em modalidades preferidas, a mutação não altera ou não altera significativamente a atividade, ou a atividade inseticida, do polipeptídeo.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo com a mutação introduzida possui pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% da atividade inseticida de NitromobCRW.

Este método é exemplificado nos exemplos do presente relatório descritivo, onde, por exemplo, foi constatado que a variante NitromobCRW Y213L/I215L tem digestibilidade melhorada no ensaio SGF. A mesma também manteve uma atividade inseticida muito alta.

[0074] Em algumas modalidades do método descrito acima, a mutação (ou mutações) introduzidas podem estar localizadas entre os resíduos de aminoácidos 1 a 300 de qualquer um das SEQ ID NOs: 39 a 74. Em modalidades adicionais, a(s) mutação(ões) introduzida(s) pode(m) estar localizada(s) entre os resíduos de aminoácidos 97 a 300 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 39 a 74. Em modalidades adicionais, a(s) mutação(ões) introduzida(s) pode(m) estar localizada(s) entre os resíduos de aminoácidos 97 a 266 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 39 a 74. Em modalidades adicionais, a(s) mutação(ões) introduzida(s) pode(m) estar localizada(s) entre os resíduos de aminoácidos 175 a 266 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 39 a 74. Em modalidades adicionais, a(s) mutação(ões) introduzida(s) pode(m) estar localizada(s) entre os resíduos de aminoácidos 185 a 250 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 39 a 74. Em modalidades adicionais, a(s) mutação(ões) introduzida(s) pode(m) estar localizada(s) entre os resíduos de aminoácidos 200 a 230 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 39 a 74.

[0075] Em outras modalidades, uma mutação pode ser introduzida em Y213 e/ou I215 da SEQ ID NO: 39 ou próxima às mesmas. Em modalidades adicionais, a mutação pode ser Y213L/I215L. Em outras modalidades, a mutação pode ser a inserção ou deleção de um resíduo de aminoácido, tal como, por exemplo, a inserção de pelo menos um resíduo de leucina. Este resíduo (ou resíduos) pode ser adjacente ou vizinho a Y213 e/ou I215 da SEQ ID NO: 39, tal como, por exemplo, NitromobCRW variantes L214-Leu-I215 (SEQ ID NO: 57) ou I215-

Leu-G216 (SEQ ID NO: 58). Os resíduos de leucina também podem ser inseridos proximais a Y213 e/ou I215, em que "proximal" pode ser pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 4, pelo menos 6, pelo menos 8, pelo menos 10 ou pelo menos 20 aminoácidos distante de Y213 e/ou I215.

[0076] As proteínas inseticidas da presente invenção têm atividade de controle de insetos quando testadas contra pragas de insetos em bioensaios. Em uma modalidade, as proteínas inseticidas da invenção são ativas contra insetos Coleópteros e/ou Lepidópteros. Um perito na técnica apreciará que uma proteína da presente invenção pode ter uma gama diferente de atividade inseticida em comparação com outras proteínas da invenção. Em algumas modalidades, uma variante mutante de NitromobCRW pode ter atividade inseticida em uma faixa mais ampla de pragas de insetos, tais como mais espécies de Coleópteros ou Lepidópteros, em comparação com outras variantes de NitromobCRW. Em outras modalidades, uma variante de NitromobCRW pode ter atividade inseticida em espécies de Lepidópteros, mas não em espécies de Coleópteros. Em algumas modalidades, uma variante de NitromobCRW pode ter atividade em uma faixa mais ampla de atividade inseticida em espécies de Coleópteros ou Lepidópteros em comparação com NitromobCRW não modificado (SEQ ID NO: 39).

[0077] Os insetos na ordem Lepidoptera incluem, sem limitação, qualquer inseto agora conhecido ou posteriormente identificado que seja classificado como um Lepidóptero, incluindo aquelas espécies de inseto dentro das subordens Zeugloptera, Glossata e Heterobathmiina, e qualquer combinação dos mesmos. Insetos Lepidópteros exemplificativos incluem, porém, sem limitação, Ostrinia spp. tal como O. nubilalis (broca europeia do milho); Plutella spp. tal como P. xylostella (traça-das-crucíferas); Spodoptera spp. tal como S. frugiperda (lagarta do cartucho do milho), S. ornithogalli (lagarta militar), S. praefica (lagarta do cartucho amarelo ocidental), S. eridania (lagarta das folhas) e S. exigua (lagarta da beterraba); Agrotis spp. tal como A. ipsilon (lagarta negra), A. segetum (lagarta comum), A. gladiaria (lagarta de dorso argiloso) e A. orthogonia (lagarta ocidental pálida); Striacosta spp. tal como S. albicosta (lagarta do feijão ocidental); Helicoverpa spp. tal como H. zea (lagarta da espiga do milho), H. punctigera (lagarta do botão nativa), S. littoralis (lagarta do algodão egípcio) e H. armigera (lagarta do algodão); Heliothis spp. tal como H. virescens (lagarta da maçãs); Diatraea spp. tal como D. grandiosella (broca do milho do sudoeste) e D. saccharalis (broca da cana-de-açúcar); Trichoplusia spp. tal como T. ni (lagarta mede palmo); Sesamia spp. tal como S. nonagroides (broca do milho do Mediterrâneo); Pectinophora spp. como P. gossypiella (lagarta rosada); Cochylis spp. tal como C. hospes (mariposa do girassol em faixas); Manduca spp. tal como M. sexta (mandarová do fumo) e M. quinquemaculata (lagarta do tomate); Elasmopalpus spp. tal como E. lignosellus (lagarta elasmo); Pseudoplusia spp. tal como P. includens (lagarta falsa medideira da soja); Anticarsia spp. tal como A. gemmatalis (lagarta da soja); Plathypena spp. tal como P. scabra (lagarta do trevo verde); Pieris spp. tal como P. brassicae (borboleta de repolho), Papaipema spp. tal como P. nebris (broca do caule); Pseudaletia spp. tal como P. unipuncta (lagarta do cartucho comum); Peridroma spp. tal como P. saucia (lagarta variegada); Keiferia spp. tal como K. lycopersicella (traça do tomate); Artogeia spp. tal como A. rapae (verme do repolho importado); Phthorimaea spp. tal como P. operculella (traça da batatinha); Crymodes spp. tal como C. devastator (lagarta vítrea); Feltia spp. tal como F. ducens (lagarta suja); e qualquer combinação dos anteriores. Em um aspecto desta modalidade, as proteínas inseticidas da invenção são ativas contra lagarta-rosca negra, broca da cana-de-açúcar e/ou broca do milho do sudoeste.

[0078] Os insetos na ordem Coleoptera incluem, porém, sem limitação qualquer inseto Coleóptero agora conhecido ou posteriormente identificado, incluindo aqueles nas subordens Archostemata, Myxophaga, Adephaga e Polyphaga, e qualquer combinação dos mesmos.

[0079] Em um aspecto desta modalidade, as proteínas inseticidas da invenção são ativas contra Diabrotica spp. Diabrotica é um gênero de besouros da ordem Coleoptera comumente referidos como “lagartas-da-raiz do milho” ou “besouros das cucurbitáceas”. Espécies de Diabrotica exemplificativas incluem, sem limitação, Diabrotica barberi (lagarta da raiz do milho do norte), D. virgifera virgifera (lagarta da raiz do milho ocidental), D. undecimpunctata howardii (lagarta da raiz do milho do sul), D. balteata (besouro do pepino em faixas), D. undecimpunctata undecimpunctata (besouro do pepino manchado ocidental), D. significata (besouro das folhas com 3 manchas), D. speciosa (besouro do crisântemo), D. virgifera zeae (lagarta da raiz do milho mexicano), D. beniensis, D. cristata, D. curviplustalata, D. dissimilis, D. elegantula, D.

emorsitans, D. graminea, D. hispanloe, D. lemniscata, D. linsleyi, D. milleri, D. nummularis, D. occlusal, D. porrecea, D. scutellata, D. tibialis, D. trifasciata e D. viridula; e qualquer combinação dos mesmos.

[0080] Outros exemplos não limitantes de pragas de insetos Coleópteros de acordo com a presente invenção incluem Leptinotarsa spp. tal como L. decemlineata (besouro da batata do Colorado); Chrysomela spp. tal como C. scripta (besouro das folhas do choupo); Hypothenemus spp. tal como H. hampei (broca do café); Sitophilus spp. tal como S. zeamais (gorgulho do milho); Epitrix spp. tais como E. hirtipennis (besouro da pulga do tabaco) e E. cucumeris (besouro da pulga da batata); Phyllotreta spp. tais como P. cruciferae (besouro da pulga crucifer) e P. pusilla (besouro da pulga do oeste); Anthonomus spp. tal como A. eugenii (gorgulho da pimenta); Hemicrepidus spp. tal como H. memnonius (vermes); Melanotus spp. tal como M. communis (verme); Ceutorhychus spp. tal como C. assimilis (gorgulho da semente do repolho); Phyllotreta spp. tal como P. cruciferae (escaravelho da pulga crucifer); Aeolus spp. tal como A. mellillus (verme); Aeolus spp. tal como A. mancus (verme do trigo); Horistonotus spp. tal como H. uhlerii (verme da areia); Sphenophorus spp. tais como S. maidis (percevejo do milho), S. zeae (percevejo do milho), S. parvulus (percevejo do bluegrass) e S. callosus (percevejo do milho do sul); Phyllophaga spp. (Larvas brancas); Chaetocnema spp. tal como C. pulicaria (besouro da pulga do milho); Popillia spp. tal como P. japonica (besouro japonês); Epilachna spp. tal como E. varivestis (besouro do feijão mexicano); Cerotoma spp. tal como C. trifurcate (besouro da folha do feijão); Epicauta spp. tais como E.

pestifera e E. lemniscata (besouros da bolha); e qualquer combinação dos anteriores.

[0081] As proteínas inseticidas da invenção podem também ser ativas contra Hemípteros, Dípteros, Lygus spp., e/ou outros insetos perfurantes e sugadores, por exemplo da ordem Orthoptera ou Thysanoptera. Os insetos na ordem Diptera incluem, porém, sem limitação qualquer inseto díptero agora conhecido ou posteriormente identificado, incluindo, porém, sem limitação, Liriomyza spp. tais como L. trifolii (traça- folha) e L. sativae (traça-folha vegetal); Scrobipalpula spp. tal como S. absoluta (traça do tomateiro); Delia spp. tais como D. platura (larva do grão da semente), D. brassicae (larva da couve) e D. radicum (mosca da raiz da couve); Psilia spp. tal como P. rosae (mosca da ferrugem da cenoura); Tetanops spp. tal como T. myopaeformis (larva da raiz da beterraba sacarina); e qualquer combinação dos anteriores.

[0082] Os insetos na ordem Ortópteros incluem, porém, sem limitação, qualquer inseto ortóptero agora conhecido ou posteriormente identificado, incluindo, porém, sem limitação, Melanoplus spp. tais como M. diferencialis (gafanhoto diferencial), M. femurrubrum (gafanhoto de perna vermelha), M. bivittatus (gafanhoto de duas pernas); e qualquer combinação dos mesmos.

[0083] Os insetos na ordem Thysanoptera incluem, porém, sem limitação, qualquer inseto thysanoptera agora conhecido ou posteriormente identificado, incluindo, porém, sem limitação, Frankliniella spp. tais como F. occidentalis (tripes da flor ocidental) e F. fusca (tripes do tabaco); e Thrips spp. tais como T. tabaci (tripes da cebola), T. palmi (tripes do melão); e qualquer combinação dos anteriores.

[0084] As proteínas inseticidas da invenção podem também ser ativas contra nematódeos. O termo "nematódeo" como aqui utilizado engloba qualquer organismo que é agora conhecido ou mais tarde identificado que é classificado no reino animal, filo Nematoda, incluindo sem limitação os nematódeos da classe Adenophorea (incluindo, por exemplo, ordens Enoplida, Isolaimida, Mononchida, Dorylaimida, Trichocephalida, Mermithida, Muspiceida, Araeolaimida, Chromadorida, Desmoscolecida, Desmodorida e Monhysterida) e/ou classe Secernentea (incluindo, por exemplo, Rhabdita, Strongylida, Ascaridida, Spirurida, Camallanida, Diplogasterida, Tylenchida e Aphelenchida).

[0085] Os nematódeos incluem, mas não se limitam a nematódeos parasitas, tais como nematódeos das galhas radiculares, nematódeos formadores de cistos e/ou nematódeos de lesão. Gêneros exemplificativos de nematódeos de acordo com a presente invenção incluem, porém, sem limitação, Meloidogyne (nematódeos de galha), Heterodera (nematódeos de cisto), Globodera (nematódeos de cisto), Radopholus (nematódeos de escavação), Rotylenchulus (nematódeos reniformes), Pratylenchus ( nematódeos de lesão), Aphelenchoides (nematódeos foliares), Helicotylenchus (nematódeos em espiral), Hoplolaimus (nematódeos lanceiros), Paratrichodorus (nematódeos de raiz atarracada), Longidorus, Nacobbus (nematódeos de galhas falsas), Subanguina, Belonlaimus (nematoide de Belonlaimus), Criconemoides (nematódeos anelares), Ditylenchus, Dolichodorus, Hemicriconemoides, Hemicycliophora, Hirschmaniella, Hypsoperine, Macroposthonia, Melinius, Punctodera, Quinisulcius, Scutellonema, Xiphinema (nematódeos adaga),

Tylenchorhynchus (nematódeos acrobáticos), Tylenchulus, Bursaphelenchus (lombrigas), e qualquer combinação dos mesmos.

[0086] Nematódeos parasitas de plantas exemplificativos de acordo com a presente invenção incluem, porém, sem limitação, Belonolaimus gracilis, Belonolaimus longicaudatus, Bursaphelenchus xylophilus (nematódeo da madeira do pinheiro), Criconemoides ornata, Ditylenchus destructor (nematódeo da podridão da batata), Ditylenchus dipsaci (nematódeo do caule e bulbo), Globodera pallida (nematódeo do cisto da batata), Globodera rostochiensis (nematódeo dourado), Heterodera glycines (nematódeo do cisto da soja), Heterodera schachtii (nematódeo do cisto da beterraba sacarina); Heterodera Zeae (nematódeo do cisto do milho), Heterodera avenae (nematódeo do cisto dos cereais), Heterodera carotae, Heterodera trifolii, Hoplolaimus columbus, Hoplolaimus galeatus, Hoplolaimus magnistylus, Longidorus breviannulatus, Meloidogyne arenaria, Meloidogyne chitwoodi, Meloidogyne hapla, Meloidogyne incognita, Meloidogyne javanica, Mesocriconema xenoplax, Nacobbus aberrans, Naccobus dorsalis, Paratrichodorus christiei, Paratrichodorus minor, Pratylenchus brachyurus, Pratylenchus crenatus, Pratylenchus hexincisus, Pratylenchus neglectus, Pratylenchus penetrans, Pratylenchus projectus, Pratylenchus scribneri, Pratylenchus tenuicaudatus, Pratylenchus thornei, Pratylenchus zeae, Punctodera chaccoensis, Quinisulcius acutus, Radopholus similis, Rotylenchulus reniformis, Tylenchorhynchus dubius, Tylenchulus semipenetrans (nematódeo cítrico), Siphinema americanum, X. Mediterraneum, e qualquer combinação dos anteriores.

[0087] Em outra modalidade, a invenção abrange um método para produzir uma proteína inseticida que é ativa contra insetos, compreendendo: (a) obter uma célula hospedeira compreendendo um gene, que compreende ele próprio um cassete de expressão e/ou uma molécula de ácido nucleico da invenção; e (b) cultivar a célula hospedeira transgênica de modo a expressar uma proteína inseticida que é ativa contra insetos.

[0088] Em ainda uma modalidade adicional, a invenção abrange um método de controle de insetos, compreendendo administrar aos insetos uma quantidade eficaz para o controle de insetos de uma proteína inseticida da invenção.

[0089] Em uma modalidade, pelo menos uma proteína inseticida da invenção é expressa em um organismo superior tal como uma planta. Neste caso, as plantas transgênicas expressando quantidades eficazes controladoras de insetos da proteína inseticida protegem-se a si mesmas da praga de insetos. Quando os insetos começam a se alimentar em uma tal planta transgênica, também podem ingerir a proteína inseticida expressa. Isso irá impedir que o inseto morda adicionalmente o tecido da planta, e/ou pode até prejudicar ou matar o inseto. Um ácido nucleico da presente invenção é inserido em um cassete de expressão, que pode ser depois integrado de forma estável no genoma da planta. Em outra modalidade, o ácido nucleico é incluído em um vírus de autorreplicação não patogênico. As plantas transformadas de acordo com a presente invenção podem ser monocotiledôneas ou dicotiledôneas e incluem, mas não estão limitadas a, milho, trigo, aveia, grama de relva, grama de pastagem, linho, cevada, centeio, batata-doce, feijão, ervilha, chicória, alface, couve, couve-flor, brócolis, nabo, rabanete,

espinafre, aspargo, cebola, alho, pimenta, aipo, abóbora, abóbora-moranga, cânhamo, abobrinha, maçã, pera, marmelo, melão, ameixa, cereja, pêssego, nectarina, damasco, morango, uva, framboesa, amora, abacaxi, abacate, papaia, manga, banana, soja, tomate, sorgo, cana-de-açúcar, beterraba- sacarina, girassol, colza, trevo, tabaco, cenoura, algodão, alfafa, arroz, batata, berinjela, pepino, Arabidopsis e plantas lenhosas tais como árvores coníferas e decíduas.

[0090] Em uma outra modalidade, a invenção abrange um método de produção de uma planta ou parte de planta possuindo resistência a insetos melhorada em comparação com uma planta ou parte de planta de controle, compreendendo: (a) introduzir uma molécula de ácido nucleico compreendendo um cassete de expressão da invenção; e (b) cultivar a parte de planta para se tornar uma planta que expressa a molécula de ácido nucleico heteróloga do cassete de expressão e que tem resistência a insetos melhorada em comparação com uma planta ou parte de planta de controle que não foi transformada com uma molécula de ácido nucleico compreendendo o cassete de expressão. Em uma modalidade preferencial, o cassete de expressão pode codificar um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, em pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou é 100% idêntico ou semelhante às SEQ ID NOs: 39 a 74. Em uma modalidade preferida, o cassete de expressão pode codificar um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60% idêntica à SEQ ID NO: 47. Resistência a insetos "melhorada" pode ser medida como um aumento da atividade inseticida. Resistência a insetos melhorada pode ser maior que 0%, pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 4%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 100%, pelo menos 125%, pelo menos 150%, pelo menos 200%, pelo menos 300%, pelo menos 400%, pelo menos 500%, pelo menos 600%, pelo menos 700%, pelo menos 800%, pelo menos 900%, ou pelo menos 1000% maior atividade inseticida comparada a uma planta controle. Uma planta ou parte de planta tendo uma resistência a insetos melhorada em comparação com uma planta ou parte de planta de controle pode ser produzida por métodos de transformação vegetal, cultura de tecido vegetal, ou manipulação. A planta ou parte de planta pode ser produzida por métodos de propagação sexual ou assexuada. Qualquer planta de controle ou parte da planta adequada pode ser usada, por exemplo, uma planta do mesmo ou semelhante fundo genético crescida no mesmo ambiente. Em modalidades, a planta ou parte de planta de controle é do mesmo fundo genético e está a crescer no mesmo ambiente como a planta descrita, mas não compreende uma molécula da invenção, enquanto que a planta descrita compreende uma molécula da invenção.

[0091] Em outra modalidade, a invenção engloba um método para melhorar resistência a insetos em uma planta ou parte de planta em comparação com uma planta ou parte de planta de controle, compreendendo expressar na planta ou parte de planta uma molécula de ácido nucleico ou um cassete de expressão da invenção, em que a expressão do ácido nucleico heterólogo do cassete de expressão resulta em resistência a insetos melhorada em uma planta ou parte de planta em comparação com uma planta ou parte de planta de controle.

Em modalidades, o cassete de expressão ou molécula de ácido nucleico compreende um promotor operacionalmente ligado a uma molécula de ácido nucleico heteróloga compreendendo uma sequência de nucleotídeos que compreende: (a) uma sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 38; (b) uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou é 100% idêntica à sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 38; (c) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo compreende as SEQ ID NOs: 39 a 74, e tem atividade de controle de insetos; (d) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo é pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70 %, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96 %, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou é 100% idêntica à sequência das SEQ ID NOs: 39 a 74; ou (e) uma sequência de nucleotídeos que é complementar à sequência de nucleotídeos de qualquer um de (a) a (d) acima.

A molécula de ácido nucleico ou cassete de expressão pode ser introduzida na planta. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico ou cassete de expressão pode ser introduzida em uma parte de planta e uma planta compreendendo a molécula de ácido nucleico ou cassete de expressão pode ser produzida da parte da planta.

[0092] Em outra modalidade, a invenção abrange um método de produção de uma planta tendo resistência a insetos melhorada em comparação com uma planta controle, compreendendo detectar, em uma parte de planta, um ácido nucleico heterólogo compreendendo uma molécula de ácido nucleico ou um cassete de expressão da invenção e produzir uma planta a partir de parte da planta, produzindo, assim, uma planta que tem resistência a insetos melhorada em comparação com uma planta de controle. Em uma modalidade adicional, a invenção abrange um método de identificação de uma planta ou parte de planta tendo resistência a insetos melhorada em comparação com uma planta ou parte de planta de controle, compreendendo detectar, na planta ou parte de planta, uma molécula de ácido nucleico ou um cassete de expressão da invenção, identificando, assim, uma planta ou parte de planta tendo resistência a insetos melhorada. Em uma modalidade adicional, o cassete de expressão ou um seu fragmento de diagnóstico é detectado em um produto de amplificação de uma amostra de ácido nucleico da planta ou parte da planta. O fragmento de diagnóstico pode ser uma molécula de ácido nucleico de pelo menos 10 nucleotídeos contíguos de comprimento que é única para o cassete de expressão da invenção.

[0093] Em ainda outra modalidade, a invenção abrange um método de produção de uma planta que possui resistência a insetos melhorada em comparação com uma planta ou parte de planta de controle, compreendendo o cruzamento de uma primeira planta genitora com uma segunda planta genitora, em que pelo menos a primeira planta genitora compreende dentro do seu do genoma um ácido nucleico heterólogo que compreende uma molécula de ácido nucleico ou um cassete de expressão da presente invenção e a produção de uma geração de progênie, em que a geração de progênie compreende pelo menos uma planta que possui o ácido nucleico heterólogo no seu genoma e que apresenta resistência a insetos melhorada em comparação com uma planta de controle.

[0094] Em modalidades preferenciais, os métodos da invenção conferem resistência aumentada a insetos em uma planta ou parte da planta contra uma praga de inseto Coleóptero e/ou Lepidóptero. O controle de insetos de pragas de insetos Coleópteros é demonstrado nos Exemplos. Em modalidades adicionais, os métodos da invenção conferem resistência aumentada a insetos em uma planta ou parte da planta contra espécies de Diabrotica, incluindo Diabrotica virgifera virgifera, Diabrotica barberi, Diabrotica undecimpunctata howardi, Diabrotica virgifera zeae e/ou Diabrotica speciosa e/ou espécies relacionadas.

[0095] Em modalidades preferidas, os métodos da invenção conferem resistência a insetos melhorada em uma planta monocotiledônea.

[0096] A presente invenção abrange adicionalmente uma planta transgênica que compreende uma molécula de ácido nucleico heteróloga ou um cassete de expressão da invenção,

que quando transcrito e traduzido confere resistência aumentada a insetos.

Em modalidades preferidas, a molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% pelo menos 99%, ou 100% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 38, ou um complemento das mesmas.

Em modalidades preferidas, a planta transgênica compreende uma molécula de ácido nucleico heteróloga compreendendo uma sequência pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% pelo menos 99%, ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 1 a 38, ou um complemento das mesmas.

Em modalidades, a planta transgênica é uma planta dicotiledônea.

Em modalidades preferidas, a planta transgênica é uma planta monocotiledônea.

Em modalidades adicionais, a planta transgênica é alfafa, endro, maçã, damasco, alcachofra, rúcula, espargos, abacate, banana, feijão, beterraba, amora, mirtilo, brócolis, couve-de- bruxelas, repolho, canola, meloa, cenoura, mandioca, couve- flor, salsão, cereja, coentro, cítrico, clementina, café, milho, algodão, pepino, abeto-de-douglas, berinjela, endívia, escarola, eucalipto, erva-doce, figos, cabaça, uva, toranja, baba de mel, jicama, quiuí, alface, alho-poró, limão, lima, pinheiro amarelo, manga, melão, cogumelo, noz,

quiabo, cebola, laranja, uma planta ornamental, mamão, salsa, ervilha, pêssego, amendoim, pera, pimenta, caqui, pinheiro, abacaxi, banana-da-terra, ameixa, romã, álamo, batata, abóbora-moranga, marmeleiro, pinheiro-de-monterey, chicória, rabanete, framboesa, arroz, centeio, sorgo, pinheiro do sul, soja, espinafre, abóbora, morango, beterraba sacarina, girassol, batata doce, liquidâmbar, tangerina, chá, tabaco, tomate, relva, uma videira, melancia, inhame ou abobrinha italiana. Em modalidades preferenciais, a planta transgênica é milho-painço, painço amarelo, milho, sorgo, trigo, aveia, grama de relva, grama de pastagem, linho, arroz, cana-de-açúcar, colza ou cevada.

[0097] Ainda em outra modalidade, uma planta transgênica da invenção compreende uma molécula de ácido nucleico heteróloga compreendendo uma sequência promotora. Ainda em outra modalidade, uma planta transgênica da invenção pode compreender uma molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica pelo menos uma característica adicional desejada. A característica adicional pode ser codificada na mesma molécula de ácido nucleico heteróloga que uma molécula da invenção, ou pode ser codificada em uma segunda molécula de ácido nucleico heteróloga. A característica adicional desejada pode conferir resistência a insetos a uma segunda praga, resistência a insetos à mesma praga, tolerância ao estresse abiótico, esterilidade masculina, resistência a herbicidas, resistência a doenças bacterianas, resistência a doenças fúngicas, resistência a doenças virais, resistência a nematódeos, metabolismo de ácidos graxos modificado, metabolismo de carboidratos modificado, valor nutricional melhorado, desempenho em um processo industrial melhorado ou capacidade reprodutiva alterada. A característica adicional desejada pode também induzir a produção dentro da planta de uma enzima ou metabolito comercialmente valiosa.

[0098] Em modalidades, a característica desejada adicionada é um segundo agente pesticida. O segundo agente pesticida pode ser ativo em qualquer praga de plantas, incluindo insetos, nematódeos, fungos, vírus ou bactérias. Exemplos de pragas de plantas de insetos incluem e não se limitam a Nilaparvata spp. (por exemplo N. lugens (cigarrinha marrom)); Laodelphax spp. (por exemplo L. striatellus (cigarrinha marrom pequena)); Nephotettix spp. (por exemplo N. virescens ou N. cincticeps (cigarrinha verde), ou N.nigropictus (cigarrinha do arroz)); Sogatella spp. (por exemplo S. furcifera (cigarrinha de costas brancas)); Blissus spp. (por exemplo B. leucopterus leucopterus (percevejo das gramíneas)); Scotinophora spp. (por exemplo S. vermidulate (gorgulho do arroz)); Acrosternum spp. (por exemplo A. hilare (percevejo verde)); Parnara spp. (por exemplo P. guttata (larva da borboleta do arroz)); Chilo spp. (por exemplo C. suppressalis (broca riscada do tronco do arroz), C. auricilius (broca do tronco de bordas douradas), ou C. polychrysus (broca do tronco de cabeça escura)); Chilotraea spp. (por exemplo C. polychrysa (broca do caule do arroz)); Sesamia spp. (por exemplo S. inferens (broca rosa do arroz)); Tryporyza spp. (por exemplo T. innotata (broca branca do arroz), ou T. incertulas (broca amarela do arroz)); Cnaphalocrocis spp. (por exemplo C. medinalis (lagarta-enroladeira do arroz)); Agromyza spp. (por exemplo A. oryzae (lagarta mineira), ou A. parvicornis lagarta mineira do milho)); Diatraea spp. (por exemplo D. saccharalis (broca da cana-de-açúcar), ou D. grandiosella (broca do milho do sudoeste)); Narnaga spp. (por exemplo N. aenescens (lagarta verde do arroz)); Xanthodes spp. (por exemplo X. transversa (lagarta verde)); Spodoptera spp. (por exemplo S. frugiperda (lagarta militar do milho), S. exigua (lagarta militar da beterraba), S. littoralis (lagarta- rosca) ou S. praefica (lagarta militar de listras amarelas do oeste)); Mythimna spp. (por exemplo Mythmna (Pseudaletia) seperata (lagarta militar)); Helicoverpa spp. (por exemplo H. zea (lagarta da espiga do milho)); Colaspis spp. (por exemplo C. brunnea (besouro de Colaspis da uva)); Lissorhoptrus spp. (por exemplo L. oryzophilus (gorgulho de água de arroz)); Echinocnemus spp. (por exemplo E. squamos (gorgulho do arroz)); Diclodispa spp. (por exemplo D. armigera (hispa do arroz)); Oulema spp. (por exemplo O. oryzae (besouro de folha); Sitophilus spp. (por exemplo S. oryzae (gorgulho do arroz)); Pachydiplosis spp. (por exemplo P. oryzae (mosca-de-galha do arroz)); Hydrellia spp. (por exemplo H. griseola (lagarta mineira pequena), ou H. sasakii (larvas da haste do arroz)); Chlorops spp. (por exemplo C. oryzae (larvas da haste)); Diabrotica spp. (por exemplo D. virgifera virgifera (lagarta-da-raiz do milho do oeste), D. barberi (lagarta-da-raiz do milho do norte), D. undecimpunctata howardi (lagarta-da-raiz do milho do sul), D. virgifera zeae (lagarta-da-raiz do milho mexicana); D. balteata (besouro de pepino listrado)); Ostrinia spp. (por exemplo O. nubilalis (broca europeia do milho)); Agrotis spp. (por exemplo A.ipsilon (lagarta-rosca negra)); Elasmopalpus spp. (por exemplo E. lignosellus (lagarta-

Elasmo)); Melanotus spp. (vermes); Cyclocephala spp. (por exemplo C. borealis (besouro mascarado do norter), ou C. immaculata (besouro mascarado do sul)); Popillia spp. (por exemplo P. japonica (besouro japonês)); Chaetocnema spp. (por exemplo C. pulicaria (besouro da folha do milho)); Sphenophorus spp. (por exemplo S. maidis (gorgulho do maís)); Rhopalosiphum spp. (por exemplo R. maidis (pulgão da folha do milho)); Anuraphis spp. (por exemplo A. maidiradicis (pulgão da raiz do milho)); Melanoplus spp. (por exemplo M. femurrubrum (gafanhoto-de-patas-vermelhas) M. differentialis (gafanhoto diferencial)) ou M. sanguinipes (gafanhoto migratório)); Hylemya spp. (por exemplo H. platura (larva da semente do milho)); Anaphothrips spp. (por exemplo A. obscrurus (tripes da grama)); Solenopsis spp. (por exemplo S. milesta (formiga ladra)); ou spp. (por exemplo T. urticae (ácaros-aranha de duas manchas), T. cinnabarinus (ácaros-aranha vermelho comum); Helicoverpa spp. (por exemplo H. zea (lagarta das espigas do algodoeiro), ou H. armigera (lagarta roscada americana)); Pectinophora spp. (por exemplo P. gossypiella (lagarta rosada)); Earias spp. (por exemplo E. vittella (lagarta roscada manchada)); Heliothis spp. (por exemplo H. virescens (lagarta-da-maçã)); Anthonomus spp. (por exemplo A. grandis (bicudo do algodoeiro)); Pseudatomoscelis spp. (por exemplo P. seriatus (pulga do algodão)); Trialeurodes spp. (por exemplo T. abutiloneus (mosca branca de asas listradas) T. vaporariorum (mosca branca de estufa)); Bemisia spp. (por exemplo B. argentifolii (mosca branca da folha prateada)); Aphis spp. (por exemplo A. gossypii (pulgão do algodão)); Lygus spp. (por exemplo L. lineolaris (percevejo manchado) ou L.

hesperus (percevejo manchado do oest)); Euschistus spp. (por exemplo E. conspersus (percevejo marrom)); Chlorochroa spp. (por exemplo C. sayi (percevejo Say)); Nezara spp. (por exemplo N. viridula (percevejo verde do sul)); Thrips spp. (por exemplo T. tabaci (tripes da cebola)); Frankliniella spp. (por exemplo F. fusca (tripes do tabaco), ou F. occidentalis (tripes-da-califórnia)); Leptinotarsa spp. (por exemplo L. decemlineata (besouro da batata do Colorado), L. juncta (besouro falso da batata), ou L. texana (besouro falso da batata do Texas)); Lema spp. (por exemplo L. trilineata (besouro de batata de três linhas)); Epitrix spp. (por exemplo E. cucumeris (besouro da folha da batata), E. hirtipennis (besouro da folha do tabaco), ou E. tuberis (besouro saltador do tubérculo)); Epicauta spp. (por exemplo E. vittata burrinho listrado)); Phaedon spp. (por exemplo P. cochleariae (besouro da folha da mostarda)); Epilachna spp. (por exemplo E. varivetis (besouro do feijão mexicano)); Acheta spp. (por exemplo A. domesticus (grilo doméstico)); Empoasca spp. (por exemplo E. fabae (cigarrinha verde da batata)); Myzus spp. (por exemplo M. persicae (pulgão verde do pessegueiro)); Paratrioza spp. (por exemplo P. cockerelli (psilídeo)); Conoderus spp. (por exemplo C. falli (verme da batata), ou C. vespertinus (verme do tabaco)); Phthorimaea spp. (por exemplo P. operculella (traça da batatinha)); Macrosiphum spp. (por exemplo M. euphorbiae (pulgão da batata)); Thyanta spp. (por exemplo T. pallidovirens (percevejo da costa castanha)); Phthorimaea spp. (por exemplo P. operculella (traça da batata)); Helicoverpa spp. (por exemplo H. zea (broca grande do fruto); Keiferia spp. (por exemplo K. lycopersicella (verme do tomate)); Limonius spp. (vermes); Manduca spp. (por exemplo M. sexta (mandarová do tabaco), ou M. quinquemaculata (mandarová do tomate)); Liriomyza spp. (por exemplo L. sativae, L. trifolli ou L. huidobrensis (lagarta mineira)); Drosophilla spp. (por exemplo D. melanogaster, D. yakuba, D. pseudoobscura ou D. simulans); Carabus spp. (por exemplo C. granulatus); Chironomus spp. (por exemplo C. tentanus); Ctenocephalides spp. (por exemplo C. felis (pulga do gato)); Diaprepes spp. (por exemplo D. abbreviatus (gorgulho da raiz)); Ips spp. (por exemplo I. pini (besouros-da-casca do pinheiro)); Tribolium spp. (por exemplo T. castaneum (besouro castanho)); Glossina spp. (por exemplo G. morsitans (mosca tsé-tsé)); Anopheles spp. (por exemplo A. gambiae (mosquito da malária)); Helicoverpa spp. (por exemplo H. armigera (lagarta Helicoverpa armigera)); Acyrthosiphon spp. (por exemplo A. pisum (afídeo da ervilha)); Apis spp. (por exemplo A. melifera (abelha do mel)); Homalodisca spp. (por exemplo H. coagulate (atirador vítreo-de-asa)); Aedes spp. (por exemplo Ae. aegypti (mosquito da febre-amarela)); Bombyx spp. (por exemplo B. mori (mariposa-de-seda)); Locusta spp. (por exemplo L. migratoria (gafalhoto-migratório)); Boophilus spp. (por exemplo B. microplus (carrapato de boi)); Acanthoscurria spp. (por exemplo A. gomesiana (aranha- caranguejeira)); Diploptera spp. (por exemplo D. punctata (baratas-besouro do Pacífico)); Heliconius spp. (por exemplo H. erato (borboleta vermelha da flor da paixão) ou H. melpomene (borboleta de carteiro)); Curculio spp. (por exemplo C. glandium (escaravelho da bolota)); Plutella spp. (por exemplo P. xylostella (traça-das-crucíferas)); Amblyomma spp. (por exemplo A. variegatum (carrapato tropical)); Anteraea spp. (por exemplo A. yamamai (mariposa de seda japonesa)); e Armigeres spp. (por exemplo A. subalbatus).

[0099] As proteínas inseticidas da invenção podem ser usadas em combinação com outros agentes pesticidas (por exemplo, proteínas Bt Cry) para aumentar a gama de pragas alvo. Além disso, o uso das proteínas inseticidas da presente invenção em combinação com um agente inseticida que tem um modo de ação diferente ou tem como alvo um receptor diferente no intestino de insetos, tem particular utilidade para a prevenção e/ou gestão da resistência dos insetos.

[00100] O segundo agente pesticida pode ser uma proteína inseticida derivada de Bacillus thuringiensis. Uma proteína inseticida B. thuringiensis pode ser qualquer uma de uma série de proteínas inseticidas incluindo, porém, sem limitação, uma proteína Cry1, uma proteína Cry3, uma proteína Cry 6, uma proteína Cry7, uma proteína Cry8, uma proteína Cry9, uma proteína Cry11, uma Proteína Cry22, uma proteína Cry 23, uma proteína Cry 36, uma proteína Cry37, uma proteína Cry34 juntamente com uma proteína Cry35, uma proteína inseticida binária CryET33 e CryET34, uma proteína inseticida binária TIC100 e TIC101, uma proteína inseticida binária PS149B1, uma VIP (Proteína Inseticida Vegetativa, revelada nas Patentes dos EUA 5,849,870 e 5.877.012, incorporadas ao presente documento a título de referência), uma TIC900 ou proteína relacionada, uma TIC901, TIC1201, TIC407, TIC417, uma proteína Cry3A modificada, ou proteínas híbridas ou quimeras produzidas de qualquer uma das proteínas inseticidas anteriores. Em outras modalidades, a proteína inseticida B. thuringiensis é selecionada do grupo que consiste em proteínas Cry3Bb1, Cry34Ab1 em conjunto com Cry35Ab1, mCry3A (Patente dos EUA N.º 7,276,583, aqui incorporada a título de referência), eCry3.1Ab (Patente dos EUA N.º 8,309,516, aqui incorporada a título de referência) e Vip3A, incluindo Vip3Aa (Patente dos EUA N.º 6,137,033, aqui incorporada a título de referência).

[00101] Em outras modalidades, a planta transgênica da invenção pode compreender um segundo agente pesticida que pode ser derivado de outras fontes sem ser B. thuringiensis. O segundo agente inseticida pode ser um agente selecionado do grupo compreendendo uma α amilase, uma peroxidase, uma colesterol oxidase, uma patatina, uma protease, um inibidor de protease, uma urease, um inibidor de alfa-amilase, uma proteína formadora de poros, uma quitinase, uma lectina, um anticorpo ou fragmento de anticorpo manipulado, uma proteína inseticida de Bacillus cereus, uma proteína inseticida de Xenorhabdus spp. (tal como de X. nematophila ou X. bovienii), uma proteína inseticida de Photorhabdus spp. (tal como de P. luminescens ou P. asymobiotica), uma proteína inseticida de Brevibacillus spp. (tal como de B. laterosporous), uma proteína inseticida de Lysinibacillus spp. (tal como de L. sphearicus), uma proteína inseticida de Chromobacterium spp. (tal como de C. subtsugae ou uma proteína inseticida de C. piscinae), uma proteína inseticida de Yersinia spp. (tal como de Y. entomophaga), uma proteína inseticida de Paenibacillus spp. (tal como de P. propylaea), uma proteína inseticida de Clostridium spp. (tal como de C. bifermentans), uma Pseudomonas spp. (tal como P. fluorescens)e uma lignina. Em outras modalidades, o segundo agente pode ser pelo menos uma proteína inseticida derivada de um complexo de toxina inseticida (Tc) de Photorhabdus, Xenorhabus, Serratia ou Yersinia. Em outras modalidades. A proteína inseticida pode ser uma ADP-ribosiltransferase derivada de uma bactéria inseticida, tal como Photorhabdus ssp. Ainda em outras modalidades, a proteína inseticida pode Axmi205 ou derivada de Axmi205 (Patente dos EUA N.º 8,575,425 e N.º 9,394,345, cada uma aqui incorporada por referência). Em outras modalidades, a proteína inseticida pode ser uma proteína VIP, tal como VIP1 e/ou VIP2 de B. cereus. Em ainda outras modalidades, a proteína inseticida pode ser uma toxina binária derivada de uma bactéria inseticida, tal como ISP1A e ISP2A de B. laterosporous ou BinA e BinB de L. sphaericus. Em outras modalidades, a proteína inseticida pode ser uma proteína LachbCRW (Pedido PCT n.º PCT/US2017/045,256), um aHmassCRW (Pedido PCT n.º PCT/US2017/058,179) ou uma WoodsCRW (Pedido PCT n.º PCT/US2018/012.730) ou variante de proteína. Em ainda outras modalidades, a proteína inseticida pode ser manipulada ou pode ser um híbrido ou quimera de qualquer uma das proteínas inseticidas precedentes.

[00102] Em algumas modalidades, a planta transgênica da invenção pode compreender e/ou expressar pelo menos um segundo agente pesticida que é não proteico. Em algumas modalidades, o segundo agente pesticida pode estar presente na superfície da planta, por exemplo, como uma aplicação tópica. Em modalidades preferidas, o segundo agente pesticida é uma molécula de RNA de interferência. Um RNA de interferência compreende tipicamente pelo menos um fragmento de RNA contra um gene alvo, uma sequência espaçadora e um segundo fragmento de RNA que é complementar ao primeiro, de forma que possa ser formada uma estrutura de RNA de fita dupla.

Ocorre interferência de RNA (RNAi) quando um organismo reconhece moléculas de RNA de fita dupla (dsRNA) e as hidrolisa.

Os produtos de hidrólise resultantes são pequenos fragmentos de RNA com cerca de 19-24 nucleotídeos em comprimento, chamados pequenos RNA de interferência (siRNA). Os siRNA se difundem depois ou são transportados ao longo do organismo, incluindo através de membranas celulares, onde hibridam com mRNA (ou outros RNA) e causam hidrólise do RNA.

Os RNA de interferência são reconhecidos pelo complexo silenciador de interferência de RNA (RISC) no qual é carregada uma fita efetora (ou “fita guia”) do RNA.

Esta fita guia atua como um molde para o reconhecimento e destruição das sequências do duplex.

Este processo é repetido de cada vez que o siRNA hibrida com o seu alvo de RNA complementar, evitando efetivamente que esses mRNA sejam traduzidos, e assim “silenciando” a expressão de genes específicos a partir dos quais os mRNA foram transcritos.

Os RNA de interferência são conhecidos na técnica como sendo úteis para controle de insetos (ver, por exemplo, publicação WO2013/192256, aqui incorporada a título de referência). Um RNA de interferência projetado para controle de insetos produz um RNA de fita dupla de ocorrência não natural, que tira vantagem das vias nativas de RNAi no inseto para desencadear regulação negativa de genes alvo que possa levar à cessação da alimentação e/ou crescimento e possa resultar na morte da praga de insetos.

A molécula de RNA de interferência pode conferir resistência a insetos contra a mesma praga alvo que a proteína da invenção, ou pode ter como alvo uma praga diferente.

A praga de plantas de insetos alvo pode se alimentar mastigando, sugando ou perfurando.

Os

RNA de interferência são conhecidos na técnica como sendo úteis para o controle de insetos. Nas modalidades, o dsRNA útil para o controle de insetos é descrito nas Publicações WO N.os WO2018/026770, WO2018/026773 e WO2018/026774, incorporadas ao presente documento a título de referência. Em modalidades, o dsRNA útil para controle de insetos é descrito nas Patentes EUA N.os 9,238,8223, 9,340,797 ou 8,946,510, incorporadas no presente documento por referência. Em modalidades, o dsRNA útil para controle de insetos é descrito nos Pedidos de Patentes EUA N.os 12/868,994, 13/831,230, 14/207,313 ou 14/207318, incorporados no presente documento por referência. Em outras modalidades, o RNA de interferência pode conferir resistência contra uma praga de plantas que não insetos, tais como pragas de nematódeos ou uma praga vírus.

[00103] A coexpressão de mais do que um agente pesticida na mesma planta transgênica pode ser alcançada por meio de um único vetor recombinante compreendendo sequências codificantes de mais do que um agente pesticida na chamada pilha molecular e manipulação genética de uma planta para conter e expressar todas os agentes pesticidas na planta transgênica. Tais pilhas moleculares podem também ser feitas usando minicromossomas tal como descrito, por exemplo na Patente dos EUA 7,235,716. Alternativamente, uma planta transgênica compreendendo um ácido nucleico que codifica um primeiro agente pesticida pode ser novamente transformada com um ácido nucleico diferente que codifica um segundo agente pesticida e assim por diante. Alternativamente, uma planta, Genitor 1, pode ser geneticamente manipulada para a expressão de genes da presente invenção. Uma segunda planta,

Genitor 2, pode ser geneticamente manipulada para expressão de um segundo agente pesticida. Por cruzamento do Genitor 1 com o Genitor 2 são obtidas plantas de progênie que expressam todos os genes introduzidos nos Genitores 1 e 2.

[00104] Plantas ou semente transgênicas compreendendo e/ou expressando uma proteína inseticida da invenção podem ser também tratadas com um inseticida ou revestimento de semente inseticida como descrito nas Patentes dos EUA N.os 5,849,320 e 5,876,739, aqui incorporadas por referência. Em modalidades, onde tanto o inseticida ou revestimento de semente inseticida como a planta ou semente transgênica da invenção são ativos contra o mesmo inseto alvo, por exemplo uma praga de Coleópteros ou praga alvo de Diabrotica, a combinação é útil (i) em um método para intensificação adicional da atividade da composição da invenção contra o inseto alvo e/ou (ii) em um método para prevenção do desenvolvimento de resistência à composição da invenção pelo proporcionar de ainda outro mecanismo de ação contra o inseto alvo. Assim, em modalidades, a invenção proporciona um método de intensificação do controle de uma população de insetos de Diabrotica compreendendo proporcionar uma planta ou semente transgênica da invenção e aplicar à planta ou à semente de um inseticida ou revestimento de semente inseticida na planta ou semente transgênica da invenção.

[00105] Mesmo quando o inseticida ou revestimento de semente inseticida é ativo contra um inseto diferente, o inseticida ou revestimento de semente inseticida é útil para expandir a faixa de controle de insetos, por exemplo, adicionando um inseticida ou revestimento de semente inseticida que tem atividade contra insetos lepidópteros a uma semente transgênica da invenção, que, em algumas modalidades, tem atividade contra insetos Coleópteros e alguns Lepidópteros, a semente transgênica revestida produzida controla pragas de insetos tanto Lepidópteros quanto Coleópteros.

[00106] Exemplos de tais inseticidas e/ou revestimentos de sementes inseticidas incluem, sem limitação, um carbamato, um piretroide, um organofosfato, um friprole, um neonicotinoide, um organocloreto, uma nereistoxina ou uma combinação dos mesmos. Em outra modalidade, o inseticida ou revestimento de semente inseticida é selecionado do grupo consistindo em carbofurano, carbaril, metomil, bifentrina, teflutrina, permetrina, ciflutrina, lambda-cialotrina, cipermetrina, deltametrina, clorpirifós, cloretoxifós, dimetoato, etoprofós, malation, metil-paration, forato, terbufós, tebupirimifós, fipronil, acetamiprida, imidacloprida, tiacloprida, tiametoxam, endossulfano, bensultap e uma sua combinação. Produtos comerciais contendo tais inseticidas e revestimentos de semente inseticidas incluem, sem limitação, Furadan® (carbofurano), Lanate® (metomil, metomil, mesomila), Sevin® (carbaril), Talstar® (bifentrina), Force® (teflutrina), Ammo® (cipermetrina), Cymbush® (cipermetrina), Delta Gold® (deltametrina), Karate® (lambda-cialotrina), Ambush® (permetrina), Pounce® (permetrina), Brigade® (bifentrina), Capture® (bifentrina), ProShield® (teflutrina), Warrior® (lambda-cialotrina), Dursban® (clorfirifós), Fortress® (cloretoxifós), Mocap® (etoprop), Thimet® (forato), AAstar® (forato, flucitinato), Rampart® (forato), Counter® (terbufós), Cygon® (dimetoato), Dicapton, Regent® (fipronil), Cruiser® (tiametoxam), Gaucho®

(imidacloprida), Prescribe® (imidacloprida), Poncho® (clotianidina) e Aztec® (ciflutrina, tebupirimfos).

[00107] A presente invenção também abrange uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de controle de insetos de uma proteína inseticida de acordo com a invenção. Em outras modalidades, a composição compreende um transportador agricolamente adequado e um polipeptídeo da invenção com atividade inseticida. O veículo agrícola pode incluir adjuvantes, misturadores, intensificadores, etc. benéficos para a aplicação de um ingrediente ativo, tal como um polipeptídeo da invenção, incluindo um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, pelo menos 65%, em pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% idêntica a qualquer um das SEQ ID NOs: 39 a 74. Os transportadores adequados não devem ser fitotóxicos para culturas valiosas, particularmente às concentrações empregues na aplicação das composições na presença de culturas, e não devem reagir quimicamente com os compostos do ingrediente ativo aqui descrito, nomeadamente um polipeptídeo da invenção, ou outros ingredientes da composição. Tais misturas podem ser desenhadas para aplicação direta às culturas ou podem ser concentrados ou formulações que são normalmente diluídos com transportadores e adjuvantes adicionais antes da aplicação. Podem incluir componentes inertes ou ativos e podem ser sólidos, tais como, por exemplo, poeiras, pós, grânulos, grânulos dispersíveis em água ou pós molháveis, ou líquidos, tais como, por exemplo, concentrados emulsificáveis, soluções, emulsões ou suspensões. Transportadores agrícolas adequados podem incluir transportadores líquidos, por exemplo água, tolueno, xileno, nafta de petróleo, óleo de cultura, acetona, cetona de metiletila, cicloexanona, tricloroetileno, percloroetileno, acetato de etila, acetato de amila, acetato de butila, éter de monometila de propilenoglicol e éter de monometila de dietilenoglicol, metanol, etanol, isopropanol, álcool de amila, etilenoglicol, propilenoglicol, glicerina e similares. A água é geralmente o transportador de escolha para a diluição de concentrados. Transportadores sólidos adequados incluem talco, argila de pirofilita, sílica, argila de atapulgita, kieselguhr, giz, terra diatomácea, cal, carbonato de cálcio, argila de bentonita, terra de Fuller, cascas de sementes de algodão, farinha de trigo, farinha de soja, pedra-pomes, farinha de madeira, farinha de cascas de nozes, lignina e similares. Em outra modalidade, um polipeptídeo da invenção pode ser encapsulado em uma matriz sintética tal como um polímero e aplicado à superfície de um hospedeiro tal como uma planta. A ingestão das células hospedeiras por um inseto permite administração dos agentes de controle de insetos ao inseto e resulta em um efeito tóxico na praga de inseto.

[00108] Em modalidades adicionais, uma composição da invenção pode ser um pó, poeira, pélete, grânulo, aspersão, emulsão, coloide ou solução. Uma composição da invenção pode ser preparada por dessecação, liofilização, homogeneização, extração, filtração, centrifugação, sedimentação ou concentração de uma cultura de células bacterianas. Uma composição da invenção pode compreender pelo menos 1%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos

50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, ou pelo menos 99% em peso de um polipeptídeo da invenção.

[00109] Em modalidades, uma composição da invenção pode compreender pelo menos um segundo agente pesticida (por exemplo, que pode ser expresso transgenicamente a partir da planta e/ou ser incorporado na composição), o qual pode ser inseticida, nematicida, fungicida ou bactericida. Pelo menos um segundo agente pesticida pode ser inseticida para o mesmo inseto que um polipeptídeo da invenção ou para um inseto diferente. O segundo agente pesticida pode ser um polipeptídeo. O agente pesticida pode ser um RNA de interferência (por exemplo, um dsRNA). O segundo agente pesticida pode ser um microrganismo, tal como uma bactéria, que compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica um agente pesticida e/ou contém um agente pesticida, tal como um polipeptídeo ou RNA de interferência. O microrganismo pode ser atenuado, inativado pelo calor ou liofilizado. O microrganismo pode estar morto ou incapaz de se reproduzir. O segundo agente pesticida pode ser um inseticida, por exemplo carbofurano, carbaril, metomil, bifentrina, teflutrina, permetrina, ciflutrina, lambda-cialotrina, cipermetrina, deltametrina, clorpirifos, cloretoxifos, clotianidina, dimetoato, etoprofos, malation, metil- paration, forato, terbufos, tebupirimifos, fipronil, acetamiprida, imidacloprida, tiacloprida, tiametoxam, endossulfano, bensultap, ou uma sua combinação, ou um produto comercial contendo tais inseticidas e revestimentos de sementes inseticidas como descrito acima.

[00110] Uma composição da invenção, por exemplo uma composição compreendendo um polipeptídeo da invenção e um transportador agricolamente aceitável, pode ser usada em métodos agrícolas convencionais. Um transportador agricolamente aceitável é uma formulação útil para aplicar uma composição compreendendo um polipeptídeo da invenção a uma planta ou semente. Por exemplo, as composições da invenção podem ser misturadas com água e/ou fertilizantes e podem ser aplicadas pré-emergência e/ou pós-emergência a um lócus desejado por quaisquer meios, tal como tanques de pulverização em aviões, equipamento de irrigação, equipamento de pulverização com injeção direta, tanques de pulverização de costas, tanques de imersão para gado, equipamento agrícola usado na pulverização do solo (por exemplo, pulverizadores de barras, pulverizadores manuais) e similares. O lócus desejado pode ser solo, plantas e similares.

[00111] Uma composição da invenção pode ser aplicada a uma semente ou propágulo de planta em qualquer estado fisiológico, em qualquer momento entre a coleta da semente e a semeadura da semente; durante ou após a semeadura; e/ou após a germinação. É preferido que a semente ou propágulo de planta esteja em um estado suficientemente durável de modo a incorrer em danos nulos ou mínimos, incluindo danos físicos ou danos biológicos, durante o processo de tratamento. Uma formulação pode ser aplicada às sementes ou propágulos de plantas usando técnicas e máquinas revestimento convencionais, tais como técnicas de leito fluidizado, o método do moinho de cilindros, depuradores de sementes rotoestáticos e revestidores de tambor.

[00112] A presente invenção também compreende um método para controlar uma população de pragas de Lepidópteros e/ou Coleópteros que compreende o contato da referida população com uma quantidade eficaz para controle de insetos de um polipeptídeo da invenção com atividade inseticida, em que o polipeptídeo é de pelo menos 45%, pelo menos 50 %, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92 %, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou é 100% idêntico às SEQ ID NOs: 39 a 74. O contato inclui membros da população de pragas que se alimentam ou ingerem o polipeptídeo. O polipeptídeo pode ser incorporado em alimentos da dieta de insetos ou pode ser expresso em ou presente no tecido da planta que o inseto ingere depois. Em outras modalidades, o controle das populações de pragas de Lepidópteros e/ou Coleópteros inclui exterminar os insetos por contato dos insetos com uma quantidade eficaz de controle de insetos de um polipeptídeo da invenção.

[00113] A presente invenção também compreende um método para proteger uma planta de uma praga de inseto, compreendendo expressar em uma planta ou célula da planta uma sequência de nucleotídeos ou cassete de expressão que codifica um polipeptídeo inseticida da invenção. Em modalidades, a sequência de nucleotídeos é pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos

96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou é 100% idêntica à sequência de nucleotídeos das SEQ ID NOs: 2 a 36 ou codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos pelo menos 98%, pelo menos 99% ou é 100% idêntica às SEQ ID NOs: 39 a 74. Em modalidades adicionais, a planta ou célula da planta produz um polipeptídeo inseticida tendo atividade inseticida contra uma praga de Lepidópteros e/ou Coleópteros.

[00114] A presente invenção também compreende um método para aumentar o rendimento de uma planta compreendendo cultivar em um campo uma planta, ou uma sua semente, tendo estavelmente incorporado no seu genoma uma molécula de ácido nucleico de um cassete de expressão da presente invenção, e em que o referido campo está infestado com uma praga contra a qual o referido polipeptídeo tem atividade inseticida.

[00115] Uma vez que um ácido nucleico desejado tenha sido transformado em uma espécie de planta particular, ele pode ser propagado nessa espécie ou movido para outras variedades da mesma espécie, que incluem em particular variedades comerciais, usando técnicas de melhoramento tradicionais.

[00116] Em modalidades, um ácido nucleico desta invenção é expresso em plantas transgênicas, causando assim a biossíntese da proteína inseticida correspondente nas plantas transgênicas. Deste modo, as plantas transgênicas com resistência a insetos melhorada, particularmente lagarta-da-raiz do milho, são geradas.

Para sua a expressão em plantas transgênicas, os ácidos nucleicos da invenção podem ser opcionalmente modificados e otimizados.

Apesar de, em muitos casos, os genes dos organismos microbianos poderem ser expressos em plantas a níveis elevados sem modificação, a baixa expressão nas plantas transgênicas pode resultar dos ácidos nucleicos microbianos com códons que não são preferidos nas plantas.

É conhecido na técnica que todos os organismos têm preferência específicas para o uso de códon, e os códons dos ácidos nucleicos descritos nesta invenção podem ser alterados para se adequar às preferências das plantas, enquanto mantêm os aminoácidos codificados desse modo.

Além do mais, a elevada expressão em plantas é mais bem alcançada a partir de sequências codificantes que têm pelo menos cerca 35% de conteúdo de GC, preferencialmente mais do que cerca de 45%, mais preferencialmente mais do que cerca de 50%, e o mais preferencialmente mais do que cerca de 60%. Ácidos nucleicos microbianos que têm baixo conteúdo de GC podem expressar-se pobremente em plantas devido à existência de motivos ATTTA que podem desestabilizar mensagens, e motivos AATAAA que podem causar poliadenilação inapropriada.

Em modalidades, sequências podem ser modificadas para considerar as preferências de códon específicas e preferências de conteúdo GC de monocotiledôneas ou dicotiledôneas, já que essas preferências mostraram diferir (Murray et al.

Nucl.

Acids Res. 17:477-498 (1989)). Em adição, os ácidos nucleicos são analisados para a existência de sítios de splice ilegítimos que podem ocasionar truncação de mensagem.

Todas as alterações que é necessário fazer nos ácidos nucleicos, como as descritas acima, podem ser efetuadas usando técnicas bem conhecidas de mutagênese sítio-dirigida, PCR, e construção de genes sintéticos, por exemplo usando os métodos descritos nos pedidos de patente publicados EP 0 385 962, EP 0 359 472 e WO 93/07278.

[00117] Em uma modalidade da invenção, uma sequência codificante para uma proteína inseticida da presente invenção é feita de acordo com o procedimento divulgado na Patente dos EUA 5,625,136, aqui incorporada por referência. Neste procedimento, são usados os códons preferidos do maís, isto é, é usado o único códon que codifica mais frequentemente aquele aminoácido em maís. O códon preferencial de maís para um aminoácido particular pode ser derivado, por exemplo, de sequências de gene conhecidas de maís. O uso de códons de milho por 28 genes de plantas de milho encontra-se em Murray et al., Nucleic Acids Research 17:477-498 (1989), a divulgação da qual é aqui incorporada como referência.

[00118] Desta maneira, a sequência de nucleotídeos pode ser otimizada para a expressão em qualquer planta. É reconhecido que toda ou qualquer parte da sequência de gene pode ser otimizada ou sintética. Ou seja, também podem ser usadas sequências sintéticas ou parcialmente otimizadas.

[00119] Para iniciação mais eficiente da tradução, sequências adjacentes à metionina iniciadora podem ser modificadas. Por exemplo, podem ser modificadas pela inclusão de sequências conhecidas por serem eficazes em plantas. Joshi sugeriu um consenso apropriado para plantas (NAR 15:6643-6653 (1987)) e Clontech sugere um iniciador de tradução de consenso adicional (catálogo 1993/1994, página 210). Essas sequências de consenso são adequadas para uso com os ácidos nucleicos da presente invenção. Em modalidades, as sequências são incorporadas em construtos compreendendo os ácidos nucleicos, até e incluindo o ATG (deixando o segundo aminoácido não modificado), ou alternativamente até e incluindo o GTC subsequente o ATG (com a possibilidade de modificar o segundo aminoácido do transgene).

[00120] A expressão dos ácidos nucleicos em plantas transgênicas é dirigida por promotores que funcionam em plantas. A escolha do promotor irá variar dependendo dos requisitos temporais e espaciais para expressão, e dependendo também das espécies-alvo. Deste modo, a expressão dos ácidos nucleicos desta invenção em folhas, em galhos ou troncos, em espigas, em inflorescências (por exemplo, espinhos, panículas, sabugos, etc.), em raízes, e/ou plântulas é preferencial. Em muitos casos, no entanto, é pretendida proteção contra mais do que um tipo de praga de insetos e, logo, é desejável a expressão em múltiplos tecidos. Embora tenha sido mostrado que muitos promotores de dicotiledôneas são operacionais em monocotiledôneas e vice- versa, idealmente são selecionados promotores de dicotiledôneas para expressão em dicotiledôneas, e promotores de monocotiledôneas para expressão em monocotiledôneas. No entanto, não há restrição quanto à proveniência de promotores selecionados; é suficiente que os mesmos sejam operacionais no direcionamento da expressão os ácidos nucleicos na célula desejada.

[00121] Em uma modalidade são utilizados promotores que são expressos constitutivamente incluindo os promotores de actina ou ubiquitina ou CMP ou os promotores CaMV 35S e 19S.

Os ácidos nucleicos dessa invenção também podem ser expressos sob a regulação de promotores que são quimicamente regulados. A tecnologia preferida para indução química da expressão de genes está detalhada no pedido publicado EP 0 332 104 (em nome de Ciba-Geigy) e Patente dos EUA 5,614,395. Um promotor preferido para indução química é o promotor PR-1a do tabaco.

[00122] Em outra modalidade pode ser usada uma categoria de promotores que que é induzível por ferida. Foram descritos inúmeros promotores que são expressos em sítios de ferida e também nos sítios de infecção fitopatogênica. Idealmente, um tal promotor só deve ser ativo localmente nos locais de infecção, e deste modo as proteínas inseticidas da invenção só se acumulam nas células que precisam de sintetizar as proteínas para matar a praga de insetos invasora. Os promotores preferidos deste tipo incluem aqueles descritos por Stanford et al. Mol. Gen. Genet. 215:200 a 208 (1989), Xu et al. Plant Molec. Biol. 22:573 a 588 (1993), Logemann et al. Plant Cell 1:151 a 158 (1989), Rohrmeier & Lehle, Plant Molec. Biol. 22:783 a 792 (1993), Firek et al. Plant Molec. Biol. 22:129-142 (1993), e Warner et al. Plant J. 3:191-201 (1993).

[00123] Promotores específicos de tecido ou preferenciais de tecido úteis para a expressão de genes que codificam proteínas inseticidas da invenção em plantas, particularmente milho, são aqueles que dirigem a expressão na raiz, medula, folha ou pólen, particularmente raiz. Tais promotores, por exemplo aqueles isolados de PEPC ou trpA, são divulgados na Pat. dos EUA N.º 5,625,136, ou MTL, divulgados na Pat. dos EUA N.º 5,466,785. Ambas as patentes dos EUA estão aqui incorporadas a título de referência em sua totalidade.

[00124] Adicionalmente podem ser usados promotores funcionais em plastídeos. Exemplos não limitativos de tais promotores incluem o gene T3 de bacteriófago a 5´ UTR e outros promotores divulgados na Patente dos EUA N.º 7,579,516. Outros promotores úteis com a invenção incluem o, mas não estão limitados ao, promotor da carboxilase de RuBP de pequena subunidade S-E9 e o promotor do gene do inibidor de tripsina Kunitz (Kti3).

[00125] Em aspectos adicionais, as sequências de nucleotídeos da invenção podem estar operacionalmente associadas a um promotor que é induzível por feridas ou induzível por infecção por pragas ou patógenos (por exemplo, uma praga de insetos ou nematódeos de planta). Foram descritos numerosos promotores que são expressos em locais de ferida e/ou em locais de ataque de pragas (por exemplo, alimentação de insetos/nematódeos) ou infecção de fitopatógenos. Idealmente, um tal promotor deve ser somente ativo localmente nos ou adjacente aos locais de ataque, e deste modo a expressão das sequências de nucleotídeos da invenção estará focada nas células que estão sendo invadidas ou das quais se estão alimentando. Tais promotores incluem, mas não estão limitados aos descritos por Stanford et al., Mol. Gen. Genet. 215:200-208 (1989), Xu et al. Plant Molec. Biol. 22:573-588 (1993), Logemann et al. Plant Cell 1:151- 158 (1989), Rohrmeier e Lehle, Plant Molec. Biol. 22:783-792 (1993), Firek et al. Plant Molec. Biol. 22:129-142 (1993), Warner et al. Plant J. 3:191-201 (1993), Patente dos EUA N.º 5,750,386, Patente dos EUA N.º 5,955, 646, Patente dos EUA

N.º 6,262,344, Patente dos EUA N.º 6,395,963, Patente dos EUA N.º 6,703,541, Patente dos EUA N.º 7,078,589, Patente dos EUA N.º 7,196,247, Patente dos EUA N.º 7,223,901 e Publicação de Pedido de Patente dos EUA 2010043102.

[00126] Em algumas modalidades da presente invenção é usado um “promotor mínimo” ou “promotor basal”. Um promotor mínimo é capaz de recrutar e de se ligar ao complexo de RNA polimerase II e suas proteínas acessórias para permitir a iniciação transcricional e alongamento. Em algumas modalidades, um promotor mínimo é construído para compreender somente os nucleotídeos/sequências de nucleotídeos de um promotor selecionado que são requeridos para a ligação dos fatores de transcrição e transcrição de uma sequência de nucleotídeos de interesse que está operacionalmente associada ao promotor mínimo incluindo, mas não se limitando a sequências de caixas TATA. Em outras modalidades, o promotor mínimo não tem sequências cis que recrutam e se ligam a fatores de transcrição que modulam (por exemplo, intensificam, reprimem, conferem especificidade quanto aos tecidos, conferem induzibilidade ou repressibilidade) a transcrição. Um promotor mínimo está geralmente localizado a montante (isto é, 5´) de uma sequência de nucleotídeos a ser expressa. Assim, nucleotídeos/sequências de nucleotídeos de qualquer promotor usáveis com a presente invenção podem ser selecionados para uso como um promotor mínimo.

[00127] Inúmeras outras sequências podem ser incorporadas em cassetes de expressão descritos na presente invenção. Estas incluem sequências que mostraram intensificar a expressão como sequências de íntrons (por exemplo, de Adhl e bronzel) e sequências-líder virais (por exemplo, de TMV, MCMV e AMV).

[00128] Pode ser preferível direcionar a expressão dos ácidos nucleicos da presente invenção para diferentes localizações celulares na planta. Em alguns casos, a localização no citosol pode ser desejável, enquanto, em outros casos, a localização em alguma organela subcelular, pode ser preferida. A localização subcelular de enzimas codificadas por transgene é feita usando técnicas bem conhecidas na arte. Tipicamente, o DNA que codifica o peptídeo alvo de um produto genético conhecido dirigido para o organelo é manipulado e fundido a montante do ácido nucleico. Muitas dessas sequências alvo são conhecidas pelo cloroplasto e foi mostrado o seu funcionamento em construções heterólogas. A expressão dos ácidos nucleicos da presente invenção é também direcionada para o retículo endoplasmático ou para os vacúolos das células hospedeiras. As técnicas para alcançar isso são bem conhecidas na técnica.

[00129] Vetores adequados para transformação de plantas são bem conhecidos na técnica. Para transformação mediada por Agrobacterium, os vetores binários ou vetores que portam pelo menos uma sequência limite de T-DNA são adequados, enquanto que para transferência de gene direta qualquer vetor é adequado e DNA linear contendo apenas o construto de interesse pode ser preferencial. No caso de transferência genética direta pode ser usada transformação com uma única espécie de DNA ou cotransformação (Schocher et al. Biotechnology 4:1093- 1096 (1986)). Para transferência de genes direta e transferência mediada por Agrobacterium, a transformação é usualmente (mas não necessariamente)

realizada com um marcador selecionável que pode proporcionar resistência a um antibiótico (canamicina, higromicina ou metotrexato) ou um herbicida (basta). Os vetores de transformação de plantas compreendendo as moléculas de ácido nucleico da presente invenção também podem compreender genes (por exemplo fosfomanose isomerase; PMI) que proporcionam para a seleção positiva das plantas transgênicas, tal como divulgado nas Patentes dos EUA 5,767,378 e 5,994,629, aqui incorporadas por referência. A escolha de marcador selecionável não é, no entanto, crítica para a invenção.

[00130] Em modalidades, o ácido nucleico pode ser transformado no genoma nuclear. Em outra modalidade, um ácido nucleico da presente invenção é transformado diretamente no genoma do plastídeo. Uma vantagem principal da transformação de plastídeo é que os plastídeos são em geral capazes de expressar genes bactericidas com substancial otimização de códon, e os plastídeos são capazes de expressar múltiplos quadros de leitura abertos sob controle de um único promotor. A tecnologia de transformação com plastídeos é extensamente descrita nas Patentes dos EUA N.os 5,451,513, 5,545,817 e 5,545,818, no Pedido PCT N.º WO 95/16783 e em McBride et al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91, 7301-7305. A técnica básica para a transformação de cloroplastos envolve a introdução de regiões de DNA de plastídeo clonado flanqueando um marcador selecionável em conjunto com o gene de interesse em um tecido alvo adequado, por exemplo, usando transformação biolística ou de protoplastos (por exemplo, transformação mediada por cloreto de cálcio ou PEG). As regiões de flanqueamento de 1 a 1,5 kb, denominadas sequências de direcionamento, facilitam a recombinação homóloga com o genoma de plastídeo e assim permitem a substituição ou modificação de regiões específicas do plastoma.

Inicialmente, as mutações pontuais no rRNA 16S de cloroplasto e genes rps12 que conferem resistência à espectinomicina e/ou estreptomicina são usados como marcadores selecionáveis para transformação (Svab, Z., Hajdukiewicz, P., e Maliga, P. (1990) Proc.

Nati.

Acad.

Sci.

USA 87, 8526-8530; Staub, J.

M., e Maliga, P. (1992) Plant Cell 4, 39-45). Isto resultou em transformantes homoplasmáticos estáveis a uma frequência de aproximadamente um por 100 bombardeamentos de folhas alvo.

A presença de locais de clonagem entre estes marcadores permitiu a criação de um vetor de direcionamento de plastídeo para introdução de genes estranhos (Staub, J.M., e Maliga, P. (1993) EMBO J. 12, 601-606). Aumentos substanciais na frequência de transformação são obtidos através da substituição dos genes de resistência a antibiótico de proteína r ou rRNA recessivos com um marcador selecionável dominante, o gene aadA bacteriano que codifica a enzima de cletoxificação de espectinomicina aminoglicosídeo- 3´- adeniltransferase (Svab, Z., e Maliga, P. (1993) Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 90, 913-917). Anteriormente, este marcador havia sido usado com sucesso para transformação de elevada frequência do genoma de plastídeo da alga verde Chlamydomonas reinhardtii (Goldschmidt- Clermont, M. (1991) Nucl.

Acids Res. 19:4083-4089). Outros marcadores selecionáveis úteis para transformação de plastídeos são conhecidos na técnica e englobados dentro do escopo da invenção.

Tipicamente são requeridos aproximadamente 15-20 ciclos de divisão celular após transformação para se alcançar um estado homoplastídico.

A expressão em plastídeos, na qual os genes são inseridos por recombinação homóloga em todos os vários milhares de cópias do genoma de plastídeo circular presente em cada célula vegetal, tira partido da vantagem do enorme número de cópias em relação a genes expressos no núcleo para permitir níveis de expressão que podem prontamente exceder 10% da proteína vegetal solúvel total. Em uma modalidade preferencial, um ácido nucleico da presente invenção é inserido em um vetor direcionando plastídeos e é transformado no genoma de plastídeo de uma planta hospedeira desejada. As plantas homoplásticas para genomas de plastídeo que contêm um ácido nucleico da presente invenção são obtidas, e são preferencialmente capazes de elevada expressão do ácido nucleico.

EXEMPLOS

[00131] A invenção será adicionalmente descrita por referência aos seguintes exemplos detalhados. Estes exemplos são proporcionados, somente, para os propósitos de ilustração e não se destinam a ser limitativos, a não ser que de outro modo especificado. As técnicas de DNA recombinante e clonagem molecular padrão usadas aqui são bem conhecidas na técnica e são descritas por J. Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª Ed., Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001); por T.J. Silhavy, M.L. Berman e L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) e por Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, New

York, John Wiley and Sons Inc., (1988), Reiter, et al., Methods in Arabidopsis Research, World Scientific Press (1992), e Schultz et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers (1998).

Exemplo 1: Identificação de uma Proteína com atividade Inseticida contra a Lagarta-da-raiz do Milho do Oeste

[00132] Uma proteína inseticida (SEQ ID NO: 39) foi identificado a partir de Nitrococcus mobilis. Uma versão otimizada de E. coli deste gene foi sintetizada (SEQ ID NO: 1) e o gene foi clonado em um vetor pET29a, criando o construto p(Nitromob). O construto p(Nitromob) foi transformado em E. coli BL21 * (DE3) e a expressão da proteína foi realizada em caldo Luria-Bertani com indução de IPTG a 18 °C durante a noite. A fração solúvel dos lisados foi preparada a partir destas culturas usando uma célula de pressão francesa seguida de centrifugação de lisados completos a 20.000 x g durante trinta minutos. O sobrenadante (fração solúvel) foi então testado quanto à bioatividade para a Lagarta da Raiz do Milho Ocidental (WCR; Diabrotica virgifera).

[00133] Os ensaios de bioatividade foram realizados usando um método de incorporação de dieta. Resumidamente, lisados de E. coli BL21*(DE3) foram misturados com um volume igual de dieta artificial de inseto aquecida (Bioserv, Inc., Frenchtown, NJ) em tubos de centrífuga de 1,5 ml e depois aplicados a placas de Petri pequenas. Depois que a mistura da amostra de dieta foi arrefecida e solidificada, 12 larvas WCR foram adicionadas a cada placa. As placas foram seladas e mantidas às condições ambiente do laboratório no que se refere à temperatura, iluminação e umidade relativa. Os lisados de culturas de E. coli BL21* (DE3) contendo o vetor pET29a vazio foram usados como controles negativos. A mortalidade foi avaliada no dia 4 e no dia 7, ou opcionalmente no dia 3 e no dia 6. Para esta e todas as tabelas subsequentes que mostram atividade inseticida sobre CRW, as abreviações para a coluna "Observações" são as seguintes: s = larvas pequenas, sm = larvas pequenas/médias, m= larvas médias, mb = larvas médias/grandes, b= larvas grandes, vb = larvas muito grandes Para essa e todas as Tabelas subsequentes que mostram a atividade inseticida de NitromobCRW ou uma variante do mesmo, o "SEQ ID NO." se refere à sequência de aminoácidos da proteína. Como mostrado na Tabela 1, o lisado da cultura que expressa p(Nitromob) mostrou forte bioatividade contra WCR. A proteína N. mobilis foi renomeada como NitromobCRW. Tabela 1: Atividade inseticida do Nitromob contra a Lagarta da Raiz do Milho Ocidental S Dia 4 Dia 7

E Q

I Tratamento Mor % Observa Mor % Observa

D tas Mort. ções tas Mort. ções

N

O . BL21 */pET29a- 0 0% b 1 8% b vazio

BL21*/(pNitr 3 10 83% m 12 100% omob) 9 Exemplo 2: Variantes de NitromobCRW possuem atividade inseticida contra WCR

[00134] As mutações foram introduzidas em NitromobCRW e a estabilidade da proteína e atividade inseticida de lisados bacterianos que compreendem a variante mutante NitromobCRW foram testadas. As mutações incluem mudanças de aminoácidos em vários resíduos e também a inserção de resíduos de leucina. Essas mutações foram introduzidas para determinar se poderia ser projetada uma variante mutante NitromobCRW que mantivesse a atividade inseticida, mas seria digerível em um ensaio de Fluido Gástrico Simulado (SGF). Essa variante NitromobCRW pode ter valor comercial, por exemplo, através da expressão transgênica em uma planta para conferir propriedades inseticidas à planta.

[00135] A atividade inseticida foi determinada usando ensaios de incorporação de dieta realizados essencialmente como descrito no Exemplo 1, usando 12 larvas de WCR por ensaio experimental. Os resultados são mostrados nas Tabelas 2-6. SEQ ID NOs corresponde à sequência de aminoácidos da variante. Os tratamentos mostrados nas Tabelas 5 e 6 também indicam a diluição do lisado bacteriano usado. Todas as variantes mutantes NitromobCRW mostram atividade inseticida no dia 6 ou 7.

Tabela 2: Atividade inseticida da variante mutante de NitromobCRW contra WCR

S Dia 4 Dia 7

E

Q I % % Tratamento Mor Observ Mor Observ D Mort Mort tas ações tas ações N . .

O . BL21 */pET29a- 0 0% mb/b 2 17% b vazio BL21*/Nitromob 7 7 58% m 12 100% CRW Y213L 3 Tabela 3: Atividade inseticida de variantes mutantes de NitromobCRW contra WCR S Dia 4 Dia 7

E

O . BL21 */pET29a- 0 0% b 1 8% b vazio BL21*/NitromobCRW 4 10 83% sm 12 100% Y213L/I215L 7

BL21*/NitromobCRW 7 11 92% s 12 100% V177L/I215L 2

BL21*/NitromobCRW 7 12 100% 12 100% E186L/I215L 1

BL21*/NitromobCRW 7 11 92% s 12 100% E196L/I215L 0

BL21*/NitromobCRW 6 12 100% 12 100% V193L/I215L 9

BL21*/NitromobCRW 4 11 92% s 12 100% I175L 2

BL21*/NitromobCRW 4 10 83% s 12 100% I208L 3

BL21*/NitromobCRW 4 11 92% m 12 100% I245L 8

BL21*/NitromobCRW 4 12 100% 12 100% I255L 9

BL21*/NitromobCRW 4 11 92% s 12 100% I215F 5

BL21*/NitromobCRW 4 12 100% 12 100% I215Y 6

BL21*/NitromobCRW 5 10 83% 1s, 1m 12 100% V220L 6

BL21*/NitromobCRW 5 12 100% 12 100% V167L 5

BL21*/NitromobCRW 5 12 100% 12 100% V122L 4

BL21*/NitromobCRW 5 12 100% 12 100% I257L 1

BL21*/NitromobCRW 5 9 75% sm 12 100% I265L 0

BL21*/NitromobCRW 4 11 92% m 12 100% I98L 0

BL21*/NitromobCRW 4 11 92% m 12 100% V99L 1 BL21 3 */NitromobCRW 10 83% m 12 100% 9 tipo selvagem

Tabela 4: Atividade inseticida de variantes mutantes de NitromobCRW contra WCR Tratamento Dia 4 Dia 6

S E

Q % % I Mor Observ Mor Observ Mort Mort D tas ações tas ações . .

N

O . BL21 */pET29a- 0 0% mb/b 0 0% b vazio BL21*/NitromobCR 6 12 100% 12 100% W V203S/M204L 5 BL21*/NitromobCR 6 11 92% s 12 100% W V185L 8 BL21*/NitromobCR 6 12 100% 12 100% W T218F 7 BL21*/NitromobCR 6 10 83% 1s,1m 12 100% W T218L 6 BL21*/NitromobCR 6 10 83% 2m 12 100% W I175L/I215L 0 BL21*/NitromobCR 6 11 92% 1m 12 100% W I215L/I255L 2

BL21*/NitromobCR 6 11 92% 1m 12 100% W I208L/I215L 1 BL21*/NitromobCR 6 12 100% 12 100% W I255L/I257L 3 BL21*/NitromobCR 5 10 83% 1s,1m 12 100% W Y213F/I215L 9 Tabela 5: Atividade inseticida da variante mutante de NitromobCRW contra WCR Dia 3 Dia 6

SEQ % Obser % Obser Tratamento ID Mor Mor Mort vaçõe Mort vaçõe NO. tas tas . s . s BL21 */pET29a-vazio 0 0% b 3 25% vb BL21 */NitromobCRW I215L/V203S/M204L, 74 9 75% m 12 100% não diluído BL21 */NitromobCRW I215L/V203S/M204L, 74 1 8% b 7 58% mb/b 1:50 Tabela 6: Atividade inseticida de NitromobCRW I215L contra

WCR S Dia 4 Dia 6 E % % Tratamento Mor Observ Mor Observ Q Mort Mort tas ações tas ações I . .

D N

O . BL21 */pET29a- 0 0% mb 0 0% b vazio BL21*/NitromobCR 4 10 83% sm 12 100% W I215L-1:2 4 BL21*/NitromobCR 4 2 17% m 12 100% W I215L-1:20 4 BL21*/NitromobCR 4 2 17% m 11 92% m W I215L-1:50 4 BL21*/NitromobCR 4 0 0% mb 0 0% b W I215L-1:200 4 Exemplo 3: Ensaio de fluido gástrico simulado em preparações de lisado de E. coli

[00136] Este exemplo descreve o ensaio realizado para determinar a digestibilidade de SGF. Cada variante da proteína NitromobCRW foi produzida na cepa de E. coli BL21 * (DE3). O nível de expressão da variante na cepa bacteriana e a solubilidade da variante são indicados na Tabela 7. Lisados de bactérias em fosfato de potássio a 50 mM pH 7,0, cloreto de sódio a 50 mM foram diluídos para 3 mg/ml (concentração de proteína total) para a análise de digestibilidade.

A reação de digestão foi iniciada pela adição de 15 µl de lisado a 285 µl de fluido gástrico simulado [10 Unidades de pepsina/µg de proteína, ou aproximadamente 1579 Unidades de pepsina/ml, em solução G-Con (2 mg/ml de cloreto de sódio, pH 1,2)] a 37 °C.

Em 5 minutos, 100 µl da reação de lisado-SGF foram removidos e a reação terminada por adição a 100 µl de solução de parada pré-aquecida (95 °C) composta por 65% de Tampão de Carregamento de Tricina (Bio-rad 2x Tricine Load Buffer 10% em peso β-mercaptoetanol) e 35% de bicarbonato de sódio 500 mM, pH 11,0. Foi produzido um ponto temporal zero (T0) adicionando 5 µl de lisado de teste a 100 µl de Solução de Paragem pré-aquecida (95 °C) e 95 µl de fluido gástrico simulado.

Todas as amostras foram aquecidas a 95 °C durante 5 minutos e depois armazenadas em gelo até análise por SDS-PAGE.

Trinta microlitros de cada reação foram carregados em um gel de peptídeos de Tris- tricina a 10-20% antes da eletroforese padrão em gel de proteína.

O gel de Tris-tricina foi fixado durante 20 minutos com uma mistura de 40% de metanol:10% de ácido acético imediatamente após a eletroforese.

O gel foi então corado com um corante de proteína GelCode Blue durante 1 hora à temperatura ambiente.

Após 1 hora, o gel de poliacrilamida foi descorado com água destilada durante pelo menos 12 horas.

Os resultados são mostrados qualitativamente na Tabela 7. Uma "Falha" para o teste T5 significa que a variante da proteína NitromobCRW intacta ou parcialmente digerida foi detectável por coloração de proteína GelCode Blue após eletroforese em gel, indicando que a proteína não era totalmente digerível no ensaio SGF.

Uma "Aprovação" para o teste T5 significa que a variante da proteína NitromobCRW intacta não foi detectável, indicando que a variante da proteína NitromobCRW foi digerível no ensaio SGF. A atividade inseticida ("Ativa") da variante da proteína NitromobCRW também é indicada, com um "sim" que indica atividade inseticida, como mostrado nos exemplos anteriores.

Tabela 7: Digestão de variantes mutantes de NitromobCRW no Ensaio SGF SEQ ID Expres Solubili Teste Ati Variante mutante NO. são dade T5 vo NitromobCRW I175L 42 ++++ Alta Falha sim NitromobCRW I208L 43 ++++ Alta Falha sim NitromobCRW I215L 44 ++++ Alta Falha sim NitromobCRW I245L 48 ++++ Alta Falha sim NitromobCRW I255L 49 ++++ Alta Falha sim NitromobCRW I215F 45 +++ Alta Falha sim NitromobCRW I215Y 46 ++++ Alta Falha sim NitromobCRW 214-Leu- 215 57 +++ Nenhum NitromobCRW 215-Leu- 216 58 +++ Nenhum NitromobCRW G216A 52 +++ Nenhum NitromobCRW G216L 53 +++ Nenhum NitromobCRW V220L 56 ++++ Alta Falha sim NitromobCRW V167L 55 ++++ Alta Falha sim NitromobCRW V122L 54 ++++ Alta Falha sim NitromobCRW I257L 51 ++++ Alta Falha sim NitromobCRW I265L 50 ++ Baixa Falha sim NitromobCRW I98L 40 ++++ Alta Falha sim

NitromobCRW V99L 41 ++++ Alta Falha sim NitromobCRW I175L/I215L 60 ++++ Alta Falha sim NitromobCRW I215L/I255L 62 ++++ Alta Falha sim NitromobCRW I208L/I215L 61 ++++ Alta Falha sim NitromobCRW I255L/I257L 63 ++++ Alta Falha sim NitromobCRW Y213F/I215L 59 ++++ Alta Falha sim NitromobCRW L214S/I215L 64 +++ Nenhum NitromobCRW V203S/M204L 65 ++++ Alta Falha sim NitromobCRW T218L 66 ++++ Alta Falha sim NitromobCRW T218F 67 ++++ Alta Falha sim NitromobCRW V185L 68 ++++ Alta Falha sim NitromobCRW V177L/I215L 72 ++++ Alta Falha sim NitromobCRW E186L/I215L 71 ++++ Alta Falha sim NitromobCRW E196L/I215L 70 ++++ Alta Falha sim NitromobCRW V193L/I215L 69 ++++ Alta Falha sim NitromobCRW Aprov Y213L/I215L 47 ++++ Alta ado sim NitromobCRW Y213L 73 ++++ Alta Falha sim

NitromobCRW V203S/M204L/I215L 74 ++++ Alta Falha sim

[00137] Surpreendentemente, de todas as variantes do NitromobCRW produzidas, apenas o NitromobCRW Y213L/I215L (SEQ ID NO: 47) passou definitivamente no teste SGF Ensaio T5. NitromobCRW I215L (SEQ ID NO: 44) exibiu melhor digestibilidade do que a proteína de tipo selvagem, mas esta variante não passou no teste T5. Curiosamente, as variantes do NitromobCRW 214-Leu-215, 215-Leu-216, G216A, G216L e L214S/I215L não eram solúveis e a variante do NitrobCRW I265L tinha baixa solubilidade. Estes dados sugerem que um domínio, motivo ou dobra nesta região da proteína é crítico para a função da proteína e/ou estabilidade da proteína.

Exemplo 4: Variante de NitromobCRW Y213L/I215L purificada é inseticida contra WCR

[00138] Esta variante foi caracterizada adicionalmente por suas propriedades inseticidas. Dois litros de células E.coli BL21 * (DE3) contendo pET-NitromobCRW Y213L/I215L foram cultivadas a 37 °C em meio LB. IPTG (1 mM) foi adicionado às culturas quando a DO atingiu 0,8 a 1,0 e, em seguida, as culturas foram movidas para 18 °C durante 18 horas. O pélete celular foi colhido e ressuspenso em Tris 20 mM, pH 8,5 com glicerol a 10%. As células foram lisadas com o uso de uma célula de pressão francesa; o lisado foi então centrifugado a 100k x g em uma ultracentrífuga. O sobrenadante foi coletado e depois filtrado antes de carregamento em uma coluna de troca aniônica HiPrepQ que foi pré-equilibrada em Tris 20 mM, pH 8,5 com glicerol a 10%. A coluna HiPrepQ vinculou NitromobCRW Y213L/I215L efetivamente; a proteína foi eluída da coluna com o uso de um gradiente de NaCl linear. O tampão de alto teor de sal consistiu em Tris 20 mM, pH 8,5, NaCl 0,5 M com glicerol a 10%. As frações mais puras foram reunidas e depois concentradas para aproximadamente 2 ml. A proteína foi carregada em uma coluna de filtração em gel Sephadex 200 que tinha sido pré- equilibrada em 1X PBS. Frações da coluna Sephadex 200 foram analisadas quanto à pureza por SDS-PAGE (NitromobCRW Y213L/I215L (SEQ ID NO: 47) tem um peso molecular previsto de 32,1 kDa). As frações mais puras foram reunidas e, em seguida, concentradas a 7,2 mg/ml, antes do armazenamento a -80 °C. A proteína pura foi então testada contra 12 larvas WCR ao longo de uma faixa de concentrações no método de incorporação de dieta essencialmente conforme descrito no Exemplo 1. Como mostrado na Tabela 8, NitromobCRW Y213L/I215L é eficaz contra WCR; NitromobCRW Y213L/I215L a 50 µg/ml produziu pelo menos 75% de mortalidade no dia 6.

Tabela 8: Atividade inseticida de NitromobCRW Y213L/I215L purificado contra WCR Dia 3 Dia 6 Tratamen Mort % Observaç Mort % Observaç to as Mort. ões as Mort. ões 1X PBS 0 0% b 1 8% b 1X PBS 0 0% b 0 0% b Nitromob CRW 3 25% sm 12 100% Y213L/I2

15L 200 µg/ml Nitromob

CRW Y213L/I2 6 50% m/mb 12 100% 15L 200 µg/ml Nitromob

CRW Y213L/I2 3 25% m/mb 12 100% 15L 100 µg/ml Nitromob

CRW Y213L/I2 2 17% mb 11 92% 1b 15L 100 µg/ml Nitromob

CRW Y213L/I2 1 8% mb 12 100% 15L 50 µg/ml Nitromob

CRW Y213L/I2 0 0% mb 9 75% 2m, 1b 15L 50 µg/ml Nitromob CRW 2 17% mb 4 33% mb Y213L/I2

15L 25 µg/ml Nitromob

CRW Y213L/I2 4 33% mb 7 58% mb 15L 25 µg/ml Nitromob

CRW Y213L/I2 1 8% mb/b 1 8% m/mb 15L 12,5 µg/ml Nitromob

CRW Y213L/I2 0 0% mb/b 1 8% m/mb 15L 12,5 µg/ml Exemplo 5: NitromobCRW Y213L/I215L possui atividade inseticida contra cepas de Lagarta da Raiz do Milho Ocidental resistentes a Cry

[00139] Para determinar se a toxicidade de NitromobCRW Y213L/I215L (SEQ ID NO: 47) é através de um modo de ação separado das proteínas relacionadas com Cry3, o lisado de NitromobCRW Y213L/I215L foi purificado como no Exemplo 4 e testado quanto à eficácia contra uma cepa de WCR que é resistente a uma toxina eCry3.1Ab (eCry3.1Ab-R; consultar Tabela 9), uma cepa de WCR que é resistente a uma toxina Cry3A (mCry3A) modificada (mCry3A-R; consultar Tabela 10) e uma cepa de WCR que é resistente a uma toxina Cry3Bb (Cry3Bb- R ; consultar a Tabela 11). Ensaios de incorporação de dieta foram realizados ao longo de uma faixa de proteína NitromobCRW Y213L/I215L essencialmente como descrito no Exemplo 4, e a mortalidade foi avaliada no dia 3 e no dia 6 (Tabela 9) ou no dia 2 e no dia 7 (Tabela 10). O NitrobmobCRW Y213L/I215L foi testado duas vezes em diversas concentrações (µg/ml), como indicado nas Tabelas 9, 10 e 11. O controle negativo tinha apenas 1X PBS. Cada ensaio foi realizado com 12 larvas WCR. Como mostrado nas Tabelas 9, 10 e 11, NitromobCRW Y213L/I215L demonstra atividade inseticida contra cepas de WCR resistentes a Cry.

Tabela 9: Atividade inseticida de NitromobCRW Y213L/I215L purificado contra WCR resistente a eCry3.1Ab Dia 3 Dia 6 Tratamen Mort % Observaç Mort % Observaç to as Mort. ões as Mort. ões 1X PBS 0 0% b 0 0% b 1X PBS 0 0% b 1 8% b Nitromob

CRW Y213L/I2 9 75% m 12 100% 15L 200 µg/ml Nitromob

CRW Y213L/I2 5 42% m 12 100% 15L 200 µg/ml

Nitromob

CRW Y213L/I2 7 58% m/mb 12 100% 15L 100 µg/ml Nitromob

CRW Y213L/I2 2 17% mb 11 92% m 15L 50 µg/ml Nitromob

CRW Y213L/I2 0 0% mb 9 75% 2m, 1b 15L 50 µg/ml Nitromob

CRW Y213L/I2 1 8% mb 8 67% m 15L 25 µg/ml Nitromob

CRW Y213L/I2 0 0% mb 8 67% mb 15L 25 µg/ml

Nitromob

CRW Y213L/I2 0 0% mb 5 42% b 15L 12,5 µg/ml Nitromob

CRW Y213L/I2 0 0% mb 4 33% b 15L 12,5 µg/ml Tabela 10: Atividade inseticida de NitromobCRW Y213L/I215L purificado contra WCR resistente a mCry3A Dia 2 Dia 7 Tratamen Mort % Observaç Mort % Observaç to as Mort. ões as Mort. ões 1X PBS 0 0% mb/b 0 0% b/vb 1X PBS 2 17% mb/b 3 25% b Nitromob

CRW Y213L/I2 2 17% mb/b 12 100% 15L 200 µg/ml Nitromob

CRW Y213L/I2 1 8% mb/b 12 100% 15L 200 µg/ml

Nitromob

CRW Y213L/I2 0 0% mb/b 12 100% 15L 100 µg/ml Nitromob

CRW Y213L/I2 0 0% mb/b 11 92% mb 15L 100 µg/ml Nitromob

CRW Y213L/I2 0 0% mb 9 75% mb 15L 50 µg/ml Nitromob

CRW Y213L/I2 1 8% mb/b 11 92% m 15L 50 µg/ml Nitromob

CRW Y213L/I2 1 8% mb/b 8 67% 3mb, 1b 15L 25 µg/ml Nitromob

CRW Y213L/I2 0 0% mb/b 8 67% mb 15L 25 µg/ml

Nitromob

CRW Y213L/I2 0 0% mb/b 6 50% b 15L 12,5 µg/ml Nitromob

CRW Y213L/I2 0 0% mb/b 4 33% b 15L 12,5 µg/ml Tabela 11: Atividade inseticida de NitromobCRW Y213L/I215L purificado contra WCR resistente a Cry3Bb Dia 3 Dia 9 % % Observaçõ Observaçõ Tratamento Mort Mort. es es . 1X PBS 0% b 0% b 1X PBS 0% b 0% b NitromobCRW 25% mb 100% Y213L/I215L 200 µg/ml NitromobCRW 8% mb 100% Y213L/I215L 200 µg/ml NitromobCRW 8% mb/b 100% Y213L/I215L 100 µg/ml NitromobCRW 0% mb/b 92% 1b Y213L/I215L 100 µg/ml NitromobCRW 0% b 83% 2mb Y213L/I215L 50 µg/ml

NitromobCRW 0% b 75% 3mb Y213L/I215L 50 µg/ml NitromobCRW 0% b 0% b Y213L/I215L 25 µg/ml NitromobCRW 0% b 0% b Y213L/I215L 25 µg/ml NitromobCRW Y213L/I215L 12,5 0% b 25% b µg/ml NitromobCRW Y213L/I215L 12,5 0% b 0% b µg/ml Exemplo 6: NitromobCRW Y213L/I215L não possui atividade inseticida contra Lepidópteros

[00140] Lisados de culturas bacterianas que expressam NitromobCRW Y213L/I215L (SEQ ID NO: 47) foram testados quanto à bioatividade em um painel de pragas de insetos Lepidópteros com o uso de bioensaios de sobreposição de dieta. A broca do milho europeia (ECB), a lagarta negra (BCW) e a lagarta da espiga do milho (CEW) e a lagarta do cartucho (FAW) foram testadas quanto à atividade inseticida de NitromobCRW por um ensaio de incorporação de dieta semelhante àquele do Exemplo 1. 12 larvas L1 foram testadas para cada experimento, com o uso de lisados de culturas bacterianas Bl21 * (DE3) que abrigam um gene que codifica para NitromobCRW Y213L/I215L (SEQ ID NO: 9). Uma amostra de controle positivo para BCW, CEW e FAW consistiu em larvas expostas a lisados de E.coli BL21 * (DE3) que expressam uma proteína Vip3. 1X PBS isoladamente e lisados de culturas de bactérias BL21* (DE3) contendo o vetor pET29 vazio foram usados como controles negativos. A mortalidade foi avaliada no dia 7. As larvas que atingem o estágio L3 não foram significativamente afetadas pelo tratamento. Se as larvas atingem apenas o estágio L2, então é possível que o tratamento tenha causado inibição do crescimento. Se as larvas permanecerem no estágio L1 durante todo o tratamento então ocorreu inibição do crescimento. Isto também pode ser considerado "mortalidade efetiva", pois as larvas não se desenvolverão além do estágio L1, mesmo que permaneçam vivas. Para as Tabelas 11 a 14, L1 = 1º ínstar, L2 = 2º ínstar, L3 = 3º ínstar. NitromobCRW não foi ativo contra as pragas de insetos Lepidópteros testadas nessas condições experimentais (Tabelas 12 a 15).

Tabela 12: Atividade inseticida de NitromobCRW Y213L/I215L contra CEW # % Tratamento L1 L2 L3 Mortos Mort. BL21 */pET29a-vazio 0% 12 BL21*/pET-Vip3D (+) 12 100% KPi a 50 mM, pH 7,0, 0% 12 NaCl a 50 mM 1X PBS 0% 12 NitromobCRW Y213L/I215L 250 0% 12 µg/ml

NitromobCRW Y213L/I215L 100 0% 12 µg/ml NitromobCRW 0% 12 Y213L/I215L 40 µg/ml

Tabela 13: Atividade inseticida de NitromobCRW Y213L/I215L contra FAW # % Tratamento L1 L2 L3 Mortos Mort.

BL21 */pET29a-vazio 0% 12 BL21*/pET-Vip3D (+) 12 100% KPi a 50 mM, pH 7,0, 0% 12 NaCl a 50 mM 1X PBS 0% 12 NitromobCRW Y213L/I215L 250 0% 12 µg/ml NitromobCRW Y213L/I215L 100 0% 12 µg/ml NitromobCRW 0% 12 Y213L/I215L 40 µg/ml

Tabela 14: Atividade inseticida de NitromobCRW Y213L/I215L contra BCW # % Tratamento L1 L2 L3 Mortos Mort.

BL21 */pET29a-vazio 0% 12 BL21*/pET-Vip3D (+) 12 100%

KPi a 50 mM, pH 7,0, 0% 12 NaCl a 50 mM 1X PBS 0% 12 NitromobCRW Y213L/I215L 250 0% 12 µg/ml NitromobCRW Y213L/I215L 100 0% 12 µg/ml NitromobCRW 0% 12 Y213L/I215L 40 µg/ml Tabela 15: Atividade inseticida de NitromobCRW Y213L/I215L contra ECB

ECB # % Tratamento L1 L2 L3 Mortos Mort. BL21 */pET29a-vazio 0% 12 BL21*/pET-Vip3D (+) 12 100% KPi a 50 mM, pH 7,0, 0% 12 NaCl a 50 mM 1X PBS 0% 12 NitromobCRW Y213L/I215L 250 0% 12 µg/ml NitromobCRW Y213L/I215L 100 0% 12 µg/ml NitromobCRW 0% 12 Y213L/I215L 40 µg/ml

Exemplo 7: NitromobCRW Y213L/I215L possui atividade inseticida contra o Lagarta-da-Raiz do Milho do Norte

[00141] NitromobCRW Y213L/I215L foi purificado como no Exemplo 1 e foi testado quanto à eficácia contra 12 larvas da Lagarta da Raiz do Milho do Norte (NCR) para cada concentração em um ensaio de incorporação de dieta, realizado essencialmente como descrito no Exemplo 1. O controle negativo tinha apenas 1X PBS.

Tabela 16: Atividade inseticida de NitromobCRW Y213L/I215L contra NCR Dia 3 Dia 6 Tratamento % Observaçõe % Observaçõe Mort s Mort. s . 1X PBS 17% mb 25% mb/b 1X PBS 25% mb 42% mb/b NitromobCRW 75% m 100% Y213L/I215L 200 µg/ml NitromobCRW 75% m 100% Y213L/I215L 200 µg/ml NitromobCRW 33% mb 92% 1m Y213L/I215L 100 µg/ml NitromobCRW 67% m/mb 92% m Y213L/I215L 100 µg/ml

NitromobCRW 50% mb 100% Y213L/I215L 50 µg/ml NitromobCRW 33% mb 92% m Y213L/I215L 50 µg/ml NitromobCRW 25% mb 83% m Y213L/I215L 25 µg/ml NitromobCRW 33% mb 92% m Y213L/I215L 25 µg/ml NitromobCRW Y213L/I215L 12,5 17% mb 75% m µg/ml NitromobCRW Y213L/I215L 12,5 25% mb 100% µg/ml Exemplo 8: NitromobCRW Y213L/I215L possui atividade inseticida contra o Lagarta-da-Raiz do Milho do Sul

[00142] NitromobCRW Y213L/I215L foi purificado como no Exemplo 1 e foi testado quanto à eficácia contra 12 larvas de Lagarta da Raiz do Milho do Sul (SCR) em um ensaio de incorporação de dieta, realizado essencialmente como descrito no Exemplo 1. NitromobCRW Y213L/I215L (SEQ ID NO: 47) foi testado em uma faixa de concentração de 100 µg/ml a 400 µg/ml. O controle negativo tinha apenas 1X PBS. Como mostrado na Tabela 16, NitromobCRW Y213L/I215L demonstra atividade inseticida contra SCR.

Tabela 16: Atividade inseticida de NitromobCRW Y213L/I215L contra SCR Dia 4 Dia 6 Tratamen Mort % Observaç Mort % Observaç to as Mort. ões as Mort. ões 1X PBS 0 0% b 0 0% vb 1X PBS 0 0% b 0 0% vb Nitromob

CRW Y213L/I2 12 100% 12 100% 15L 400 µg/ml Nitromob

CRW Y213L/I2 11 92% mb 12 100% 15L 400 µg/ml Nitromob

CRW Y213L/I2 9 75% 2m, 1b 12 100% 15L 200 µg/ml Nitromob

CRW Y213L/I2 9 75% m 11 92% m 15L 200 µg/ml Nitromob 5 42% mb 9 75% 1m, 2b

CRW

Y213L/I2 15L 100 µg/ml Nitromob

CRW Y213L/I2 10 83% 1m, 1b 11 92% b 15L 100 µg/ml Exemplo 9: Transformação de Maís com NitromobCRW Y213L/I215L

[00143] É produzido um construto de vetor binário adequado para transformação mediada por Agrobacterium de NitromobCRW Y213L/I215L. O vetor binário compreende uma sequência de codificação de NitromobCRW Y213L/I215L otimizada para maís (SEQ ID NO: 38), ligada operacionalmente na extremidade 5' a um promotor adequado para dirigir a expressão em plantas e ligado operacionalmente na extremidade 3' a uma sequência terminadora. A otimização de códons de maís é realizada, por exemplo, com o uso dos métodos descritos na Patente dos EUA N.º 6,320,100 (incorporada ao presente documento a título de referência). O construto é transformado em Agrobacterium tumefaciens com o uso de técnicas de biologia molecular padrão conhecidas pelos especialistas na técnica. Para preparar Agrobacteria para transformação, as células são cultivadas em meio YPC líquido a 28 °C e 220 rpm durante a noite. A transformação de Agrobacterium de embriões de maís imaturos é realizada essencialmente como descrito em Negrotto et al., 2000, (Plant Cell Reports 19: 798-803). Para este exemplo, todos os constituintes dos meios são essencialmente como descrito em Negrotto et al., supra. No entanto, vários constituintes de meios conhecidos na técnica podem ser substituídos.

[00144] Após a transformação, seleção e regeneração, as plantas são testadas quanto à presença do gene que codifica o marcador selecionável e a sequência de codificação otimizada por códons de maís NitromobCRW Y213L/I215L com o uso de análise TaqMan®. As plantas também são testadas quanto à presença da estrutura do vetor. As plantas negativas para a estrutura do vetor e que compreendem uma cópia do transgene são transferidas para a estufa e testadas quanto à resistência aos danos do WCR.

Exemplo 10: Plantas de maís que expressam NitromobCRW Y213L/I215L têm atividade inseticida contra WCR A presença de NitromobCRW Y213L/I215L foi detectada por ELISA como ng/mg de proteína solúvel total (TSP) na folha ou no tecido da raiz de cada evento. A atividade inseticida foi determinada com o uso de um Bioensaio de Segmento de Raiz. Resumidamente, as amostras de tecido da raiz de maís de cada evento foram excisadas quando os eventos de maís que expressam a variante NitromobCRW atingiram o estágio V3-V4. O tecido de raiz de maís foi colocado em uma placa Petri e então infestado com 12 larvas de WCR. Duas amostras de tecido de raiz (Rep1 e Rep2) são avaliadas quanto a orifícios de alimentação (FH) e danos de cicatriz no dia 3. O tecido radicular do milho não transformado (nulo) serviu como controle negativo. A pontuação para danos causados por insetos é realizada com o uso de o seguinte: ND = nenhum detectado; FH = orifícios de alimentação; L = cicatriz leve;

M = cicatriz média; H = cicatriz forte; ++ = excelente desempenho; + = bom desempenho; - = mau desempenho Tabela 17: Atividade inseticida de Maís NitromobCRW Y213L/I215L Transgênico contra WCR Conc. de N.º do NiromobCRW Atividade Evento (ng/mg de TSP) de WCR 43 34 + 47 43 + 49 56 ++ 50 39 + 52 13 - 56 42 - 57 17 + 61 32 - 81 28 - 83 36 - 86 21 + 91 30 + 93 35 + Exemplo 11: NitromobCRW Y213L/I215L em combinação com um RNA interferente tem atividade inseticida contra WCR

[00145] NitromobCRW e/ou uma variante de NitromobCRW são purificados como lisados bacterianos como no Exemplo 1 ou purificados como proteínas semelhantes ao Exemplo 4. O dsRNA contra um alvo essencial e conhecido por ter atividade inseticida é preparado. Em exemplos não limitantes, o dsRNA pode ter como alvo um gene que codifica ATP sintase vacuolar, beta-tubulina, proteína p28 da subunidade do proteossoma 26S, EF1α 48D, troponina I, tetraspanina, gama-coatômero, beta-coatômero e/ou hormônio juvenil epóxido hidrolase (Publicações WO N.os WO2018/026770, WO2018/026773 e WO2018/026774; Patente dos EUA N.º 7,812,219; cada uma incorporada ao presente documento a título de referência). O dsRNA e a proteína NitromobCRW purificada são testados quanto à eficácia inseticida contra WCR em um ensaio de incorporação de dieta, realizado essencialmente como descrito no Exemplo 1, mas com a adição do dsRNA na dieta artificial.

[00146] Asdadasdas Exemplo 12. NiromobCRW com extensão C-terminal está ativo contra CRW.

[00147] Este exemplo descreve os efeitos de anexar um peptídeo C-terminal à proteína NitromobCRW. Um pET- NitromobCRW-Y213L/I215L:construto de extensão C-terminal que codifica SEQ ID NO: 77 foi clonado em E. coli. O peptídeo de extensão C-terminal compreende SEQ ID NO: 76 e é uma combinação de uma sequência de ligante (aminoácidos 1 a 35 da SEQ ID NO:76) e um marcador SUMO (aminoácidos 36 a 133 da SEQ ID NO: 76). SUMO é uma pequena proteína modificadora semelhante à ubiquitina que, quando fundida a uma proteína de interesse, aumenta a produção de proteína funcional em sistemas de expressão procarióticos e eucarióticos, com base na estabilidade e solubilidade de proteínas significativamente melhoradas. Após a expressão e purificação da proteína de fusão, o marcador SUMO é tipicamente clivado por proteases específicas (SUMO) por meio de sua atividade de endopeptidase in vitro para gerar o parceiro de proteína liberado desejado. Para este exemplo, o peptídeo de extensão C-terminal (SEQ ID NO: 76) não foi clivado da proteína NitromobCRW e a proteína estendida intacta (NitromobCRW-Cterm-SUMO; SEQ ID NO: 77) foi testada quanto à digestibilidade de SGF e atividade inseticida contra WCR.

[00148] A análise de SGF de NitromobCRW-Y213L-I215L-Cterm- SUMO foi a mesma descrita acima. A digestibilidade do NitromobCRW-Y213L-I215L-Cterm-SUMO foi comparada com o NitromobCRW-Y213L-I215L sem uma extensão do terminal C como controle. A proteína NitromobCRW-Y213L-I215L-Cterm-SUMO também foi testada quanto à atividade contra WCR como descrito acima.

[00149] Os resultados do ensaio de digestibilidade de SGF demonstraram que NitromobCRW-Y213L-I215L-Cterm-SUMO é digerido antes do ponto no tempo de 5 minutos. Portanto, a adição do marcador Cterm SUMO não teve efeito sobre a digestibilidade da proteína NitromobCRW. Os géis SGF para a proteína marcada e não marcada eram quase idênticos (dados não mostrados). Os resultados do bioensaio, mostrados na Tabela 18, demonstram que a proteína NitromobCRW com um peptídeo de extensão C-terminal é tão ativa quanto a proteína NitromobCRW sem um peptídeo de extensão C-terminal.

Tabela 18. Bioatividade da proteína NitromobCRW-Cterm-SUMO contra WCR. NitromobCRW-Cterm-

SUMO

Conc (μg/ml) % de Mortalidade de

WCR 200 100 100 80 50 60 25 20 12,5 8 1XPBS (controle) 8

[00150] Deve ser entendido que os exemplos e modalidades descritos aqui são somente para propósitos ilustrativos e que várias modificações ou mudanças à luz dos mesmos da descrição serão sugeridas a pessoas peritas na técnica e são para ser incluídas dentro do espírito e alcance deste pedido e do escopo das reivindicações anexas.

[00151] Todas as publicações e pedidos de patentes mencionados em esta descrição são indicativos do nível de perícia dos peritos na técnica à qual esta invenção pertence. Todas as publicações e pedidos de patentes são aqui incorporados por referência na mesma medida como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado como estando incorporado por referência.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Cassete de expressão caracterizado pelo fato de que compreende um promotor operacionalmente ligado a uma molécula de ácido nucleico heteróloga compreendendo: (a) uma sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 38; (b) uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 45% idêntica à sequência de nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 38; (c) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo compreende as SEQ ID NOs: 39 a 74; (d) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo é pelo menos 45% semelhante à sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 39 a 74; (e) uma sequência de nucleotídeos que é complementar à sequência de nucleotídeos de qualquer um de (a) a (d) acima.

2. Molécula de ácido nucleico caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 36 ou SEQ ID NO: 37, ou um complemento das mesmas.

3. Polipeptídeo caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 74.

4. Vetor ou construto caracterizado pelo fato de que compreende o cassete de expressão, conforme definido na reivindicação 1.

5. Célula hospedeira caracterizada pelo fato de que contém o cassete de expressão, conforme definido na reivindicação

1.

6. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que é uma célula hospedeira bacteriana.

7. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que é uma célula vegetal.

8. Método de produção de um polipeptídeo com atividade inseticida, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a célula hospedeira, conforme definida na reivindicação 5, sob condições nas quais a molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo é expressa.

9. Método de produção de uma planta ou parte de planta possuindo resistência a insetos melhorada em comparação com uma planta ou parte de planta de controle, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) introduzir uma molécula de ácido nucleico compreendendo o cassete de expressão, conforme definido na reivindicação 1, em uma parte da planta; e (b) cultivar a parte de planta para se tornar uma planta que expressa a molécula de ácido nucleico e que tem resistência a insetos melhorada em comparação com uma planta ou parte de planta de controle que não compreende uma molécula de ácido nucleico compreendendo o cassete de expressão, conforme definido na reivindicação 1.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 45% idêntica às SEQ ID NOs: 39 a 74.

11. Método para melhorar a resistência a insetos em uma planta ou parte de planta em comparação com uma planta ou parte de planta de controle, caracterizado pelo fato de que compreende expressar na planta ou parte de planta o cassete de expressão, conforme definido na reivindicação 1, em que a expressão do cassete de expressão resulta em resistência a insetos melhorada em uma planta ou parte de planta em comparação com uma planta ou parte de planta de controle.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente introduzir o cassete de expressão na planta.

13. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente introduzir o cassete de expressão em uma parte de planta e produzir uma planta a partir da parte de planta.

14. Método de produção de uma planta tendo resistência a insetos melhorada em comparação com uma planta de controle,

caracterizado pelo fato de que compreende detectar, em uma parte de planta, um ácido nucleico compreendendo o cassete de expressão, conforme definido na reivindicação 1, e produzir uma planta a partir da parte da planta, produzindo, assim, uma planta tendo resistência a insetos melhorada em comparação com uma planta de controle.

15. Método de identificação de uma planta ou parte de planta tendo resistência a insetos melhorada em comparação com uma planta ou parte de planta de controle, caracterizado pelo fato de que compreende detectar, na planta ou parte de planta, um ácido nucleico, conforme definido na reivindicação 2, identificando, assim, uma planta ou parte de planta tendo resistência a insetos melhorada.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão ou um seu fragmento de diagnóstico é detectado em um produto de amplificação a partir de uma amostra de ácido nucleico da planta ou parte de planta.

17. Método de produção de uma planta que possui resistência a insetos melhorada em comparação com uma planta ou parte de planta de controle, caracterizado pelo fato de que compreende o cruzamento de uma primeira planta genitora com uma segunda planta genitora, em que pelo menos a primeira planta genitora compreende no seu genoma uma molécula de ácido nucleico que compreende o cassete de expressão, conforme definido na reivindicação 1, e a produção de uma geração de progênie, em que a geração de progênie compreende pelo menos uma planta que possui os ácidos nucleicos no seu genoma e que apresenta resistência a insetos melhorada em comparação com uma planta de controle.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 e 17, caracterizado pelo fato de que a resistência a insetos melhorada é contra pragas de insetos Coleópteros e/ou Lepidópteros.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 e 18, caracterizado pelo fato de que a resistência a insetos melhorada é contra uma espécie de Diabrotica.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a resistência a insetos melhorada é contra Diabrotica virgifera virgifera, Diabrotica barberi e/ou Diabrotica undecimpunctata howardi.

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 e 20, caracterizado pelo fato de que a planta ou parte de planta é uma planta monocotiledônea.

22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 e 21, caracterizado pelo fato de que a planta é milho-painço, painço amarelo, milho, sorgo, trigo, aveia, grama de relva, grama de pastagem, linho, arroz, cana-de-açúcar, colza ou cevada.

23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 e 22, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico compreende adicionalmente uma sequência de promotor selecionada do grupo que consiste em uma sequência de promotor constitutivo, uma sequência de promotor específico de tecido, uma sequência de promotor quimicamente induzível, uma sequência de promotor induzível por ferida, uma sequência de promotor induzível por estresse e uma sequência de promotor específico do estágio de desenvolvimento.

24. Planta transgênica compreendendo uma molécula de ácido nucleico que confere resistência a insetos melhorada, caracterizada pelo fato de que a referida molécula de ácido nucleico compreende o cassete de expressão, conforme definido na reivindicação 1.

25. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que a referida molécula de ácido nucleico compreende uma sequência pelo menos 80% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 38, ou um complemento das mesmas.

26. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que a referida molécula de ácido nucleico compreende uma sequência pelo menos 95% idêntica às SEQ ID NOs: 1 a 38, ou um complemento das mesmas.

27. Planta transgênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24, 25 e 26, caracterizada pelo fato de que a referida planta é uma planta monocotiledônea.

28. Planta transgênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24, 25, 26 e 27, caracterizada pelo fato de que a referida planta é milho-painço, painço amarelo, milho, sorgo, trigo, aveia, grama de relva, grama de pastagem, linho, arroz, cana-de-açúcar, colza ou cevada.

29. Planta transgênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24, 25, 26, 27 e 28, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência do promotor selecionada do grupo que consiste em uma sequência de promotor constitutivo, uma sequência de promotor específico de tecido, uma sequência de promotor quimicamente induzível, uma sequência de promotor induzível por ferida, uma sequência de promotor induzível por estresse e uma sequência de promotor específico do estágio de desenvolvimento.

30. Planta transgênica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24, 25, 26, 27, 28 e 29, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica pelo menos uma característica desejada adicional, em que a característica desejada é selecionada do grupo que consiste em resistência a insetos, tolerância ao estresse abiótico, esterilidade masculina, resistência a herbicidas, resistência a doenças bacterianas, resistência a doenças fúngicas, resistência a doenças virais, resistência a nematódeos, metabolismo de ácidos graxos modificado, metabolismo de carboidratos modificado, produção de uma enzima ou metabólito comercialmente valiosos, valor nutricional melhorado, desempenho em um processo industrial melhorado e capacidade reprodutiva alterada.

31. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que a mesma molécula de ácido nucleico ou uma segunda molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um segundo agente pesticida.

32. Planta transgênica, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que o segundo agente pesticida é uma molécula de RNA de interferência.

33. Composição caracterizada pelo fato de que compreende um transportador agrícola apropriado e um polipeptídeo com atividade inseticida, em que o polipeptídeo é selecionado do grupo que consiste em: a) um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 39 a 74; e b) um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 45% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 39 a 74, em que a referida sequência de aminoácidos tem atividade inseticida.

34. Composição, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que a referida composição é selecionada do grupo que consiste em um pó, poeira, pélete, grânulo, aspersão, emulsão, coloide e solução.

35. Composição, de acordo com a reivindicação 33, em que a referida composição é caracterizada pelo fato de que é preparada por dessecação, liofilização, homogeneização, extração, filtração, centrifugação, sedimentação ou concentração de uma cultura de células bacterianas.

36. Composição, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que compreende de cerca de 1% a cerca de 99% em peso do referido polipeptídeo.

37. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 33, 34, 35 e 36, caracterizada pelo fato de que a composição compreende pelo menos um segundo agente pesticida.

38. Composição, de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que a composição compreende uma molécula de RNA de interferência.

39. Método para controlar uma população de pragas de Lepidópteros ou Coleópteros, caracterizado pelo fato de que compreende o contato da referida população com uma quantidade de controle de insetos eficaz de um polipeptídeo com atividade inseticida, em que o polipeptídeo é selecionado do grupo que consiste em:

a) um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 39 a 74; e b) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 45% de identidade de sequência com à sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 39 a 74.

40. Método para exterminar uma população de pragas de Lepidópteros ou Coleópteros caracterizada pelo fato de que compreende o contato da referida população com uma quantidade de controle de insetos eficaz de um polipeptídeo com atividade inseticida, em que o polipeptídeo é selecionado do grupo que consiste em: a) um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 39 a 74; e b) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 45% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 39 a 74.

41. Método para aumentar o rendimento de uma planta compreendendo cultivar em um campo uma planta, ou uma sua semente, caracterizado pelo fato de que tem estavelmente incorporado no seu genoma um construto de DNA, conforme definido na reivindicação 4, e em que o referido campo está infestado com uma praga contra a qual o referido polipeptídeo tem atividade inseticida.

42. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo é pelo menos 93% idêntica à sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 39 a 74.

43. Cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico heteróloga compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo, em que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo é a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 72 e em que o resíduo de aminoácido "X" pode ser qualquer resíduo de aminoácido.

44. Polipeptídeo caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 45% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 74, e que compreende adicionalmente um sítio de clivagem de protease introduzido.

45. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o sítio de clivagem de protease introduzido está localizado entre os resíduos de aminoácido 97 a 266 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 39 a

74.

46. Polipeptídeo caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 45% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 74, compreendendo adicionalmente uma mutação que introduz um sítio de clivagem de protease.

47. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o sítio de clivagem de protease introduzido é introduzido por inserção, deleção ou substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido.

48. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que o sítio de clivagem de protease introduzido é introduzido por inserção de um resíduo de leucina.

49. Polipeptídeo caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 45% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOs: 40 a 74, compreendendo uma mutação que melhora a digestibilidade em um ensaio SGF em comparação com um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 39.

50. Método que melhora a digestibilidade de um polipeptídeo pelo menos 45% idêntico à SEQ ID NO: 39 em um ensaio SGF, caracterizado pelo fato de que compreende a introdução de pelo menos uma mutação na sequência de aminoácidos do polipeptídeo NitromobCRW.

51. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma mutação é uma inserção, deleção ou mutação de pelo menos um resíduo de aminoácido.

52. Método, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma mutação é uma inserção de um resíduo de leucina.

53. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma mutação é introduzida entre os resíduos de aminoácido que correspondem aos 97 a 266 da SEQ ID NO: 39.

54. Método, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma mutação é introduzida nos, ou proximal aos, resíduos de aminoácidos que correspondem ao 213 e/ou 215 da SEQ ID NO: 39.

55. Método, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que as mutações são Y213L e I215L.

56. Método, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma mutação é uma inserção de um resíduo de leucina vizinho ou proximal aos resíduos de aminoácidos que correspondem ao 213 ou 215 da SEQ ID NO:

39.